Literatura académica sobre el tema "Inhibiteurs CDK4"

L’hormonorésistance acquise constitue l’un des défis majeurs dans le traitement du cancer du sein avancé exprimant le récepteur aux estrogènes (RE) et sans surexpression de HER2. Les mutations activatrices du gène ESR1 affectant le domaine de liaison du ligand ont récemment été identifiées comme l’un des principaux mécanismes de résistance aux inhibiteurs de l’aromatase (IA). Ces mutations peuvent être recherchées sur des prélèvements histologiques ou sur ADN tumoral circulant, par PCR ou séquençage de nouvelle génération (NGS). Elles induisent une activation constitutionnelle du RE conduisant à une résistance acquise aux IA ; le tamoxifène, le fulvestrant et les thérapies ciblées anti-mTOR ou anti-CDK4/6 conservent leur efficacité. La place en pratique clinique de la détection des mutations du gène ESR1 reste encore à définir.

Chez ces patientes, il est primordial de rechercher la notion de crise viscérale, qui définira la stratégie du traitement. La crise viscérale est définie selon ABC comme un dysfonctionnement sévère d’un organe entrainant des signes et des symptômes, des anomalies biologiques ou une progression rapide de la maladie. La crise viscérale n’est pas synonyme de métastases viscérales mais une évolution rapide nécessitant un traitement rapidement efficace. Dans les cancers du sein métastatiques RH+/Her2-, la prise en charge a changé ces dernières années. L’hormonothérapie (HT) est devenue le traitement de base de ces cancers en dehors de deux situations particulières à savoir la crise viscérale et la maladie oligo-métastatique. Dans la méta-analyse de la Cochrane publiée en 2003, la chimiothérapie ne fait pas mieux que l’HT mais avec une toxicité plus élevée. Ainsi, un traitement par HT sera proposé aussi longtemps que la maladie reste hormonosensible et cela que l’on soit en première, en deuxième qu’en troisième ligne thérapeutique. Le choix des traitements dépendra à la fois du statut ménopausique, du délai de la rechute et de la disponibilité des drogues. En première ligne métastatique, une nouvelle classe de thérapies ciblées appelées les inhibiteurs de cyclines. Trois molécules sont disponibles : Palbociclib, Ribociclib et Abémaciclib. L’association de ces inhibiteurs des CDK4/6 avec une anti-aromatase ou du Fulvestrant a entrainé un doublement de la survie sans progression de la maladie à plus de deux ans dans des essais de phase III et cela avec une tolérance acceptable. Une deuxième option thérapeutique en première ligne chez les patientes naïves de traitement, est le Fulvestrant 500 mg, qui avait montré dans l’étude de phase III FALCON, une amélioration de la survie sans progression par rapport à un anti-aromatase. Au-delà de la première ligne, il y avait plusieurs options thérapeutiques, à savoir les anti-CD4/6 + AA ou Fulvestrant, s’ils n’ont pas été utilisés en premières ligne, l’association Evérolimus et Exemestane dans l’étude de phase III BOLERO 2, le Fulvestrant 500, les AA, le Tamoxiféne, l’Alpélisib. L’Everolimus est globalement bien toléré. Les effets secondaires se manifestent le plus souvent au premier trimestre. Il s’agit souvent de mucite, d’hyperglycémie, d’hyperlipidémie, pneumopathies et asthénie. L’Evérolimus garde toujours sa place dans le traitement des cancers du sein métastatique RH+/Her2- en deuxième. Actuellement le traitement du cancer du sein métastatique doit se faire à la carte.

Abstract Osteolytic lesions are a hallmark of myeloma bone disease and other metastatic cancers, resulting in significant morbidity. In order to successfully target skeletal disease, it is critical to identify the mediators of osteoclastogenesis. Osteoclastogenesis is a multistep process regulated by receptor activator of nuclear factor κ B ligand (RANKL) and monocyte colony stimulating factor (mCSF). These cytokines recruit monocyte precursors, stimulate their fusion into multinucleated cells, and finally induce osteoclast (OC) formation and activation. Recent data suggest that several chemokines in combination with RANKL and/or vitamin D3 (Oba et al., Exp. Hematology 2005) modulate osteoclastogenesis. Moreover, the autocrine secretion of RANTES and MCP-1 mediate monocyte multinucleation (Kim et al., J. Biol. Chem. 2005), the initial step towards osteoclastogenesis. Since CCR1 is one of the main chemokine receptors expressed on monocytes and OC, we here studied the effects of CCR1 inhibition on osteoclastogenesis. MLN3897 is a small molecule, specific antagonist of the chemokine receptor CCR1. In order to analyze the effects of MLN3897 on osteoclastogenesis, we generated OC from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors by stimulation with RANKL and M-CSF (50 ng/ml) for three weeks, in the absence or presence of MLN3897. Mature OC were multinucleated TRAP+ cells, and their functional activity was confirmed by a pit formation and a collagen release ELISA assay. Our data demonstrates that MLN3897 inhibits osteoclastogenesis in a dose and time-dependent fashion. MLN3897 at 10 nM concentration decreases OC number to 40% (range 20 to 70%) compared to untreated controls (p<0.05). Time course experiments demonstrate that MLN3897 inhibites OC formation if added at the beginning of culture, whereas no inhibition is noted after 7 or 14 days. The reduced OC number is associated with decreased OC activity as demonstrated by a decrease in collagen fragments (control 82 +/−8 vs treated 25+/− 19 nM). Because the effects of MLN3897 are noted at early time points, we hypothesized that MLN3897 interfers with the monocyte multinucleation process. Our data demonstrates that MLN3897 induces a 60% reduction in the multinucleated cell number at one week (control 61+/−14 vs treated 35+/−9), associated with decreased nuclei per cell at two weeks. This correlates with an early induction of CCR1 expression on monocytes by RANKL and mCSF. Flow cytometry confirms an increment of double-stained CD14/CCR1 monocyte population (from 20% to 50%) associated with increased ERK phosphorylation at 36 hours of stimulation, which is completely abrogated by MLN3897. Taken together, these data therefore suggest that CCR1 inhibition by MLN3897 blocks ERK pathway activation and impairs the monocyte multinucleation process, an early step in osteoclastogenesis. These studies delineate a novel mechanism of action of MLN3897 on osteoclastogenesis, and provide the rationale for its clinical evaluation to treat osteolytic bone disease.

Les vésicules extracellulaires (VEs), nanoparticules dérivées des membranes cellulaires, sont vectrices de matériels biologiques et circulent via les fluides de l’organisme. Elles se positionnent aujourd’hui comme des biomarqueurs potentiels de la progression du cancer et de la réponse aux thérapies. Le cancer du sein (CS) demeure la première cause de décès par cancer chez la femme, malgré de nombreuses stratégies thérapeutiques innovantes qui permettent d’améliorer la prise en charge et le taux de survie. Ainsi, l’identification de biomarqueurs spécifiques représente un réel espoir pour surveiller l’évolution de la maladie et prédire l’efficacité des traitements. L’objectif principal de ce projet de recherche a été de caractériser les VEs plasmatiques en tant que biomarqueurs potentiels de la réponse au traitement par inhibiteurs de CDK4/6 chez les patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique (CSM) positif aux récepteurs hormonaux (RH+). Pour faciliter la recherche translationnelle sur l’utilisation des VEs en tant que biomarqueur circulant, nous avons établi une procédure en trois étapes, applicable en clinique : 1- les VEs ont été isolées du plasma par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) semi-automatisée ; 2- la concentration plasmatique des VEs (i.e., vésiculémie) a été déterminée à l’aide du VideoDrop, un microscope utilisant le phénomène d’interférométrie ; et 3- la signature sphingo-lipidique a été analysée par spectrométrie de masse. Nous avons d’abord déterminé la vésiculémie dans une population saine afin d’établir une valeur de référence, en tenant compte des critères de sexe et d’âge. Ensuite, nous avons suivi l’évolution de la vésiculémie physiologique sur une période de 24 mois afin de la comparer avec celle des patientes atteintes d’un CSM RH+ à différents stades de leur prise en charge thérapeutique. Nos résultats révèlent que l’augmentation de la vésiculémie deux mois après le début du traitement est significativement associée à une progression précoce de la maladie. De plus, nous avons analysé la composition lipidique des VEs pour renforcer leur potentiel comme biomarqueurs de progression de la maladie. Une signature spécifique de 16 sphingolipides associés aux VEs nous a permis d’établir un score identifiant avec une précision de 82% les patientes résistantes au traitement par inhibiteurs de CDK4/6. Finalement, cette caractérisation des VEs plasmatiques comme biomarqueurs nous a conduit à explorer leur potentiel chez des patientes atteintes d’un CSM triple négatif et HER2+
Extracellular vesicles (EVs), nanoparticle entities derived from cellular membranes, transport biological materials and circulate through body fluids. They are currently positioned as potential biomarkers for cancer progression and therapeutic response. Despite numerous innovative therapeutic strategies improving management and survival rates, breast cancer (BC) remains the leading cause of cancer-related death in women. Thus, the identification of specific biomarkers represents a significant hope for monitoring disease progression and predicting treatment efficacy. The primary objective of this research project was to characterize plasma EVs as potential biomarkers of response to CDK4/6 inhibitors treatment in metastatic breast cancer (MBC) patients with hormone receptor-positive (HR+) status. To facilitate translational research on the use of EVs as circulating biomarkers, we established a three-step procedure clinically applicable: 1- EVs were isolated from plasma using semi-automated size-exclusion chromatography (SEC); 2- plasma EV concentration (i.e., vesiclemia) was determined using the VideoDrop, a microscope utilizing interferometry; and 3- the sphingo-lipidic signature was analyzed by mass spectrometry. We initially measured vesiclemia in a healthy population to establish a reference value, accounting for sex and age. Subsequently, we monitored the physiological vesiclemia evolution over 24 months and compared it with that of MBC HR+ patients at different treatment stages. Our results reveal that an increase in vesiclemia two months after treatment initiation is significantly associated with early disease progression. Furthermore, we analyzed the lipid composition of EVs to reinforce their potential as biomarkers of disease progression. A specific signature of 16 EV-associated sphingolipids enabled us to establish a score identifying CDK4/6 inhibitor-resistant patients with82% accuracy. Finally, this characterization of plasma EVs as biomarkers led us to explore their potential in MBC patients with triple-negative and HER2+ status

Les CDK/cyclines jouent un rôle majeur dans la progression du cycle cellulaire et dans le maintien de la prolifération des cellules cancéreuses, constituant ainsi des biomarqueurs clés et des cibles pharmacologiques attractives. Plus particulièrement, l’activité de CDK4/cycline D, kinase responsable de la progression de la phase G1 et de la transition G1/S, est dérégulée dans de nombreux cancers dont le mélanome. Cette hyperactivation est associée à des mutations, à l’amplification ou à la surexpression de CDK4, cycline D, p16INK4a ou encore pRb.Comme aucune approche sensible et directe n’existe pour évaluer l’activité de CDK4/cycline D dans des conditions physiologiques et pathologiques, le premier objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur fluorescent permettant d’étudier cette kinase in vitro et in cellulo. Une fois caractérisé et validé in vitro, le biosenseur a été appliqué à la détection d’altérations de CDK4/cycline D dans des biopsies de peau humaine et de xénogreffes de mélanome dans des essais fluorescents d’activité kinase, ainsi que dans des cellules cancéreuses vivantes par microscopie de fluorescence et vidéo microscopie.Par ailleurs, peu d’inhibiteurs sont actuellement disponibles pour inhiber CDK4/cycline D et la plupart d’entre eux ciblent la poche de fixation de l’ATP. C’est pourquoi le second objectif de ma thèse a consisté à identifier des inhibiteurs non compétitifs de l’ATP, soit par élaboration rationnelle de peptides, soit par criblage de petites molécules. A cette fin, deux biosenseurs fluorescents ont été développés qui permettent d’identifier respectivement des composés ciblant l’interface entre CDK4 et cycline D ou des inhibiteurs allostériques capables de perturber la dynamique conformationnelle de CDK4. Des essais de criblage par fluorescence réalisés avec ces biosenseurs ont conduit à l’identification de touches qui ont été validées et caractérisées in vitro et dans des essais de prolifération cellulaire, et qui constituent des candidats prometteurs pour une chimiothérapie sélective du mélanome
CDK/cyclins play a central role in coordinating cell cycle progression, and in sustaining proliferation of cancer cells, thereby constituting established cancer biomarkers and attractive pharmacological targets. In particular, CDK4/cyclin D, which is responsible for coordinating cell cycle progression through G1 into S phase, is a relevant target in several cancers including melanoma, associated with mutation of CDK4, cyclin D, p16INK4a and pRb.As there are no sensitive and direct approaches to probe CDK4/cyclin D activity in physiological and pathological conditions, the first goal of my thesis has consisted in engineering a fluorescent biosensor to probe this kinase in vitro and in cellulo. Once characterized and validated in vitro, the biosensor was applied to detect CDK4/cyclin D alterations in biopsies from human skin and melanoma xenografts in fluorescence-based activity assays, and in living cancer cells by fluorescence microscopy and timelapse imaging.Moreover, only few inhibitors are currently available to target CDK4/cyclin D and most of them bind the ATP pocket. As such, the second major goal of my thesis project has consisted in identifying non-ATP competitive inhibitors, either through rational design of peptides or by screening small molecule libraries. To this aim, two fluorescent biosensors were engineered which discriminate compounds that target the interface between CDK4 and cyclin D, or that perturb the conformational dynamics of CDK4, respectively, from ATP-pocket binding compounds. Fluorescence-based screening assays performed with these biosensors lead to identification of hits, which were validated and characterized in vitro and in cell proliferation assays, and which constitute promising candidates for selective chemotherapy in melanoma

Les kinases cycline-dépendantes (CDK) sont des protéines régulatrices essentielles du cycle cellulaire. Elles contrôlent la prolifération cellulaire et sont souvent déréglées dans les cancers. De nombreux inhibiteurs de CDKs ont été élaborés et sont actuellement le sujet d'essais cliniques. Bien que Cdk1 soit un régulateur essentiel de cycle cellulaire, Cdk2 n’est pas nécessaire pour la progression du cycle cellulaire, mais favorise la tumorigenèse. Par conséquent, Cdk2 est une cible thérapeutique prometteuse. L’utilisation des inhibiteurs de kinases pour modifier la prolifération cellulaire s’apparente à appliquer une sélection Darwinienne. Cette sélection peut être modélisée mathématiquement. Cette approche a montré que des avantages sélectifs, mêmes marginaux, peuvent être d'une importance majeure dans la compétition inter-cellulaire et la progression du cancer. Selon ce principe, nous avons fait l’hypothèse que le fait que la Cdk2 ait un rôle mineur dans la progression du cycle cellulaire lui confèrerait le statut de cible pertinente pour une thérapie du cancer. Selon cette hypothèse, son inhibition serait bien tolérée, permettant de réduire le niveau d’activité CDK et ainsi agir contre la prolifération déréglée des cellules. Nous avons supposé qu’au lieu d’éliminer entièrement les cellules les plus prolifératives, qui seraient les plus sensibles au traitement, il serait potentiellement intéressant de les exploiter pour concurrencer l’émergence des cellules résistantes, moins prolifératives. L'utilisation d'un traitement continu à faible dose avec les inhibiteurs Cdk2 pourrait permettre de maintenir cet équilibre. L'objectif de la thèse était d'étudier si Cdk2 confère un avantage prolifératif aux cellules cancéreuses, si les cellules peuvent développer une résistance aux inhibiteurs de CDKs, et si oui, déterminer quels étaient les mécanismes de résistance qui permettent de réduire le « fitness » des cellules prolifératives. Pour répondre à ces questions, nous avons généré des lignées cellulaires ayant des degrés variés de résistance à un inhibiteur spécifique de Cdk2 (inhibant également Cdk1 à des concentrations élevées). Nous avons caractérisé leur capacité à proliférer en comparaison avec des cellules parentales et des cellules isogéniques n’exprimant plus Cdk2 en raison d’un « knock-out » du gène. Bien que dans ces premières cellules le gène Cdk2 est retrouvé non muté et que l'expression de la protéine Cdk2 reste inaltérée, l'activité kinase de Cdk2 est diminuée. Les cellules résistantes à l’inhibiteur prolifèrent efficacement in vitro. Cependant, lors des expériences de compétition avec les cellules parentales, sensibles aux inhibiteurs, elles sont perdantes. Ceci montre que le développement d’une résistance à un inhibiteur de kinase entraîne un désavantage sélectif. Malgré une prolifération normale en l’absence de compétiteurs, ce désavantage est mis en évidence dans une population mixte, validant ainsi l’hypothèse de départ. Nous avons constaté que les Cdk2 KO et les cellules résistantes à l’inhibiteur (R50) ont un métabolisme altéré. Ces cellules sont sensibles à l'épuisement des nutriments et du glucose ainsi qu’à l'hypoxie, malgré un taux de consommation d'oxygène normal, ce qui indique une augmentation de la glycolyse aérobique. Les cellules R50 surexpriment la protéine Cdk6, ce qui peut contribuer à la résistance à l'inhibition Cdk2. De plus elles sont sensibles à l’inhibition des Cdk4/6, cibles référencées dans le traitement de certaines classes de cancer du sein. Enfin, les cellules Cdk2 KO présentent un point de contrôle de la phase S perturbé. Ces résultats suggèrent que des inhibiteurs pharmacologiques ciblant Cdk2 pourraient être synergique avec d’autres traitements, par exemple l’inhibition concomitante de la réplication de l'ADN, de la glycolyse, ou de Cdk6. Cela pourrait ainsi diminuer la prolifération des cellules cancéreuses et empêcher l’émergence d'une résistance thérapeutique
Cyclin-dependent kinases (Cdk) are essential regulators of the cell cycle that support cell proliferation and are often deregulated in cancer. While Cdk1 is an essential regulator of the cell cycle, Cdk2 is not required for cell cycle progression but promotes tumorigenesis. Therefore, Cdk2 is a promising drug target. Many Cdk inhibitors have been developed and are currently undergoing clinical trials. Darwinian selection can be modelled mathematically, and such studies have shown that even marginal selective advantages can be of great importance in outcomes of cell-cell competition and cancer progression. We hypothesised that the non-essential role of Cdk2 for cell cycle progression may mean that it is a good target for cancer therapy as continual inhibition should be tolerated and should counteract deregulated cell proliferation in cancer. However, as with all chemotherapeutic agents, the development of clinical resistance is likely. We further hypothesized that applying a low-dose treatment with Cdk2 inhibitors should minimize chances of developing resistance, by maintaining competition between robustly proliferating cells that are sensitive to treatment, and resistant cells.The aim of the thesis was to investigate whether Cdk2 confers a proliferative advantage to cancer cells, whether cells can develop resistance to Cdk inhibitors, and if so, whether the mechanisms allowing resistance reduce cellular proliferative fitness.To answer these questions, we have created cell lines with varying degrees of resistance to a selective Cdk2 inhibitor (that at high doses, also inhibits Cdk1) and have characterised their proliferation capacity in comparison with parental cells and isogenic Cdk2 knockout cells. Although in these cells the Cdk2 gene is not mutated and the expression of Cdk2 protein remained unaltered, the kinase activity of Cdk2 is decreased. Similarly, Cdk2 gene knockout (Cdk2 KO) cells have reduced sensitivity to Cdk2 inhibition. Inhibitor-resistant cells proliferate efficiently but are outcompeted by parental, inhibitor-sensitive cells in competition experiments, confirming that inhibitor resistance entails a selective disadvantage. We found that the proliferation of both Cdk2 knockout and inhibitor-resistant (R50) cells is sensitive to nutrient and glucose depletion as well as hypoxia, despite a normal oxygen consumption rate, indicating increased aerobic glycolysis. R50 cells have highly upregulated Cdk6, which may contribute to resistance to Cdk2 inhibition. Moreover, they are sensitised to Cdk4/6 inhibition, which is currently authorised as a treatment for some classes of breast cancer. Finally, Cdk2 knockout cells have an impaired S-phase checkpoint. These results suggest that pharmacological inhibitors targeting Cdk2 might be synthetically lethal with other treatments, eg inhibition of DNA replication, of glycolysis, or of Cdk6. This might diminish cancer cell proliferation and prevent emergence of therapeutic resistance

Les kinases cycline-dépendantes (CDKs) sont des régulateurs essentiels du cycle de division cellulaire (CDK1, 2, 3, 4, 6, 7), de l’apoptose (CDK1, 5), et de la transcription (CDK7, 9). Les inhibiteurs pharmacologiques de CDKs constituent une nouvelle famille de produits anti-cancéreux potentiels : dix sont actuellement en clinique, dont la roscovitine issue de notre laboratoire. Ma thèse a porté sur l’identification, l’optimisation et la caractérisation détaillée des effets biochimiques et cellulaires de trois nouvelles classes d’inhibiteurs de kinases : indirubines-7-bromées (7BIO), meriolines et nouveaux analogues de la roscovitine (N&N1 et C&R8). Le 7BIO induit une mort cellulaire non-apoptotique par un mécanisme encore inconnu (pas de relargage de cytochrome C, pas d’activation de caspases). En revanche les meriolines et les roscovitine de seconde génération induisent une mort apoptotique classique suite à l’inhibition de CDK9. Qui conduit à une disparition d’un facteur de survie cellulaire essentiel, Mcl-1. Ces trois familles chimiques ont des effets anti-prolifératifs et tumoraux prometteurs
Cyclin-dependent kinases (CDKs) are key regulators of cell division cycle (CDK1, 2, 3, 4, 6, 7), apoptosis (CDK1, 5), and transcription (CDK7, 9). Pharmacological inhibitors of CDKs constitute a new family of potential antitumor agents: ten are under clinical trials, among which roscovitine, was discovered in our laboratory. My thesis is about identification, optimisation and characterization of biochemical and cellular effects of three new kinase inhibitory classes: 7-bromo-indirubins (7BIO), meriolin and new analogs of roscovitine (N&N1 and C&R8). 7BIO induces non-apoptotic cell death through an unknown mechanism (no release of cytochrome C, nor caspase activation). On the other hand, meriolins and second generation roscovitine analogs induce a classical apoptosis due to CDK9 inhibition, thus leading to disappearance of the cell survival factor, Mcl-1. These three classes of chemicals display promising anti-proliferative and antitumor properties

En dehors de son activité inhibitrice de MMPs, le TIMP-1 présente d'autres activités biologiques telles que des effets mitogéniques et anti-apoptotiques sur différentes lignées cellulaires. Nous avons montré que le TIMP-1 induit la survie des cellules érythroleucémiques humaines UT-7 en activant la voie JAK2/PI 3-kinase/Akt. Récemment, nous avons montré que le TIMP-1 se fixe à une pro-MMP-9 localisée à la membrane plasmique des cellules UT-7 et que l'expression membranaire de la pro-MMP-9 est nécessaire à l'effet anti-apoptotique du TIMP-1. Dans une première partie, nous montrons que CD44 permet l'ancrage de la pro-MMP-9 à la surface cellulaire et que cette protéine joue un rôle crucial dans l'effet anti-apoptotique du TIMP-1 puisque si l'on éteint l'expression de CD44, la pro-MMP-9 n'est plus localisée à la surface cellulaire et le TIMP-1 n'est plus capable d'induire la survie cellulaire. Dans la signalisation anti-apoptotique du TIMP-1, JAK2 est la première tyrosine kinase qui est phosphorylée suite à une stimulation par le TIMP-1. Dans une deuxième partie, nous avons étudié l'interaction entre CD44 et la tyrosine kinase JAK2. Nous montrons que CD44 est associée de manière constitutive à JAK2 et que cette interaction se fait via le domaine FERM de JAK2. D'autres kinases pourraient intervenir dans la signalisation anti-apoptotique du TIMP-1, parmi lesquelles les Src kinases. Dans une troisième partie, nous avons étudié l'implication de la Src kinase Lyn dans l'effet anti-apoptotique du TIMP-1. Nous montrons que la Src kinase Lyn joue un rôle crucial dans l'effet anti-apoptotique du TIMP-1 en amont de la PI 3-kinase
Besides its ability to inhibit MMP activity, TIMP-1 exhibits other biological functions such as mitogenic and anti-apoptotic effects on various cell lines. We showed that TIMP-1 induced UT-7 erythroid cell survival through activation of the JAK2/PI 3-kinase/Akt pathway. Recently, we showed that TIMP-1 specifically bound to pro-MMP-9 localized at the UT-7 plasmic membrane and that pro-MMP-9 membrane expression is crucial for TIMP-1 anti-apoptotic effect. In a first part, we showed that CD44 anchored pro-MMP-9 at the cell surface and that this protein played a crucial role in TIMP-1 anti-apoptotic effect since CD44 silencing abrogated pro-MMP-9 cell surface localisation and enabled TIMP-1-mediated cell survival. In TIMP-1 anti-apoptotic signalling pathway, JAK2 is the first tyrosin kinase phosphorylated following TIMP-1 stimulation. In a second part, we studied the interaction between CD44 and tyrosin kinase JAK2. We showed that CD44 is associated in a constitutive manner to JAK2 via the JAK2 FERM domain. Other kinases could be implicated in TIMP-1 anti-apoptotic pathway, among them the Src kinases. In a third part, we studied the implication of Lyn Src kinase in TIMP-1 effect. We showed that Lyn played a crucial role in TIMP-1 anti-apoptotic effect upstream the PI 3-kinase

Les kinases dépendantes des Cyclines (Cdk) contrôlent le déroulement du cycle cellulaire, mais leur étude est difficile car des mécanismes de compensation se développent lorsqu'une Cdk est absente. Cdk2 est principalement impliquée dans la phase de réplication de l'ADN, cependant l'ablation génétique de Cdk2 chez la souris n'a pas d'effet sur leur développement: les fonctions de Cdk2 sont compensées par d'autres Cdk. L'inhibition chimique permet de bloquer une Cdk et de limiter les compensations. Pour étudier les rôles de Cdk2, nous l'avons inhibé avec NU6102 qui sélectif pour Cdk2 dans le modèle xénope. Nous avons aussi développé des mutants de Cdk2 résistants à NU6102 pour vérifier sa sélectivité et avons cherché à mieux comprendre les paramètres qui déterminent l'affinité entre Cdk2 et un ligand. D'autre part, nous déterminons in vitro que NU6102 serait plus sélectif pour Cdk2 que pour les autres Cdk chez l'humain, et avons décrit les phénotypes induits par cet inhibiteur dans les cellules humaines en cultures. Ces résultats ne permettent pas de confirmer la sélectivité de NU6102 mais montrent que NU6102 a des caractéristiques intéressantes pour être utilisé dans le traitement contre le cancer. L'activité des Cdk est essentielle à l'initiation de la réplication de l'ADN, mais aucun substrat essentiel n'a été identifié chez les métazoaires. Nous avons réalisé un crible des protéines chargées sur la chromatine en présence et en absence d'activité Cdk dans le modèle xénope, afin d'identifier des substrats qui pourraient être impliqués dans la réplication. Ces résultats suggèrent que l'activité Cdk, qui initie la réplication au niveau des origines de réplication de l'ADN, pourrait être impliquée dans d'autres fonctions cellulaires
Cycline Dependant Kinases (Cdk) control cell cycle progression. The study of their roles is often difficult because of functional redundancy; when a given Cdk is absent, others may compensate. The main role of Cdk2 in the cell cycle is in the initiation of DNA replication, but absence of Cdk2 is compensated for by Cdk1. For example, mice with a genetic knockout of Cdk2 are viable. The chemical inhibition of Cdks may limit compensation by other Cdks. Therefore, to study Cdk2 roles, we have studied chemical inhibition by NU6102, which seems to be selective for Cdk2 in the Xenopus model. To verify the selectivity and study parameters that determine selectivity, we have designed and produced mutants of Cdk2 which are resistant to NU6102, allowing restoration of function in the presence of inhibitor. Moreover, we demonstrate in vitro that NU6102 is selective for Cdk2 compared to other human Cdks, and we describe phenotypes induced by NU6102 in cultured cells, which are interesting in the light of potential applications of NU6102 in cancer chemotherapy. Cdk activity is essential for initiation of DNA replication, but in metazoans no essential substrates are known. To identify potential Cdk substrates during DNA replication, we have performed a proteomics screen of the proteins loaded onto chromatin in the presence or absence of Cdk activity, in the Xenopus model. The results suggest that Cdk activity is not only required for assembling DNA replication complexes onto origins of replication, but may also be implicated in other cellular functions

L'activité fonctionnelle des cellules immunes est régulée par un équilibre entre des signaux activateurs et inhibiteurs. Les récepteurs inhibiteurs KIR (Killer cell Ig-like Receptors) exprimés par les cellules NK et par les lymphocytes T effecteurs mémoires lient les molécules du CMH-I et suppriment l'activation cellulaire via le recrutement de SHP-1. Pour mieux comprendre le rôle des KIR sur les cellules T CD4⁺, des transfectants KIR2DL1 ont été obtenus à partir d'une lignée T Jurkat et de lymphocytes T CD4⁺ primaires. Suite à une stimulation du TCR, la production d'IL-2 est augmentée dans les cellules T CD4⁺ transfectées par le KIR2DL1 indépendamment de son engagement, mais suite à son engagement l'activation induite par le TCR est inhibée. La co-stimulation du signal positif initié par le TCR via le KIR2DL1 nécessite des ITIM intacts et fait suite à leur phosphorylation. Il s'en suit le recrutement de SHP-2 et une augmentation de la phosphorylation de PKCθ et ERK. Lors du contact avec une cellule cible, la synapse est caractérisée par une augmentation du recrutement des p-Tyr, de SHP-2 et de la PKCθ. L'interaction avec une cellule cible exprimant les ligands du KIR2DL1 induit sa forte accumulation à la synapse et le recrutement de SHP-1/SHP-2 qui inhibent la production d'IL-2. Le KIR2DL1 induirait deux signaux opposés dans les cellules T CD4⁺ dépendant ou non de son engagement. Les résultats inattendus observés sur la régulation des cellules T CD4⁺ par le KIR2DL1, de part la dualité fonctionnelle des ITIM est fondamentale pour déterminer la capacité du système immunitaire à développer une réponse appropriée, c'est à dire à maintenir la balance tolérance/immunité
The functional activity of immune cells is controlled by a balance between activators and inhibitors signals. The Inhibitory killer Ig-like receptors (KIR) expressed on NK cells and memory effectors T-cell recognize the CMH-I molecules and inhibit cellular activation by SHP-1 recruitment. To better understand the fonction of KIR receptors on CD4⁺ T-cells, KIR2DL1 transfectants were obtained from human T-cell line and from primary CD4⁺ T-cells. Following TCR stimulation, IL-2 production is increased in CD4+ T cells transfected by KIR2DL1 independently of its engagement. When KIR2DL1 is engaged by its cognate ligand the TCR activation is inhibited. Co-stimulation of the TCR signaling by KIR2DL1 requires intact ITIM and their phosphorylation. It induces a subséquent SHP-2 recruitment and an increased of PKCθ and ERK phosphorylation. Synapses leading to activation are characterized by an increase in the recruitment of p-Tyr, SHP-2, and p-PKCθ. Interaction of KIR2DL1 with its ligand leads to a strong synaptic KIR2DL1 accumulation and SHP-1/SHP-2 recruitment resulting in the inhibition of TCR-induced IL-2 production. These data reveal that KIR2DL1 may induce two opposite signaling outputs in CD4⁺ T cells, depending on whether the KIR receptor is bound to its ligand. The unexpected results observed on the regulation of CD4⁺ T cells by KIR2DL1 receptors, through the functional duality of ITIM, is fundamental to determine the immune System capacity to develop an adapted answer, i. E. To maintain the balance between tolerance and immunity

Les pyrido[d]pyrimidines constituent une classe de composés intéressants tant sur le plan chimique que biologique. Une des applications courante pour cette famille concerne leur utilisation dans l’élaboration de nouvelles drogues inhibitrices de kinases. Dans ce travail nous nous sommes intéressés aux pyrido[3,2-d]pyrimidines, les moins décrites dans la littérature, car leurs voies d’accès sont souvent difficiles et les produits de départ sont très onéreux. Dans le cadre de la recherche de nouveaux agents cytotoxiques et d’inhibiteurs de kinases toujours plus sélectifs, nous avons développé de nouvelles méthodologies originales, efficaces et moins coûteuses, pour la synthèse des 2,4-dichloro et 2,4,7-trichloro pyrido[3,2-d]pyrimidines. La réactivité de ces deux synthons clés a été étudiée lors de réactions de substitutions nucléophiles aromatiques et divers couplages pallado-catalysés qui ont permis l’obtention d’un large panel de molécules polyfonctionnalisées en position 2, 4 et 7. Différentes analyses pharmacologiques ont été réalisées. L’inhibition des kinases (DYRK1A, CDK5, GSK3) par nos produits originaux et l’évaluation de leur cytotoxicité sur diverses cellules humaines cancéreuses ont été réalisées. Certaines molécules ont donné des résultats extrêmement prometteurs. Les relations entre structure et activité de ces nouvelles familles de composés sont discutées.

Ce travail de thèse reposait sur l’hypothèse que la variabilité génétique des protéines « cibles » des médicaments immunosuppresseurs de la famille des inhibiteurs de la calcineurine (ICN ; ciclosporine et tacrolimus) pourrait expliquer une partie de la variabilité observée dans leur efficacité et toxicité. Une revue de la littérature nous a permis de lister un panel de variants génétiques au sein de la voie de la calcineurine, considérés comme étant de bons candidats pour des études en transplantation. Ces variants n’ont pas été associés au risque de rejet aigu ou d’infection grave dans une étude incluant 381 patients transplantés rénaux suivis durant un an après la transplantation. La variabilité pharmacodynamique des ICN a ensuite été explorée au travers des régulations épigénétiques. Une analyse de la méthylation de l’ADN après exposition médicamenteuse a été menée sur deux modèles. Premièrement, la lignée cellulaire JURKAT a été utilisée pour développer la méthode d’immunoprécipitation de l’ADN méthylé (MeDIP). Chez des souris traitées par ciclosporine et tacrolimus durant 3 mois, nous avons ensuite isolé les cellules cibles des médicaments, les lymphocytes T CD4 puis, après immunoprécipitation de l’ADN méthylé et analyse par séquençage pangénomique haut débit (MeDIP-seq, séquençeur Ion Proton), nous avons recherché les régions du génome présentant des différences de méthylation induites par le traitement. L’analyse différentielle bio-informatique a été menée à l’aide des outils SAMtools (Li et col., 2009), BEDtools (Quinlan and Hall, 2010), MACS2 (Zhang et col., 2008) et Diffbind (Stark and Brown, 2011 - Bioconductor). Sur l’ensemble du génome, nous n’avons identifié que 24 régions présentant un niveau de méthylation modifié par l’exposition au tacrolimus. Le promoteur du gène Calm2, codant pour l’isoforme 2 de la calmoduline, semble être davantage méthylé chez les souris traitées. Ces résultats préliminaires semblent prometteurs pour la découverte de biomarqueurs épigénétiques de la réponse thérapeutique aux immunosuppresseurs
Inter-individual genetic variation might account for diverse efficacy and toxicity of calcineurin inhibitors (cyclosporin and tacrolimus). In particular, some variants located within genes coding for proteins of the calcineurin pathway can explain part of this variability. In this manuscript, a panel of candidate genes was selected based on bibliographic review and tested in a pharmacogenetics study encompassing 381 renal transplants followed for one year after surgery. None of these candidates was associated with the acute rejection or serious infection risks. Furthermore, the pharmacodynamic variability of these drugs was also investigated, exploring the use of epigenomics profiling as proximal readout of the calcineurin inhibition treatment. In particular, we investigated the impact of drug exposure on DNA methylation in two experimental models. Methylated DNA immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (MeDIP-seq, Ion Proton technology) was deployed in JURKAT cell line, used as in vitro model, and in CD4 T lymphocytes isolated from mice treated with either cyclosporin or tacrolimus for three months. After sequencing, the differentiated methylated regions caused by drug exposure were analyzed. Bioinformatics analyses were performed using SAMtools (Li et al., 2009), BEDtools (Quinlan and Hall, 2010), MACS2 (Zhang et al., 2008) and Diffbind (Stark and Brown, 2011 - Bioconductor). Overall, the genome-wide analysis revealed only 24 regions with a differentiated enrichment in DNA methylation after three month-tacrolimus treatment, indicating a targeted effect of these treatments on a subset of key genes. Of note, CALM2 promoter, coding for the calmodulin isoform 2 protein, showed significant hypermethylation in tacrolimus-treated mice. These preliminary results corroborate the interest in using DNA methylation as promising approach to identify candidate biomarkers for therapeutic drug monitoring in calcineurin inhibitor treatments