Tesis sobre el tema "Infertilité masculine"

L’implication de l’aromatase dans la qualité du spermatozoïde a été appréhendée chez des patients tunisiens consultant pour infertilité et présentant des anomalies de la mobilité et de la forme des spermatozoïdes. Une diminution significative du transcrit aromatase a été notée chez les tératospermiques et les asthénotératospermiques. Les asthénospermiques se divisent en deux sous-groupes avec des taux d’ARNm de l’aromatase abaissés dans le premier et augmentés dans le second. Une corrélation significative entre les taux de transcrits de l’aromatase et le pourcentage de formes atypiques et/ou l’IAM a été enregistrée. Les taux des paramètres biochimiques du plasma séminal montrent une diminution du fructose chez les asthénozoospermiques en comparaison aux asthénotératozoospermiques. L’analyse de corrélation révèle que l’a-glucosidase neutre est corrélée avec le volume séminal et le pH; l’acide citrique avec le pH et le fructose avec le volume séminal, la numération des spermatozoïdes et la morphologie. Une implication des gènes de l’aromatase et des récepteurs aux estrogènes alpha dans la stérilité des hybrides chromosomiques issus de croisements entre souris domestiques Robertsoniennes (22Rb) 2n=22 et standard (40Std) 2n=40 a été vérifiée par l’analyse de l’expression des gènes de l’aromatase et du récepteur aux estrogènes alpha. Nos résultats n’ont pas montré de différence des taux d’ARNm de ces marqueurs dans les testicules entre les hybrides et les races parentales, mais chez les femelles une réduction du taux d’ARNm de l’aromatase a été observée dans les ovaires des hybrides du croisement (♀40Std×♂22Rb)
The involvement of aromatase in the quality of the spermatozoa was undertaken in Tunisian patients with abnormal mobility and morphology spermatozoa and undergoing infertility assessment. A significant decrease of aromatase transcript was noted in both teratozoospermia and asthenoteratozoospermia groups compared with normozoospermia. Asthenozoospermia group was divided into two sub-groups with aromatase mRNA rates lowered in the first and increased in the second. Moreover, a significant correlation between mRNA aromatase and the percentage of sperm morphology and/or MAI was recorded. The seminal plasma biochemical parameters in these patients revealed a significant reduction of fructose level in the asthenozoospermic in comparison with asthenoteratozoospermic patients. The correlation analysis reveals that neutral a- glucosidase is correlated with seminal volume and pH; citric acid with pH and fructose with seminal volume, sperm count and morphology. The implication of aromatase and estrogen receptor alpha gene in the sterility of chromosomal hybrid mice resulting from crosses between Robertsonian (22Rb) 2n = 22 and standard (40Std) 2n = 40 domestics mice was verified by the analysis of the expression of aromatase and estrogens receptor alpha genes. Our data showed no difference of mRNA rates of these two markers in the testes between hybrids and parental races but, in females a reduced level of aromatase ARNm was observed in the ovaries of hybrids resulting from the cross (♀40Std×♂22Rb)

Le surpoids et l’obésité, dont la prévalence augmente régulièrement depuis quelques décennies, ont un impact négatif sur les fonctions de reproduction masculine. De plus, le concept de DOHAD suggère que l’environnement très précoce pourrait programmer à long terme la fertilité d’un individu. L’objectif de cette thèse est d’évaluer, d’une part, la relation entre l’obésité et les paramètres spermatiques, d’autre part, l’influence de l’environnement maternel et du développement néonatal sur les fonctions de reproduction masculine. Dans une étude incluant 300 hommes infertiles, nous avons observé un impact négatif de l’obésité sur l’intégrité de l’ADN spermatique. L’obésité abdominale, évaluée par impédancemétrie et mesure du tour de taille, semble également impacter sur la qualité spermatique. Nous n’avons cependant pas observé d’influence du surpoids ou de l’obésité sur la capacité des spermatozoïdes à se fixer à la zone pellucide. Nous rapportons aussi l’histoire de 6 patients infertiles présentant une obésité abdominale et une augmentation de la fragmentation de l’ADN spermatique. Après quelques mois de prise en charge hygiéno-diététique, une diminution ciblée de l’obésité abdominale et une amélioration de l’intégrité de l’ADN spermatique et du bilan hormonal ont été observées. Les 6 couples ont par la suite obtenu une grossesse et la naissance d’un enfant en bonne santé. Concernant l’impact de la croissance in utero sur les paramètres spermatiques masculins, nous avons observé une corrélation négative entre le poids de naissance et le nombre total de spermatozoïdes, ainsi qu’une corrélation positive entre le poids de naissance et la fragmentation de l’ADN spermatique. Une étude chez le lapin nous a permis d’observer un impact négatif de l’hyperlipidémiehypercholestérolémie maternelle sur le poids des testicules et des épididymes des lapins adultes et sur les concentrations en testostérone, montrant ainsi l’importance de l’alimentation maternelle dans le développement des fonctions de reproduction masculine. Ces résultats confirment l’importance de la corpulence des hommes dans la prise en charge de l’infertilité. Les effets néfastes de l’obésité, simplement définie par l’IMC, ou de l’obésité abdominale, définie par une augmentation du tour de taille, pourraient être réversibles avec une prise en charge adaptée. L’alimentation de la mère pendant la grossesse semble également être un facteur important pour la programmation de la fertilité à long terme. Ce travail s’inclut dans un large projet, qui prend en compte l’origine multifactorielle de l’infertilité et nécessite une prise en charge multidisciplinaire très précoce du couple.

L’infertilité masculine parait augmenter depuis plusieurs décennies. Ses étiologies sont multiples, mais les causes génétiques et épigénétiques paraissent importantes. Nous avons dans cette thèse étudié différentes causes génétiques et épigénétiques d’infertilité en mettant en évidence les anomalies portées par les spermatozoïdes et parfois transmissibles au conceptus. Ce travail comporte trois parties, à savoir, tout d'abord, les infertilités associées à des anomalies du caryotype constitutionel en étudiant les conséquences pour le risque chromosomique porté par les spermatozoïdes avec le risque évalué sur tous les spermatozoïdes puis, les infertilités, à caryotype constitutionel normal, dont l’origine génique a parfois été démontrée et où la morphologie spermatique est altérée avec les spermatozoïdes macrocéphales, les spermatozoïdes globozoocéphales et les spermatozoïdes à larges ou petites vacuoles et enfin, les anomalies de la méthylation de l’ADN dans les différentes étiologies d’azoospermie. Ces approches ont un triple intérêt car elles permettent d'évaluer les risques pour le conceptus, de guider la prise en charge des patients et le choix des spermatozoïdes à injecter dans l’ovocyte. A plus long terme grâce à une compréhension des mécanismes en jeu, prévenir des infertilités et proposer de véritables solutions thérapeutiques
The male infertility seems to increase for several decades. Infertility etiologies are multiple, but the genetic and epigenetic causes are important. Here, we tried to study, the abnormalities carried by spermatozoa and sometimes transmissible in the conceptus. This work contains three parts, in a first time, the infertility linked with abnomalities of constitutionel karyotype by studying the consequences for the chromosomal risk with the risk estimated on all spermatozoa, in a second time, the infertility, with normal constitutionel karyotype, where the genetic origin was sometimes demonstrated and sperm morphology altered with macrocephalic sperm, Globozoospermia and spermatozoa with large or small vacuoles and in fine, DNA methylation abnormalities in various azoospermic aetiologies. These approaches have a triple interest because, it estimate the risks for conceptus and advice patients care, guide the choice of spermatozoa to be injected in the oocyte

L'infertilité affecte environ 15% des couples et l'étiologie est masculine dans la moitié des cas.Cette thèse étudie trois facteurs de l'infertilité masculine et se divise en deux parties décrites ci-dessous. Dans la première partie,l'équipement chromosomique et la fragmentation de I'ADN spermatique dans les gamètes d'hommes infertiles ont été étudiés par la technique FISH et TUNEL. Chez 4 patients présentant une mosaïque gonosomique, un taux élevé de gamètes aneuploïdes et de fragmentation de I'ADN spermatique a été observé. Concernant les l3 patients ayant une anomalie chromosomique de structure, l'équipement chromosomique et l'état de I'ADN spermatique ont été analysés dans chaque gamète. Les résultats montrent que les gamètes chromosomiquement déséquilibrés ont un ADN plus fragmenté que ceux dont l'équipement chromosomique est normal ou équilibré. Dans la deuxième partie, la mise au point d'une technique d'étude du transcriptome dans les spermatozoïdes a été faite sur des échantillons de sperme frais et congelé. La combinaison d'un gradient de densités discontinues et d'une lyse des cellules somatiques permet d'éliminer complètement des cellules somatiques en récupérant le maximum possible de spermatozoïdes dans le sperme. Le kit NucleoSpin RNA XS (Macherey Nagel) est plus adapté pour I'extraction d'ARN spermatiques que le kit d'extraction d'ARN de chez Qiagen. La pureté des ARN spermatiques est vérifiée par RT-PCR et le Bioanalyzer 2700. Ces deux méthodes donnent des résultats similaires et concordants. L'analyse de microarray montre que les spermatozoïdes frais ne partagent pas le même profil d'expression génétique que les spermatozoïdes congelés
Infertility affects about 15% of couples with male factor found in half of the cases. This Ph.D thesisinvestigates three causes of male infertility including chromosomal abnormality, genetic disorderand factors related to alterations in sperm DNA quality. The thesis is organized into two parts.In the first part, the chromosomal equipment and sperm DNA fragmentation in gametes of infertilemen were assessed by FISH and TUNEL. On the one hand, a high rate of aneuploid gametes andsperm DNA fragmentation were observed in four patients with gonosomal mosaicism. On the otherhand, analysis of chromosomal equipment and sperm nuclear DNA in each gamete from 13 patientswith structural chromosome abnormalities showed that unbalanced gametes have more fragmentedDNA than normal or balanced ones.In the second part, a technique for analysing the transcriptome in spermatozoa was developed onfresh and frozen semen. In fact, the combination of a discontinuous density gradient and a somaticcell lysis solution makes it possible to completely eliminate somatic cells and to recover as manysperms in the semen as possible. The XS NucleoSpin RNA kit (Macherey Nagel) was found to bemore suitable for RNA extraction than the RNA extraction kit from Qiagen. The purity of sperm RNA was verified by both RT-PCR and the Bíoanalyzer 2100. These two methods have yieldedsimilar and consistent results. The microarray analysis showed that fresh sperms do not share thesame gene expression profile than frozen ones

Les gènes du chromosomeX sont majoritairement inactivés au cours de la méiose mâle. Chez la souris, seulement 6% d’entre eux sont réactivés au cours des stades post-méiotiques. Parmi eux le gène Uba1X codant pour l’enzyme activatrice de l'ubiquitine, UBA1 qui produit trois transcrits dont deux sont ubiquitaires mais le troisième prédomine dans les cellules post¬-méiotiques : les spermatides. Nos travaux montrent que les 5’UTR, seul différence entre ces trois transcrits, déterminent la localisation et la dose relative des isoformes nucléaire et cytoplasmique de la protéine UBA1. Nous avons mis en évidence chez la souris que le transcrit spermatide-spécifique code pour l'isoforme nucléaire, exprimée fortement dans les spermatides suggérant un rôle de la protéine UBA1 dans la dégradation des histones lors du remodelage chromatinien. Nous avons détecté deux mutations dans la région spermatide-spécifique du gène : une délétion de 13pb et une transition G>A, chacune portée par un patient infertile, et non retrouvée dans notre population témoin. Les analyses ont montré que la délétion de 13pb induit un épissage anormal du transcrit spermatide-spécifique et que la transition G>A pouvait réduire le taux d’expression du transcrit spermatide-spécifique. Ces mutations pourraient induire l'infertilité des deux patients. En parallèle nous avons pu démontrer que les mutations dans le gène codant pour la protamine PRM1 décrites dans la littérature c.102G>T et c.-107G>C ne sont pas liées à l'infertilité masculine et que le variant est un polymorphisme fréquemment retrouvé dans la population congolaise
The majority of genes on the X chromosome are repressed during meiosis and only 6% of them are expressed in post meiotic germ cells. One of these genes is Ubal, encoding the ubiquitin-activating enzyme UBA1. Ubal produces three different transcripts, two of which are ubiquitously expressed while the third is predominant in the post meiotic germ cells: the spermatids. Our study shows that the 5’UTR, which is the only difference between these transcripts, determines the localization and the relative dose of the nuclear and cytoplasmic isoform of the UBA1 protein. The spermatid-specific transcript encodes for the nuclear isoform in the spermatids in the mouse suggesting that the UBA1 protein is implicated in chromatin remodeling during spermiogenesis. We have detected two mutations in the spermatid-specific region of the UBA1 gene in two infertile men: a deletion of 13bp and a G>A transition, neither of which was found in our cohort of fertile men. The deletion of 13bp diminishes the correct splicing of the spermatid-specific transcript and that the G>A transition may reduce expression of the spermatid-specific transcript. These results show that the UBA1 gene is involved in spermiogenesis, and reactivated in spermatids by its spermatid-specific transcript and that the mutations identified may induce infertility by reducing UBA1 levels in spermatids. We have also demonstrated that two variants described in the protamine codant gene PRM1C.102G>T and c.-107G>C are clearly not associated with male infertility and that the c.-107G>C is polymorphism frequently found in the congolese population

Cette recherche est née de la constatation clinique de l'existence d'événements traumatiques dans la filiation de certains hommes souffrant d'infertilité en particulier dans la filiation de certains hommes souffrant d'infertilité en particulier dans la branche paternelle; il s'agira de déterminer si le projet de devenir père pourrait être entravée par les difficultés d'identification qui en résultent. L'approche psychodynamique sera consacrée à approcher le lien entre l'impact psychique de ces événements et la survenue d'une infertilité
The object of this study is the history of a set of infertile men through a filiation grid, based on psychoanalytical approach ; it examines the genealogical tree and applies the filiation grid to a sample of 30 înfertle men met in art departement cornpared to a reference group. The resuit shows a statistical difference in the two population. We can therefore assume than in the past génération play a part in some case of infertility

Récemment, il a été émis l'hypothèse que la mort cellulaire des spermatozoïdes par apoptose puisse représenter une cause d'infertilité masculine et par conséquent, que les événements apoptotiques présents dans les spermes éjaculés seraient potentiellement de nouveaux marqueurs diagnostiques de l'infertilité masculine utilisables pour orienter les choix des techniques d'assistance médicale à la procréation. L'objectif de ce travail a été de tester cette hypothèse sur des échantillons de spermes provenant de patients infertiles enrôlés dans des protocoles de fécondation in vitro (FIV). Pour se faire, dans un premier temps, l'analyse en cytométrie de flux des stigmates apoptotiques classiques de cellules somatiques (chute du potentiel de membrane mitochondriale (dpm), génération de substances réactives de l'oxygène, fragmentation de l'ADN et perte de viabilité) a été réalisée en parallèle de l'analyse conventionnelle du spermogramme. Nous avons ainsi observé que parmi ces marqueurs apoptotiques, la détermination du dpm représentait le test le plus sensible pour évaluer la qualité des spermes de patients infertiles puisque le pourcentage de spermatozoïdes à dpm élevé était fortement corrélé à la mobilité fléchante et aux taux de fécondation après FIV. Nous avons ensuite pu démontrer que la détection par cytométrie en flux des caspases actives -des enzymes impliquées dans l'apoptose des cellules somatiques- dans les spermes éjaculés est également le reflet de la qualité des spermatozoïdes. Pleinement convaincus de l'utilité de la détection des marqueurs apoptotiques dans les spermes de patients infertiles, notre attention s'est ensuite focalisée sur la mise en place de conditions optimales pour détecter de manière fiable les variations du dpm au laboratoire de biologie de la reproduction. Nos résultats indiquent que plusieurs fluorochromes sont utilisables de manière identique pour détecter avec précision les variations du dpm dans les spermatozoïdes en cytométrie de flux, leur choix dépendant de leurs caractéristiques spectrales afin de les utiliser pour des marquages multiparamétriques. Encouragés par ces résultats, nous avons souhaité caractériser les capacités fécondantes des spermatozoïdes en fonction de leur dpm. En utilisant le tri cellulaire par cytométrie, nous avons montré que les spermatozoïdes viables à dpm élevé représentaient une sous population de spermatozoïdes de haute qualité aux capacités élevées de fécondation, puisqu'ils avaient une morphologie normale, une mobilité importante et étaient capables de subir la réaction acrosomique induite par le calcium ionophore. Enfin, nous avons étudié l'influence du pourcentage de spermatozoïdes ayant des mitochondries fonctionnelles, sur le succès des FIV. Nous avons ainsi observé que lorsque l'éjaculat présente moins de 64 % des spermatozoïdes avec un dpm élevé, aucune grossesse n'est observée après FIV. En conclusion, notre travail démontre l'intérêt de développer l'évaluation des marqueurs apoptotiques au laboratoire de biologie de la reproduction et en particulier, la détermination du dpm dans les spermes éjaculés fournit une information précise capable d'identifier les patients à au risque d'échec de FIV.

L’infertilité est considérée actuellement par l’organisation mondiale de la santé (OMS) comme une préoccupation majeure de santé affectant plus de 50 millions de couples dans le monde. Dans les pays occidentaux, la majorité des couples infertiles ont recours aux techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP) pour obtenir une grossesse. Malgré le succès de ces techniques, près de la moitié des couples qui ont recours à l’AMP sortent du parcours de soin sans enfant. Une partie de ces échecs est expliquée par l’altération de la gamétogenèse. Chez l’homme, la spermatogenèse fait interagir des centaines de gènes spécifiquement exprimés dans le testicule. L’abondance de ces gènes suggère que les troubles de la spermatogenèse présentent une forte composante génétique. Récemment, les avancées techniques ont favorisé l’identification de gènes responsables de ces anomalies mais la grande majorité des cas d’infertilité masculine reste classée comme idiopathique. L’objectif de la thèse est d’identifier de nouvelles causes génétiques responsables d’infertilité masculine et d’élucider les mécanismes physiopathologiques associés à ces anomalies.Au cours de ma thèse j’ai participé avec l’équipe GETI (génétique, épigénétique et thérapies de l’infertilité) à l’exploration génétique et moléculaire de deux phénotypes distincts d’anomalies spermatiques liés à des défauts post-méiotiques de la spermatogenèse : une forme rare d’azoospermie non obstructive (ANO) et le phénotype d’anomalies morphologiques multiples du flagelle spermatique (AMMF). Enfin j’ai joué un rôle important dans la création et l’analyse de modèles murins pour caractériser la pathogénie de ces anomalies.L’analyse génétique de deux frères infertiles nés de parents consanguins et présentant une ANO idiopathique associée à un arrêt post-méiotique de la spermatogenèse nous a permis d’identifier un variant homozygote délétère dans le gène SPINK2 qui code pour un inhibiteur de sérine-protéases. L’étude des souris KO pour ce gène nous a permis d’observer que les souris mâles adultes sont infertiles et miment parfaitement les phénotypes spermatique et testiculaire observés chez nos patients. Nous avons montré que la protéine codée par ce gène est exprimée dans l’acrosome à partir du stade de spermatide ronde. En l’absence de Spink2, l’activité protéolytique non-neutralisée des protéases cibles qui transitent par le Golgi cause sa fragmentation et bloque la spermiogénèse au stade de spermatide ronde. Nous avons également pu observer que les spermatozoïdes provenant de patients et de souris hétérozygotes présentent un taux élevé d’anomalies morphologiques et une baisse de la mobilité progressive conduisant à une hypofertilité à expressivité variable. Ces résultats montrent pour la première fois que l’oligo-tératozoospermie et l’azoospermie peuvent constituer un continuum pathologique dû à une même pathogénie.Nous avons également réalisé le séquençage exomique complet d’une cohorte de 78 individus AMMF non apparentés et avons identifié chez 49 sujets des mutations bi-alléliques délétères dans 11 gènes candidats dont DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 et FSIP2, soit un rendement diagnostique de 63%. Ces résultats confirment l’hétérogénéité génétique du phénotype MMAF et l’efficacité diagnostique du séquençage haut débit dans son exploration. Nous avons également validé l’implication de certains gènes candidats (n=4) dans ce phénotype chez le modèle murin knock-out créé par la nouvelle technologie d’édition du génome, CRISPR/Cas9.Dans son ensemble, ce travail montre l’intérêt et l’efficacité de la combinaison du séquençage exomique et de la technique de CRISPR/Cas9 pour étudier les troubles de la spermatogenèse et l’infertilité masculine
Infertility is currently considered by the World Health Organization (WHO) as a major health concern affecting more than 50 million couples worldwide. In western countries, the majority of infertile couples seek assisted reproductive technologies (ART) to achieve a pregnancy. Despite the success of these techniques, almost half of these couples fail to obtain a child. Part of these failures are explained by the alteration of gametogenesis. In humans, spermatogenesis involves hundreds of genes specifically expressed in the testis. The abundance of these genes suggests that spermatogenic defects are associated with a strong genetic component. Recently, technical advances have led to the identification of numerous causative genes, but the vast majority of male infertility cases remain idiopathic. The aim of the present thesis is to identify new genetic causes responsible for male infertility and to elucidate the physiopathological mechanisms associated with these anomalies.During my thesis, I participated with the team GETI (genetics, epigenetics and therapies of infertility) in the genetic exploration of two phenotypes of male infertility related to post-meiotic defects of spermatogenesis: a rare form of non-obstructive azoospermia and the phenotype of multiple morphological abnormalities of the sperm flagella (MMAF). I have also played a key role in creation and analysis of transgenic mice to better characterize the pathogeny of the identified genetic causes in Human.Genetic analyses performed on two infertile brothers born form consanguineous parents and presenting an-idiopathic non-obstructive azoospermia associated with a post-meiotic arrest of spermatogenesis allowed us to identify a homozygous variant in the SPINK2 gene that encodes a serine-protease inhibitor. Phenotypic analysis of Spink2-/- adult male mice showed that they are infertile and perfectly mimic the sperm and testicular phenotypes observed in our patients. We showed that Spink2 protein is expressed from the round spermatid stage and localized in the acrosome, a lysosomal-like vesicle rich in proteases that play a key role during fertilization. When Spink2 is absent, the deregulated proteolytic activity of the targeted proteases such as acrosin leads to the fragmentation of the Golgi apparatus and arrest of spermiogenesis at the round spermatid stage. We also showed that sperm from heterozygous human and mice present a high level of morphological abnormalities and a decrease of progressive motility leading to a variable subfertility. These results showed for the first time that oligo-teratozoospermia and azoospermia could present a pathological continuum due to the same pathogeny.We also performed exome sequencing in a cohort of 78 non related MMAF subjects and identified in 49 cases deleterious bi-allelic mutations in a total of 11 candidate genes including DNAH1, CFAP43, CFAP44, WDR66 and FSIP2 giving a genetic diagnosis yield of 63%. These results confirm the genetic heterogeneity of MMAF and the efficiency of high throughput sequencing in genetic exploration of this phenotype. We also demonstrated the pathogenic implication of certain candidate genes (n=4) using knock-out mice created by the new technology of genome editing, CRISPR/Cas9.Overall, this work demonstrates the interest and effectiveness of combining exome sequencing and CRISPR/Cas9 system to study spermatogenesis disorders and male infertility

L'infertilité masculine concerne plus de 20 millions d'homme à travers le monde et représente un véritable enjeu de santé public. Bien que multifactorielle, l'infertilité masculine a une composante génétique importante qui jusqu'à présent n'a été que peu étudiée. L'objectif de mon travail a été d'initier et de poursuivre les investigations génétiques sur trois phénotypes de tératozoospermie: les spermatozoïdes macrocéphales, la globozoospermie et les anomalies morphologiques multiples des flagelles (AMMF).Pour le premier phénotype, nous avons étudié 87 patients, dont 83 cas-index, présentant un phénotype de macrozoospermie. Nous avons trouvé la mutation c.144delC dans le gène AURKC chez 82% des patients (68/83) confirmant qu'il s'agit de l'évènement génétique prépondérant pour ce phénotype. Une nouvelle mutation récurrente, p.Y248*, entrainant la dégradation totale du transcrit anormal par nonsense-mediated mRNA decay, a été retrouvée chez 10 patients non‐apparentés. L'identification de deux mutations ancestrales dans AURKC maintenues au cours de l'évolution malgré leur effet délétère sur la reproduction chez l'homme homozygote, ouvre la question d'un potentiel avantage sélectif procuré par l'haplo-insuffisance d'AURKC.Pour le second phénotype, nous avons analysé une cohorte de 34 patients globozoospermiques par séquençage et MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification). Au total, la délétion homozygote de DPY19L2 a été retrouvée chez 22 patients sur 30 cas non apparentés (73.3%) et 3 nouvelles mutations ponctuelles ont été identifiées. Ces résultats indiquent que l'analyse moléculaire de DPY19L2 des patients globozoospermiques ne devrait pas être limitée à la recherche de la délétion homozygote de DPY19L2. Dans un second temps, nous avons démontré que la délétion récurrente de DPY19L2 était médiée par le mécanisme de recombinaison homologue non allélique (NAHR) entre deux séquences répétées homologues (LCR) de 28kb situées de chaque côté du gène. La très grande majorité des points de cassure surviennent dans une région de 1,2 kb située dans la partie centrale des LCRs. Cette région minimale de recombinaison est elle‐même centrée sur une séquence consensus de 13 nucléotides reconnue par PRDM9, une protéine à doigts de zinc qui favorise la survenue des cassures doubles brins initiant les processus de recombinaisons. Les modèles théoriques prédisent que, lors de la méiose, le mécanisme NAHR génère de novo plus d'allèles recombinés délétés que dupliqués. Étonnamment, dans la population générale les allèles DPY19L2 dupliqués sont trois fois plus fréquents que les allèles délétés. Nous avons développé une PCR digitale sur le sperme afin de mesurer le taux de délétions et de duplications de novo à ce locus chez des témoins. Tel qu'il était prédit par le modèle de NAHR, nous avons identifié un taux de délétions supérieur à celui des duplications. Ce paradoxe peut s'expliquer par la sélection qui s'opère à l'encontre des hommes infertiles porteurs de la délétion homozygote et potentiellement des hommes porteurs d'une délétion hétérozygote.Enfin pour le troisième phénotype, nous avons réalisé l'analyse par cartographie par homozygotie de 20 patients infertiles, dont 18 cas-index, présentant des anomalies morphologiques du flagelle. Cinq mutations homozygotes ont été identifiées dans le gène DNAH1 parmi les 18 patients non-apparentés (28%). Ce gène code pour une chaine lourde des bras internes de dynéine exprimée dans le testicule. Des analyses d'immunofluorescence et de RT-PCR ont confirmé le caractère pathogène d'une de ces mutations situées sur un site donneur d'épissage. Les analyses par microscopie électronique ont révélé une désorganisation générale de l'axonème incluant une disparition des doublets centraux et des bras internes de dynéine suggérant que DNAH1 est une protéine clé dans la biogenèse du flagelle du spermatozoïde
Male infertility affects more than 20 million men worldwide and represents a major health concern. Although multifactorial, male infertility has a strong genetic basis which has so far not been extensively studied. The objectives of my thesis were to initiate and conduct some genetic investigations on three specific phenotypes of teratozoospermia: macrozoospermia, globozoospermia and multiple morphological abnormalities of the flagella (MMAF).For the first phenotype, we studied 87 patients with macrozoospermia, including 83 index cases, and identified c.144delC, a pathogenic mutation in the AURKC gene in 82% of patients (68/83) confirming that this variant is the main cause of macrozoospermia. A new recurrent mutation, p.Y248*, leading to degradation of the mutant transcripts by non-sense mediated mRNA decay was identified in 10 unrelated patients. Patients with no identified AURKC mutation have a decreased rate of spermatozoa with a large head and multiple flagella. Identification of two ancestral mutations in AURKC maintained during evolution despite their negative effect on reproduction in homozygous men, raises the question of a potential selective advantage provided by the AURKC haploinsufficiency.For the second phenotype, we first analyzed 34 patients presenting with globozoospermia using MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) and Sanger sequencing. In total, 22 of the 30 unrelated patients where homozygous for the DPY19L2 deletion (73.3%) and 3 novel point mutations were identified. These results suggest that the molecular investigation of the DPY19L2 gene in globozoospermic patients should not be limited to the detection of the DPY19L2 genomic deletion and open interesting perspectives for the identification of DPY19L2 partners during acrosome biogenesis. Subsequently, we demonstrated that the genomic deletion was mediated by Non-Allelic Homologous Recombination (NAHR) between two homologous 28-Kb Low Copy Repeats (LCRs) located on each side of the gene. The vast majority of genomic breakpoints fell within a 1.2-Kb region central to the 28-Kb LCR. A 13-mer consensus sequence is located in the centre of that 1.2-Kb region recognized by PRDM9, a multi-unit zinc finger binding protein that promotes the formation of double-strand breaks (DSBs) initiating the homologous recombination process. The accepted theoretical NAHR model predicts that during meiosis, NAHR produces more deleted than duplicated alleles. Surprisingly, array-CGH data show that, in the general population, DPY19L2 duplicated alleles are approximately three times as frequent as deleted alleles. In order to shed light on this paradox, we developed a sperm-based digital PCR to measure the de novo rates of deletions and duplications at this locus. As predicted by the NAHR model, we identified an excess of de novo deletions over duplications. These discording results may be explained by the purifying selection against sterile, homozygous deleted men. Heterozygous deleted men might also suffer a small fitness penalty.Lastly, for the third phenotype, homozygosity mapping was carried out on a cohort of 20 North African individuals, presenting with primary infertility resulting from impaired sperm motility caused by a mosaic of multiple morphological abnormalities of the flagella (MMAF). Five unrelated subjects out of 18 (28%) carried a homozygous variant in DNAH1, which encodes an inner dynein heavy chain and is expressed in testis. RT-PCR and immunostaining studies confirmed the pathogenic effect of one of these mutations located on a donor splice site. Electronic microscopy revealed a general axonemal disorganization including mislocalization of the microtubule doublets and loss of the inner dynein arms suggesting that DNAH1 plays a critical role in sperm flagellum biogenesis and assembly

Ce travail rapporte l'étude d'une population d'hommes présentant une infertilité dans le contexte d'une demande d'AMP [aide médicale à la procréation]. L'étude moléculaire du bras long du chromosome Y, dans la région AZF, montre la fréquence non négligeable des microdélétions de cette région, justifiant la proposition de cette analyse dans tous les cas d'infertilité sévère inexpliquée. Les délétions complètes de la région AZFa sont identifiées avec une fréquence supérieure aux données de la littérature, associées à une azoospermie sécrétoire. L'existence de délétions partielles de la région AZFb et AZFc est montrée : les délétions partielles proximales AZFb sont rares et le phénotype associé mérite d'être exploré plus avant. Ce travail montre l'intérêt de la mise en œuvre de la PCR [polymerase chain reaction] quantitative en temps réel pour la détection des délétions et des duplications partielles de la région AZFc. Ces résultats sont comparés et discutés en fonction des données concernant la cartographie et la pathologie moléculaire de l'Y
The study of an infertile male population seeking for Assisted Reproductive Technology is reported. Molecular study of the long arm of the Y chromosome, in AZF region, shows a relatively high ftequency of microdeletions, reflecting and confirming the interest of such an analysis in severe unexplained male infertility. Complete AZFa deletions are detected with a higher ftequency compared to literature data, essentially in non-obstructive azoospermia. Moreover, partial AZFb and AZFc deletions are detected: partial ptoximal AZFb deletions are rare and the associated phenotype has to be delimited. This work shows the interest of real-time PCR [polymerase chain reaction] technique to detect partial deletions or duplications of the AZFc region. The results are discussed following available data regarding mapping and molecular pathology of the Y chromosome

L’infertilité masculine est actuellement considérée comme un problème majeur qui pose une situation alarmante sur la santé publique. L’oligozoospermie, l’asthénozoospermie et la tératozoospermie sont les trois anomalies les plus connues des spermatozoïdes. Elles affectent, respectivement, la densité, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes. Un spermatozoïde anormal est très souvent corrélé à des altérations génétiques et épigénétiques qui peuvent affecter considérablement le transcriptome. Dans ce sens, le séquençage aléatoire du transcriptome entier des spermatozoïdes ou RNA-seq constitue un outil puissant pour caractériser ces maladies. Jusqu’à présent, il n’existe aucune étude exploitant des données RNA-seq chez des hommes présentant de telles anomalies spermatiques. L’objectif principal de notre étude fût d’identifier des profils distincts des modifications du transcriptome de chaque phénotype d’infertilité pour ainsi révéler des gènes-signatures qui tamponnent une spermatogenèse pathologiquePour ce faire, les transcriptomes des spermatozoïdes de 60 sujets infertiles atteints soit d’oligozoospermie, d’asthénozoospermie ou de tératozoospermie ont été comparés à ceux de 20 patients fertiles. Ces analyses supervisées nous ont conduit à identifier: (i) les gènes clés spécifiques aux différentes anomalies des spermatozoïdes (ii) les voies de signalisation associées, (ii) les différents longs ARNs non codants dérégulés dans ces anomalies. Au niveau de l’oligozoospermie, les transcrits de spermatozoïdes dérégulés étaient associées à divers stades de la spermatogenèse, y compris le cycle cellulaire méiotique, l’assemblage du complexe synaptonémal, la cohésion des chromatides sœurs, les processus métaboliques de piRNA, le processus catabolique protéique dépendant de la voie de l’ubiquitine, à la réponse aux dommages de l'ADN et particulièrement le processus de fécondation. Quant à l’asthenozoospermia, la spermatogenèse, l’assemblage du cil, des voies métaboliques reliées à la spermatogenèse, la chimiotaxie et la physiologie des cellules immunitaires ont été significativement dérégulés. De plus, ce qui nous a intéressé au plus était l’analyse des transcrits sous-exprimés qui a permis l’identification de nombreux transcrits associées aux modifications des histones. Nous avons aussi mis en évidence une sous expression des gènes différentiellement exprimés qui définit la tératozoospermie. Cette sous expression est associée au système ubiquitine-protéasome, à l’organisation du cytosquelette, au cycle cellulaire, à la SUMOylation en réponse aux dommages de l'ADN et aux protéines de réparation ainsi qu’à de nombreux modulateurs épigénétiques. Les gènes signature de l'oligozoospermie ont été liés au processus de fécondation et les composants de la matrice extracellulaire, tandis que ceux de la tératozoospermie sont liés à la spermatogenèse et la morphogenèse cellulaire, alors que les gènes signature de l'asthénozoospermie sont impliqués dans l'assemblage du ribosome et du flagelle. En complément de cette étude, nous avons réalisé une étude très globale du paysage épigénétique du sperme des hommes infertiles. Nous avons, ainsi comparé les niveaux des espèces réactives de l’oxygène (ERO), de méthylation de l’ADN, ainsi que l’intégrité de la chromatine dans les spermatozoïdes de 30 individus infertiles avec ceux de 33 individus fertiles. Nos analyses montrent des niveaux élevés d’ERO chez les individus infertiles. Ces niveaux sont d’une part négativement corrélés avec les niveaux de méthylation globale de l’ADN et d’autre part négativement corrélés avec ceux de la 5-hydroxyméthylcytosine et de la 5-formylcytosine (intermédiaire dans le processus de déméthylation active). Ces derniers suggèrent qu’une infertilité associée au stress oxydatif conditionne l’épigénome du sperme. En conclusion, l’ensemble de notre travail apporte des ressources précieuses et originales dans la compréhension des pathologies de sperme
Male infertility is actually considered as a public alarming health problem. The sperm pathologies spectrum ranges between different phenotypes including oligozoospermia, asthenozoospermia and teratozoospermia depending on the sperm conventional parameters abnormalities. Abnormal sperm is characterized by genetic alterations and epigenetic alterations which can affect the transcriptome extensively. These alterations in RNA profiles are retrospectively indicative of aberrant spermatogenic events. RNA-seq is a powerful tool for comprehensive characterization of whole transcriptome. To date, RNA-seq analysis of sperm from infertile men has not been reported. Our objectives are: (i) recognize key clusters, key pathways and specific gene transcripts for different sperm abnormalities; (ii) catalog the spermatozoal lncRNAs in different sperm pathologies; (iii) identify signature genes which are mechanistically important in the cascade of events driving a pathological spermatogenesis; (iii) portray the global epigenetic landscape in sperm from infertile men. Expression data from 60 sperm samples from 3 groups of infertile men (oligozoospermia, asthenozoospermia, and teratozoospermia) were generated on Illumina HiSeq platform, compared to 20 fertiles, and the resulting gene expression patterns were analyzed for functional enrichment. Our supervised analyses identified numerous differentially expressed genes between fertile and infertile men. In oligozoospermia, the deregulated spermatozoal transcripts were associated with various stages of spermatogenesis including meiotic cell cycle, synaptonemal complex assembly, sister chromatid cohesion, piRNA metabolic process, ubiquitin-dependent protein catabolic process, cellular response to DNA damage stimulus and interestingly fertilization. As for asthenozoospermia, spermatogenesis, cilium assembly, metabolic-related pathways, chemotaxis and immune cell physiology were most significantly differentially expressed. Interestingly, numerous transcripts associated with histone modifications were highly down-regulated. With regards to teratozoospermia, we evidenced sperm-specific differentially expressed genes which are involved in the ubiquitin-proteasome, cytoskeleton organization, the cell cycle pathway, SUMOylation of DNA damage response and repair proteins, as well as many putative epigenetic modulators of gene expression.. We also attempted to identify distinct patterns of gene expression changes that were definite to the different abnormal sperm phenotypes in infertile men relative to controls. Signature genes of oligozoospermia were over-enriched by genes involved in fertilization and extracellular matrix components, while signature genes of teratozoospermia were enriched by genes involved in spermatogenesis and cellular components involved in morphogenesis, whilst signature genes of asthenozoospermia were enriched by genes implicated in ribosome and cilium assembly.We complemented this work by a parallel epigenetic analysis of the global epigenetic landscape in infertile men. We compared the levels of reactive oxygen species (ROS), DNA integrity and global epigenetic parameters in sperm from 33 infertile subjects with abnormal semen parameters compared to fertile individuals. We pointed out that infertile men are characterized by strikingly high levels of reactive oxygen species (ROS) which were in part negatively correlated with the global DNA methylation, and positively correlated with the levels of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine (active demethylation intermediates). These findings suggest that male infertility associated with oxidative stress shapes the sperm epigenetic landscape. In summary, this original work yielded a transcriptional portrait of sperm abnormalities and provided valuable resources that would further elucidate sperm pathologies

La morphogénèse des spermatozoïdes a lieu pendant la spermiogénèse, la dernière phase de la spermatogenèse.Cette différenciation est accompagnée de modifications drastiques de l’enveloppe nucléaire associées à un fort remodelage chromatinien. Notre travail été centré sur l'enveloppe nucléaire des spermatides pendant la spermiogénèse humaine. Nous avons notamment caractérisé la lamina nucléaire, réseau protéique composant de l’enveloppe nucléaire, et ses protéines partenaires potentiellement impliqués dans les liaisons lamine-chromatine: les protéines à domaine LEM, LBR, la protéine chromatinienne BAF et BAF-L.Nous avons révélé la présence exclusive des lamines de type B concentrées au pôle postérieur à la fin de la spermiogénèse dans les spermatozoïdes, et nous avons identifié et caractérisé l’isoforme testicule-spécifique lamine B3 humain.Nous avons découvert et caractérisé la lamine A2, un isoforme méiotique du gène LMNA, chez l'homme et la souris.Nous avons ensuite étudié ces protéines chez des patients atteints de globozoospermie, et nous avons pu identifier BAF comme un nouveau biomarqueur de l’immaturité des noyaux de spermatozoïdes. Par ailleurs, nous avons identifié la deuxième mutation perte de fonction dans le gène SUN5 chez 3 patients apparentés, et validé son implication dans la mise en place de la jonction tête-flagelle des spermatozoïdes.Notre caractérisation de la lamina nucléaire et ses protéines partenaires au cours de la spermiogénèse humaine apporte une meilleure compréhension de son rôle dans la différenciation des spermatides en spermatozoïdeset peut être la base de nouveaux champs d’investigation cas d’infertilité liés à des anomalies nucléaires
The morphogenesis of mature spermatozoa takes place during spermiogenesis, the last phase of spermatogenesis.This differentiation involves drastic changes in the nuclear envelope associated with profound chromatin remodelling.Our work was focused on the nuclear envelope of spermatids during human spermatogenesis.We have characterized, the nuclear lamina, a protein meshwork component of the nuclear envelope, and its protein partners potentially implicated in the linkage lamin-chromatin: LEM-domain proteins, LBR, chromatinien protein BAF and BAF-L.Our study revealed the exclusive presence of B-type lamins concentrated at the posterior pole of mature spermatozoaat the end of spermiogenisis and we have identified and characterised the testis-specific isoform lamin B3 in human.We have also discovered and characterized the lamin A2, a meiotic isoform expressed from the LMNA gene in human and mouse. By studying abnormal globozoospermic spermatozoa, we were able to identify BAF as a potential biomarker of spermatozoa nucleus immaturity.Moreover, we have identified the second loss-of-function mutation in the nuclear envelope protein SUN5 in three related patients, and thus demonstrated its involvement in the formation of the spermatozoa head-tail junction.Our characterization of the nuclear lamina and its protein partners during human spermiogenesis, provides a better understanding of its role in the differentiation of spermatids into spermatozoa, and provides a solid basis for future investigation of cases of male infertility related to nuclear anomalies

La spermatogenèse est un processus complexe qui dépend de la coopération de nombreux gènes. Son produit final le spermatozoïde, est un sujet d’étude idéal car il renferme à la fois des indices d’événements passés ainsi que des informations qui seront transmises à l'ovocyte lors de la fécondation. L'identification de nouveaux acteurs de la spermatogenèse, des modifications spécifiques de l'ADN du sperme ou la présence de transcrits spécifiques pourraient servir comme biomarqueurs dans le diagnostic de l’infertilité. Cette thèse avait pour but d’analyser le génome, le transcriptome et l’épigénome de spermatozoïdes dans le contexte de l'infertilité masculine. Nous avons identifié de nouvelles causes génétiques et confirmé la présence d'anomalies de méthylation dans le sperme d'hommes infertiles. Nous avons découvert 20 mutations dans le gène SOX8, chez des patients atteints de trouble du développement sexuel ou d'infertilité masculine ou féminine, qui apparaît comme un régulateur du développement et de la fonction gonadique. Par séquençage d’exome, une mutation dans le gène ATAD2 modeleur de la chromatine spécifique de la lignée germinale mâle fut également identifiée. Par RNA-seq et MeDIP-chIP du sperme d’hommes fertiles et infertiles, nous avons caractérisé la signature transcriptionnelle du sperme. La majorité des ARNs spermatiques humain est remarquablement conservée chez les mammifères placentaires suggérant des fonctions ancestrales importantes. Enfin, nos données transcriptomiques et épigénétiques tendent à indiquer qu’une expression et une régulation adéquates des gènes impliqués dans le remodelage de la chromatine constituent un facteur clé pour la fertilité masculine
Spermatogenesis is a complex process which depends on the cooperation of many genes. The end-product, the spermatozoon, is an ideal subject for study since it carries both clues of the past events and information which will be transmitted to the oocyte at fertilization. The identification of main actors of spermatogenesis, specific modifications of sperm DNAs or sperm specific isoforms could improve our understanding of a such complex mechanism and could serve as a determination of biomarkers or diagnostic tools for fertility. The aim of the project was to go further three omes: genome, epigenome and transcriptome of mature human sperm in the context of male infertility. We identified new genetic causes of male infertility and confirmed the presence of methylation abnormalities in sperm cells of infertile men. Firstly, SOX8 gene was found mutated in a cohort of 20 patients with disorder of sex development and male or female infertility. Similarly, to NR5A1, SOX8 appears to be a novel regulator of gonadal development and function. Then by exome-sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in the male germline-specific chromatin modeler ATAD2. Furthermore, RNA-seq and MeDIP-chIP of sperm from fertile and infertile men along with bioinformatics analyzes of the generated data, enabled us to characterize more deeply the normal sperm transcriptional signature. We also found that the majority of human sperm RNAs are remarkably preserved in placental mammals suggesting crucial ancestral functions. Finally, proper expression and regulation of chromatin remodelers seem to be critical for male fertility, as revealed by both the transcriptomic and the epigenetic data

Près de 15% des couples sont confrontés à des problèmes d'infertilité. Dans près de la moitié des cas, une composante masculine est retrouvée, avec souvent une anomalie des paramètres du spermogramme montrant une diminution de la qualité du sperme. L'étiologie de la grande majorité des infertilités masculines reste inconnue et une origine génétique est probablement responsable d'une proportion importante des troubles de la spermatogénèse. Ce travail comporte deux parties: dans la 1ère partie, l'analyse d'une large cohorte de patients (n=87), nous a permis d'identifier deux nouvelles mutations du gène AURKC. La mutation [c.36-2A>G] a été identifiée uniquement à l'état hétérozygote chez deux frères et le 2ème variant identifié [p.Y248*]: est une mutation récurrente retrouvée chez 11 patients non apparenté d'origine maghrébine et européenne. La 2ème partie de notre étude a été réalisée sur 20 patients infertiles présentant un phénotype homogène d'anomalies flagellaire de type flagelles courts, absents et de calibre irrégulier associé a une asthénozoospermie. Nous avons appliqué la stratégie d'homozygotie par filiation qui a permis de mettre en évidence deux régions d'homozygoties communes: la 1ère région, située sur le chromosome 3, est commune à 9/20 patients et la 2ème sur le chromosome 20 commune à 13/20 patients. Trois gènes candidats présents dans ces régions ont été sélectionnés : les gènes KIF9, SPAG4 et DNAH1. Le séquençage du gène DNAH1 a permis de mettre en évidence des mutations de type faux-sens [c.3877G>A], run-on [c.12796 T>C] et d'épissage [c.5094+1G>A] [c.11958-1G>A]. L'absence de la protéine DNAH1 a pu être mise en évidence par immunomarquage sur les spermatozoïdes d'un patients porteur de la mutation [c.11958-1G>A] et confirme la dégradation du transcrit muté par NMD également observé. Les analyses par microscopie électronique sur les spermatozoïdes d'un patient de la cohorte ont permis de mettre en évidence des anomalies de la structure de l'axonème. Cette étude précise le diagnostic d'infertilité masculine et élargit les connaissances sur les gènes impliquées dans la spermatogenèse.

La région AZFc du bras long du chromosome Y est une des régions les moins stables du génome humain. Elle est composée de multiples palindromes entraînant différents types de réarrangements, dont certains seraient associés à l'infertilité masculine. Nous avons recherché les microréarrangements d'AZFc dans 2 populations : 344 hommes infertiles et 136 hommes d'une population contrôle (119 normospermiques et 17 présentant une azoospermie de type obstructif). Nous avons observé une fréquence élevée de remaniements génomiques (8,7%), avec des fréquences de délétions et de duplications similaires dans les deux populations. Les remaniements ont ensuite été caractérisés au niveau des gènes DAZ et CDY1 et au niveau des haplogroupes du chromosome Y. Nous avons également étudié l'expression des gènes de la famille DAZ par RT-PCR [reverse transcription-polymerase chain reaction] quantitative « en temps réel» à partir de 30 biopsies testiculaires présentant des situations d'infertilité masculine bien identifiées. Différents profils d'expression ont été obtenus en fonction des gènes et des pathologies de la fertilité
The AZFc region on the Y chromosome long arm is one of the most unstable regions in the human genome. It consists almost entirely of very long repeats, is prone to rearrangement and some of them have been reported to be associated with male infertility. We screened two populations: 344 infertile patients and 136 controls for AZFc microrearrangements and we observed a high frequency of genomic rearrangements with similar frequency of deletions and duplications in both populations. Rearrangements were then characterized using DAZ and CDY 1 genes analyses and Y chromosome haplogroup determination. We also studied DAZ gene family expression by "real time" quantitative RT-PCR [reverse transcription-polymerase chain reaction] from 30 testicular biopsies presenting distinct histological pictures. Different expression profiles were obtained according to the gene tested and the fertility status

Les chromosomes sexuels subissent pendant la spermatogenèse de multiples modifications qui entrainent d’importantes variations dans le niveau d’expression des gènes qu’ils portent. Notamment, ils sont inactivés au cours de la méiose et la majorité reste réprimé tout au long de la spermiogenèse. Cette étude met en évidence l’existence de transcrits alternatifs particuliers de gènes sur le chromosome X et Y, dont les profils d’expressions témoignent de leur rôle au cours de ces deux phases de la spermatogenèse. Sur le chromosome X nous avons isolé, chez l’homme et chez la souris, trois gènes ubiquitaires (Uba1x, Prdx4, Atp11c) réactivés dans les spermatides via un transcrit alternatif exprimé de façon majoritaire dans les testicules. Le gène Prdx4 code, pour deux isoformes de protéines différentes par leur domaine N-terminal. Nous avons mis au point des anticorps spécifiques de chaque isoforme et nous avons démontré que, chez la souris, le transcrit réactivé est traduit dans les spermatides et produit une protéine dans un compartiment cellulaire distinct de l’autre isofome ubiquitaire. Un total de cinq mutations, affectant ces transcrits exprimés dans les spermatides, ont été retrouvées dans les gènes UBA1X et PRDX4 chez des hommes infertiles. Sur le chromosome Y chez la souris, nous avons étudié les gènes Zfy1 et Zfy2, deux homologues testicules spécifiques codant pour des protéines à doigt de zinc avec un long domaine d’activation. Zfy2, mais pas Zfy1, promeut l’élimination apoptotique des spermatocytes contenant un chromosome X univalent. Nous avons identifié un transcrit alternatif du gène testicule spécifique Zfy1 exprimé dans les spermatocytes et les spermatides. La protéine putative issue de ce transcrit, possédant un domaine acidique réduit de moitié qui pourrait être à l’origine des différences fonctionnelles entre les gènes homologues Zfy1 et Zfy2 au cours de la méiose murine. Chez l’homme, l’orthologue de ces gènes ZFY est ubiquitaire et nous avons montré qu’il produisait un transcrit alternatif testicule spécifique, codant une protéine avec le même domaine acidique raccourci que Zfy1. Nos données indiquent que ce transcrit alternatif est prédominant dans les spermatocytes et les spermatides chez l’homme et chez la souris. Ces résultats apportent la première évidence d’une fonction du gène ZFY au cours de la spermatogenèse chez l’homme et de son implication possible dans la fertilité masculine
Sex chromosomes undergo many modifications during spermatogenesis, leading to dramatic variations in the expression levels of their genes. In particular, they are inactivated during meiosis with most genes remain silent throughout spermiogenesis. Our study describes specific alternative transcripts produced by X and Y chromosome genes, whose expression indicates roles in early spermatocytes (meiosis) and in spermatids (spermiogenesis). On the X chromosome, we have shown that three widely transcribed genes, Uba1x, Prdx4, and Atp11c, are reactivated in mouse and human spermatids via an alternative transcript that is expressed mainly in the testis. The Prdx4 gene codes two isoforms of the peroxiredoxin 4 that differ in their N-terminal domain. We have raised antibodies specific for each PRDX4 isoform and demonstrate, in mouse, that the reactivated transcript is translated in spermatids, producing a protein in a distinct cellular compartment from the ubiquitous isoform. Altogether, five mutations, affecting the spermatid-reactivated transcripts uniquely, of UBA1x and PRDX4, have been found specifically in our group of infertile men. On the mouse Y chromosome, we have studied Zfy1 and Zfy2, nearly identical testis specific zinc finger genes with long acidic (activation) domains. Zfy2, but not Zfy1, promotes the apoptotic elimination of spermatocytes with an unpaired X chromosome. We have identified an alternatively spliced transcript of Zfy1 that lacks half the acidic domain, and could explain the functional difference between Zfy1 and Zfy2. In human, the ZFY gene is widely transcribed, but we show that ZFY produces a testis specific variant transcript, encoding the same short acidic domain as Zfy1. Our data indicate that the alternative transcripts predominate in spermatocytes and spermatids, in both human and mouse. This provides the first evidence that human ZFY may play a conserved role during spermatogenesis, and contribute to human male fertility

Le génotypage d'une famille jordanienne consanguine constituée de 5 frères globozoospermiques et de 3 frères fertiles sur puce Affymetrix, a permis d'identifier un nouveau gène responsable de la globozoospermie situé dans un intervalle de 6.4Mb en 12q14.2. Au regard de son expression prédominante dans le testicule et l'implication de son orthologue, chez C. elegans, dans la polarisation cellulaire, le gène DPY19L2 est un gène candidat parfait. Le gène, codant pour une protéine transmembranaire, est flanqué par deux séquences répétées (LCRs) qui partagent 96,5% d'identité. Dans une première étude, une délétion de 200Kb englobant l'ensemble du gène a été mise en évidence chez les 4 frères infertiles de cette famille jordanienne ainsi que chez 3 autres patients non apparentés. Nous avons ensuite recruté une plus grande cohorte de 54 patients. Parmi ces patients, 20 sont homozygotes pour la délétion de DPY19L2 et 7 sont hétérozygotes composites associant la délétion hétérozygote et une mutation ponctuelle. En outre, nous avons identifié, 4 patients avec des mutations ponctuelles homozygotes. Par conséquent, la fréquence d'implication de DPY19L2 s'élève à 66.7%. En tout, 9 points de cassures, regroupés en deux hotspots au sein des LCRs, ont pu être mis en évidence. Ceci confirme que le mécanisme sous-jacent de la délétion est une recombinaison homologue non allélique (NAHR) entre les LCRs. En conclusion, nous confirmons que DPY19L2 est le principal gène de la globozoospermie et nous élargissons le spectre des mutations possible dans ce gène.

La mobilité est une fonction clé de la qualité fécondante et de sélection des spermatozoïdes des techniques d’assistance médicale à la procréation (AMP). Nous manquons cependant d'information des mécanismes moléculaires contrôlant cette mobilité. Ce travail de thèse est articulé autour de 2 protéines d’intérêts impliquées dans la mobilité spermatique: la protéine Tau (Tubule-associated unit) associée à la polymérisation des microtubules dans le neurone, et la protéine d’ancrage aux kinases A4 (AKAP4), protéine majeure de la gaine fibreuse du flagelle spermatique, connue pour son implication dans la mobilité spermatique.Très peu d’études traitent de la protéine Tau dans l’appareil génital masculin, et aucune chez l’homme. Dans une première partie de ce travail, nous avons analysé l’expression de la protéine Tau dans le spermatozoïde et le testicule humain par une approche immuno-histo-chimique (article 1). La protéine Tau est localisée dans la pièce intermédiaire du flagelle du spermatozoïde, et dans le spermatocyte et la spermatide dans le testicule. Les rôles potentiels de la protéine Tau durant la spermatogenèse sont discutés dans une revue de la littérature (article 2).Les avancées dans le domaine de la protéomique permettent aujourd’hui d’étudier le protéome du spermatozoïde et de ses compartiments cellulaires de façon hautement résolutive. Le protéome global du spermatozoïde a été étudié chez des hommes consultant le centre de procréation assistée du CHRU de Lille. Il a permis de définir un groupe de spermatozoïdes présentant majoritairement des protéines de haut poids moléculaire et un groupe présentant une protéolyse aux dépends des protéines de haut poids moléculaire. L’AKAP4 a été identifiée parmi les protéines de hauts poids moléculaire. Nous avons étudié, quantifié le profil d’expression de l’AKAP4 en Western Blot dans le sperme d’hommes venant effectuer un spermogramme et corrélé les données biochimiques du protéome et de l’AKAP4 au spermogramme (article en soumission 3). Le rôle de l’AKAP4 comme marqueur prédictif en AMP est ensuite abordé. Les données clinico-biologiques (logiciel INFOFIV) des tentatives d’AMP au CHRU de Lille ont été confrontées aux données quantitatives du protéome global et de l’AKAP4 (article en préparation 4).Les protéines Tau et AKAP4 sont des protéines d’intérêts dans la prise en charge de l’homme infertile. L’AKAP4 pourrait être proposée comme biomarqueur dans la prise en charge en AMP
Motility is a key function of the fertilizing quality and the selection of sperm for assisted reproductive technology (ART). However, we lack information on molecular mechanisms controlling this mobility. This thesis is structured around 2 proteins of interest involved in sperm mobility: Tau (tubule-associated unit) associated with microtubule polymerization in the neuron, and the A-kinase anchoring protein 4 (AKAP4), the main protein of the fibrous sheath of the sperm’s flagellum, known for its involvement in sperm motility.Very few studies focus on the Tau protein in the male reproductive system, and none in humans. In the first part of this work, we analysed the expression of the Tau protein in the sperm and human testis through an immuno-histo-chemical approach (Article 1). The Tau protein is localized in the intermediate part of the sperm flagellum and in the spermatocyte and spermatid in the testis. The potential roles of the Tau protein during spermatogenesis are discussed in a review of the literature (Article 2).Advances in the field of proteomics now allow the study the proteome of sperm and its cellular compartments in a highly-resolutive way. The global sperm proteome was studied in men visiting the assisted reproduction center of Lille University Hospital. This has led to a group of sperm with predominantly high molecular weight proteins being identified as well as a group having proteolysis at the expense of high molecular weight proteins. The AKAP4 was identified among the high molecular weight proteins. We studied, quantified the profile of AKAP4 expression by Western Blot in the sperm of men undergoing a semen analysis and correlated the biochemical data of the proteome and AKAP4 to the semen analysis (article 3 in submission). The role of AKAP4 as a predictive marker of ART success is then discussed. Clinical and biological data (INFOFIV software) of ART attempts at the Lille University Hospital were compared with quantitative data of the global proteome and AKAP4 (Article 4 in preparation).Tau protein and AKAP4 are proteins of interest in the management of infertile men. The AKAP4 could be proposed as a biomarker in ART treatments

L’épididyme, organe clé de la fertilité masculine, est le lieu de maturation et de stockage des spermatozoïdes. Cependant, l’arrivée massive et tardive de ces cellules à la puberté, longtemps après la mise en place du répertoire du soi, en fait des cibles potentielles pour le système immunitaire qui risque de les détruire. Dans le même temps, l’épididyme est fréquemment la cible d’infections rétrogrades qui, non contrôlées, altèrent la fertilité. Par conséquent, l’épididyme doit mettre en place une réponse immunitaire efficace contre les agents pathogènes tout en établissant une tolérance envers les spermatozoïdes. Une altération de cet équilibre est impliquée dans 10 à 15% des cas d’infertilité masculine. Le testicule a longtemps été considéré, à tort, comme le seul organe possédant une immunité dans le tractus génital mâle, induisant un retard dans l’étude des autres organes, dont l’épididyme.Les travaux menés au cours de cette thèse visaient à compléter les connaissances disponibles sur les acteurs cellulaires et moléculaires potentiellement impliqués dans les mécanismes de maintien de l’équilibre immun dans l’épididyme murin. Mon premier objectif était d’identifier et de quantifier les populations de phagocytes mononucléaires et de lymphocytes, présents dans le tissu en contexte physiologique. J’ai ainsi identifié et localisé trois populations lymphocytaires jamais décrites dans l’épididyme murin. La suite de mes travaux a porté sur l’étude du Transforming growth factor-beta (TGF-β), dont la voie de signalisation est impliquée dans la tolérance aux spermatozoïdes chez la souris, sans que la molécule ou ses récepteurs y soient totalement décrits. Nous avons ainsi montré que les 3 isoformes du TGF-β et de ses récepteurs sont exprimées de manière différentielle tout au long de l’organe, suggérant des rôles variés dans la physiologie épididymaire, en plus de la tolérance aux spermatozoïdes.Ces études ont montré la richesse des mécanismes potentiellement impliqués dans l’équilibre immun épididymaire et offrent de nombreuses pistes de recherche qui viseraient à améliorer les traitements de l’infertilité masculine d’origine immunologique
The epididymis, a key organ of male fertility, is the place of maturation and storage of sperm. However, the massive and late arrival of these cells at puberty, long after the setting of self-tolerance, makes them potential targets for the immune system which risks to destroy them. At the same time, the male genital tract, in contact with the external environment, is frequently challenged by ascending pathogens, which, if not controlled, impair fertility. Therefore, the epididymis must develop an efficient immune response against pathogens while establishing effective tolerance towards sperm. Alteration of this equilibrium is involved in 10 to 15% of male infertility cases. Nevertheless, the immune system of the epididymis has long been neglected compared to that of the testis, due to the common and admittedly mistaken idea that the testis conferred their immune protection to the whole genital tract. The work carried out during this PhD. aimed to strengthen the available knowledge on cellular and molecular actors involved in the maintenance of the immune balance in the murine epididymis. My first objective was to identify and quantify the mononuclear phagocyte and lymphocyte populations present, at steady state, in the tissue. I identified and located three lymphocyte populations never described in the murine epididymis. The rest of my work focused on Transforming growth factor-beta (TGF-β), whose signaling pathway is involved in sperm tolerance in mice, but, its receptors had not been fully described in the organ. We have shown that the three TGF-β isoforms and their receptors are differently expressed throughout the organ, suggesting various roles in epididymal physiology, in addition to sperm tolerance.These studies have shown the diverse potential mechanisms involved in epididymal immune balance and offer many avenues for research to improve treatments of male infertility of immunological origin

La santé reproductive de l'homme est un indicateur de la santé générale de celui-ci. Elle est également intimement liée aux expositions de l'environnement et du milieu de vie. Aujourd'hui, on observe une baisse séculaire de la qualité du sperme et une augmentation des pathologies et malformations de l'appareil reproducteur masculin. L'objectif de ce travail est d'étudier la santé reproductive de l'homme d'un point de vue épidémiologique et par le biais de différents outils statistiques. Nous nous sommes intéressés à l'incidence et aux facteurs de risque du cancer du testicule. Ensuite, nous avons étudié le parcours thérapeutique d'une population d'hommes ayant consulté pour infécondité masculine en analysant la relation entre leurs paramètres du sperme et leurs investigations andrologiques, ainsi que l'issue de leur projet parental. Enfin, l'événement naissance a été analysé en tenant compte de son délai de réalisation en utilisant des modèles de durées de vie incluant la censure à droite : modèles de Cox et arbres de survie. En y associant des techniques de sélection stable de variables (stepwise, pénalisation de type L1, bootstrap) les performances prédictives de ces méthodes ainsi que leur capacité à fournir aux cliniciens un modèle facilement interprétable ont été comparées. Dans le sud de la France, l'incidence du cancer du testicule a doublé au cours des 20 dernières années. L'effet cohorte de naissance, c'est-à-dire l'effet générationnel, suggère un effet délétère des expositions environnementales sur la santé reproductive de l'homme. Toutefois, aucune exposition du milieu de vie de l'homme durant sa vie adulte ne semble être un facteur de risque potentiel de survenue du cancer du testicule, suggérant l'hypothèse d'une exposition à des perturbateurs endocriniens in utero. Actuellement, la responsabilité de l'homme dans des difficultés à concevoir représente 50% des causes d'infertilité. La prise en charge de l'homme est donc essentielle. Dans notre cohorte de couples consultant pour des problèmes d'infertilité, un examen andrologique anormal est observé chez 85% des partenaires masculins. Une relation significative est observée entre l'examen de sperme et l'examen andrologique, suggérant la nécessité de pratiquer des investigations cliniques afin d'identifier les causes d'infertilité masculine. Finalement, un couple sur deux réussit à avoir un enfant. Et l'âge des hommes de plus de 35 ans apparaît comme un facteur de risque majeur, ce qui devrait encourager les couples à entamer leur projet parental le plus tôt possible. En prenant en compte la composante temporelle dans l'issue reproductive de ces couples inféconds, les modèles de durée de vie obtenus sont très souvent instables du fait du grand nombre de covariables. Nous avons intégré des techniques de rééchantillonnage à des approches de sélection de variables. Bien que l'approche Random Survival Forests soit la meilleure en qualité de prévision, ses résultats ne sont pas facilement interprétables. Concernant les autres méthodes, les résultats diffèrent selon la taille de l'échantillon. L'algorithme stepwise intégré au modèle de Cox ne converge pas si le nombre d'événements est trop faible. L'approche qui consiste à choisir la meilleure division en bootstrappant l'échantillon à chaque noeud lors de la construction d'un arbre de survie ne paraît pas avoir une meilleure capacité prédictive qu'un simple arbre de survie quand l'échantillon est suffisamment grand. Finalement, le modèle de Cox avec une sélection de variables par pénalisation de type L1 donne un bon compromis entre facilité d'interprétation et prévision dans le cas de petits échantillons
Male reproductive health is an indicator of his overall health. It is also closely linked to environmental exposures and living habits. Nowadays, surveillance of male fertility shows a secular decline in sperm quality and increased disease and malformations of the male reproductive tract. The objective of this work is to study the male reproductive health in an epidemiologic aspect and through various statistical tools. Initially, we were interested in the pathology of testicular cancer, its incidence and its risk factors. Then, we studied the population of men consulting for male infertility, their andrological examination, their therapeutic care and their parenthood project. Finally, the birth event was analyzed through survival models: the Cox model and the survival trees. We compared different methods of stable selection variables (the stepwise bootstrapped and the bootstrap penalisation L1 method based on Cox model, and the bootstrap node-level stabilization method and random survival forests) in order to obtain a final model easy to interpret and which improve prediction. In South of France, the incidence of testicular cancer doubled over the past 20 years. The birth cohort effect, i. E. The generational effect, suggests a hypothesis of a deleterious effect of environmental exposure on male reproductive health. However, the living environment of man during his adult life does not seem to be a potential risk factor for testicular cancer, suggesting hypothesis of exposure to endocrine disruptors in utero. The responsibility of man for difficulties in conceiving represents 50% of cases of infertility, making the management of male infertility essential. In our cohort, 85% of male partners presented an abnormal clinical examination (either a medical history or the presence of an anomaly in andrological examination). Finally, one in two couples who consulted for male infertility successfully had a child. The age of men over 35 appears to be a major risk factor, which should encourage couples to start their parenthood project earlier. Taking into account the survival time in the reproductive outcome of these infertile couples, the inclusion of large numbers of covariates gives models often unstable. We associated the bootstrap method to variables selection approaches. Although the method of Random Survival Forests is the best in the prediction performance, the results are not easily interpretable. Results are different according to the size of the sample. Based on the Cox model, the stepwise algorithm is inappropriate when the number of events is too small. The bootstrap node-level stabilization method does not seem better in prediction performance than a simple survival tree (difficulty to prune the tree). Finally, the Cox model based on selection variables with the penalisation L1 method seems a good compromise between interpretation and prediction

Parmi les couples avec un projet parental, le facteur masculin d’infertilité est responsable d’environ 20%. Malgré de longues années d’activités d’assistance médicale à la procréation, un nombre important de cas reste idiopathiques. Considérant le nombre élevé des gènes potentiellement impliqués dans la gamétogenèse, il est fort probable que la majorité des formes ‘idiopathiques’ sont d’origine génétique. Dans l'étude présente, nous avons d’identifier deux nouveaux gènes impliqués dans une infertilité masculine. Nos données suggèrent que la mutation dans TEX15 puisse corréler avec une diminution du nombre de spermatozoïdes au fil du temps. Un test diagnostique identifiant la mutation chez un patient pourrait fournir une indication d’organiser au plus tôt une cryopréservation du sperme. On a aussi identifié MAGEB4 liées à l’X comme un nouveau gène impliqué dans une infertilité masculine héritée. Cette étude fournit le premier indice sur la fonction physiologique d'une protéine MAGE
Among couples with a desire for a child, male factor is responsible approximately 20%. Despite long years of assisted reproductive activities, a significant number of cases remain idiopathic. Considering the high predicted number of genes involved in male gametogenesis, it is likely that most ‘idiopathic’ forms may have a genetic origin. In the present study, we have defined two new genes implicated in male infertility. Our data suggested that a nonsense mutation in TEX15 correlates with a decrease in sperm count over time. A diagnostic test identifying the mutation in man could provide an indication of spermatogenic failure and prompt patients to undertake sperm cryopreservation at an early age. We also identified MAGEB4 as a new X-linked gene involved in an inherited male infertility. This study provides the first clue on the physiological function of a MAGE protein

La protéine TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) appartient à la famille des SLC26, une famille de transporteurs d’anions qui contribuent dans différents épithelia à l’homéostasie cellulaire. La protéine TAT1 s’exprime exclusivement dans les cellules germinales mâles, chez l’homme et chez la souris. Sur le spermatozoïde mature, la protéine TAT1 est localisée à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, au niveau de l’annulus, une structure en forme d’anneau composée de différents polymères de Septines (1, 4, 6, 7 et 12).Le modèle murin d’invalidation du gène Tat1 présente une infertilité mâle par asthénozoospermie totale (absence de mobilité des spermatozoïdes) et des défauts de capacitation associés à des anomalies structurales du flagelle (plicature du flagelle, disjonction entre la PI et la PP, atrophie de l’annulus). Ce modèle indique que la protéine TAT1 pourrait avoir un rôle structural dans le maintien de l’annulus et dans la mise en place du flagelle. Par ailleurs, la protéine TAT1 possédant une activité de transport d’anions, il est vraisemblable qu’elle puisse influer directement sur la régulation de la mobilité et de la capacitation puisqu’il est bien établi que les échanges ioniques sont essentiels au contrôle de ces deux processus.En effet, les ions chlorure, bicarbonate et calcium participent à l’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA, au cours des processus de mobilité et de capacitation (i.e. processus de maturation ayant lieu dans le tractus génital féminin et conférant au spermatozoïde un mouvement hyperactivé et la capacité à interagir avec l’ovocyte).Plusieurs travaux ont montré une interaction physique et fonctionnelle des membres de la famille SLC26 avec le canal chlorure/bicarbonate CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) dont les mutations sont responsables de la mucoviscidose. De manière intéressante des données récentes ont montré l’expression de CFTR dans le spermatozoïde et son rôle dans la régulation des flux de chlorure au cours de la capacitation. Au cours de ma thèse, nous avons testé la coopération entre les protéines TAT1 et CFTR ; nous avons pu montrer que la protéine TAT1 est capable d’interagir physiquement avec CFTR et de stimuler son activité de transport d’anions, suggérant qu’in vivo les deux protéines forment un complexe moléculaire impliqué dans la régulation des flux de chlorure et de bicarbonate dans le spermatozoïde.Tout comme TAT1, plusieurs membres de la famille SLC26 ont une expression tissulaire spécifique. Par ailleurs, les mutations génétiques de certains SLC26 sont associées à des pathologies humaines (surdité, diarrhée chlorurée congénitale et chondrodysplasie). De par le phénotype du modèle murin Tat1 et l’importance des SLC26 en pathologie humaine, TAT1 constitue un bon candidat dans la recherche des causes génétiques des asthénozoospermies humaines.Le laboratoire a mis en place au cours de ma thèse, un projet de recherche de mutations du gène TAT1 dans les asthénozoospermies humaines. Le séquençage des régions codantes du gène TAT1 dans une cohorte de 147 hommes infertiles par asthénozoospermie a ainsi permis d’identifier des variations de séquence inédites du gène chez 7 sujets. L’étude in vitro de certains variants indique pour trois d’entre eux une instabilité des formes mutantes associée à un défaut de stimulation du canal CFTR, in vitro. Par ailleurs, les spermatozoïdes de ces patients présentent d’importantes anomalies flagellaires dans la mise en place de la pièce intermédiaire, compatible avec un rôle de la protéine TAT1 et de ses partenaires (les septines) dans la genèse du flagelle
TAT1 (Testis Anion Transporter 1 ; SLC26A8) belongs to the SLC26 family of anion transporters, which is implicated in cellular homeostasis of different epithelia. TAT1 is exclusively expressed in male germ cells, in human and mouse. On mature spermatozoa, TAT1 is located at the annulus, a ring-shaped structure composed of different septins polymers (1, 4, 6, 7 and 12), at the junction of the midpiece (MP) and principal piece (PP) of the flagellum.The knock-out mouse model of Tat1 gene shows a male infertility by complete asthenozoospermia (lack of sperm motility) and capacitation defects combined with flagellar structural abnormalities (flagella bending, MP and PP disjunction and atrophy of the annulus). This model suggests that the TAT1 protein could fulfill structural roles in the annulus and during flagellum biogenesis. Moreover TAT1 displayind an anion transport activity, it could also be implicated in the control of sperm motility and capacitation by regulating anions exchannges, which are well known to be essential for both processes.Indeed, chloride, bicarbonate and calcium ions are involved in the activation of the cAMP/PKA pathway, controlling sperm motility and capacitation processes (i.e. maturation events occuring in the female genital tract and providing the spermatozoa an hyperactivation movement and the ability to interact with oocyte).Several publications have reported a physical and functionnal interaction between SLC26 family members and the chloride/bicarbonate CFTR channel (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), which mutations are responsible of cystic fibrosis. Interestingly, recent data showed CFTR expression in spermatozoa and its role in the regulation of chloride fluxes during capacitation. During my thesis, we tested TAT1 and CFTR cooperation; we showed that TAT1 can interact physically with CFTR and stimulate its anion transport activity, suggesting that in vivo they form a molecular complex involved in the regulation of chloride and bicarbonate fluxes during sperm capacitation.Like TAT1, several SLC26 family members have a tissue specific expression. Furthermore genetic mutations in several SLC26 members result in human pathology such as deafness, congenital chloride diarrhea and chondrodysplasia. According to the phenotype of the KO Tat1 mouse model and the role of SLC26 members in human pathology, TAT1 constitutes a good candidate for the search of genetic causes of human asthenozoospermia.During my thesis, the laboratory has set up, a research project aiming at identifying mutations in the TAT1 gene that are responsible for human asthenozoospermia.Sequencing of the TAT1 gene coding regions in a cohort of 147 infertile men presenting with asthenozoospermia allowed us to identify several new sequence variations in in the TAT1 gene. In vitro study of these variants shows that 3 of them are associated with protein instability and abrogate CFTR stimulation. Besides, patients sperm show important flagellar abnormalities in the midpiece, consistent with a role of TAT1 and its partners (septins) in flagellum biogenesis

L'infertilité masculine est une préoccupation croissante dans les sociétés modernes. Parmi les différentes causes d'infertilités masculines, certaines ont une origine génétique. C'est le cas de la globozoospermie de type I, une infertilité sévère caractérisée par la production exclusive des spermatozoïdes ayant une tête ronde et sans acrosome. Cette pathologie présente un phénotype complexe associant à l'absence de l'acrosome, des défauts de compaction nucléaire, des lésions de l'ADN et une déficience d'activation ovocytaire.Récemment notre équipe a montré que le gène DPY19L2 est impliqué dans 60 à 80% des cas de globozoospermie de type I et représente donc la cause majeure de la globozoospermie de type I chez l'homme. La fonction de la protéine étant complètement inconnue au moment de l'identification du gène DPY19L2, nous avons alors réalisée une étude fondamentale sur les mécanismes moléculaires expliquant la pathogénie moléculaire de cette maladie et avons démontré, grâce à l'utilisation du modèle des souris KO pour le gène Dpy19l2, que la protéine est localisée dans la membrane nucléaire interne et est nécessaire à l'ancrage de l'acrosome sur l'enveloppe nucléaire. Dans le but d'identifier d'autres acteurs impliqués dans l'attachement de l'acrosome au noyau spermatique, nous nous sommes intéressés à l'étude de la protéine Sun5 de l'enveloppe nucléaire interne située en regard de l'acrosome qui pouvait être un partenaire de Dpy19l2. On a trouvé que les deux protéines n'étaient pas des partenaires puisque Sun5 était, contrairement à ce qui a été décrit dans la littérature, du côté postérieur opposé à l'acrosome. En deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la compréhension des principales causes moléculaires de l'absence de fécondation ou du très faible taux de réussite lors d'ICSI réalisées avec des spermatozoïdes globozoospermiques.Pour ce faire, nous avons recherché la protéine PLC ζ, le principal facteur spermatique activateur de l'ovocyte, dans les spermatozoïdes humains provenant de patients délétés pour le gène DPY19L2 et murins (de souris KO Dpy19l2-/-) et avons montré qu'effectivement cette protéine est absente tant chez les patients que dans le modèle d'étude murin. Nous avons également réalisé une étude comparative des principales étapes de la compaction du génome spermatique entre les souris mâles WT et Dpy19l2-/- et nous avons montré que la compaction du génome des spermatozoïdes globozoospermiques était défectueuse avec un défaut de protamination et une rétention des histones. Ainsi, la déficience en PLC ζ, les défauts de compaction et le taux élevé de fragmentation de l'ADN sont susceptibles d'expliquer l'échec de la fécondation après ICSI, et le développement très réduit des embryons issus des patients déficients pour le gène DPY19L2 ainsi que des souris Dpy19l2-/-. La compréhension de cette physiopathologie devrait permettre la proposition de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d'améliorer le taux du développement embryonnaire en AMP
Male infertility is a growing concern in modern societies. Among the various causes of male factor infertility, some have a genetic origin. This is the case of type I globozoospermia, a severe infertility characterized by the presence in the ejaculate of a majority of round spermatozoa devoid of acrosome. This pathology presents a complex phenotype associating to the absence of the acrosome, sperm nuclear compaction defects, DNA damage and failure in egg activation.Recently our team identified the DPY19L2 gene as responsible for a large majority of pure globozoospermia cases (>80%) and therefore represents the major cause of type I globozoospermia in humans. The function of the protein was completely unknown at the time of identification of DPY19L2 gene, we then performed a fundamental study of the molecular mechanisms underlying the molecular pathogenesis of the disease and have shown, through the use of knockout mice model for the Dpy19l2 gene, that the protein is localized in the inner nuclear membrane and is necessary for the anchoring of the acrosome to the nuclear envelope. In order to characterize new actors of acrosome attachment, we assessed the importance of Sun5 (also called Spag4l) in acrosome attachment which was previously shown to be expressed in NE of spermatogenic cells, facing the acrosome and that could be a partner of Dpy19l2. Interestingly we demonstrate that Sun5 and Dpy19l2 are not partners and that Sun5, is not as initially reported, facing the acrosome but is in fact excluded from this zone. We were also interested in understanding the main molecular causes of the poor fertilization ability or the very low success rate in ICSI when performed with globozoospermics sperm.Therefore we have searched the PLC ζ protein, the sperm factor thought to induce the Ca2+ oscillations responsible for egg activation, in human spermatozoa from patients with DPY19L2 deleted gene and in murine spermatozoa from Dpy19l2 Knock-Out mice and showed that actually this protein is absent both in patients and in KO mice. We also made a comparative study of the main stages of genome compaction of sperm from both WT and Dpy19l2 KO mice and we showed that Dpy19l2 deficient sperm displays defective genome condensation and DNA alterations. Thus, PLC ζ deficiency, the compaction defects and the high rate of DNA fragmentation may explain the failure of fertilization after ICSI, and the poor development of embryos from patients deficient for the gene DPY19L2 as well as Dpy19l2 KO mice.Understanding the physiopathology of globozoospermia should allow the proposal of new therapeutic strategies that improves the rate of embryonic development in ART

Les inversions paracentriques sont des anomalies chromosomiques généralement considérées comme inoffensives. Toutefois, des cas de porteurs de chromosomes remaniés issus d'inversions paracentriques ont été rapportés, soulignant la nécessité d'étudier le comportement méiotique de ces anomalies. Seules quelques études ont été pratiquées, utilisant la technique de fécondation croisée Homme-Hamster, le typage génétique des spermatozoïdes (sperm typing) ou l'hybridation in situ fluorescente (FISH) par marquages centromériques ou télomériques. Afin d'améliorer l'efficacité de l'étude méiotique des inversions paracentriques, nous avons développé l'utilisation des sondes BAC qui permettent une localisation chromosomique précise des points de cassures chromosomiques et l'identification de tous les produits méiotiques des inversions dans le sperme humain. Les points de cassures et la ségrégation méiotique de 3 inversions paracentriques, inv(5)(q13. 2q33. 1), inv(9)(q21. 2q34. 13) et inv(14)(q23. 2q32. 13), ont ainsi été déterminés. Les taux de recombinants observés dans ces 3 inversions varient de 3,72% à12,55%. Cette localisation des points de cassures et l'analyse des séquences d'ADN adjacentes sont essentielles pour mettre en évidence la formation de boucles d'inversion, pour déterminer le risque de recombinaison à terme, ainsi que pour étudier les mécanismes méiotiques de formation des recombinaisons. Ainsi, la présence de régions d'ADN riches en recombinaisons et en duplications inter-chromosomiques a été mise en évidence, en complément de la formation de recombinants chromosomiques. Par ailleurs, une nouvelle technique de FISH multi-couleurs 3D (3D MCB FISH) a été adaptée aux spermatozoïdes humains pour l'analyse in situ des ségrégations. Cette approche permet de visualiser in situ les inversions paracentriques et d'estimer la fréquence de tous les types de recombinants issus de boucles d'inversion, de recombinaisons U-loop ou de processus de cassure/fusion des chromatides-soeurs.

Le but de ce travail consiste en une approche destinée à préciser le rôle joué par certains facteurs de croissance dans les domaines de la croissance et de la fertilité. L'exploration de l'axe somatotrope et la contribution de ses différents acteurs ont permis de mieux cerner les mécanismes qui pourraient contribuer à l'accélération transitoire de la croissance constatée dans les mois suivant la transplantation rénale en dehors de toute thérapeutique par hormone recombinante. L'approche plus fondamentale concerne la purification et l'identification, à partir de sérum humain, d'un hexapeptide, de structure primaire : HWESAS, stimulant in vitro les activités de sulfatation et mitogénique des insulin-like growth factors. Les études originales réalisées sur les cytokines dans le sperme humain laissent entrevoir l'implication potentielle de ces facteurs de croissance dans l'hypofertilité masculine. Ce travail met en exergue la diversité et les multiples facettes des facteurs de croissance ouvrant des perspectives dans la compréhension de leurs interactions dans le fonctionnement et la régulation des activités cellulaires.

Parmi les 10 à 15% de couples confrontés à des problèmes d'infertilité, l'étiologie est masculine dans la moitié des cas. La présence d'une anomalie chromosomique constitutionnelle, ou d'une anomalie génique (microdélétions du chromosome Y, mutations dans Aurora Kinase c -AURKc-) ou encore un ADN spermatique fragmenté peuvent être une des causes d'infertilité masculine. Ce travail a consisté à étudier, par FISH (Fluorescent in situ Hybridization), l'équipement chromosomique des gamètes d'hommes infertiles que le caryotype lymphocytaire soit normal ou non et le taux de fragmentation de l'ADN spermatique chez ces patients, par la méthode TUNEL (Terminal Uridine Nick-end Labeling). Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques permettant de rechercher laprésence de microdélétions sur le chromosome Y et de mutations sur AURKc. Chez des patients présentant une tératozoospermie, le taux de gamètes chromosomiquement déséquilibrés s'échelonne de 0,47% à 100%. De plus, leur taux de fragmentation est 12 fois supérieur à celui des témoins (14,6% versus 1,2%). Chez les patients porteurs d'une anomalie de structure constitutionnelle, l'analyse de la ségrégation méiotique révèle des taux de gamètes chromosomiquement déséquilibrés de 0% à 65,60% selon l'anomalie de structure (translocation réciproque équilibrée, translocation robertsonienne ou inversion péricentrique). Leur taux de fragmentation de l'ADN spermatique est compris entre 1% et 27%. Les gamètes chromosomiquement déséquilibrés ont un ADN plus fragmenté que les normaux/équilibrés. L'étude de la ségrégation méiotique et de la fragmentation sont complémentaires dans l'exploration de l'infertilité masculine.

L’infertilité est définie par l’OMS comme l’incapacité à concevoir un enfant dans un couple, après au moins douze mois de rapports sexuels réguliers sans protection. Elle concerne 15 % des couples qui désirent avoir un enfant, un facteur masculin est retrouvé dans 50 % des cas. Dans le cadre de cette thèse, les principaux objectifs étaient de déterminer des causes génétiques d’infertilité masculine chez des patients atteints d'oligozoospermie sévère (OS) ou d'asthénozoospermie en lien avec des anomalies morphologiques des flagelles, afin de mieux comprendre la spermatogénèse, d’améliorer la prise en charge des couple infertiles et d'évaluer les risques de transmission à leur descendance. Nous avons abordé ces problématiques par le séquençage d’exome entier d'hommes ayant un de ces phénotypes au sein de deux familles consanguines. L'ensemble des résultats de cette thèse apportent des éléments de réponses sur de nouvelles causes génétiques d’infertilité masculine liée à une anomalie quantitative ou qualitative de la spermatogénèse. De plus, nos résultats concernant EXD1 nous interrogent sur la possibilité de transmission de mutations génétiques ou modifications de marques épigénétiques à la descendance en Assistance Médicale à la Procréation pour certains patients avec une oligozoospermie
Infertility is defined by the WHO as the inability of a couple to conceive a child after twelve months of unprotected regular sexual intercourse. It concerns 15% of couples who wish to have a child, and a male factor is found in 50% of cases. In this thesis, the main objectives were to determine genetic causes of male infertility in patients with severe oligozoospermia (SO) or asthenozoospermia related to morphological abnormalities of the flagella, in order to better understand spermatogenesis, improve the care of infertile couples and inform risk evaluation for their offspring. We addressed these objectives by sequencing the whole exome of men with one of these phenotypes within two consanguineous families.The results presented in this thesis reveal new genetic causes of male infertility related to a quantitative or a qualitative abnormality of spermatogenesis. Moreover our findings concerning EXD1 raise questions about the risk that, for some patients with oligozoospermia, medically assisted reproduction could transmit de novo genetic or epigenetic modifications to future generations

Cette recherche de thèse porte sur le travail réalisé avec des sujets demandant une prise en charge en médecine procréative. Nous envisageons la question du travail collaboratif entre psychanalyse et médecine dans le champ de l’assistance médicale à la procréation, sur la base de deux approches. La première, historique, porte sur l’évolution de la représentation culturelle de l’infertilité, et la seconde, clinique, d’inspiration psychanalytique, a été construite sur la base de notre expérience au sein d'un centre d’assistance médicale à la procréation et dans un cabinet privé. Nos hypothèses visent à montrer comment les pré-conceptions médicales et psychologiques barrent le dialogue entre le sujet demandant une prise en charge et celui qui l’accueille. À cet effet, nous envisagerons le processus d’objectivation subi par le concept de désir d’enfant, de plus en plus assimilé à celui de projet d’enfant, et nous abordons aussi les difficultés que l’infertilité pose aux hommes dans une époque où elle commence à être conçue comme une maladie du couple et non pas comme une maladie des femmes. À partir d’une mise à jour de la notion d’infertilité, telle qu’elle est comprise par la médecine et par la loi, et de la reprise des théorisations freudiennes autour du symptôme et de la pratique clinique, nous chercherons à montrer la valeur d’une perspective qui n’assume pas d’emblée que toute demande de prise en charge en médecine procréative est une demande d’enfant à la médecine
This research focuses on work with subjects requiring care in medically assisted procreation. Based on two approaches: an historical one, on the evolution of the cultural representation of infertility. The other clinical, from a psychoanalytic perspective, developed working in a center of assisted reproduction and in private practice. Our work addresses the question of collaborative work between psychoanalysis and medicine in the field of reproductive medicine. Our hypotheses are intended to show how medical and psychological preconceptions difficult the dialogue between the subject requiring care and those who receive him. To this end we will consider the process of objectification suffered in the concept of desire for a child, now assimilated to that of the project of a child. We also address the challenges that infertility imposes on men when it begins to be seen as a couple’s disease and not only as women’s disease. From an update of the notion of infertility, as it is comprised now by medicine and law, and the recovering of Freudian theories about the symptom and clinical practice, we intend to show the value of a perspective that does not automatically assume the demand for care in reproductive medicine as a demand of a child to medicine

Résumé : L’imagerie testiculaire développée dans notre unité a deux thématiques principales : l’infertilité et la caractérisation tumorale. Cette imagerie est basée sur l’échographie et l’IRM multiparamétriques. Nous avons défini des critères diagnostiques pour différentes pathologies, ayant un impact sur la prise en charge des patients, et évalué des modalités innovantes.Nous avons caractérisé l’aspect des testicules de patients infertiles porteurs d’un syndrome de Klinefelter. Nous avons déterminé l’aspect en Mode B et en Doppler couleur des tumeurs à cellules de Leydig dont la plupart sont actuellement découvertes de façon fortuite et peuvent bénéficier d’une surveillance ou d’une tumorectomie. Nous avons défini les critères diagnostiques des tumeurs éteintes ou «burned out tumors» découvertes en écho-Doppler chez des patients adressés pour bilan d’infertilité.Nous avons montré la capacité de l’IRM multiparamétrique à améliorer la caractérisation tumorale, par l’analyse qualitative et quantitative du rehaussement et par la valeur du coefficient de diffusion (ADC).L’échographie de contraste a montré des différences significatives entre les tumeurs éteintes et les autres lésions.L’élastographie par onde de cisaillement a montré des différences de dureté entre les testicules des patients infertiles par mécanisme obstructif et non obstructif mais le chevauchement des valeurs minimise l’impact clinique potentiel. Les tumeurs bénignes à cellules de Leydig étaient plus molles que les tumeurs malignes et les tumeurs éteintes. Le couplage des informations données par le mode B, le Doppler couleur, et l’élastographie ont permis une caractérisation optimale.Le Doppler ultrasensible a permis une analyse qualitative de l’architecture vasculaire des tumeurs, de la vascularisation testiculaire dans les urgences scrotales et une quantification de la vascularisation testiculaire. Nous avons objectivé une diminution de la vascularisation testiculaire pendant la manœuvre de Valsalva chez les patients avec varicocèle, ce qui représente une explication physiopathologique à l’infertilité par mécanisme hypoxique
The testicular imaging we developped in our department focused on two main subjects: infertility and tumoral characterization. It is based on multiparametric ultrasound and MRI. We defined diagnostic criteria of several pathologies, which may change the patient’s management, and we evaluated new modalities.We characterized Klinefelter patient’s testis.We determined the Color-Doppler features of Leydig cell tumors which are currently incidentally discovered and can benefit from monitoring or tumorectomy.We defined multiparametric US and MRI diagnostic’s criteria of burned out tumors in patients referred for US infertility screening.We demonstrated the ability of multiparametric MRI to improve the tumoral characterization using qualitative and quantitative enhancement parameters and apparent diffusion coefficient values.CEUS showed significant differences between the burned out tumors and other lesions.. Shear Wave Elastography (SWE) showed significant differences in testicular stiffness between normal, obstructive azoospermia on one side and non-obstructive azoospermic patients, but overlapped values seemed to minimize the potential clinical impact. Benign Leydig cell were softer compared to malignant tumors and burned out tumors. Association of B mode, color Doppler, and elastography allowed an optimal characterization.Ultrasensitive Doppler allowed a qualitative evaluation of the tumoral vascular architecture, a testicular vascularization assessment in case of acute scrotum, and a testicular perfusion quantification. We demonstrated a decreased testicular vascularization during the Valsalva maneuver confirming the hypoxic physiopathological explanation of the infertility process

De manera rutinària, el diagnòstic inicial de la infertilitat masculina es realitza mitjançant l’estudi macroscòpic i microscòpic de la mostra de semen. Aquests proporcionen informació rellevant sobre el recompte, la mobilitat i la morfologia dels espermatozoides, però no sobre el potencial de fertilització de la mostra, sovint aquests paràmetres tenen un valor pronòstic limitat en processos de fecundació natural i/o artificial. A més, alguns estudis determinen que hi ha pacients que es poden diagnosticar erròniament com a idiopàtics, ja que hi ha certes anomalies a nivell molecular o genètic que no són detectables en el seminograma. Per abordar aquest problema, és necessari estudiar nous biomarcadors que permetin entendre els mecanismes moleculars implicats en la infertilitat. Per a això, en aquest treball s’han utilitzat tècniques proteòmiques d’expressió diferencial tant en mostres de plasma seminal com d’espermatozoides. En el primer estudi, s’ha demostrat la presència d’activitat nucleasa en el líquid seminal de diferents grups de pacients, inclosos aquells que no presenten espermatozoides, amb azoospermia. A més, s’ha observat un increment de l’activitat nucleasa per espermatozoide en aquells grups que tenen més paràmetres del seminograma alterats, així com una correlació entre l’activitat nucleasa i la fragmentació de l’ADN dels espermatozoides valorada amb Comet alcalí, la morfologia i la mobilitat espermàtica. Per últim, mitjançant la corba ROC s’ha comprovat que l’activitat nucleasa és una bona variable per predir la infertilitat masculina. En el segon estudi, s’ha comparat el perfil proteic del líquid seminal de controls fèrtils amb pacients seleccionats segons el seminograma, patologia i valors d’integritat de l’ADN dels espermatozoides mitjançant Comet neutre, alcalí i SCD. Les 24 mostres analitzades s’han classificat en 4 grups diferents: controls fèrtils, avortaments de repetició, astenoteratozoospèrmics i astenoteratozoospèrmics amb varicocele. L’anàlisi proteòmica comparativa s’ha realitzat mitjançant la tecnologia 2D-DIGE i ha revelat la presència de 28 proteïnes diferencials. Aquestes estan involucrades en processos metabòlics i cel·lulars, funcions catalítiques i es troben al component extracel·lular. L’anàlisi de les interaccions entre proteïnes ha mostrat que estan associades entre elles i també amb la Ubiquitina C, indicant que la regulació d’aquestes proteïnes té un paper important en la infertilitat masculina. En el tercer estudi, s’ha comparat el perfil proteic dels espermatozoides de mostres de controls fèrtils amb avortaments de repetició abans i després d’un tractament oral amb antioxidants mitjançant el marcatge isobàric TMT. S’han identificat 34 proteïnes amb expressió diferencial entre els grups d’avortaments de repetició i controls fèrtils, a més algunes proteïnes milloren el seu perfil d’expressió després del tractament amb antioxidants, indicant que són vulnerables a l’estrès oxidatiu. No obstant, no hi ha diferències significatives entre els avortaments de repetició abans i després del tractament amb antioxidant, per tant, la patologia espermàtica produïda en aquests pacients no és deguda principalment a l’estrès oxidatiu. Finalment, l’anàlisi d’interaccions entre les proteïnes diferencials ha mostrat tres vies principals d’afectació: metabolisme, citoesquelet i dany en l’ADN dels espermatozoides. En conjunt, els resultats obtinguts demostren la importància de l’estudi de proteïnes que s’expressen de manera diferencial entre individus fèrtils i infèrtils ja que permet aprofundir en el coneixement dels mecanismes moleculars implicats en la infertilitat masculina i personalitzar el diagnòstic de pacients amb la construcció de nous panells de biomarcadors.
De manera rutinaria, el diagnóstico inicial de la infertilidad masculina se realiza mediante el estudio macroscópico y microscópico de la muestra de semen. Estos proporcionan información relevante sobre el recuento, la movilidad y la morfología de los espermatozoides, pero no sobre el potencial de fertilización de la muestra, a menudo estos parámetros tienen un valor pronóstico limitado en procesos de fecundación natural y/o artificial. Además, algunos estudios determinan que hay casos de infertilidad masculina que se pueden diagnosticar erróneamente como idiopáticos, ya que hay ciertas anomalías a nivel molecular o genético que no presentan manifestaciones detectables con el seminograma. Para abordar este problema, es necesario obtener nuevos biomarcadores que ayuden a entender los mecanismos moleculares implicados en la fecundación. Para ello, en este trabajo se han utilizado técnicas proteómicas de expresión diferencial tanto en muestras de plasma seminal como de espermatozoides. En el primer estudio, se ha demostrado la presencia de actividad nucleasa en el líquido seminal de diferentes grupos de pacientes incluidos aquellos que no presentan espermatozoides, con azoospermia. Además, se ha observado un incremento de la actividad nucleasa por espermatozoide en aquellos grupos que tienen más parámetros del seminograma alterados, así como una correlación entre ésta y la fragmentación de cadena sencilla del ADN de los espermatozoides, la morfología y la movilidad espermática. Por último, mediante la curva ROC se ha comprobado que la actividad nucleasa es una buena variable para predecir la infertilidad masculina. En el segundo estudio, se ha comparado el perfil proteico del líquido seminal de controles fértiles con pacientes seleccionados según su seminograma, patología y valores de integridad del ADN de los espermatozoides mediante Comet neutro, alcalino y SCD. Las 24 muestras analizadas se han clasificado en 4 grupos diferentes: controles fértiles, abortos de repetición, astenoteratozoospérmicos, astenoteratozoospérmicos con varicocele. El análisis proteómico comparativo se ha realizado mediante el sistema de electroforesis en gel bidimensional basado en el marcaje fluorescente (2D-DIGE) y ha revelado la presencia de 28 proteínas diferenciales. Éstas están involucradas en procesos metabólicos y celulares, funciones catalíticas y se encuentran en el componente extracelular. El análisis de las interacciones entre proteínas ha mostrado que están asociadas entre ellas y también con la ubiquitina C, indicando que la regulación de estas proteínas tiene un papel importante en la infertilidad masculina. En el tercer estudio, se ha comparado el perfil proteico de los espermatozoides de muestras de controles fértiles con abortos de repetición antes y después de un tratamiento oral con antioxidantes usando el marcaje isobárico TMT. Se han identificado 34 proteínas con expresión diferencial entre los grupos de abortos de repetición y controles fértiles, además algunas proteínas mejoran su perfil de expresión después del tratamiento con antioxidantes, indicando que son vulnerables al estrés oxidativo. Sin embargo, no hay diferencias significativas entre los abortos de repetición antes y después del tratamiento con antioxidantes, por lo tanto, la patología espermàtica producida en estos pacientes no se debe principalmente al estrés oxidativo. Finalmente, el análisis de interacciones entre las proteínas diferenciales ha mostrado tres vías principales de afectación: metabolismo, citoesqueleto y daño en el ADN de los espermatozoides. En conjunto, los resultados obtenidos demuestran la importancia del estudio de las proteínas que se expresan de manera diferencial entre individuos fértiles e infértiles ya que permite profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la infertilidad masculina y personalizar el diagnóstico de pacientes con la construcción de nuevos paneles de biomarcadores.
Routine evaluation of sperm quality during the initial diagnosis of male fertility is performed by macroscopic and microscopic examination of the semen sample. These provide useful information regarding sperm count, sperm motility, sperm morphology but not on the fertilization potential of the sample often have a limited prognostic value in processes of natural and/or artificial fertilization. In addition, some studies determine that there are cases of male infertility that can be misdiagnosed as idiopathic, as there are certain abnormalities at the molecular or genetic level that do not present detectable manifestations with basic semen analysis. To address this problem it is necessary to obtain new biomarkers that help to better understand the molecular mechanisms involved in fertilization.To this end, differential expression proteomic techniques have been used in both seminal plasma and sperm samples in this work. In the first study, the presence of nuclease activity in the seminal plasma of different groups of patients has been found in all of them, including those that do not have sperm, with azoospermia. In addition, an increase in sperm nuclease activity has been observed in patients with most altered parameters of semen analysis, as well as a correlation between nuclease activity and sperm DNA fragmentation assessed by alkaline Comet, morphology and sperm motility. Finally, the ROC curve has shown that nuclease activity is a good variable for predicting male infertility and could therefore improve the diagnosis of idiopathic patients. In the second study, the protein profile of seminal plasma from fertile donors was compared with patients selected according to their seminogram, pathology, and sperm DNA integrity values using neutral and alkaline Comet, and SCD test. 24 samples analyzed were classified into 4 different groups: fertile donors, recurrent miscarriage, asthenoteratozoospermic and asthenoteratozoospermic with varicocele. Comparative proteomic analysis was performed with the two-dimensional gel electrophoresis system based on fluorescent labeling (2D-DIGE) and revealed the presence of 28 differential proteins that are involved in metabolic and cellular processes, catalytic functions and located in the extracellular component. Analysis of protein interactions has shown that they are associated with each other and also to Ubiquitin C, indicating that the regulation of these proteins plays an important role in male infertility. In the third study, protein profile of sperm from fertile donor samples was compared with recurrent miscarriage before and after oral treatment with antioxidants using TMT isobaric labeling. 34 proteins with differential expression have been identified between groups of recurrent miscarriage and fertile donors, in addition some proteins ameliorated their expression after treatment with antioxidants, indicating that they are vulnerable to oxidative stress. However, no significant differences between recurrent miscarriages before and after antioxidant treatment have been found, therefore, damage produced in sperm from patients with this pathology is not mainly due to oxidative stress. In addition, analysis of interactions between differential proteins showed three main pathways of involvement: metabolism, cytoskeleton, and sperm DNA damage. In summary, results obtained demonstrate the usefulness of proteomic analysis and the importance of the study of proteins that are differentially expressed between fertile and infertile individuals as it allows to deepen the knowledge of the molecular mechanisms involved in male infertility and be able to personalize the diagnosis of patients with new biomarker panels.

L’épididyme est un organe accolé au testicule, formé d’un long tubule dont l’épithélium est constitué de 6 types cellulaires différents aux fonctions partiellement connues. Le tubule épididymaire est entouré de muscles lisses participant, par leurs contractions, à l’avancée des spermatozoïdes. Au centre du canal se retrouve le fluide épididymaire dont la composition est régulée par les absorptions et sécrétions de l’épithélium épididymaire. Les gamètes arrivant du testicule sont inaptes à assurer la fécondation. La maturation post-testiculaire des spermatozoïdes, durant leur descente dans le tubule épididymaire, va leur permettre d’acquérir la mobilité et la capacité à reconnaître et féconder un ovule (qualités regroupées sous le terme de “pouvoir fécondant”). Cette maturation se fait grâce aux interactions permanentes des spermatozoïdes avec le fluide. Les LXRs sont des régulateurs majeurs de l’homéostasie du cholestérol, un élément fondamental dans la physiologie de la reproduction puisqu’il est le précurseur des hormones stéroïdes (androgènes) et un régulateur du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. Les souris mâles invalidées pour les 2 isoformes de ces récepteurs (lxrα;β-/-) ont une fertilité perturbée en association avec des altérations testiculaires et épididymaires. Ces mâles présentent une infertilité dès 6 mois conduisant à une stérilité complète à 9 mois. Le but de ce travail est de comprendre la relation entre la régulation de l’homéostasie du cholestérol et le phénotype épididymaire de ces souris. A l’âge de 4 mois, alors que les souris mâles lxrα;β-/- sont fertiles, le phénotype est caractérisé par une accumulation de lipides dans certains types cellulaires de l’épithélium et dans les muscles lisses entourant le tubule. Chez les mâles lxrα;β-/- âgés de 9 mois, lorsque le phénotype d’infertilité complète est installé, on observe une destructuration de la partie proximale de l’épididyme comprenant une diminution de la hauteur de l’épithélium, une perte des muscles lisses péritubulaires et la présence de spermatozoïdes non mobiles et malformés dans la lumière du tubule. Mes travaux ont permis de mettre en évidence différents phénomènes : 1/ Une nouvelle fonction d’un type cellulaire particulier, les cellules “apicales”, dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol épididymaire. En effet, ces cellules accumulent du cholestérol en association avec la perte de “ABCA1” (ATP Binding Cassette A1), codée par un gène cible de LXR, impliquée dans l’export de l’excédent de cholestérol cellulaire. Suite à cela, ces cellules apicales entrent en apoptose et contribuent à la perte de fonction de l’épithélium. 2/ Une altération des cellules musculaires lisses péritubulaires associée au vieillissement des souris lxrα;β-/-. Ces cellules accumulent elles aussi du cholestérol et se transforment en cellules invasives, les cellules “spumeuses” migrant à travers l’épithélium. Ce phénomène est très proche des phases de développement de la pathologie artérielle liée au cholestérol et au vieillissement, l’athérosclérose. La perte des muscles lisses va limiter la progression des spermatozoïdes et accompagner la perte de fonction des cellules épithéliales qui ne seront plus aptes à effectuer des échanges avec le fluide, empêchant ainsi l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes. (...)
The epididymis is a long tubule which epithelium is made of 6 different cellular types with partially unknown functions. The epididymal tubule is surrounded by smooth muscles participating, by their contractions, to the sperm progression. At the center of the tubule is present the epididymal fluid which composition is regulated by the absorptions and secretions of the epithelium. The spermatozoa coming from the testis are unable to fertilize an oocyte. Post-testicular maturation of spermatozoa, during their transit through the epididymis, allows them to become motile, to recognize and to fertilize an oocyte. This maturation is due to the constant interaction of the spermatozoon with the epididymal fluid. LXR are the major sensors of cholesterol homeostasis, a fundamental element in reproductive physiology because it is the steroid hormones precursor and a regulator of the sperm fertilizing capacities. LXR deficient mice (lxrα;β-/-) have fertility disorder associated with testicular and epididymal alterations. These males present an infertility since 6 months of age leading to a complete infertility at 9 months of age. The purpose of this work is to understand the relation between cholesterol homeostasis regulation and epididymal sperm maturation. At 4 months of age, the lxrα;β-/- males are fertile but present an epididymal phenotype characterized by neutral lipid accumulations in some epithelial cell types and in the smooth muscle cells surrounding the tubule. At 9 months of age, the totally infertile lxrα;β-/- male, present a complete destructuration of the proximal epididymis associated with a complete shrinking of the epithelium height, the loss of the peritubular smooth muscle cells and the presence of immotile and abnormal spermatozoa in the cauda epididymis. My works put in light : 1/ A novel function of a particular cell type, the “apical cells”, in the regulation of the epididymal cholesterol homeostasis. These cells accumulate cholesteryl esters in association with the loss of the ATP Binding Cassette A1 “ABCA1”, a transporter implicated in the cholesterol efflux. Following this, apical cells become apoptotic participating to the epithelial function loss. 2/ An alteration of peritubular smooth muscle cells associated with the mice aging. These cells also accumulate cholesteryl esters and transdifferentiate into invasive foam cells migrating through the epithelium. This phenomenon is very similar to what is observed in the arterial pathology related to cholesterol and aging, the atherosclerosis. The loss of smooth muscle cells limit the progression of the spermatozoa in the lumen and lead to the loss of function of the epithelial cells which become unable to make any exchange with the fluid, hence disturbing spermatozoa maturation. 3/ A deleterious effect of a cholesterol enriched diet on the fertility in 3-month-old lxrα;β-/- male, which are normally fertile and without epididymal phenotype. When submitted to the diet during 4 weeks, these mice become completely infertile, showing the epididymal phenotype of the 9-month-old lxrα;β-/- male mice. The infertility of these mice is characterized by defects in spermatozoa motility, viability and functional parameters. Our results show, on the one hand, the importance of LXR in the post testicular maturation of spermatozoa and in the maintenance of the integrity and functionality of the epididymis. On the other hand, the data that we collected put in evidence the impact of the alimentation and in particular cholesterol enriched diet on the post-testicular maturation

La protéine TAT1/SLC26A8 a été isolée dans le laboratoire comme une cible des GTPases Rho, exclusivement exprimée dans le testicule humain adulte. Elle appartient à la famille des protéines de transport SLC26 et l'équipe a précédemment montré sa localisation à la membrane plasmique des cellules germinales mâles aux stades spermatocyte et spermatide, ainsi que son activité vis-à-vis des anions sulfate et chlorure. Durant ma thèse, j'ai caractérisé un modèle d'inactivation du gène Tatl chez la souris (Knock ouf) et mis en évidence l'importance de la protéine Tatl pour la différenciation et la mobilité des spermatozoïdes. Ainsi, les souris mâles Tat1-/- sont stériles suite à une asthénozoospermie sévère et des défauts structuraux des spermatozoïdes. Les spermatozoïdes Tat1-/- présentent une atrophie de l'annulus, structure en forme d'anneau située à la jonction des pièces intermédiaire (PI) et principale (PP) du flagelle, une disjonction PI/PP, une plicature du flagelle et une cassure de l'axonème; par ailleurs les spermatozoïdes TaT1-/- présentent une absence d'hyperphosphorylation en conditions capacitantes. En accord avec ce phénotype, nous avons montré que chez l'homme comme chez la souris, la protéine TAT1 est également exprimée dans le spermatozoïde mature où elle se localise à l'annulus. De manière à tester l'implication de la protéine TAT1 dans les infertilités masculines humaines, nous avons réalisé des immunodétections de la protéine TAT1 sur des frottis de spermatozoïdes de sujets asthénozoospermiques. Le criblage d'une cohorte de 75 sujets a permis d'isoler un patient présentant une asthénozoospermie modérée associée à une absence de marquage TAXI à l'annulus. Par microscopie électronique à transmission, nous avons observé l'absence complète de l'annulus et une disjonction PI/PP. Ces résultats inédits suggèrent que chez l'homme comme chez la souris, l'intégrité de l'annulus conditionne la mobilité et la différenciation flagellaire des spermatozoïdes. Finalement, afin de déterminer si le rôle de la protéine Tatl dans le contrôle de la mobilité du spermatozoïde fait intervenir son activité de transport anionique, j'ai crée deux mutants ponctuels de la protéine TAT1 (D95N et G218V); ces mutations précédemment décrites dans la littérature abolissent l'activité de transport des protéines SLC26 mais préservent leur adressage à la membrane plasmique. In vitro, y ai vérifié que les mutants TAT1 D95N et TAT1 G218V présentent une expression quantitativement normale et un adressage correct à la membrane plasmique des cellules COS. Si comme attendu, ces mutations induisent, in vitro, une perte de l'activité de transport d'anions, elles seront introduites (de manière indépendante) dans le gène Tatl murin pour la création de modèles d'étude de type « Knock in »
We have previously identified TAT1/SLC26A8 as a potential target of Rho GTPases, exclusively expressed in human adult testis. TAT1 is a member of the SLC26 family and we have shown that TAT1 is located at the plasma membrane of germ cells at spermatocyte/spermatid stages and exhibits a transport activity towards sulfate and chloride anions. During my thesis, I characterized the phenotype of mice with a targeted disruption of Tat gene (knock out) and showed that Tatl protein is essential for sperm flagella differentiation and motility. Hence, Tat1-/- males are sterile due to severe asthenozoospermia and structural defects of the spermatozoa. Tatr spermatozoa display an atrophia of the annulus (the ring shape structure connecting the midpiece to the principal piece), a midpiece-principal piece disjunction and hairpin-like bending of the flagella leading to the disruption of the axonemal structure. In addition, we observed that Tat1-/- spermatozoa do not display the phosphorylation profile required for sperm capacitation. According to this phenotype, we showed that TAT1 is also expressed in mature sperm where it is specifically localized at the annulus. In order to investigate the implication of TAT1 in human asthenozoospermia, we performed imunodetection of TAT1 on sperm smear preparations from a cohort of 75 asthenozoospermic subjects. We identified one patient with a moderate asthenozoospermia associated with the absence of TAT1 staining at the annulus. By transmission electron miscroscopy, we observed complete lack of the annulus and midpiece-principal piece disjunction in spermatozoa from the patient. This case, so far unique, suggests that in human the integrity of the annulus is also required for proper sperm motility and flagella differentiation. Finally, in order to address the role of TAT1 anion transport activity in the control of sperm motility and capacitation, I generated two mutants (D95N and G218V) in TAT1 sequence, based on published data concerning mutations in SLC26 proteins that abolish transport activity without affecting plasma membrane localization. I analyzed these mutants, in vitro, and showed normal expression level and proper localization of the proteins at plasma membrane of COS cells. If, as we expect, these mutations inhibit TAT1 transport activity in vitro, we will proceed to their introduction into the murine Tatl gene in order to generate « knock in » mouse models

L’infertilité représente un problème majeur de santé publique en concernant 10 à 15% des couples en âge de procréer. Un facteur masculin est responsable de l’infertilité du couple dans près de la moitié des cas. Pour environ 30% d'entre eux, l'étiologie reste inexpliquée. Le premier axe du travail a concerné l’étude moléculaire d’une cohorte de patients infertiles (azoospermie non-obstructive/cryptozoospermie ou désordre du développement sexuel ou DSD) pour lesquels les analyses du caryotype standard et/ou des microdélétions des régions AZF par PCR n’ont pas permis d’expliquer le phénotype. L'impact des variations de nombre de copies de l'ADN (CNV) détectées par l'hybridation génomique comparative sur puce à ADN est peu documenté. Un design personnalisé de puce à ADN de format 400K, pangénomique et enrichi sur un large panel de 445 gènes liés à l'infertilité et à un DSD a été développé. Cette puce a permis l’identification de 171 CNV d’intérêt. Ces résultats soulignent l’intérêt de ce design comme outil diagnostic dans le cadre du bilan de l’infertilité masculine. Le second axe du travail a été de modéliser l’infertilité masculine in vitro dans un contexte d’anomalie génétique. Des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) ont été générées à partir d’érythroblastes de deux patients infertiles porteurs d’un remaniement chromosomique complexe ou d’un caryotype 46,XX-SRY négatif avec mutation du gène de l’AMH. Dans un deuxième temps, la fonctionnalité des lignées de cellules hiPS générées a été testée par différenciation in vitro en cellules germinales primordiales (CGP). Elles expriment les marqueurs clés du stade CGP dont SOX17, le déterminant germinal le plus précoce des CGP. Les perspectives de ce travail seront de poursuivre la différenciation germinale vers des stades plus matures et ainsi de pouvoir étudier le processus méiotique dans un contexte d’anomalie génétique
Infertility represents a major public health problem and concerns 10 to 15% of couples in the general population. A male factor is responsible for the infertility of the couple in about half of all cases. In approximately 30% of them, the etiology remains unexplained.The first working axis concerned the molecular study of a cohort of infertile patients (nonobstructiveazoospermia/ cryptozoospermia and disorder of the sex development or DSD) for whom analyses of standard karyotype and/or microdeletions of AZF regions were not able to explain the phenotype. The impact of copy number variations of DNA (CNVs) detected by comparative genomic hybridization (CGH-array) is poorly documented. A custom design 400K micoarray, genome-wide and enriched on a wide panel of 445 genes linked with infertility and DSD has been achieved. This array allowed the identification of 171 CNVs of interest.These results underline the potential of this design for diagnosis of male infertility. The second objective of this work was the in vitro modelisation of male infertility in a context of genetic abnormality. For that purpose, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were generated from erythroblasts by means of not integrative Sendaï virus, in two patients carrying genetic abnormalities (complex chromosomal rearrangement and 46,XX-SRY negative karyotype associated with AMH gene mutation). Secondly, functionality of hiPSCs generated was tested by germ cells in vitro differentiation. Primordial germ cell (PGC) stage was successfully obtained. Cells expressed key PGC markers such as SOX17. The perspectives of this work will be to continuethe germinal differentiation towards more mature stages and so to be able studying the meiotic process in a context of genetic abnormality

Un certain nombre d’études épidémiologiques ont montré au cours des cinquante dernières années une augmentation des infertilités, des malformations de l’appareil reproducteur masculin et des cancers testiculaires. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie foetale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Les molécules qui sont suspectées d’avoir des effets néfastes à long terme sur le tractus génital mâle possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. Parmi les mécanismes impliqués dans l’effet à long terme, un certain nombre d’auteurs mettent en avant l’intervention de mécanismes de type épigénétiques. Dans ce contexte, nous avons utilisé deux types de modèles expérimentaux reposant sur l’exposition développementale de rats à ces composés : un modèle d’exposition néonatale à un estrogène (estradiol benzoate) et un modèle d’exposition foetale à un antiandrogène (flutamide). Les deux modèles expérimentaux induisent chez le rongeur un phénotype d’hypospermatogenèse. Dans le cas de l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate nous montrons que l’hypospermatogenèse observée chez les animaux à l’âge adulte est due à l’activation chronique de l’apoptose des cellules germinales testiculaires. Cette apoptose mettrait en jeu, par un mécanisme post-transcriptionnel, la diminution à long terme de l’expression de protéines clés de la machinerie épigénétique de méthylation de l’ADN, les ADN méthyltransférases (DNMT 3A, 3B et 1), et du facteur antiapoptotique, MCL-1. D’un point de vue fonctionnel, la chute d’expression des DNMTs se traduit notamment par l’augmentation d’expression des éléments transposables LINE-1 et du gène Ibtk normalement contrôlés par méthylation de l’ADN. En amont, la chute d’expression des DNMTs et de MCL-1 serait dépendante de l’augmentation d’expression d’autres effecteurs épigénétiques, les microRNAs de la famille miR-29. Dans le cas de l’exposition in utero au flutamide, notre travail indique que l’apoptose chronique des cellules germinales serait liée à la diminution à long terme de l’expression des inhibiteurs d’apoptose cIAP1 et cIAP2, et une augmentation d’expression de leur inhibiteur SMAC/DIABLO. En revanche, l’absence de mort des cellules somatiques testiculaires (Sertoli et Leydig) dans ce modèle serait due à l’augmentation d’expression spécifiquement dans ces cellules des inhibiteurs d’apoptose XIAP et SURVIVIN. Par ailleurs, le phénotype d’apoptose observé à l’âge adulte impliquerait également une altération précoce de l’expression des DNMTs. En conclusion, nous apportons une réponse mécanistique au phénotype de programmation foetale/néonatale d’apoptose des cellules germinales testiculaires adultes. En effet, l’augmentation des miR-29s provoquerait : (1) une chute d’expression des DNMTs altérant ainsi le profil de méthylation des gènes, et (2) une chute d’expression de facteurs protégeant les cellules germinales contre l’apoptose comme le facteur MCL-1
During the five past decades, a number of epidemiological studies have indicated a higher incidence of infertility problems, male reproductive tract abnormalities and testicular cancers. Among the different hypotheses proposed, fetal or neonatal exposure to environmental compounds that can interfere with endocrine system, termed endocrine disruptors, may be at the origin of the rising incidence of these diseases. The molecules that are supposed to have long term adverse effects on the male genital tract have estrogenic or antiandrogenic properties. Some authors have suggested that the long term effects of endocrine disruptors could be mediated through epigenetic mechanisms. In this context, we have used two types of experimental models based on developmental exposure to these compounds: one model of neonatal exposure to an estrogen (estradiol benzoate) and another model of fetal exposure to an antiandrogen (flutamide). The two experimental models induce a phenotype of hypospermatogenesis in rodents. In the context of neonatal exposure to estradiol benzoate we show that the hypospermatogenesis observed in adult animals is the consequence of a chronic activation of the apoptotic process of testicular germ cells. This cell death process seem to involve the decrease of the key epigenetic effectors of DNA methylation machinery DNA methyltransferases (DNMT3A, 3B & 1), and of the antiapoptotic protein MCL-1 through post transcriptional mechanisms. In term of functional consequences the decrease of DNMTs proteins leads to increased expression of transposable element LINE-1 and Ibtk gene that are normally controlled by DNA methylation. Upstream DNMTs and MCL-1 decrease may be triggered by the increase of other epigenetic factors, the microRNAs belonging to miR-29 family. Concerning in utero exposure to flutamide, our work indicate that the chronic apoptotic process of germ cells may be linked to long term decrease of the inhibitors of apoptosis cIAP1 & 2, and an increase of proapoptotic factors SMAC/DIABLO. On the other hand, the lack of testicular somatic cell death in this model may be the result of higher expression of inhibitors of apoptosis XIAP and SURVIVIN in these cells. Besides, the apoptotic process observed at the adult age may also involve a precocious alteration of DNMTs expression. In summary, our work provides a mechanistic view to the fetal/neonatal programming of adult germ cell death. Indeed, the increased levels of miR-29s may induce: (1) a decrease in DNMTs expression levels that consequently could alter the methylation pattern of some genes, and (2) a decrease in factors that normally prevent germ cells death such as MCL-1

INTRODUÇÃO: A varicocele é a dilatação das veias do plexo pampiniforme do testículo. A associação entre a varicocele e a infertilidade é diagnosticada em 20 a 40% dos homens inférteis. Atualmente, o estudo ultrassonográfico da varicocele é realizado com o paciente na posição supina antes e durante a realização de Valsalva, levando-se em consideração o diâmetro das veias (> 0,20cm), e a presença de refluxo maior que 1, segundo ao estudo Doppler espectral. OBJETIVO: A) Propor uma nova metodologia na avaliação ultrassonográfica da varicocele. B) Avaliar a concordância dos achados no exame ultrassonográfico com Doppler colorido dos vasos dos plexos pampiniformes e as alterações no espermograma na infertilidade masculina. C) Avaliar a correlação entre o diâmetro de um dos vasos dos plexos pampiniformes e as alterações no espermograma na infertilidade masculina. MÉTODOS: Foram examinados 266 pacientes, provenientes do setor de reprodução humana do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCUSP), por meio de duplex Doppler colorido, inicialmente com o paciente em decúbito dorsal e posteriormente, após 5 minutos de espera, na posição ortostática, realizando as medidas dos diâmetros transversais dos plexos pampiniforme nas duas posições, tanto em repouso como em Valsalva. Ao estudo pulsado foi considerado refluxo patológico apenas quando persistia por mais de 1 segundo, com uma velocidade superior que 2 cm/s. Estes pacientes também foram submetidos a analise seminal. RESULTADOS: Em relação à metodologia de realização do exame, observou-se aumento no diâmetro do plexo pampiniforme apenas com a variação da posição de cerca de 18% à direita e 5,9% à esquerda, bem como aumento na detecção do refluxo venoso na posição ortostática, de 23% à direita e 6,8% à esquerda. Observou-se também correlação direta entre as alterações no espermograma com o refluxo venoso, 65% à direita e 86% à esquerda, o mesmo não ocorrendo com o diâmetro do plexo pampiniforme. CONCLUSÕES: A) O exame de ultrassongrafia com Doppler colorido deve ser realizado na posição ortostática, após um período de latência de no mínimo cinco minutos, com condições ambientais confortáveis e manobra de esforço. B) Houve concordância significativa entre o refluxo venoso nos plexos pampiniformes e as alterações do espermograma. C) Não há correlação significativa entre o diâmetro de um dos vasos dos plexos pampiniformes e o espermograma
INTRODUCTION: Varicocele is the dilatation of the veins of the pampiniform plexus of the testicle. The association between varicocele and infertility is diagnosed in 20 to 40% of the infertile men. Currently, in the ultrasound study of varicocele, the diameter of the veins is carried through with the patient in the supine position, before and during the Valsalva maneuver, taking the diameter of the veins consideration (> 0,20cm), and a more than 1 second bigger presence of reflux according to spectral Doppler study. OBJECTIVE: A) To consider a new methodology in the ultrasonographic evaluation of varicocele. B) To evaluate the agreement of the findings in the colorful Doppler ultrasonographic examination of the pampiniform plexus vases with the alterations in the spermogram in masculine infertility. C) To evaluate the correlation between the diameter of one the pampiniform plexus vases and the alterations in the spermogram in the masculine infertility. METHODS: 266 patients from the reproduction sector human being of the Hospital of the Clinics of the University of São Paulo (HCUSP) had been examined, by means of colorful duplex-Doppler, initially with the patient in dorsal decubitus and later, after 5 minutes, in the orthostatic position, carrying through the transversal measures of the diameter of the pampiniform plexus in the two positions, in rest and in Valsalva. To the pulse study reflux was considered pathological only when persisted for more than 1 second, with speed superior to 2 cm/s. These patients were also submitted to seminal analysis. RESULTS: Regarding the methodology of accomplishment of the examination, an increase in the diameter of pampiniform plexus was noted only with the variation of the examination position, about 18% to the right and 5,9% to the left, as well as an increase in the detection of venous reflux in the orthostatic position, 23% to right and 6,8% to the left. It was also detected a correct correlation between variations in the spermogram and the venous reflux, 65% to the right and 86% to the left, the same not occurring with the diameter of pampiniform plexus. CONCLUSIONS: A) The colorful Doppler ultrasound examination must be carried through in the orthostatic position, after a period of latency of at least five minutes, with comfortable environement conditions and effort maneuver. B) A significant accordance between the pampiniform plexus venous reflux and the alterations of the spermogram. C) It does not have significant correlation between the diameter of one of the pampiniform plexus vases and the spermogram

Topaz1 (pour Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1) est un gène très conservé chez les vertébrés qui présente une expression spécifique dans les cellules germinales. La caractérisation du modèle murin dépourvu du gène Topaz1 a mis en évidence son rôle indispensable pour la fertilité mâle. Les souris mutantes présentent un arrêt de la spermatogenèse lors de la première division méiotique. Les spermatocytes Topaz1-/- bloqués en fin de prophase I de méiose présentent un défaut d’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique. D'un point de vue histologique, les différences observées entre les testicules de souris Topaz1-/- et Topaz1+/+ apparaissent entre 15 (P15) et 20 (P20) jours après la naissance. Une première analyse transcriptomique par puce à ADN a montré que 10% des gènes dérégulés (DEGs) à P20 sont des ARN non codants longs (lncRNAs). Au cours de cette thèse, des analyses transcriptomiques à haut débit (RNAseq) ont été réalisées à P16 et P18 afin de mieux caractériser le phénotype testiculaire des souris dépourvues du gène Topaz1. Dès P16, le transcriptome testiculaire est perturbé et le nombre de DEGs est multiplié par 10 à P18. Des gènes associés au centrosome, centriole, à la dynamique des microtubules et à la spermatogenèse appartiennent aux voies moléculaires les plus perturbées. De plus, un quart des DEGs sont des lncRNAs. Trois d'entre eux, dérégulés à P16 et à P18, ont été étudiés par hybridation in situ et biologie moléculaire et sont spécifiques des cellules germinales. Puis une lignée de souris exempt d'un de ces lncRNA a été générée grâce à la technologie CripsR/Cas9. Ces animaux mutants se développent normalement et sont fertiles pour les deux sexes.Néanmoins, les souris mâles mutantes présentent une diminution de plus de 50% de la concentration de spermatozoïdes épipidymaires ainsi qu’une modification de paramètres de motilité par rapport à des souris sauvages. Des nouvelles analyses RNAseq ont été réalisées afin d'étudier le transcriptome testiculaire de ces souris. Elles mettent en évidence que ce lncRNA régule un nombre important de gènes codants pour les protéines (environ 80% des DEGs à P18). Là encore, certains d'entre eux régulent la dynamique des microtubules, la spermatogenèse et la génération des gamètes haploïdes.En conclusion, le gène Topaz1 murin est donc essentiel pour la mise en place d’un fuseau bipolaire en fin de prophase I de méiose et son absence empêche la première division méiotique. La dérégulation d’un nombre important de gènes codants pour des protéines du centrosome, des microtubules et de la spermatogenèse ainsi que la forte répression de l'expression de lncRNAs au sein du testicule murin laisse à penser que des complexes ARNs-protéines se forment au cours de la méiose.Dans cette étude, la suppression d'un de ces lncRNA ne perturbe pas la fertilité des souris bien que la concentration spermatique soit réduire de moitié. Chez l'homme, une telle baisse pourrait conduire à des infertilités masculines. Une mutation du gène Topaz1 chez l'homme pourrait aussi induire une azoospermie non obstructive. L'étude des complexes ARN-protéines pourrait représenter un nouveau champ d’investigation dans l’étude des infertilités et notamment de la régulation de la méiose
Topaz1 (Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1), a germ cell specific factor, is a highly conserved gene in vertebrates. The study of the Topaz1-inactivation mouse model demonstrated its essential role for male fertility. The absence of Topaz1 in mutant mice caused spermatogenesis arrest during the first meiotic division. Topaz1-/- spermatocytes, blocked at the end of meiotic prophase I, showed chromosome misalignment along the metaphase I plate. Histological experiments specified that the differences observed between Topaz1-/- and Topaz1+/+ mouse testes appeared between 15 (P15) and 20 (P20) days post-partum. Previously, transcriptomic analyses using a whole-genome expression array indicated that 10% of P20-deregulated genes (DEGs) were long non-coding RNAs (lncRNAs). During this thesis, high throughput transcriptomic analyses (RNAseq) were performed at P16 and P18 in order to better characterise the testicular phenotype of mice lacking the Topaz1 gene. From P16, the testicular transcriptome was disturbed and the DEGs number was multiplied by 10 at P18. Genes associated with centrosome, centriole, microtubule dynamics and spermatogenesis belonged to the most disturbed molecular pathways. Moreover, a quarter of DEGs were lncRNAs. Three of them, deregulated at P16 and P18, were studied by in situ hybridization and molecular biology techniques. They were germ cell specific. Thus, a new mouse model deleted for one of these lncRNAs was generated using CRISPR/Cas9 technology. These mutant mice developed normally and were fertile in both sexes. However, mutant male mice presented a more than 50% decrease in the epididymal sperm concentration as well as a change in motility parameters compared to wild-type mice. New RNAseq analyses were realised to study testicular transcriptome of these mice. These showed that this lncRNA regulates a large number of protein-coding genes (approximately 80% of the DEGs at P18). There again, some of them regulated microtubule dynamics, spermatogenesis and haploid gamete generation.In conclusion, this work shows that the murine Topaz1 gene is therefore essential for the establishment of the bipolar spindle during the transition from late prophase I to metaphase I and its absence prevents the first meiotic division. The deregulation of a significant number of protein-coding genes of the centrosome, microtubule movements and spermatogenesis, as well as the strong repression of lncRNAs expression within mouse testis, suggests that RNAs-proteins complexes are formed during meiosis.In this study, deletion of one of these lncRNA did not affect fertility in mice even though sperm concentration was halved. In men, such a decrease could lead to male infertility. A mutation of the Topaz1 gene in men could also induce non-obstructive azoospermia. The study of RNAs-proteins complexes could represent a new field of investigation in the understanding of infertility, particularly in meiotic regulation

In the last decades estrogens have been regarded as “male hormones” playing an important role controlling male reproductive function. However, the effect of estrogens regulating testicular function and the spermatogenic process it is not fully addressed. Estrogenic actions in target tissues, including testis, are mediated by hormone interaction with the classical estrogens receptors (ER and ER) and also via the membrane G-protein coupled receptor (GPR30/GPER). Ultimately, the estrogens alter the gene expression network in cells and tissues modulating its functioning. Male fertility relies on a successful spermatogenesis, which is dependent from the support of Sertoli cells (SCs), the somatic cells within seminiferous tubules (SeT). Apoptosis is a key event strictly maintaining the appropriate ratio between germ cells and SCs and, thus, it is crucial to maintain the spermatogenic output. It has been suggested that SCs play a crucial role controlling germ cells fate, by secretion of survival and death factors, which act on receptors in germ cells. These include the survival factor desert hedgehog (Dhh), the stem cell factor (SCF) and its receptor the c-kit, as well as the death factors Fas-Ligand (FasL) and Fas-receptor (FasR). It has been shown that estrogens regulate Dhh, SCF, c-kit, FasL and FasR expression in several other tissues. Therefore, we hypothesize that estrogens may influence germ cell survival or death in testicular cells by governing the expression of SCF, c-kit, FasL, FasR. In the present work rat SeT and SCs were cultured in presence or absence of 100nM of 17β-estradiol (E2), and the expression of the aforementioned factors was studied through real-time PCR and Western blot techniques. In addition, in order to start elucidating the molecular mechanisms by which the estrogenic effects are attained, SCs were cultured with E2 0,1nM and with 100nM of each ER specific agonist: G1, DPN and PPT, respectively, agonists for GPER, ERand ER. E2 down-regulated the c-kit expression while increasing expression of its ligand, SCF, both in SeT and SCs. The expression of Fas system, FasR and FasL was also increased in response to E2. No differences were found in Dhh expression between experimental groups. The expression of SCF and FasL in SCs was strongly increased by G1 stimulation indicating the involvement of GPRER. Our results demonstrated that the estrogenic stimulation may modulate germ cell apoptosis in a direct way or through altering germ cell:SCs communication, which could have a profound impact in male fertility, particularly in cases of hyperestrogenism.
Nas últimas décadas os estrogénios têm sido considerados hormonas masculinas, desempenhando um papel importante no controlo das funções reprodutivas masculinas. Contudo, o efeito dos estrogénios na regulação das funções testiculares ainda não está completamente abordado. As ações estrogénicas nos tecidos alvo, entre eles o testículo, são mediadas por interações hormonais com os recetores de estrogénios (ER e ER) clássicos e também através do recetor membranar associado à proteína-G (GPR30/GPER). Por fim, os estrogénios alteram a rede de expressão dos genes nas células e nos tecidos, modulando o seu funcionamento. A fertilidade masculina assenta numa espermatogénese bem sucedida, a qual é dependente do suporte das células de Sertoli (SCs), as células somáticas presentes nos túbulos seminíferos (SeT). A apoptose é o evento chave que mantem o ratio apropriado entre as células germinativas e as SCs e desta forma é crucial para manter a qualidade e quantidade do processo espermatogénico. Tem sido sugerido que as SCs desempenham um papel crucial no controlo do destino das células germinativas através da secreção de fatores de sobrevivência/morte, que atuam nos recetores nas células germinativas. Esses incluem o fator de sobrevivência Desert Hedgehog (Dhh), o Stem Cell Factor (SCF) e o seu receptor (c-kit), assim como os fatores de morte Fas Ligando (FasL) e o seu recetor (FasR). Tem sido demonstrado que os estrogénios regulam a expressão do Dhh, SCF, c-kit, FasL e FasR em diversos tecidos. Portanto colocou-se a hipótese de que os estrogénios podem influenciar a sobrevivência ou morte das células testiculares através do controlo da expressão dos referidos genes. Neste trabalho, SeT e SCs de rato foram colocados em cultura na presença ou ausência de 100nM de 17β-estradiol (E2), e a expressão dos fatores acima-citados foi estuda através das técnicas de Real-Time PCR e Western Blot. Além disso, para elucidar qual o mecanismo molecular pelo qual o efeito dos estrogénios é conseguido, SCs foram colocadas em cultura na presença de 100 nM E2 ou 100nM de agonistas específicos para cada um dos recetores: G1, DPN e PPT, respetivamente, agonistas para o GPER, ERα e ERβ. O E2 diminuiu a expressão do c-kit enquanto por sua vez expressão do seu ligando SCF aumentou. Não houve diferenças na expressão do Dhh entre os diferentes grupos experimentais. A expressão do SCF e do FasL nas SCs foi muito aumentada pela estimulação com G1 indicando o envolvimento do GPER. Os nossos resultados demonstram que a estimulação com estrogénios pode moldar a apoptose das células germinativas tanto de uma forma directa como através da alteração da comunicação entre as SCs e as células germinativas, podendo isto ter um profundo impacto na fertilidade masculina em especial nos casos de hiperesteroidismo.

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Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG
Male infertility affects about half of couples with infertility history and is considered a multifactorial syndrome, including a broad spectrum of diseases. Chromosomal abnormalities are a major cause of human infertility and interfere with spermatogenesis. Infertility in patients with Klinefelter's syndrome (KS) is a consequence of degeneration of germ cells and that affects about 4% of infertile men. Objective: To investigate the presence of chromosomal abnormalities in infertile men with azoospermia or oligozoospermia seen at the Human Reproduction Laboratory of the Hospital das Clinicas (LabRep -HC) of the Federal University of Goiás, in 2013. Methodology: Descriptive study. Metaphases were analyzed in GTG bands obtained from lymphocytes cultures of 20 infertile men idiopathic causes. Results: The patients' ages ranged from 26-59 years and the design attempts ranged on average of 5 (± 5.02) years. In 3/20 (15%) patients were found karyotype 47, XXY (SK) and the rest, 17/20 patients had a normal karyotype. Conclusion: Genetic testing can help identify which patients would benefit from the technical reproduction. These studies are relevant because the assisted reproduction techniques ignore the process of natural selection and some classic chromosomal abnormalities end some deleterious mutations that could through generations. Thus, genetic assessment can lead to genetic counseling and hence the primary and secondary prevention of congenital defects in offspring of patients with male infertility. This study helps to assess the prevalence of chromosomal abnormalities in some men treated at LabRep - HC UFG.
A infertilidade masculina afeta cerca da metade dos casais com histórico de infertilidade e é considerada uma síndrome multifatorial, incluindo um amplo espectro de doenças. As anormalidades cromossômicas são uma das principais causas de infertilidade humana e interferem na espermatogênese. A infertilidade em indivíduos com a síndrome de Klinefelter (SK) é uma consequência da degeneração de células germinativas e acomete cerca de 4% dos homens com infertilidade. Objetivo: Investigar a presença de anormalidades cromossômicas de homens inférteis com azoospermia ou oligozoospermia, atendidos no Laboratório de Reprodução Humana do Hospital das Clínicas (LabRep -HC) da Universidade Federal de Goiás, no ano de 2013. Metodologia: Estudo descritivo. Foram analisadas metáfases em bandas GTG obtidas a partir de cultura de linfócitos de 20 homens inférteis de causas idiopáticas. Resultados: A idade dos pacientes variou de 26-59 anos e as tentativas de concepção variaram em média de 5 (± 5,02) anos. Em 3/20 (15%) pacientes foi encontrado cariótipo 47,XXY (SK) e o restante, 17/20 pacientes, apresentaram cariótipo normal. Conclusão: Os testes genéticos podem ajudar a identificar quais pacientes poderiam ser beneficiados com as técnicas de reprodução. Estes estudos são relevantes, pois as técnicas de reprodução assistida ignoram o processo de seleção natural e algumas anormalidades cromossômicas clássicas ou algumas mutações deletérias que poderiam ser herdadas. Desta forma, a avaliação genética pode levar ao aconselhamento genético e, consequentemente, à prevenção primária e secundária dos defeitos congênitos nos descendentes dos pacientes com infertilidade masculina. O presente estudo contribui para avaliar a prevalência de anormalidades cromossômicas de alguns homens atendidos no LabRep - HC da UFG.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-09Bitstream added on 2014-06-13T18:39:54Z : No. of bitstreams: 1 maia_fa_me_botfm.pdf: 761192 bytes, checksum: af7cd1654f8ff045bdb288b848b037dc (MD5)
A infertilidade é definida pela inabilidade de engravidar após 12 meses ou mais de coito regular não protegido. O uso de polivitamínico e polimineral parece influenciar na qualidade seminal. Dados da literatura sobre o uso oral isolado ou combinado desses micronutrientes na melhoria dos parâmetros seminais e eventual fertilidade são controversos e escassos. Analisar os parâmetros seminais de indivíduos inférteis em uso de polivitamínico e polimineral e compará-los com indivíduos normais, comprovadamente férteis sem uso destas substâncias. Foram analisados os parâmetros Seminais de 57 casais inférteis acompanhados no ambulatório de esterilidade do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, no período de 2003 a 2007. Nos indivíduos inférteis a análise seminal foi realizada antes e com 90 dias de micronutrientes por via oral os quais foram comparados com 50 indivíduos saudáveis comprovadamente férteis sem uso destas substâncias. A avaliação do sêmen foi feita de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde - OMS (1999) e morfologia de Kruger et al. (1986). A análise estatística foi feita utilizando os testes t de Student, Mann-Whitney e Wilcoxon, considerando um nível de significância de 5%. Os indivíduos inférteis e os comprovadamente férteis apresentaram similaridade quanto a idade (31,0±5,6 versus 30,3±6,5) (p=0,55) e ao tabagismo (29,8% versus 22,0) (p=0,36). Nos indivíduos inférteis, o uso desses micronutrientes aumentou significativamente a morfologia tanto pelos critérios estabelecidos pela OMS (18,3±9,6 para 22,6±11,8) (p=0,006) e por Kruger (6,9±4,1 para 9,1±5,2) (p=0,002). Verificou-se que os homens inférteis antes do uso de micronutrientes quando comparados aos férteis apresentavam significantemente uma menor concentração de espermatozóides/ml (68,0[37,8;101,2]...
Infertility is defined as the inability to become pregnant after 12 months or more of regular unprotected intercourse. The use of multivitamin/multimineral supplements seems to influence semen quality. Data on the isolated or combined use of these micronutrients to improve semen parameters and eventual fertility are controversial and scarce. To assess semen parameters in infertile individuals using multivitamin and multimineral supplements in comparison with healthy proven fertile individuals not using these substances. Semen parameters were evaluated in 57 infertile couples followed up in the Sterility Outpatient Clinic of Botucatu Medical School between 2003 and 2007. Semen analysis was performed before and after 90 days of oral micronutrient use in infertile individuals that were compared with 50 healthy proven fertile individuals not using these substances. Semen was evaluated according to the recommendations of the World Health Organization- WHO (1999) and the criteria described by Kruger et al. (1986). Statistical analysis was carried out using Student’s t test and the tests of Mann-Whitney and Wilcoxon with significance set at 5%. Infertile and proven fertile individuals showed similar age (31.0±5.6 versus 30.3±6.5) (p=0.55) and smoking status (29.8% versus 22.0) (p=0.36). In infertile individuals, the use of micronutrients significantly improved morphology according to the criteria of WHO (18.3±9.6 to 22.6±11.8) (p=0.006) and Kruger (6.9±4.1 to 9.1±5.2) (p=0.002). Before micronutrient use, infertile individuals compared with fertile males showed lower spermatozoa/ml concentration (68.0[37.8;101.2] versus 96.5[49.0;144.2]) and vitality (85,4±9,2 versus 89.6±6.9) and higher leukocyte count (600.0 [300.0;121.5] versus 350.0[100.0;675.0]). In infertile individuals using multivitamin and multimineral supplements, semen parameters... (Complete abstract click electronic access below)

Els individus infèrtils poden presentar anomalies d'aparellament, sinapsi o recombinació dels cromosomes meiòtics i/o alteracions en la dotació cromosòmica dels espermatozoides resultants. Per aquesta raó, els protocols d'anàlisi de la infertilitat masculina sovint inclouen estudis citogenètics de la meiosi en mostres de teixit testicular i/o estudis d'hibridació in situ fluorescent (FISH) en espermatozoides en mostres de semen. Tot i així, les sèries d'individus publicades mostren una elevada variabilitat probablement deguda: al nombre d'individus analitzats, als criteris d'inclusió d'aquests, a les característiques de la població control, als criteris de valoració de les mostres o a les comparacions estadístiques realitzades. A més a més, les característiques pròpies de les mostres de teixit testicular afegeixen algunes limitacions a aquest estudi; ja sigui perquè la quantitat de mostra sovint és escassa, perquè els individus infèrtils poden presentar aturades en l'espermatogènesi que impliquen una reducció en el nombre de fases avaluables o perquè no es poden identificar els cromosomes implicats en les anomalies. Per tot això, sovint es fa difícil establir les indicacions sota les quals realitzar estudis citogènetics sobre mostres de teixit testicular i/o estudis de FISH en espermatozoides, definir un protocol estandarditzat d'anàlisi i interpretar els resultats obtinguts d'aquests estudis en el context del consell genètic reproductiu del pacient infèrtil.
Així doncs, en aquest treball es va plantejar optimitzar un protocol seqüencial d'identificació i anàlisi dels cromosomes meiòtics, combinant tècniques de tinció uniforme i d'hibridació in situ fluorescent Múltiplex (M-FISH), per tal de determinar la incidència d'anomalies cromosòmiques en els espermatòcits a metafase I i a metafase II d'una sèrie d'individus infèrtils. A més a més, també analitzar la proximitat dels bivalents autosòmics al bivalent sexual a metafase I. D'altra banda, es van emprar estudis de FISH en espermatozoides per determinar la incidència d'anomalies cromosòmiques dels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21 en els espermatozoides d'una sèrie d'individus infèrtils. En aquest treball també es va analitzar la relació entre les anomalies cromosòmiques observades en els espermatòcits i en els espermatozoides amb el seminograma, el cariotip i l'edat dels individus. Finalment, es va plantejar establir directrius per a la utilització dels estudis meiòtics i dels estudis de FISH en espermatozoides en el context de l'estudi clínic del pacient infèrtil.
Per assolir aquests objectius es van analitzar les metafases I i metafases II de 37 mostres de teixit testicular i els espermatozoides de 319 mostres de semen d'individus infèrtils. L'historial clínic del pacient va proporcionar informació del seminograma, del cariotip somàtic, del cariotip meiòtic i de l'edat d'alguns d'aquests pacients. En relació a les mostres de teixit testicular, i a partir de l'estudi dels espermatòcits primaris a l'estadi de metafase I, es va avaluar el nombre de quiasmes dels 23 bivalents per cada pacient, la variabilitat entre individus i la relació entre el recompte de quiasmes i el cariotip i/o el seminograma; a més a més d'analitzar la proximitat dels bivalents al bivalent sexual en aquesta fase. També es va avaluar la morfologia dels cromosomes a l'estadi de metafase II i els resultats obtinguts es van relacionar amb els descrits a metafase I. Pel que fa a les mostres de semen, i a partir de l'anàlisi dels cromosomes X, Y, 13, 18 i 21 mitjançant FISH, es van establir les freqüències de disomies i diploïdies dels espermatozoides d'aquests individus, i es van comparar amb la població control. Les comparacions també es van realitzar en relació al seminograma, al cariotip somàtic i al cariotip meiòtic dels individus. A més a més, es va analitzar la possible correlació entre els increments d'anomalies cromosòmiques dels espermatozoides i els paràmetres de recompte espermàtic, motilitat, morfologia i l'edat del pacient. Els resultats detallats d'ambdós estudis es recullen en la memòria escrita del treball.
Analitzant conjuntament els resultats obtinguts en el present estudi i els publicats a la bibliografia, es va concloure que:
El 48% dels individus infèrtils presenten un percentatge d'anomalies meiòtiques a l'estadi de metafase I compatible amb el diagnòstic de "meiosi alterada". La reducció del nombre de quiasmes, la presència d'univalents i l'observació de metafases tetraploides són les anomalies més freqüents. El nombre i el tipus d'anomalies són diferents entre les cèl·lules d'un mateix individu suggerint la coexistència de línies cel·lulars de comportament meiòtic normal i línies cel·lulars amb anomalies.
La presència de cromàtides separades, la pèrdua de cromàtide i l'observació de metafases aneuploides i diploides, són les anomalies més freqüents a metafase II en individus infèrtils.
El 15% dels individus infèrtils presenten increments significatius d'anomalies cromosòmiques en els espermatozoides. L'increment en el nombre d'espermatozoides disòmics pels cromosomes sexuals i/o en el nombre d'espermatozoides diploides són les anomalies més freqüents.
La reducció del nombre de quiasmes a metafase I i la separació de les cromàtides germanes a metafase II afecta majoritàriament els bivalents/cromosomes autosòmics de mida mitjana i gran. Ambdues observacions es podrien relacionar amb una recombinació aberrant a primera divisió meiòtica, entesa com una reducció significativa del número de quiasmes i/o la presència de quiasmes pericentromèrics.
El cromosomes sexuals i els cromosomes del grup F i G, principalment el cromosoma 21, són els que s'observen amb més freqüència en forma d'univalent, els més implicats en aneuploïdies a metafase II i en anomalies cromosòmiques en espermatozoides.
La presència de percentatges significatius d'espermatòcits primaris tetraploides espermatòcits secundaris diploides posa de manifest la competència meiòtica de les línies tetraploides. L'increment significatiu d'espermatozoides diploides observat en pacients infèrtils suggereix la implicació d'anomalies cromosòmiques mitòtiques en la formació de gàmetes diploides.
La posició dels bivalents a la placa metafàsica no és aleatòria: els bivalents formats per cromosomes dels grups D i G, i els bivalents 15 i 22 de forma particular, s'observen preferentment propers al bivalent sexual a metafase I.
Les anomalies cromosòmiques en espermatòcits primaris i espermatozoides s'associen de forma significativa amb individus oligozoospèrmics i/o pacients amb alteracions del cariotip somàtic, ja sigui amb variants polimòrfiques o anomalies cromosòmiques estructurals.
L'increment significatiu d'anomalies cromosòmiques en cèl·lules germinals en individus amb alteracions del cariotip recolza l'existència d'efectes intercromosòmics entre els cromosomes implicats i altres cromosomes del complement.
La freqüència d'anomalies cromosòmiques numèriques analitzada en els espermatozoides dels individus infèrtils no mostra correlació amb l'edat.
L'estudi meiòtic en biòpsia testicular està indicat en individus amb baix recompte espermàtic i/o alteracions del cariotip. Tenint en compte la informació obtinguda i el cost del procediment, no es recomana la incorporació rutinària de la tècnica de M-FISH en l'àmbit clínic. Es proposa la utilització de protocols citogenètics clàssics adreçats a analitzar la mitjana individual de quiasmes.
Diferències significatives entre aquest valor i la freqüència basal s'interpretaran com "meiosi alterada". Un resultat de "meiosi alterada", tot i indicar anomalies en els processos d'aparellament, sinapsi i/o recombinació dels cromosomes, en la majoria de casos no es tradueix amb un increment d'anomalies cromosòmiques en espermatozoides.
L'estudi de FISH en espermatozoides està indicat en individus amb un cariotip somàtic normal i baix recompte espermàtic, en individus amb un cariotip somàtic alterat i en individus amb un cariotip meiòtic anormal. L'estudi dels cromosomes 21, X i Y permet identificar la majoria dels pacients amb probabilitat de produir espermatozoides amb anomalies cromosòmiques. Un resultat de FISH en espermatozoides alterat, independentment del valor numèric, s'interpretarà com l'evidència d'anomalies en el procés de l'espermatogènesi i per tant, proporciona informació qualitativa del procés.
Infertile males can be affected by pairing, synaptic or recombination abnormalities in the meiotic chromosomes and/or chromosomal abnormalities in the resulting spermatozoa. For this reason, screening protocols of male infertility often include meiotic cytogenetic studies in testicular biopsies and/or fluorescent in situ hybridization (FISH) studies in spermatozoa from semen samples. However, the series published up to date show high variability in the results reported. This fact could be due to the number of individuals of the series, the inclusion criteria, the characteristics of the control population, the criteria used for sample assessment or even the statistical handling of data. In addition, the intrinsic characteristics of the testicular biopsies add limitations to meiotic studies: the scarce amount of the sample, the reduce number of evaluable phases (meiotic arrest) or the unfeasibility to clearly identify the chromosomes involved in the meiotic anomalies observed. Therefore, it is difficult to establish the indications for meiotic studies in testicular samples and/or FISH studies in spermatozoa. Furthermore, it is difficult to offer standardized protocols of analysis and to interpret the results obtained from these studies in the context of the reproductive genetic counsel to be given to the infertile patients.
The first aim of this work was the optimization and the application of a sequential protocol from meiotic chromosome analysis, combining uniform staining techniques and multiplex fluorescent in situ hybridization protocols (M-FISH), addressed to assess the incidence of chromosomal abnormalities in metaphase I and in metaphase II spermatocytes from an infertile male series. The vicinity of the sex chromosomes (XY) to autosomic chromosomes in metaphase I was also analyzed. Furthermore, FISH studies in spermatozoa were used to estimate the incidence of chromosomal abnormalities in chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 in a series of infertile individuals. The relationship of the chromosomal abnormalities observed in spermatocytes and spermatozoa with the seminal parameters, the karyotype and the age of the individuals was also studied. Finally, to establish guidelines for an appropriate application of meiotic studies and sperm FISH analyses in the clinical cytogenetic evaluation of the infertile patient was also attempted.
To attain these objectives, metaphases I and metaphases II of 37 testicular tissue samples and spermatozoa from 319 semen samples from infertile individuals were analyzed. Clinical records provided us with information of seminal parameters, somatic karyotype, meiotic karyotype and age of some of these patients.
Analyses of primary spermatocytes in the metaphase I stage allowed establishing the chiasmata number for every bivalents and patient, the variability among individuals and the relation between chiasmata count and the karyotype and/or the seminal parameters. Moreover, the proximity of the XY bivalent to other chromosome pairs in this phase was evaluated. The morphology of the chromosomes was also analyzed in the metaphase II stage and the results obtained were compared with the ones obtained from metaphase I. Regarding the semen samples, from the FISH analysis of chromosomes X, Y, 13, 18 and 21, the frequencies of disomic and diploid spermatozoa were established, and compared to a control population. The comparisons were also carried out to the seminal parameters, the somatic karyotype and the meiotic karyotype of the individuals. Moreover, the possible correlation between increases of chromosomal abnormalities in spermatozoa and variations in sperm parameters (count, motility and morphology) and the age of the patients were evaluated. Detailed results of the studies undertaken were included in the report of this work.
In view of the results obtained in the study it was concluded that:
Forty-eight percent of infertile males show a percentage of meiotic abnormalities in metaphase I compatible with the diagnosis of "abnormal meiosis". The reduction in the number of chiasmata, the presence of univalents and the observation of tetraploid metaphases are the most frequent anomalies. The number and the type of anomalies are different among cells in the same individuals, suggesting the coexistence of cell lines with a normal meiotic behavior and cell lines with meiotic abnormalities.
The presence of separated chromatids, chromatid loss and the observation of aneuploid and diploid metaphases, are the most frequent anomalies in metaphase II in infertile individuals.
Fifteen percent of infertile males show significant increases of chromosomal abnormalities in spermatozoa. The most frequent anomalies are the increase of spermatozoa disomic for the sex chromosomes and/or the number of diploid spermatozoa.
The reduction in the number of chiasmata in metaphase I and the separation of the sister chromatids in metaphase II affects mostly autosomal chromosomes of medium and large size. Both observations could correlate with aberrant recombination in the first meiotic division, knowledgeable as a significant reduction in the number of chiasmata and/or the presence of pericentromeric chiasmata.
The sex chromosomes and the chromosomes of group F and G, mainly chromosome 21, are those observed with more frequency in univalent form, the ones more involved in aneuploidies in metaphase II and in chromosomal abnormalities in spermatozoa.
The presence of significant percentages of tetraploid primary spermatocytes and diploid secondary spermatocytes evidences the meiotic competence of tetraploid lines. The significant increase of diploid spermatozoa observed in infertile patients suggests the implication of mitotic chromosomal anomalies in the formation of diploid gametes.
The position of the bivalents in the metaphase I plate is not random: bivalents corresponding to chromosomes of groups D and G, and bivalents 15 and 22 in particular, are preferably observed in the vicinity of the XY bivalent.
Chromosomal abnormalities in primary spermatocytes and in spermatozoa are significantly associated with oligozoospermic individuals and/or patients with alterations of the somatic karyotype (polymorphic variants or structural chromosomal anomalies).
The significant increase of chromosomal abnormalities in individuals with alterations of the karyotype supports the existence of interchromosomal effects between the implied chromosomes and other chromosomes of the complement.
The frequency of numeric chromosomal anomalies analyzed in spermatozoa of infertile males does not show any correlation with the age of the patients.
Meiotic studies in testicular biopsy are indicated in individuals with low sperm counts and/or alterations of the karyotype. Taking into consideration the information obtained and the cost of the procedure, the routinely use of the M-FISH technique in the meiotic clinical analysis is not recommended. The use of classical cytogenetic protocols addressed to analyze the individual average of chiasmata is proposed. Significant
differences between this value and the basal frequency will be interpreted as "abnormal meiosis". A result of "abnormal meiosis", although being indicative of pairing, synapsis and/or recombination anomalies, in the majority of cases does not lead to increases in sperm chromosome abnormalities.
FISH studies in spermatozoa are indicated in individuals with a normal somatic karyotype and low sperm counts, in individuals with an abnormal somatic karyotype and in individuals with an abnormal meiotic karyotype. The study of chromosomes 21, X and Y allows the identification of the majority of the patients with probability of producing spermatozoa with chromosomal abnormalities. An abnormal result of the sperm FISH study, independently of the numerical value, will be interpreted as evidence of anomalies in the spermatogenesis and therefore, provides qualitative information of the process.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2016-08-18T13:22:41Z No. of bitstreams: 1 BARBARA MARIOTTO BORDIN.pdf: 616329 bytes, checksum: 1c5d8ba717c3f2049b989263d9efa19f (MD5)
Made available in DSpace on 2016-08-18T13:22:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BARBARA MARIOTTO BORDIN.pdf: 616329 bytes, checksum: 1c5d8ba717c3f2049b989263d9efa19f (MD5) Previous issue date: 2009-03-16
Oestrogen Receptor (ER ) gene plays an important role in the regulation of fertility in both males and females. The RsaI polymorphism in exon 5 of ER has been shown to be associated with male infertility in Caucasian patients. The aim of this study was to investigate the frequency of this polymorphism in the etiology of idiopathic male infertility and to correlate with smoking and ethylism habits, xenobiotic contact and mumps. We analyzed 287 Brazilian men, including 161 infertile and 126 fertile men to evaluate the association of RsaI polymorphism in male infertility. The RsaI variant alleles (AA, AG or GG) of the patients were determined by allele-specific polymerase chain reaction. Compared with a control group (normozoospermic men), the frequency of the heterozygous RsaI AG-genotype was four times higher in infertile men (9,94 vs. 2,38%; P = 0,01), five times higher in azoospermic men (11,36 vs. 2,38%; P = 0,02) and seven times higher in teratozoospermic men ( 17,79 vs. 2,38%; P = 0,001). The frequency of the heterozygous RsaI AG-genotype was three times higher in infertile smokers (23,8 vs. 7,4%; P = 0,038) compared with infertile nonsmokers and nine times higher in azoospermic smokers (66,7 vs. 6,9%; P = 0,035), compared with azoospermic nonsmokers. The RsaI polymorphism in the ER gene may have modulating effects on human spermatogenesis. There seems to be consistent association between RsaI polymorphism and smoking habits in infertile men.
O gene Receptor de estrogênio (RE ) desempenha um papel importante na regulação da fertilidade tanto em homens e mulheres. O polimorfismo RsaI no éxon 5 do RE tem-se mostrado associada com infertilidade masculina em caucasianos. O objetivo deste estudo foi investigar a freqüência deste polimorfismo na etiologia da infertilidade idiopática masculina e sua correlação com o tabagismo, etilismo, contato com xenobióticos e caxumba. Nós analisamos 287 brasileiros, incluindo 161 inférteis e 126 homens férteis para avaliar a associação do polimorfismo RsaI do gene RE com a infertilidade masculina. Os alelos variantes do polimorfismo RsaI (AA, AG ou GG) foram determinadas pela reação em cadeia da polimerase alelo-específica. Em comparação com um grupo controle (homens normozoospérmicos), a freqüência do genótipo heterozigoto RsaI-AG foi quatro vezes maior em homens inférteis (9,94 vs. 2,38%, P = 0,01), cinco vezes maior em azoospérmicos (11,36 vs. 2,38% , P = 0,02) e sete vezes maior em teratozoospérmicos (17,79 vs. 2,38%, P = 0,001). A freqüência do genótipo heterozigoto RsaI-AG foi três vezes maior nos fumantes inférteis (23,8 vs. 7,4%, P = 0,038) em comparação com não fumantes inférteis e nove vezes maior em fumantes azoospérmicos (66,7 vs. 6,9%, P = 0,035), comparado com não fumantes azoospérmicos. O polimorfismo RsaI no gene RE pode ter efeitos sobre a modulação da espermatogênese humana. Parece haver uma associação consistente entre o polimorfismo RsaI e tabagismo em homens inférteis.

The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.

KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics
El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic.
RESUMEN EN CASTELLANO:

El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico.

PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaABM_TESE.pdf: 1144544 bytes, checksum: 6d221c02bdb372ff108e024fd2df6e45 (MD5) Previous issue date: 2014-03-20
Culturally, childbearing is understood as a situation that subjects will experience at some point in their lives, especially people who are married or have a similar affectionate relationship. Thus, to realize the inability to meet such a fate seems to be a natural cultural trigger of suffering, frustration and feelings of inadequacy and helplessness. Specifically for men, infertility is closely related to loss of masculinity, virility. He fails in his role as a male. This study sought to understand the impact that infertility have on the existence of a man who receives such a diagnosis, both in self-image as in their marital, sexual and professional roles. This study sets up as a hermeneutic phenomenological research based on the ideas of the philosopher Martin Heidegger. Participants were seven heterosexual, married and infertile men. Two interviews were conducted. The analysis of the material included both the material of the narratives, as the affectation of the researcher when interacting with the participants and their narratives, through phenomenological-hermeneutic interpretation. The results corroborate the literature that states the difficulty of the men, immersed in a context that defines them as virile, powerful and invulnerable to worry about issues related to health and disease. The possibility of any condition that impairs the reproductive capacity exceeds the acceptable limits of daily life for these men, not being recognized as a model of masculinity present in the condition in which they recognize. This leads to questions about their masculinity, role in the marital relationship and their existence. Thus, to recognize themselves as infertile surpass a medical diagnosis and is associated with the construction of meaning for their existence from the approximation with the infertility condition, which helps in redirecting their choices, restoring the project to be self and allowing further recognition as men. In the marital relationship, doing what they can to ensure, theirs happiness. Through these actions, they remain playing the role of family provider, showing that they are able to protect their wives and taking in assisted reproduction or adoption of children viable alternatives to fulfill the desire to leave a legacy and give a child to their wives and to society. Another result observed, refers to the ontological condition of care that characterizes the human being. The ways in which men are treated socially demonstrates a type of care that focuses on the development of characteristics such as strength, virility and determination but does not allow them to cope with the suffering of emotionally difficult situations, such as the diagnosis of infertility. At the end, the study gives rise to reflections on the need to provide a 12 space for men and their expressions of suffering, as well as to recognize their ability to overcome the painful and difficult situations
Culturalmente, procriar ? compreendido como uma situa??o que o sujeito deve vivenciar em algum momento de sua vida. Descobrir-se incapaz de cumprir tal destino naturalizado parece ser desencadeador de sofrimento, frustra??o e sentimentos de incapacidade e impot?ncia. Especificamente para o homem, a infertilidade est? estreitamente relacionada ? perda de masculinidade, de virilidade. Ele fracassa em seu papel de macho . O presente estudo buscou compreender os impactos que a infertilidade produz na exist?ncia do homem que recebe tal diagn?stico, tanto nos modos de perceber a si mesmo quanto no papel conjugal, sexual e profissional. Configura-se como uma pesquisa de inspira??o fenomenol?gico-hermen?utica, baseada em ideias do fil?sofo Martin Heidegger. Participaram do estudo sete homens heterossexuais, casados e com diagn?stico de infertilidade, sendo realizadas duas entrevistas individuais. A an?lise do material compreendeu tanto o material das narrativas quanto as afeta??es da pesquisadora por ocasi?o do contato com os colaboradores e suas narrativas, por meio da interpreta??o fenomenol?gico-hermen?utica. Os resultados corroboram dados da literatura, os quais afirmam a dificuldade dos homens, imersos em um contexto que exige que eles sejam viris, potentes e invulner?veis, de se preocuparem com as quest?es relacionadas ? sa?de e ? doen?a. Assim, a possibilidade de alguma condi??o que dificulte a sua capacidade reprodutiva, ultrapassa os limites aceit?veis no horizonte cotidiano de sentido que comp?e as vidas destes homens, n?o sendo reconhecida como uma condi??o presente no modelo de masculinidade no qual eles se reconhecem. Isto leva a um questionamento a respeito de sua masculinidade, de seu papel na rela??o conjugal e na pr?pria exist?ncia. Reconhecerem-se na condi??o de homens inf?rteis vai al?m de um diagn?stico m?dico e est? relacionado ? constru??o de novos sentidos existenciais. A partir da aproxima??o com tal condi??o, redirecionam suas escolhas, resgatando o projeto de ser si-mesmos e possibilitando continuarem se reconhecendo homens. Na rela??o conjugal, fazem o que estiver ao seu alcance para garantir, de alguma forma, que as esposas se sintam satisfeitas e, atrav?s destas a??es, eles permanecem exercendo o papel de provedores da fam?lia, demonstrando serem capazes de ampar?-las e proteg?-las, tendo, na reprodu??o assistida ou da ado??o de uma crian?a, alternativas vi?veis para concretizar o desejo de deixar um legado e de prover ? fam?lia e a sociedade. Outro resultado observado diz respeito ? condi??o ontol?gica de solicitude que caracteriza o ser humano. V?rias formas como os homens s?o 10 tratados pelas pessoas que est?o mais pr?ximas demonstram um tipo de solicitude no qual, ao mesmo tempo em que s?o valorizadas caracter?sticas como for?a, virilidade e determina??o, n?o ? permitido que os homens se aproximem de sofrimento, poupando-os de situa??es emocionalmente dif?ceis, como ? o caso do diagn?stico de infertilidade. Ao final, o estudo enseja reflex?es sobre a necessidade de proporcionar espa?os de acolhimento e de escuta aos homens e ?s suas express?es de sofrimento, bem como o reconhecimento de sua capacidade de supera??o das situa??es dolorosas e dif?ceis

Orientador: Anaglória Pontes
Banca: Antonio Alberto Nogueira
Banca: Edilberto de Araújo Filho
Resumo: A infertilidade é definida pela inabilidade de engravidar após 12 meses ou mais de coito regular não protegido. O uso de polivitamínico e polimineral parece influenciar na qualidade seminal. Dados da literatura sobre o uso oral isolado ou combinado desses micronutrientes na melhoria dos parâmetros seminais e eventual fertilidade são controversos e escassos. Analisar os parâmetros seminais de indivíduos inférteis em uso de polivitamínico e polimineral e compará-los com indivíduos normais, comprovadamente férteis sem uso destas substâncias. Foram analisados os parâmetros Seminais de 57 casais inférteis acompanhados no ambulatório de esterilidade do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, no período de 2003 a 2007. Nos indivíduos inférteis a análise seminal foi realizada antes e com 90 dias de micronutrientes por via oral os quais foram comparados com 50 indivíduos saudáveis comprovadamente férteis sem uso destas substâncias. A avaliação do sêmen foi feita de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde - OMS (1999) e morfologia de Kruger et al. (1986). A análise estatística foi feita utilizando os testes t de Student, Mann-Whitney e Wilcoxon, considerando um nível de significância de 5%. Os indivíduos inférteis e os comprovadamente férteis apresentaram similaridade quanto a idade (31,0±5,6 versus 30,3±6,5) (p=0,55) e ao tabagismo (29,8% versus 22,0) (p=0,36). Nos indivíduos inférteis, o uso desses micronutrientes aumentou significativamente a morfologia tanto pelos critérios estabelecidos pela OMS (18,3±9,6 para 22,6±11,8) (p=0,006) e por Kruger (6,9±4,1 para 9,1±5,2) (p=0,002). Verificou-se que os homens inférteis antes do uso de micronutrientes quando comparados aos férteis apresentavam significantemente uma menor concentração de espermatozóides/ml (68,0[37,8;101,2]... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Infertility is defined as the inability to become pregnant after 12 months or more of regular unprotected intercourse. The use of multivitamin/multimineral supplements seems to influence semen quality. Data on the isolated or combined use of these micronutrients to improve semen parameters and eventual fertility are controversial and scarce. To assess semen parameters in infertile individuals using multivitamin and multimineral supplements in comparison with healthy proven fertile individuals not using these substances. Semen parameters were evaluated in 57 infertile couples followed up in the Sterility Outpatient Clinic of Botucatu Medical School between 2003 and 2007. Semen analysis was performed before and after 90 days of oral micronutrient use in infertile individuals that were compared with 50 healthy proven fertile individuals not using these substances. Semen was evaluated according to the recommendations of the World Health Organization- WHO (1999) and the criteria described by Kruger et al. (1986). Statistical analysis was carried out using Student's t test and the tests of Mann-Whitney and Wilcoxon with significance set at 5%. Infertile and proven fertile individuals showed similar age (31.0±5.6 versus 30.3±6.5) (p=0.55) and smoking status (29.8% versus 22.0) (p=0.36). In infertile individuals, the use of micronutrients significantly improved morphology according to the criteria of WHO (18.3±9.6 to 22.6±11.8) (p=0.006) and Kruger (6.9±4.1 to 9.1±5.2) (p=0.002). Before micronutrient use, infertile individuals compared with fertile males showed lower spermatozoa/ml concentration (68.0[37.8;101.2] versus 96.5[49.0;144.2]) and vitality (85,4±9,2 versus 89.6±6.9) and higher leukocyte count (600.0 [300.0;121.5] versus 350.0[100.0;675.0]). In infertile individuals using multivitamin and multimineral supplements, semen parameters... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Introdução: A infertilidade é uma condição mundialmente prevalente e tem sido descrita como causadora de negativas repercussões psicossociais. Prejuízos nas áreas de relacionamento marital, satisfação sexual, bem-estar psicológico e sintomatologia psíquica têm sido associadas com tal condição. O construto Qualidade de Vida (QV) tem se tornado uma ferramenta útil quando o objetivo é ampliar o entendimento sobre os fenômenos complexos para desfechos além dos eminentemente clínicos, tais como sintomatologia e morbidade. Pesquisas que investigam Qualidade de Vida em populações inférteis apresentam-se em expansão recentemente. Entretanto, tais estudos ainda são escassos quando comparados às investigações de QV em outros distúrbios clínicos. Ademais, muitos estudos investigando Qualidade de Vida em infertilidade apresentam importantes limitações metodológicas, particularmente em relação aos instrumentos de aferição. Tais estudos contemplam sobremaneira a perspectiva feminina da infertilidade (em detrimento da masculina), e são inexistentes aqueles que investigam a experiência da díade marital que vivencia a infertilidade. Objetivos: Analisar de modo sistemático os estudos originais feitos com amostras de sujeitos inférteis que apresentam como desfecho medidas de Qualidade de Vida. Demonstrar que sintomas depressivos e de ansiedade são preditores importantes de Qualidade de Vida em homens inférteis, e que sua presença media a relação entre variáveis sócio-demográficas e clínicas e o desfecho QV Investigar se as percepções de Qualidade de Vida são concordantes ou discordantes dentro da díade marital. Explorar se os cônjuges são capazes de perceber adequadamente a QV de seus parceiros. Método: Baseou-se numa revisão sistemática sobre Qualidade de Vida em Infertilidade, na qual foram usadas infertility; childless; In Vitro Fertilization; Assisted Reproduction; Intra Cytoplasmic Sperm Injection e; Quality of life como palavraschave nas seguintes base de dados: Medline, PsycInfo, Embase, Health and Psychosocial Instruments no período entre 1980 e Outubro de 2008. Nos estudos com dados originais, foram utilizadas Análises Multivariadas Hierárquicas para avaliar os preditores masculinos de Qualidade de Vida e testes t pareados, ANCOVA de Medidas Repetidas e Regressão Linear Múltipla para testar a congruência da qualidade de vida entre a díade marital. Resultados: Há evidências indicando que a infertilidade apresenta reflexos negativos e extensos na qualidade de vida de mulheres. Os achados de literatura são controversos a respeito da QV de homens inférteis. Depressão e ansiedade, mesmo em níveis subclínicos, são preditores maiores de QV em homens. O casal infértil apresenta Qualidade de Vida predominantemente comparável entre seus membros. Em relação à congruência entre as percepções de QV a partir do próprio sujeito e de seu cônjuge, a hetero-avaliação mostrou-se significativamente prejudicada, com uma consistente tendência de o observador subestimar a real QV de seu parceiro.Este efeito não foi dependente do sexo do sujeito e do cônjuge. Conclusões: A presente tese visou contribuir para o entendimento mais amplo dos sujeitos inférteis e as conseqüências psicossociais derivadas da experiência da infertilidade. O conhecimento da Qualidade de Vida em infertilidade apresenta carências, e as inovações recentes neste campo ainda não foram sistematicamente incorporadas às investigações em infertilidade. Entre estas, destaca-se especialmente a adoção de estratégias estatísticas mais refinadas e o reconhecimento de que estados mentais (particularmente depressão em variados níveis) guardam relação direta com Qualidade de Vida
Introduction: Infertility is a worldwide prevalent condition, which has been described as causing negative psychosocial repercussions. Impairments on marital relationship, sexual satisfaction, psychological well-being, and psychiatric symptomatology are associated with this condition. The construct of quality of life (QOL) has become a useful tool in order to broaden the knowledge regarding complex phenomena. As such, it is able to expand the findings beyond the clinical outcomes, such as symptomatology and morbidity. The number of studies concerning quality of life among infertile populations has increased recently. Nevertheless, these studies are et scarce when compared to those investigating QOL among other clinical disorders. Moreover, several studies on quality of life in infertility have important limitations, particularly related to the instruments of assessment. They mainly approach the feminine perspective of infertility (and not the masculine), and there are not studies that explore the experience of the marital dyad facing infertility. Method: The present thesis was based on a systematic review regarding quality of life and infertility. The following terms were used as keys for the search strategy: infertility; childless; In Vitro Fertilization; Assisted Reproduction; Intra Cytoplasmic Sperm Injection; and quality of life. The following databases were consulted: Medline, PsycInfo, Embase, Health and Psychosocial Instruments, from 1980 up to October 2008. For the papers based on original data, hierarchical multivariate analyses were used to assess the predictors of male quality of life. Paired t-tests, Repeated-Measures ANCOVA and multiple linear regressions were run to explore the congruence between the martial dyad QOL. Results: There is evidence supporting that infertility has negative and extensive repercussions on women's quality of life. Findings reported in literature regarding QOL among infertile men are controversial. Depression and anxiety, even in subclinical levels, are major predictors of QOL in men. The quality of life is comparable between the members of the infertile couple. Concerning the congruence between the self and the partner's perceptions of QOL, the proxybased one proved not to be reliable. The partner has a consistent trend towards underestimating the actual partner's QOL. This finding was not sex-related. Conclusions: The present thesis aimed to contribute to the comprehensive understanding of the infertile subject and the psychosocial consequences secondary to the experience of infertility. The field of Quality of Life still has blanks, and the recent innovations have not been systematically incorporated to the investigations on infertility. Among them, the adoption of more refined statistical strategies, and the acknowledgement that mental states (specially varied levels of depression) are associated to QOL outstand.

Mestrado em Biomedicina Molecular
Infertility is a clinical condition that affects about 15% of reproductive-aged couples worldwide. Half of these cases are due to male factors. A large percentage of male infertility cases are idiopathic, however, in the last years the influence of oxidative stress in decreased semen quality has been discussed. The lifestyle, including consumption of alcohol, tobacco, drugs and the alteration in circadian cycle, has been proposed as responsible for the increase of reactive oxygen species (ROS). This increase leads to an alteration of the balance between oxidants and antioxidant defenses present in the organism, causing oxidative stress. High levels of ROS damage biomolecules – DNA, proteins or lipids – present in sperm cells and may lead to the loss of membrane integrity, DNA fragmentation or even to death by apoptosis. The aims of the thesis was to evaluate the influence of acute lifestyle changes on oxidative balance of sperm cells. Therefore, we analyzed the antioxidant capacity of the sperm, as well as the presence of certain antioxidant proteins, by colorimetric techniques and immunoblotting. We also evaluated the effect of ROS by measuring the protein oxidation. The seminal quality was evaluated by performing a routine semen analysis. The results indicate that there is a relationship between the changes in lifestyle and the amount of antioxidants in sperm, and the most reported change involved the protein superoxide dismutase (SOD). It was also demonstrated that the variation in protein oxidation levels is dependent on the consumption of alcohol and nicotine. In this study it was concluded that oxidative balance of sperm cells is affected by lifestyle changes; in turn, oxidative balance changes is then reflected in semen quality.
A infertilidade é um problema clínico que afeta cerca de 15% dos casais em idade fértil. Metade dos casos de infertilidade deve-se a fatores masculinos, sendo que uma grande percentagem tem origem idiopática. Nos últimos anos tem-se discutido a influência do stress oxidativo na diminuição da qualidade seminal. O estilo de vida, nomeadamente o consumo de álcool e tabaco têm sido fatores propostos como responsáveis pelo aumento de espécies reativas de oxigénio (ROS), levando a uma alteração do equilíbrio entre os oxidantes e as defesas antioxidantes presentes no organismo, causando stress oxidativo. Níveis aumentados de ROS danificam as biomoléculas – DNA, proteínas ou lípidos – presentes nos espermatozoides, podendo levar à perda da integridade da membrana, à fragmentação de DNA ou até mesmo à morte por apoptose. Este estudo tem como objetivo avaliar a influência da alteração aguda do estilo de vida no equilíbrio oxidativo dos espermatozoides. Desta forma, foi analisada a capacidade antioxidante dos espermatozoides, bem como a presença de certas proteínas antioxidantes, através de técnicas colorimétricas e de immunoblotting. Foi também avaliado o efeito das ROS através da medição de oxidação proteica. A qualidade seminal foi avaliada através da realização de espermogramas. Os resultados obtidos indicam que existe uma relação entre as alterações do estilo de vida e a quantidade de antioxidantes no espermatozoide, sendo que a alteração mais marcada envolveu a proteína superóxido dismutase (SOD). Foi também detetado uma variação dos níveis de oxidação proteica, dependente da alteração dos consumos de álcool e nicotina. Com este trabalho concluiu-se que o equilíbrio oxidativo dos espermatozoides é afetado pelas alterações no estilo de vida, sendo que a alteração deste equilíbrio reflete-se posteriormente na qualidade seminal.