Literatura académica sobre el tema "Incorporation de protéines membranaires"

L’étude de l’organisation structurale et fonctionnelle des cellules eucaryotes a révélé les compartiments membranaires ainsi que la machinerie nécessaires au trafic vésiculaire des protéines. La plupart des protéines essentielles à la communication intercellulaire contiennent une séquence signal leur permettant d’être incorporées dans la voie de sécrétion conventionnelle, par laquelle les protéines sont transportées séquentiellement dans le réticulum endoplasmique (RE) puis l’appareil de Golgi. Cependant, les cellules eucaryotes sont également dotées de voies de sécrétion alternatives ou voies de sécrétion non conventionnelles, qui mettent en jeu de nombreux acteurs susceptibles de détourner certains compartiments de leurs fonctions principales au profit de fonctions sécrétoires.

Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires qui sont produites dans des compartiments endosomaux. Les mécanismes moléculaires sur lesquels reposent la biologie des exosomes, de leur biogenèse à leur internalisation par les cellules cibles, font notamment appel à des protéines membranaires particulières. Ces mécanismes méritent d’être clarifiés, afin de mieux comprendre la complexité de la composition des exosomes et de rationaliser leur utilisation comme biomarqueurs ou comme outils thérapeutiques. Nous discutons ici comment les syndécanes et les tétraspanines, deux familles de protéines d’échafaudage, coopèrent pour réguler les différentes étapes de la biologie des exosomes.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires avec 800 membres chez l’Homme qui sont exprimés à la surface de la cellule où ils répondent à un large panel de stimuli extracellulaires. Des avancées récentes indiquent que les RCPG sont également exprimés dans des compartiments intracellulaires où ils remplissent des fonctions importantes. Dans cette revue, nous nous intéresserons à la localisation et à la fonction des RCPG exprimés dans les mitochondries.

Les récepteurs couplés aux protéines G ou RCPG sont les récepteurs membranaires les plus abondants de notre génome avec environ 800 membres. Ils jouent un rôle essentiel dans la plupart des phénomènes physiologiques et physiopathologiques. De plus, ils constituent 30 % des cibles de médicaments actuellement commercialisés et restent un réservoir important pour de nouvelles thérapies innovantes. Leurs principaux effecteurs sont les protéines G hétérotrimériques. Celles-ci sont composées de 3 sous-unités, α, β et γ qui, lors du couplage avec un RCPG, se dissocient en Gα et Gβγ pour activer de nombreuses voies de signalisation. Cet article décrit certaines des avancées récentes dans la compréhension du fonctionnement et du rôle des protéines G hétérotrimériques. Après une courte introduction sur les RCPG, l’historique de la découverte des protéines G est décrit succinctement. Ensuite, les mécanismes fondamentaux de l’activation, la signalisation et la régulation des protéines G sont passés en revue. Les nouveaux paradigmes qui concernent la signalisation intracellulaire, la reconnaissance spécifique des protéines G par les RCPG ainsi que la signalisation biaisée sont également abordés.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires. Classiquement, il était admis que la signalisation des RCPG, résultant de leur couplage aux protéines G, provenait exclusivement du pool de récepteurs présents à la surface cellulaire et, qu’une fois internalisés, les RCPG devenaient « silencieux ». À l’heure actuelle, il existe des preuves expérimentales montrant que des RCPG internalisés continuent à produire un signal via les protéines G. Dans notre travail, nous avons démontré, qu’une fois internalisé et présent dans la membrane des endosomes précoces, le récepteur du peptide insulinotrope dépendant du glucose (RGIP) continue de stimuler la production d’AMPc et d’activer la protéine kinase-A (PKA). En plus de preuves indirectes montrant que les cinétiques de production d’AMPc et d’activation de la PKA sont dépendantes de l’internalisation du RGIP et de son trafic intracellulaire, nous avons identifié la forme active de Gαs dans les endosomes précoces contenant le RGIP et détecté un signal au moyen d’une sonde par RET d’AMPc démontrant une production d’AMPc à la surface des endosomes contenant le GIP.

Chez les mammifères, les acides gras sont fournis par l’alimentation ou sont synthétisés de novo par l’acide gras synthase (FASN pour fatty acid synthase). Au-delà de son rôle clé dans le stockage de l’énergie, FASN est impliquée dans de nombreux processus biologiques. Elle participe activement à la synthèse des composants membranaires nécessaires à la division cellulaire, à la modification des protéines, à la signalisation et à la prolifération cellulaires. Dans cette revue, nous discutons des diverses fonctions physiologiques de FASN ainsi que de son implication dans les cancers, l’expression de cette enzyme lipogénique étant particulièrement élevée dans cette maladie.

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité cellulaire (transports d’ions et de nutriments, transduction de signal, interaction cellule-cellule). Afin de les étudier, ces protéines doivent être produites in vitro. La production classique de ces protéines membranaires intégrales dans des microorganismes présente de nombreuses difficultés liées à leur structure complexe mais aussi à des problèmes de toxicité, empêchant la production de nombre d’entre elles. En outre, pour être produites efficacement, ces protéines ont besoin d’un environnement amphiphile. Dans cette thèse, afin de pallier à ces difficultés, nous avons d’une part utilisé un système d’expression protéique acellulaire, non affecté par la physiologie des cellules vivantes. En outre, nous avons choisi de les intégrer dans des bicouches lipidiques planes reconstituées artificiellement. Dans une première partie, nous avons mis au point l’intégration d’une protéine membranaire intégrale formant un pore, l’alpha hémolysine, dans une bicouche lipidique supportée. Certaines protéines nécessitant un espace plus important de part etd’autre de la membrane, nous avons, dans une seconde partie, développé une bicouche lipidique espacée et ancrée par fusion de liposomes sur des surfaces d’or. Nous démontrons qu’il est possible d’y incorporer des protéines membranaires de type Aquaporine Z sous certaines conditions. Dans une troisième partie, dédiée à la formation de membranes biomimétiques utilisant des molécules lipidiques provenant d’Escherichia coli, nous montrons que la modification de la composition membranaire ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation de protéines. Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des premiers essais d’insertion de protéines membranaires, de type alpha hémolysine, dans des bicouches suspendues afin de montrer que ces protéines produites par le système d’expression acellulaire sont fonctionnelles
Integral membrane proteins play an essential role in the cell integrity preservation (transport of nutrients and ions, signal transduction, cell-cell interaction). In order to study these proteins, they have to be produced in vitro. Classical production of integral membrane proteins in microorganisms present many difficulties associated with their complex structure and also toxicity problems, preventing production of many of them. Moreover, to be efficiently produced, these proteins require an amphiphilic environment. In order to overcome these difficulties, we used a cell-free protein expression system, unaffected by the physiology ofliving cells. In addition, we chose to integrate them into artificial planar lipid bilayers. In a first part, we have developed the integration of an integral membrane protein forming a pore, the alpha hemolysin, in a supported lipid bilayer. Some proteins require more space on each side of the membrane, therefore in a second part, we have developed a tethered lipid bilayer membrane by liposome fusion on gold surfaces. We demonstrate that it is possible to incorporate membrane protein Aquaporin Z under certain conditions. The third part is dedicated to the formation of biomimetic membranes using lipid molecules from Escherichiacoli, we show that the membrane composition do not affect the protein incorporation. Finally, we have tested alpha hemolysin membrane proteins insertion in suspended lipid bilayers membranes to show that these proteins produced by the cell-free expression system are functional

Des anticorps monoclonaux (acmo) ont ete obtenus par immunisation de souris avec des broyats de sporozoites d'e. Falciformis. Comme un nombre important d'entre eux reconnaissaient une proteine de masse molaire 27kda a la surface du sporozoite, cette proteine a ete appelee proteine majeure de surface du sporozoite d'e. Falciformis (p27). Cette proteine a ete purifiee par immunoaffinite a l'aide d'un des anticorps monoclonaux (d14. 5) et d'autres acmo ont ete obtenus contre la molecule purifiee. L'etude de la reconnaissance de la p27 par les differents acmo en elisa competitifs ou dans le systeme biacore a permis la definition sur la molecule de deux epitopes distincts dont l'un est vraisemblablement repetitif. Les deux epitopes retrouves sur la proteine p27 sont des epitopes communs a des proteines de masse molaire 25kda des deux especes de coccidies de poule, e. Tenella et e. Acervulina. Dans les trois types de sporozoites, ces epitopes sont retrouves a la surface des sporozoites, mais aussi dans les globules refringents. Cette proteine qui possede une activite esterase-lipase et qui est ancree dans la membrane par une ancre gpi est capable de stimuler la transformation lymphoblastique de cellules de ganglions mesenteriques provenant d'animaux infectes. Elle est de plus la cible de reactions de lyse de sporozoites par les phagocytes. Par la suite cette proteine a donc ete utilisee pour declencher une immunite intestinale en incorporant l'antigene dans des iscoms et en l'administrant par voie orale. La proteine administree ainsi induit d'une part une immunite locale (humorale et cellulaire). Elle induit d'autre part l'acquisition par les souris d'une protection contre une infection ulterieure contre le parasite

Les protéines membranaires comme les récepteurs, les canaux ioniques et les transporteurs possèdent des rôles cruciaux dans les processus biologiques tels que la signalisation physiologique et les fonctions cellulaires. La description dynamique et fonctionnelle des structures protéiques est fondamentale pour comprendre la plupart des processus concernant les macromolécules biologiques. L'incorporation, dans des protéines, d'acides aminés non naturels (Uaas) possédant des propriétés physiques ou chimiques spécifiques fournit un puissant outil pour définir la structure et la dynamique de protéines complexes. Ces sondes permettent le suivi et la détection en temps réel de la conformation des récepteurs et des complexes de signalisation. Les approches d'expansion du code génétique ont permis l'incorporation d'Uaas servant de sondes dans des protéines avec une précision moléculaire. L'expansion héréditaire du code génétique peut permettre d'étudier la biologie des protéines de manière systémique.Avec cette stratégie, des Uaas capables de photopontage ont été utilisés pour étudier la relation structure/fonction des Protéines G Couplées aux Récepteurs (GPCR), telles que l'identification de la liaison du ligand ou des interactions protéine-protéine, en détectant les changements dynamiques avec les Uaas spectroscopiques et l'étiquetage bioorthogonal. Sur la base d'applications relativement bien établies d'Uaa dans les GPCR, ici, les analyses fonctionnelles sont combinées à l'incorporation génétique d'un Uaa photosensible spécifique au site, p-azido-L-phénylalanine (AzF) dans d'autres protéines membranaires, pour détecter la protéine, les changements conformationnels et les interactions protéiques. Contrairement à d’autres molécules photosensibles qui permettent aux protéines de répondre à la lumière, l'insertion des Uaas directement dans la chaine d’acides aminés offre des possibilités uniques pour le photo-contrôle de la protéine. Les aspects dynamiques de l'allostérie sont plus difficiles à visualiser que les modèles structuraux statiques. Une stratégie photochimique est présentée pour caractériser la dynamique des mécanismes allostériques des récepteurs NMDA neuronaux (NMDAR). Ces récepteurs appartiennent à la famille des canaux ioniques activés par le glutamate et portent la transmission synaptique excitatrice rapide associée à l'apprentissage et à la mémoire. En combinant le balayage AzF et un test fonctionnel résistant à la lumière, nous avons pu apporter des éléments permettant de mieux comprendre la dynamique des interfaces NTD (N-Terminal Domain des NMDAR) ainsi qu’un nouveau mécanisme de régulation allostérique, améliorant notre compréhension de la base structurale du mécanisme d’activation et de modulation des récepteurs NMDA.Outre l'incorporation de l’Uaa photopontant AzF dans les récepteurs neuronaux pour détecter l'effet fonctionnel, AzF a été appliqué pour piéger des interactions faibles et transitoires entre protéines dans un transporteur d'acides aminés LAT3, impliqué dans le cancer de la prostate. Les techniques de dépistage ont été établies en appliquant un photo-cross-linker positionné dans la protéine pour examiner les interactions entre LAT3 et les interacteurs inconnus et fournir des indices d'identification des partenaires de liaison.Dans l'ensemble, ce travail dévoile de nouvelles informations sur la modulation allostérique de l'activité du récepteur NMDA et sur les interactions protéines-protéines.. Les résultats pourraient fournir de nouvelles informations structurales et fonctionnelles et guider le dépistage de composés thérapeutiques pour des maladies associées au dysfonctionnement de ces protéines membranaires
Membrane proteins including receptors, channels and transporters play crucial roles in biological processes such as physiological signaling and cellular functions. Description of dynamic structures and functions of proteins is fundamental to understand most processes involving biological macromolecules. The incorporation of unnatural amino acids (Uaas) containing distinct physical or chemical properties into proteins provides a powerful tool to define the challenging protein structure and dynamics. These probes allow monitoring and real-time detection of receptor conformational changes and signaling complexes. The genetic code expansion approaches have enabled the incorporation of Uaas serving as probes into proteins with molecular precision. Heritable expansion of the genetic code may allow protein biology to be investigated in a system-wide manner.With this strategy, photocrosslinking Uaas have been used to study GPCR structure/function relationship, such as identifying GPCR-ligand binding or protein-protein interactions, detecting dynamic changes with spectroscopic Uaas and bioorthogonal labeling. Based on relatively well-established applications of Uaa in GPCRs, here, functional assays are combined with the site-specific genetic incorporation of a photo-sensitive Uaa, p-azido-L-phenylalanine (AzF) into other membrane proteins, to probe protein conformational changes and protein interactions. Unlike photo-sensitive ligands that enable proteins in response to light, the site-specific insertion of light-sensitive Uaas facilitates directly light-sensitive proteins. Dynamic aspects of allostery are more challenging to visualize than static structural models. A photochemical strategy was presented to characterize dynamic allostery of neuronal NMDA receptors (NMDARs), which belong to the ionotropic glutamate receptor channel family and mediate the fast excitatory synaptic transmission associated with learning and memory. By combining AzF scanning and a robust light-induced functional assay the dynamics of NMDAR N-terminal domain (NTD) interfaces and novel allosteric regulation mechanism were uncovered, improving our understanding of the structural basis of NMDAR gating and modulation mechanism.Besides incorporation of photo-cross-linker AzF into neuronal receptors to detect the functional effect, AzF was used to trap transient and weak protein-protein interactions in an amino acid transporter LAT3, which is critical in prostate cancer. Screening technique was established by applying genetically encoded photo-cross-linker to examine interactions between LAT3 and unknown interactors and provide clues to identify the binding partners.Overall, the work reveals new informations about the allosteric modulation of channel activity and proteins interactions. These light-sensitive proteins facilitated by site-specific insertion of light-sensitive Uaas enable profiling diversity of proteins. The results will provide novel structural and functional information and may guide screening of therapeutic compounds for diseases associated with malfunctioning of these membrane proteins

L'objectif de l'approche des simulations moléculaires interactive (Interactive Molecular Simulations - IMS) est d'observer en direct la dynamique conformationnelle d'une simulation moléculaire en cours. Le retour visuel instantané permet un suivi instructif ainsi que l'observation des changements structurels imposés par la manipulation de l'IMS par l'utilisateur. J'ai mené une étude approfondie des connaissances pour rassembler et synthétiser l'ensemble des recherches qui ont développé l'IMS. La dynamique moléculaire interactive (Interactive Molecular Dynamics - IMD) est l'un des premiers protocoles IMS qui a posé les bases du développement de cette approche. Mon laboratoire de thèse s'est inspirée de celle-ci pour développer le moteur de simulation BioSpring basé sur le modèle de réseaux élastique. Ce modèle permet de simuler la flexibilité de grands ensembles biomoléculaires et ainsi potentiellement révéler des changements à longue échelle de temps qui ne seraient pas facilement saisis par la dynamique moléculaire. Ce moteur de simulation ainsi que le logiciel de visualisation UnityMol, développé par le biais du moteur de jeu Unity3D, et liés par l'interface de communication MDDriver ont été étendus pour les faire converger vers une suite logicielle complète. Le but est de fournir à un expérimentateur, qu'il soit expert ou profane, une boîte à outils complète pour modéliser, afficher et contrôler interactivement l'ensemble des paramètres d'une simulation. L'implémentation particulière d'un tel protocole, basé sur une communication formalisée et extensible entre les différents composants, a été pensée pour pouvoir facilement intégrer de nouvelles possibilités de manipulation interactive et des jeux de données expérimentales qui s'ajouteront aux contraintes imposées à la simulation. L'utilisateur peut donc manipuler la molécule d'intérêt sous le contrôle des propriétés biophysiques intégrés dans le modèle simulé, tout en ayant la possibilité de piloter à la volée les paramètres de simulation. Aussi, un des objectifs initiaux de cette thèse était d'intégrer la gestion des contraintes d'interaction ambigües du logiciel d'amarrage biomoléculaire HADDOCK directement dans UnityMol, rendant possible l'utilisation de ces mêmes contraintes à une variété de moteurs de simulations. Un axe principal de ces recherches était de développer un algorithme de positionnement rapide et interactif de protéines dans des membranes implicite tiré d'un modèle appelé Integrative Membrane Protein and Lipid Association Method (IMPALA) développée par l'équipe de Robert Brasseur en 1998. La première étape consistait à effectuer une recherche approfondie des conditions dans lesquelles les expériences ont été réalisées à l'époque, afin de vérifier la méthode et de valider notre propre implémentation. Nous verrons qu'elle ouvre des questions intéressantes sur la manière dont on peut reproduire les expériences scientifiques. L'étape finale qui conclue cette thèse était le développement d'une nouvelle méthode universelle d'interaction lipide-protéine, UNILIPID, qui est un modèle d'incorporation interactif de protéines dans les membranes implicites. Elle est indépendante de l'échelle de représentation, peut être appliquée à des niveaux tout atomes, gros-grains jusqu'au niveau d'un grain par acide aminé. La représentation de la dernière version Martini3[6] ainsi qu'une méthode d'échantillonnage Monte-Carlo et de simulation de dynamique des corps rigides ont été spécialement intégrés à la méthode, en plus de divers outils de préparation de systèmes. En outre, UNILIPID est une approche versatile qui reproduit précisément des termes d'hydrophobicité expérimentaux pour chaque acide aminé. En plus de membranes implicites simples, je décrirai une implémentation analytique de membranes doubles ainsi qu'une généralisation à des membranes de forme arbitraire, toutes deux s'appuyant sur des applications inédites
The goal of Interactive Molecular Simulations (IMS) is to observe the conformational dynamics of a molecular simulation in real-time. Instant visual feedback enables informative monitoring and observation of structural changes imposed by the user's manipulation of the IMS. I conducted an in-depth study of knowledge to gather and synthesize all the research that has developed IMS. Interactive Molecular Dynamics (IMD) is one of the first IMS protocols that laid the foundation for the development of this approach. My thesis laboratory was inspired by IMD to develop the BioSpring simulation engine based on the elastic network model. This model allows for the simulation of the flexibility of large biomolecular ensembles, potentially revealing long-timescale changes that would not be easily captured by molecular dynamics. This simulation engine, along with the UnityMol visualization software, developed through the Unity3D game engine, and linked by the MDDriver communication interface, has been extended to converge towards a complete software suite. The goal is to provide an experimenter, whether an expert or novice, with a complete toolbox for modeling, displaying, and interactively controlling all parameters of a simulation. The particular implementation of such a protocol, based on formalized and extensible communication between the different components, was designed to easily integrate new possibilities for interactive manipulation and sets of experimental data that will be added to the restraints imposed on the simulation. Therefore, the user can manipulate the molecule of interest under the control of biophysical properties integrated into the simulated model, while also having the ability to dynamically adjust simulation parameters. Furthermore, one of the initial objectives of this thesis was to integrate the management of ambiguous interaction constraints from the HADDOCK biomolecular docking software directly into UnityMol, making it possible to use these same restraints with a variety of simulation engines. A primary focus of this research was to develop a fast and interactive protein positioning algorithm in implicit membranes using a model called the Integrative Membrane Protein and Lipid Association Method (IMPALA), developed by Robert Brasseur's team in 1998. The first step was to conduct an in-depth search of the conditions under which the experiments were performed at the time to verify the method and validate our own implementation. We will see that this opens up interesting questions about how scientific experiments can be reproduced. The final step that concluded this thesis was the development of a new universal lipid-protein interaction method, UNILIPID, which is an interactive protein incorporation model in implicit membranes. It is independent of the representation scale and can be applied at the all-atom, coarse-grain, or grain-by-grain level. The latest Martini3 representation, as well as a Monte Carlo sampling method and rigid body dynamics simulation, have been specially integrated into the method, in addition to various system preparation tools. Furthermore, UNILIPID is a versatile approach that precisely reproduces experimental hydrophobicity terms for each amino acid. In addition to simple implicit membranes, I will describe an analytical implementation of double membranes as well as a generalization to arbitrarily shaped membranes, both of which rely on novel applications

Les TSPO forment une famille ancienne et hautement conservée à travers l’évolution de protéines à 5 domaines transmembranaires, que l’on retrouve aussi bien chez les animaux que les plantes, ou encore les bactéries. La TSPO animale (ou TSPO1), la plus étudiée des TSPO à ce jour, se trouve majoritairement dans les tissus stéroïdiens où sa fonction précise est controversée. Chez certaines espèces animales, il existe une isoforme, la TSPO2, localisée dans la membrane plasmique des globules rouges alors que la TSPO1 est mitochondriale. La fonction de la TSPO2 n’est pas bien caractérisée. La TSPO végétale, localisée dans le réticulum endoplasmique, possède une extension N-terminale que n’ont pas les TSPO animale et bactérienne. Elle semble être impliquée dans la régulation du stress, tout comme la TSPO bactérienne. Les études structure/fonction des différentes TSPO réalisées dans ce travail ont nécessité leur production par voie recombinante car elles sont naturellement peu abondantes.Nous avons produit la TSPO1 murine marquée 15N,13C par surexpression dans la bactérie E. coli. Puis la protéine purifiée en détergent (SDS et DPC) a été étudiée par différentes techniques (CD, fluorescence, RMN). L’ajout du ligand spécifique de la TSPO1, le PK11195, stabilise une conformation en DPC ce qui a permis en 2014 la résolution de sa structure, par RMN du liquide, par une équipe allemande. Afin d’étudier la TSPO1 dans un environnement plus proche de sa membrane native, nous l’avons reconstituée dans des liposomes DMPC/DMPE et étudiée par RMN du solide. Les 1ers résultats sont encourageants et ouvrent une nouvelle approche expérimentale pour la détermination de sa structure en présence et, plus particulièrement, en absence de ligand. La surexpression de la TSPO2 humaine dans la bactérie E. coli s’est avérée difficile et nous avons dû la réalisée par système acellulaire (cell-free). Les quantités obtenues par cette méthode permettent d’envisager le développement futur des études des relations structure/fonction.La production et la purification du Nter de la TSPO d’A. thaliana marqué 15N,13C ont permis la détermination de sa structure par RMN du liquide. Son interaction avec des lipides chargés mise en évidence par les études RMN, suggère une nouvelle fonction de l’AtTSPO dans le trafic lipidique
TSPO are five-transmembrane domain proteins that form a protein family highly conserved throughout evolution and that are found in animals as well as in plants and bacteria.Animal TSPO (referred to as TSPO1), the most studied TSPO, is highly expressed in tissues involved in steroid biosynthesis where its precise role remains controversial. In some animal species the presence of a less characterized TSPO isoform, TSPO2, has been reported. TSPO2 was found to be located in the plasma membrane of red blood cells whereas TSPO1 is located in mitochondrial outer membrane. Plant TSPO, which is located in the endoplasmic reticulum, possesses an N-terminal extension that is absent in bacterial and animal TSPO. This TSPO, along with the bacterial TSPO, seems to be involved in stress regulation.The structural and functional studies of TSPO proteins conducted in this work required their production through recombinant expression because they are naturally non-abundant proteins.We made use of E. coli to produce the recombinant 15N,13C-labelled mouse TSPO1. Then the protein purified in detergent was studied through several methods (CD, fluorescence, NMR). High-affinity binding of PK11195 to TSPO1 stabilizes a conformation in DPC, which made possible the structure determination of the protein in solution by NMR by a German team. We have incorporated TSPO1 into DMPC/DPME liposomes in order to provide a native-like environment and we then studied it by solid-state NMR. Preliminary results are encouraging and open up a new approach for TSPO1 structure determination in presence or in absence of ligand.Human TSPO2 overexpression in E. coli proved to be difficult and we therefore use the cell-free method. The amounts we obtained by this method allows us to consider future developments of structurefunction relationship studies.Production and purification of 13C,15N labelled N-terminal of A. thaliana TSPO have made it possible to determine its structure by liquid state NMR. Interaction of this peptide with charged lipids revealed by NMR, suggests a new fonction of AtTSPO in lipid trafficking

Les protéines membranaires occupent en moyenne 50% de la masse des membranes cellulaires. Cependant, certaines membranes spécialisées peuvent avoir de 20 à 90% de leur masse en protéines. Dans ce cadre, l'importance de l'assemblage des protéines membranaires dans des complexes cohérents, dynamiques et fonctionnels n'est plus à démontrer.Mon projet s'inscrit dans la compréhension des forces qui mènent à l'assemblage des protéines membranaires. J'utilise pour cela le modèle de l'Aquaporine Z (AqpZ) d'Escherichia coli. En premier lieu, j'ai mis en oeuvre une approche de dynamique moléculaire gros grains avec des forces de biais adaptatifs pour étudier les relations entre orientations de deux monomères d'AqpZ. Il existe, de façon surprenante, des forces se propageant à longue distance vraisemblablement par les lipides qui biaisent les orientations relatives entre les protéines.Un deuxième axe de mon travail est l'étude des enrichissements lipidiques autour de l'AqpZ native ou mutée, à différentes distances, avec l'utilisation d'une membrane complexe rendant compte de la diversité lipidique de la membrane interne d'E.coli. Dans cette analyse, la cardiolipine est enrichie à proximité de la protéine. Enfin, j'ai construit un système contenant 125 monomères d'AqpZ dans une membranes simple ou complexe, qui représentent 50% en masse en protéines. Ce système m'a permis de questionner l'évolution spontanée d'un tel système encombré, mais aussi le devenir des forces à longue distance et des lipides enrichis à la surface de la protéine dans ce contexte
Membrane proteins represent on average 50% of the mass of cellular membranes. However, specialized membranes can have from 20 to 90% of their mass in proteins. In this context, the importance of the assembly of membrane proteins in coherent, dynamic and functional complexes isn't to be proven anymore. The goal of my project is to understand the different forces that lead to the assembly of membrane proteins. For this aim, I am using the Aquaporin Z (AqpZ) model protein from Escherichia coli, which is studied in our laboratory. First, I use a coarsed grain molecular dynamics approach with adaptive biasing forces to study the relations between orientations of two AqpZ monomers. Surprisingly, there are forces propagating at long distance, presumably by the lipids which in turn bias the relative orientations between the proteins. The second axis of my work is the study of lipid enrichments around native or mutated AqpZ, at different distances, with the use of a complex membrane accounting for the lipid diversity of the inner membrane of E.coli. In this analysis, cardiolipin is enriched near the protein. Finally, I built a system containing 125 AqpZ monomers in a simple or complex membrane, which represents 50% protein by weight. This system allowed me to examine the spontaneous evolution of such a crowded system, but also to investigate the fate of the long distance forces and the lipid enrichments at the protein surface in this context

La N-glycosylation est la modification secondaire majoritaire des protéines membranaires et secrétées. Elle débute par l'assemblage d'un oligosaccharide lié au dolichol (OLD) précurseur sur la membrane du réticulum endoplasmique. Certaines déficiences dans la voie de biosynthèse de l'OLD sont associées à un groupe de pathologies appelé "congénital disorders of glycosylation" (CDGs) de type I. Les CDGs I, dont 12 sous-types sont connus à ce jour, sont des maladies autosomiques récessives rares se manifestant par des atteintes multisystémiques sévères. Ce rapport expose le diagnostic moléculaire de deux nouveaux cas de CDG I, dont un représente la description princeps du CDG Ih. L'étude des CDG I amène de nombreuses questions à propos de la compréhension globale du phénomène de N-glycosylation. Ce rapport présente donc aussi un aspect plus fondamental : la découverte d'une nouvelle glycosyltransférase de la voie de biosynthèse de l'OLD ; ALG13/ALG14, ainsi que la synthèse d'une sonde d'affinité pour l'identification d'un transporteur impliqué dans le métabolisme des oligosaccharides libres, permettront. .
N-glycosylation is the major modification of membrane and secretory proteins. It starts by the assembly of a dolichol-linked oligosaccharide (DLO) on the endoplasmic reticulum membrane. Deficiencies of the DLO biosynthetic pathway are associated with a group of diseases called type I "congenital disorders of glycosylation" (CDGs I), of which 12 subtypes are descibed so far. They are rare autosomic recessive diseases, characterized by severe multisystemic symptoms. This thesis reports the molecular diagnosis of two new CDG I cases, one of which comprises the first CDG Ih description. The study of CDG I raises several questions concerning the general understanding of N-glycosylation. With this in mind, this thesis deals with more fundamental aspects of this the pathway as it details the discovery of a new glycosyltransferase involved in DLO biosynthesis.

L'isoforme 1 de l'échangeur Na+/H+, qui est exprimée de façon ubiquitaire dans l'organisme, fait partie d'une famille de protéines membranaires qui catalyse, grâce au gradient électrochimique du sodium, l'échange électroneutre d'un proton intracellulaire contre un sodium extracellulaire. Cette protéine est impliquée dans la régulation du pH intracellulaire et du volume cellulaire, mais est aussi responsable de certaines situations pathologiques. Ce transporteur est constitué de deux domaines fonctionnels distincts sur lesquels mes travaux de thèse ont été menés. Le domaine en N-terminal, correspondant à la région transmembranaire de l'échangeur, est suffisant pour catalyser l'échange des cations. L'utilisation de techniques de sélection génétique, basées sur la résistance de cellules à des acidifications intracellulaires, nous a permis d'isoler des clones cellulaires exprimant des formes mutées de cette protéine. Nous avons mis en évidence le rôle important de plusieurs résidus, dans le quatrième segment transmembranaire, engagés dans le site de fixation du sodium. La seconde partie de mon travail concerne le domaine cytoplasmique de l'échangeur qui est impliqué dans la régulation de son activité par des cascades de signalisation. La surexpression de ce domaine cytoplasmique atténue l'activation de l'échangeur Na+/H+ et d'un canal chlorure par les facteurs de croissance. Cette inhibition semble également provoquer un retard dans l'induction du cycle cellulaire par ces facteurs mitogéniques. Cette protéine serait un outil biochimique intéressant pour caractériser ces voies de signalisation et identifier leurs cibles.

Dans cette étude, les aspects méthodologiques pour la production de structures cristallines à haute résolution des protéines membranaires ont été combinés et rapportés ici, ainsi que leur implication pour le cas biologique concret d'étude structurale des principes de fonctionnement de l'histidine kinase transmembranaire.Dans la cristallographie de rayons X, les échantillons de cristaux de protéines varient selon les tailles, les formes et les capacités de diffraction. Pour pouvoir collecter les données de diffraction de la manière la plus efficace, l'échantillon de cristaux doit être correctement caractérisé dans chaque cas particulier. L'analyse raster par rayons X est considérée comme la technique la plus viable pour le faire et dans ce contexte, une méthode d'analyse des échantillons de cristaux pour la cristallographie des protéines est présentée ici, qui est basée sur la technique de balayage des mailles par rayons X développée à l'ESRF. La méthode estime les positions, les tailles et la qualité de la diffraction de chaque cristal dans la zone scannée qui pourrait être plus utile pour la conception rationnelle du processus de collecte de données. La performance de la méthode est démontrée sur plusieurs échantillons de cristaux de protéines.Un autre goulot d'étranglement dans la production des structures cristallines des protéines est un problème de phase communément connu. Les techniques les plus répandues pour traiter la structure qui ne peut pas être résolue avec le remplacement moléculaire sont les techniques de mise en phase expérimentales basées sur SAD ou MAD. Cela implique l'incorporation de divers diffuseurs anormaux à la structure cristalline. Dans la liste des diffuseurs disponibles, les halogénures se distinguent surtout principalement par leur faible toxicité et leur facilité de manipulation, mais en même temps leur capacité à produire un signal anormal. Le protocole de cryo-trempage des cristaux de protéines dans des solutions contenant des halogénures s'est avéré efficace sur les structures protéiques solubles. Dans l'étude actuelle, ce protocole a été testé sur quatre structures cristallines différentes des protéines membranaires. Les résultats présentés indiquent et soutiennent de manière expérimentale que l'iodure pourrait être facilement et efficacement utilisé pour résoudre le problème de phase dans le cas des structures de cristaux de protéines membranaires.Le capteur histidine kinases est l'un des récepteurs transmembranaires les plus communs présents dans tous les royaumes de la vie. La compréhension des principes de signalisation transmembranaire de l'histidine kinases sensorielle est une question fondamentale qui reste actuellement sans réponse. Pour arriver à l'idée de quels changements structurels fournissent la transmission du signal à travers la membrane lipidique dans ce travail, la structure cristalline de la construction tronquée de l'histidine kinase NarQ d'Escherichia coli – un capteur de nitrates/nitrites – qui contient le capteur périplasmique, les hélices transmembranaires et le domaine HAMP au niveau du côté cytoplasmique a été déterminée dans les états lié à un ligand et l'apo muté. Les structures présentées fournissent un aperçu des changements de conformation qui se produisent dans le domaine transmembranaire et dans le domaine HAMP en aval pendant la transduction du signal induite par le ligand. L'avancement de la recherche structurelle a été grandement renforcé par l'implication des résultats méthodologiques présentés dans ce travail. Cet impact et, en particulier, les résultats prospectifs de ce travail aux disciplines méthodologiques et appliquées de la biologie structurale et de la cristallographie des rayons X en particulier sont discutés
In this study the methodological aspects for producing high-resolution crystal structures of membrane proteins were combined and reported here as well as their implication for the concrete biologically-relevant case of structural investigation of transmembrane histidine kinase working principles.In X-ray crystallography protein crystal samples vary in sizes, shapes and diffracting abilities. To be able to collect the diffraction data in the most efficient way the crystal sample should be properly characterised on-axis in every particular case. Raster X-ray scan has been found to be the most viable technique to do so and in this context a method of crystal sample analysis for protein crystallography is presented here which is based on the X-ray mesh scan technique developed at the ESRF. The method estimates the positions, sizes and quality of diffraction of each crystal in the scanned area which could be further useful for the rational design of the data collection process. The performance of the method is demonstrated on several protein crystal samples.Another bottleneck in production of crystal structures of proteins is in commonly known phase problem. The most widespread techniques to deal with the structure that cannot be phased using molecular replacement are SAD or MAD-based experimental phasing. This implies incorporation of various anomalous scatterers to the crystal structure. In the list of available scatterers halides are particularly stood out mostly because their low toxicity and easiness of handling but at the same time their capability of producing anomalous signal. The protocol of cryo-soaking of the protein crystals in halide-containing solutions has shown to be successful on soluble protein structures. In the current study this protocol was tested on four different crystal structures of membrane proteins. The presented findings state and further support experimentally that iodide could be easily and successfully used for addressing the phase problem in the case of membrane protein crystal structures.Sensor histidine kinases are ones of the most common transmembrane receptors present in all kingdoms of life. The understanding of transmembrane signalling principles of sensor histidine kinases is a fundamental question that currently remains unanswered. In order to get to the idea of which structural changes provide the transmission of the signal across the lipid membrane in this work the crystal structure of the truncated construct of the histidine kinase NarQ of Escherichia coli – a sensor of nitrates/nitrites – which contains periplasmic sensor domain, transmembrane helices and HAMP domain at the cytoplasmic side was determined in the ligand-bound and mutated apo states. The presented structures provide an insight on the conformational changes occurring in the transmembrane domain and in the downstream HAMP domain during the ligand-induced signal transduction. The progress of the structural investigation was greatly enhanced by the involvement of the methodological findings presented in this work. This impact and as well the prospective outcomes of this work to both methodological and applied disciplines of structural biology and X-ray crystallography in particular are discussed