Literatura académica sobre el tema "Champignons endophytes – Cultures cellulaires"

L’astine C est un peptide cyclique assemblé au cours d’un mécanisme nonribosomique par une synthétase dite NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase). Ce peptide nonribosomique possède des propriétés thérapeutiques intéressantes avec notamment des activités anti-tumorale et anti-inflammatoire. Jusqu’ici ce composé était exclusivement extrait à partir des racines d’Aster tataricus, une plante utilisée traditionnellement en médecine japonaise et chinoise. Récemment, une production d’astine C a été mise en évidence chez Cyanodermella asteris, un champignon endophyte de cette plante. Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives en matière de production d’astine C, qui reste néanmoins très limitée en raison du faible taux de croissance du champignon endophyte. Au cours de cette étude, deux approches ont été développées parallèlement afin d’augmenter les taux de production de l’astine C. La première stratégie consistait à augmenter les rendements en optimisant la production homologue à partir de C. asteris. Dans cette optique, un système de culture a été établi afin de cultiver le champignon exclusivement sur un support en acier inoxydable. Ce mode de culture a favorisé à la fois le développement de la biomasse fongique et la production du composé d’intérêt. En vue d’optimiser ce procédé, l’impact de plusieurs paramètres de culture (modalité de préparation du support, type d’inoculum, pH de culture, et composition du milieu de culture) sur la production d’astine C a été évalué. Les paramètres de culture optimisés ont permis d’améliorer de nouveau les rendements en astine C, ce qui constitue une première étape dans le développement d’un procédé de production à l’échelle industrielle. En parallèle, des travaux ont été menés afin de développer un système de production hétérologue d’astine C chez la levure. Cette approche n’a pu être considérée qu’après avoir identifié, par le biais d’analyses bioinformatiques, les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l’astine. Une fois ces gènes identifiés, une revue de la littérature a permis, entre autres, de dresser un bilan des outils moléculaires disponibles pour le clonage des larges séquences nucléiques codant pour les NRPSs, et de sélectionner des hôtes hétérologues appropriés. Des séquences complète ou partielle du gène codant pour l’astine synthétase ont été clonées respectivement chez Saccharomyces cerevisiae et Yarrowia lipolytica. Pour les deux levures considérées, une expression hétérologue a été constatée. Chez S. cerevisiae, la synthèse de la NRPS d’astine n’a pas pu être démontrée. En revanche, pour la première fois, la production d’une structure de type NRPS chez Y. lipolytica a pu être mise en évidence. Bien qu’aucun peptide nonribosomique n’ait été détecté, cette étude a permis de lever une partie des verrous limitant le développement d’un mode de production hétérologue d’astine chez la levure
Astin C is a cyclic peptide assembled through a nonribosomal mechanism by a NonRibosomal Peptide Synthetase (NRPS). This nonribosomal peptide displays promising therapeutic properties including anti-tumor and anti-inflammatory activities. For decades, this compound was only extracted from the roots of Aster tataricus, a well-known plant in traditionnal japanese and chinese medicine. Recently, Cyanodermella asteris, a fungal endophyte of this plant, was demonstrated to be able to synthesize astin C. This discovery offers new opportunities for the production of this compound of interest. Nonetheless the very low growth rate of this endophytic fungus is an obstacle limiting the astin C production. In this study, two distinct approaches were conjointly considered to upscale the production rate of this compound. The first strategy was related to an optimization of the homologous production from C. asteris. For this purpose, an innovative cultivation system has been developed enabling to grow the fungus exclusively on a stainless steel support. This cultivation condition turned out to be favorable both for the fungal biomass development and for the astin C production. In order to further optimize this process, the effects of several culture parameters (i.e. support pre-treatment procedure, inoculum type, pH, medium composition) on the astin C production rates was investigated. Under optimized conditions, astin C yields were further enhanced, constituting a first step towards the development of an astin C production process at industrial scale. Meanwhile, a study was conducted in order to develop a heterologous expression system for astin C production in yeast. The identification, through bioinformatics analyses, of the genes involved in the astin biosynthesis was a precondition for the development of this approach. Once these genes have been identified, a literature review has enabled to compile the molecular tools applicable for the cloning of NRPS long lenght sequence, and to select a proper host to heterologously express them. The whole sequence or a truncated one have been transfered respectively to Saccharomyces cerevisiae or Yarrowia lipolytica. In boh considered yeasts, a heterologous expression of the foreign sequences was confirmed. In S. cerevisiae, the synthesis of the astin NRPS could not be demonstrated. On the other hand, in Y. lipolytica, for the first time, the production of a NRPS-type structure was detected. Although no nonribosomal peptide was detected, this study enabled to overcome several of the hurdles limiting the development of a astin heterologous production way in yeast

Le genre Fusarium est à l'origine de pathologies végétales concernant une grande variété de cibles avec des conséquences sur les rendements et la santé des consommateurs. Parmi elles, F. graminearum et F. oxysporum ont le plus d'impact économique et les moyens de lutte durables contre ces pathogènes sont actuellement limités. Le biocontrôle est une solution alternative aux pesticides de synthèse. Cependant, il est difficile d'exploiter pleinement le potentiel existant dans la nature. Un moyen de découvrir de nouvelles molécules d'intérêt est la co-culture. Impliquant deux ou plusieurs populations de cellules, elle recrée des interactions non existantes en monocultures. Ce projet de thèse, a ainsi eu pour but de mettre en présence des bactéries et des champignons possédant des activités connues, et ainsi de découvrir des associations produisant des cocktails de molécules antifongiques afin de lutter contre des phytopathogènes.Le projet a débuté par la sélection rationnelle de microorganismes ayant une activité antifongique rapportée dans la littérature : cinq bactéries (Bacillus subtilis, Pseudomonas syringae, Dietzia sp., Streptomyces coelicolor, Streptomyces sp.) et cinq champignons (Pseudozyma aphidis, Trichoderma harzianum, Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides et F. oxysporum) ont été retenus. Par la suite, des conditions de culture (milieu, température) adéquates pour réaliser des co-cultures et permettre la croissance des deux partenaires impliqués ont été définies et trois milieux ont été choisis : deux milieux riches (LB, NB) et un milieu minimum (GMM).Après cette sélection, des essais dans un microbioréacteur (BioLector) ont été réalisés : ces derniers impliquaient les dix microorganismes sélectionnés en monocultures et vingt-cinq co-cultures dans les trois conditions de milieu. Un criblage de l'activité antifongique des surnageants de culture générés a été réalisé contre une souche de F. oxysporum issue de l'environnement et S. cerevisiae. Treize co-cultures sur vingt-cinq ont montré une activité contre au moins l'une des deux cibles. Après ces tests, la sélection de couples d'intérêt a été réduite de vingt-cinq à dix. Ces couples ont été cultivés dans des volumes de 50 mL dans les milieux LB et NB qui ont montré la meilleure activité dans les conditions choisies, et leurs surnageants testés pour leur activité antifongique. Ces tests ont permis d'affiner le choix et de se focaliser sur six couples : P. syringae + A. oryzae, Streptomyces sp. + A. oryzae, P. syringae + F. oxysporum, P. syringae + P. aphidis, Dietzia sp. + T. harzianum, Streptomyces sp. + C. cladosporioides. Ces six couples ont fait l'objet d'une série de cultures et de tests de surnageants sur boîte et en liquide (contre F. oxysporum). Trois couples ont présenté une activité plus prononcée, en particulier contre F. oxysporum et se sont démarqués des monocultures : Streptomyces sp. + A. oryzae, Streptomyces sp. + C. cladosporioides et P. syringae + A. oryzae. La co-culture Streptomyces sp. + C. cladosporioides a présenté une activité synergique propre à inhiber ou ralentir la croissance de F. oxysporum par rapport aux monocultures seules, tandis que P. syringae + A. oryzae et Streptomyces sp. + A. oryzae ont présenté une activité additive contre F. oxysporum.Pour les trois couples retenus, les molécules produites et sécrétées ont été étudiées par protéomique et métabolomique. Quelle que soit la co-culture considérée, celle-ci induit l'activation de gènes restés silencieux en monoculture. On peut ainsi observer l'expression d'une très grande proportion de protéines ou de métabolites secondaires (38 à 50%) exclusivement présentes dans les surnageants de co-cultures. En outre, parmi les molécules sécrétées de novo dans les co-cultures, certaines connues pour leurs activités antimicrobiennes voire antifongiques ont pu être identifiées et ceci pour les trois couples étudiés
The genus Fusarium causes plant pathologies affecting a wide variety of targets with consequences on yields and consumer health. Among them, F. graminearum and F. oxysporum have the most important economic impacts and sustainable control methods against these pathogens are currently limited. Biocontrol is an alternative to synthetic pesticides. However, it is difficult to fully exploit the potential that exists in nature. One way to discover new molecules of interest is co-culture. Involving two or more populations of cells, it recreates interactions that do not exist in monocultures. The aim of this thesis project was to bring together bacteria and fungi with known activities, and thus to discover associations producing cocktails of antifungal molecules to fight against phytopathogens.The project started with the rational selection of microorganisms with antifungal activity reported in the literature: five bacteria (Bacillus subtilis, Pseudomonas syringae, Dietzia sp., Streptomyces coelicolor, Streptomyces sp.) and five fungi (Pseudozyma aphidis, Trichoderma harzianum, Aspergillus oryzae, Cladosporium cladosporioides, and F. oxysporum) were chosen. Subsequently, culture conditions (medium, temperature) adequate to perform co-cultures and allow the growth of both partners involved were defined and three media were chosen: two rich media (LB, NB) and one minimal medium (GMM).After this selection, tests in a microbioreactor (BioLector) were carried out: these involved the ten selected microorganisms in monocultures and twenty-five co-cultures in the three media conditions. A screening of the antifungal activity of the generated culture supernatants was performed against an environmental strain of F. oxysporum and S. cerevisiae. Thirteen out of twenty-five co-cultures showed activity against at least one of the two targets. After these tests, the selection of co-cultures of interest was reduced from twenty-five to ten. These co-cultures were grown in 50 mL volumes in LB and NB media that showed the best activity under the chosen conditions, and their supernatants tested for antifungal activity. These tests allowed to refine the choice and to focus on six couples: P. syringae + A. oryzae, Streptomyces sp. + A. oryzae, P. syringae + F. oxysporum, P. syringae + P. aphidis, Dietzia sp. + T. harzianum, Streptomyces sp. + C. cladosporioides. These six couples were subjected to a series of cultures and their supernatants tested on agar plates and in liquid media (against F. oxysporum). Three co-cultures showed a more pronounced activity, especially against F. oxysporum and stood out from the monocultures: Streptomyces sp. + A. oryzae, Streptomyces sp. + C. cladosporioides and P. syringae + A. oryzae. The Streptomyces sp. + C. cladosporioides co-culture showed synergistic activity in inhibiting or slowing the growth of F. oxysporum compared to monocultures alone, while P. syringae + A. oryzae and Streptomyces sp. + A. oryzae showed additive activity against F. oxysporum.For the three selected couples, the molecules produced and secreted were studied by proteomics and metabolomics. Whatever the co-culture considered, it induces the activation of genes that remained silent in monoculture. Thus, we can observe the expression of a very high proportion of proteins or secondary metabolites (38 to 50%) exclusively present in the supernatants of co-cultures. Moreover, among the molecules secreted de novo in the co-cultures, some known for their antimicrobial or even antifungal activities could be identified for the three couples that were studied

La biologie du champignon mycorhizien à arbuscules Rhizophagus irregularis DAOM197198 à la lumière de la génomique et de la transcriptomique. Les Glomeromycètes sont des champignons symbiotiques mutualistes associés aux racines des plantes. La majorité des espèces végétales sont capables de s'associer à ces champignons. Cette association favorise le recrutement de sels minéraux du sol par les plantes, en échange le champignon retire du carbone de son hôte. La mise en place de cette symbiose consiste en une succession d'étapes de développement fongique sous contrôle de molécules signalétiques. Mes travaux de recherche ont porté sur la description des programmes génétiques qui sous-tendent le développement du champignon Rhizophagus irregularis isolat DAOM197198 lors de l'établissement de la symbiose. Le champignon a été cultivé dans plusieurs conditions marquant les points clef de son développement, et les ARN ont été séquencés. Les données RNAseq obtenues ont été utilisées pour définir les modèles de gène de l'assemblage du génome. R. Irregularis possède un génome haploïde et homocaryotique (Tisserant*, Malbreil* et al. , 2013). Les strigolactones (molécules signales de la plante) régulent de l'ordre de 300 gènes durant la phase pré-symbiotique, et ce, de manière séquentielle. A travers l'étude du transcriptome de R. Irregularis en association avec trois espèces végétales phylogénétiquement éloignées, j'ai montré qu'il existe un set de 262 gènes fortement induits quel que soit l'hôte. Ces résultats ont permis d'affiner la recherche de candidats pertinents impliqués dans la symbiose et le développement dans les tissus végétaux. Enfin le couplage d'approches transcriptomiques et métabolomiques ont permis l'identification des propionyl- et butyryl-carnitine, qui sont potentiellement impliquées dans la symbiose
The biology of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis DAOM197198 enlighten by genomics and transcriptomics. Glomeromycota are mutualistic fungi associated with plant roots. The vast majority of plant species are able to form a symbiosis with these organisms. This association improves plant nutrition via a better water and mineral recruitment from the soil. In return, the fungus receives carbon compounds. Symbiosis establishment is achieved by a step by step development, led by signal exchanges. My work was focused on describing genetic programs supporting the fungal development of Rhizophagus irregularis DAOM197198, during symbiosis establishment. The fungus was grown in several conditions representing key point of its development, and RNA were sequenced by illumina. RNAseq data obtained were then used to define the gene models on the genome assembly. R. Irregularis has a haploid and homocaryotic genome (Tisserant*, Malbreil* et al. , 2013). Strigolactones (plant signal molecules) affect the expression of around 300 genes during the pre-symbiotic development, in a sequential manner. By studying the R. Irregularis transcriptomes in association with 3 phylogenetically distant plants, we report that a set of 262 genes are highly induced whatever the host is. These results allowed refining the number of candidate genes possibly playing an important role in the symbiotic development. Finally, by coupling metabolomic and transcriptomic approaches, two molecules (propionyl- and butyryl-carnitine) could be identified and might play a role in late steps of symbiosis establishment

Ce travail porte sur l'étude chimique d'une souche endophyte de Botryosphaeria mamane, un micromycète relativement peu étudié, isolée des feuilles de Bixa orellana. Des travaux préliminaires portant sur le screening de 409 souches de champignons isolés à partir de plantes médicinales d'Amérique du Sud a révélé que parmi celles-ci, B. mamane E224 était l'une des souches les plus actives in vitro sur un modèle de Leishmania infantum. L'objectif de ce travail a consisté en l'induction de la production de nouveaux métabolites secondaires produits par B. mamane via l'optimisation des conditions de culture de cette souche, la mise en place de méthodes de co-cultures et l'ajout de modificateurs épigénétiques. Une analyse des métabolomes dans les différentes conditions a été réalisée à travers une approche métabolomique, utilisant un couplage UHPLC-HRMS, ainsi que grâce à différents outils statistiques. Deux grandes classes de composés ont ainsi été détectées dans les cultures axéniques de B. mamane. Premièrement, la famille des cyclopeptides, incluant les cyclodipeptides soufrés avec en particulier trois nouveaux composés, les botryosulfuranols A-C. Puis la famille des isocoumarines, avec des dérivés de la melleine (trans-4-hydroxymelleine, 4-hydroxymelleine et 5-hydroxymellein). A travers l'ajout de modificateurs épigénétiques à la culture de B. mamane, nous avons pu étudier les effets de deux inhibiteurs d'histone désacétylases (HDACis), l'acide suberoylanilidehydroxamique (SAHA) et le valproate sodique, ajoutés à deux stades différents de la culture fongique. L'ajout de HDACi dans la culture de B. mamane a entraîné des changements importants dans la production de métabolites secondaires. En effet, une induction de certains métabolites mais également une réduction et l'inactivation de la production d'autres métabolites, ont été observés, et ceci selon la nature du modificateur épigénétique ajouté. Cette étude illustre l'importance du choix des HDACis pour l'induction de la production de métabolites spécifiques. Concernant l'optimisation de la co-culture de B.[...]
This study focused on the strain of a poorly studied fungal endophyte Botryosphaeria mamane E224, isolated from Bixa orellana leaves. Our previous screening involving 409 fungal strains isolated from medicinal plants from South America revealed that among all these strains, B. mamane was shown to be the most bioactive on in vitro model against Leishmania infantum. The objectives of this work consisted in the introduction of new metabolite production by B. mamane by optimizing the fungal culture conditions, and by using co-cultivation methods and addition of epigenetic modifiers. This work was followed by an analysis of the different metabolomes via a metabolomics approach using UHPLC-HRMS and integration of informatics and statistical tools for metabolomics. Two major compound classes were detected in B. mamane. First, the cyclopeptide family including the thiodiketopiperazines (TDKPs) alkaloids with three new compounds proposed as botryosulfuranols A-C; and the isocoumarin family, with the mellein derivatives, trans-4-hydroxymellein, 4-hydroxymellein, and 5-hydroxymellein. Regarding the exploration of B. mamane metabolome cultured in the presence of epigenetic modifier, the effects of two different histone deacetylase inhibitors (HDACis), suberoylanilidehydroxamic acid (SAHA) and valproate sodium added in two different stages of fungal growth, were investigated. As expected, HDACis addition in the culture of B. mamane led to significant changes in the secondary metabolite production. Addition of modifier not only induced metabolites production but also reduced and may inactivate metabolite production in fungi, depending on the nature of the epigenetic modifier added. This study illustrates the importance in the choice of HDACis to fungal culture in order to induce specific metabolite productions. In the study of B. mamane and C. albicans co-cultivation in different culture conditions, we showed the influence of the conditions (static versus agitation) on the metabolome of the fungi. However, the co-culture with yeast did not induce any modification in the fungal metabolome. The investigation of fungal interactions between B. mamane, Fusarium solani, and Colletotrichum linicola in 6-multi well plates in time-series based analysis has been carried out. [...]

RésuméL'objectif de cette thèse était de rechercher de nouvelles enzymes de dégradation de la lignine à partir de souches de champignons issus de milieux naturels. Des prélèvements ont été effectués sur du bois dans trois écosystèmes différents : une forêt de feuillus (hêtre, bouleau) et résineux (cyprès Lambert), un cep de chardonnay attaqué par la maladie du bois de la vigne et enfin une souche en décomposition sur un parking d'une zone urbaine. 71 souches de champignons ont été isolées à partir de ces prélèvements. Pour connaître les souches produisant des enzymes d'intérêt, un criblage d'activité ligninolytique a été effectué. Afin de rendre ce criblage le plus exhaustif possible, différentes conditions de culture ont été mises en place. Trois milieux de cultures avec des éléments inducteurs spécifiques ont été testés afin de stimuler la production d'enzymes ligninolytiques par les champignons. Les trois milieux de culture utilisés pour le criblage furent donc un milieu riche sans induction, un milieu avec de la paille de blé et un autre avec du gaïacol. De même, pour prendre en compte l'aspect cinétique de production des enzymes par les champignons, deux temps de mesure à 7 et 14 jours ont été observés. Ce criblage a permis de sélectionner 15 champignons présentant au moins une activité enzymatique d'intérêt. Sur ces 15 champignons, deux souches ont produit leurs activités ligninolytiques seulement sur les milieux contenant un inducteur. Parmi ces 15 champignons, deux basidiomycètes ainsi que 13 ascomycètes appartenant à 6 genres différents ont été identifiés. 12 ascomycètes étaient déjà décrits dans la littérature pour produire des enzymes de type laccase, Lip et Mnp. Les deux basidiomycètes, Peniophora versicolor et Piptoporus betulinus n'étaient pas connus pour cette activité ligninolytique. En outre, l'ascomycète Scedosporium apiospermum a montré une activité de type laccase lors du criblage. Des expérimentations de dégradation de la lignine ont pu déterminer que les enzymes présentes dans le surnageant de culture de ce champignon, possèdent une activité de modification du polymère de lignine. S. apiospermum a donc été sélectionné afin de caractériser ses enzymes de type laccase, détectées lors du criblage. Grâce à un criblage in silico dans le génome de S. apiospermum, neuf gènes putatifs de laccase ont été détectés. Après avoir généré une librairie d'ADNc, cinq gènes putatifs de laccase ont été amplifiés puis clonés avec succès dans la levure Yarrowia lipolytica. Dans les conditions de l'étude, deux gènes Lac2 et ITMO2 permirent d'obtenir des enzymes recombinantes actives. Dans leur structure primaire, les enzymes Lac2 et ITMO2 présentent chacune les sites de coordination du cuivre, spécifiques des oxydases à cuivre. Lac2 et ITMO2 possèdent un pH optimum de 3 et 5 respectivement. Les deux enzymes ont démontré qu'elles possèdent une activité d'oxydation sur des substrats phénoliques comme le 2.6 dimétoxyphénol, le pyrogallol et la dopamine, mais aussi sur des substrats non phénoliques comme le 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) et l'o-Dianisidine
AbstractThe goal of this thesis was to search for new fungal ligninolytic enzymes from the environment. Samples of woody biomass were collected in three different ecosystems: a forest composed of deciduous trees (beech, birch) and gymnosperm (Cupressus macrocarpa), a cep of chardonnay infected with grapevine trunk disease and finally a decaying tree stump in a parking lot of an urban area. 71 strains were isolated from these environments. To select the fungal strain able to produce enzymes of interest a screening for laccase, Lip and Mnp was carried out. In order to maximize the completeness of this screening different culture conditions were used. To trigger the production of ligninolytic enzymes by the fungi Three culture media supplemented or not with inductors were used for the screening. The first medium tested was a rich medium without induction. The two other media contained respectively wheat straw and guaiacol as inductors. Besides, sampling was performed after 7 and 14 days as the kinetics of enzyme production could vary for a given fungal strain and culture conditions. 71 strains were tested for ligninolytic activities and 15 of them presented at least one enzymatic activity. Two of them showed their ligninolytique activities only on the media with inductors. Among the 15 fungi with enzymatic activities of interest, two basidiomycetes and 13 ascomycetes belonging to 6 different genera were identified. 12 ascomycetes were already described in the literature with laccase, Lip or Mnp activity. To our knowledge, the two basidiomycetes Peniophora versicolor and Piptoporus betulinus were not described for producing ligninolytic activities. Besides Scedosporium apiospermum showed laccase activity during the screening. Experiments of lignin degradation were carried out with the culture supernatant of this fungus. The results showed that the enzymes contained in S. apiospermum were able to modify the lignin polymer. This fungus was thus selected to further characterize its laccase like enzymes detected by the screening. Thanks to an in-silico screening in the genome of S. apiospermum 9 putative laccase genes were detected. Five putative laccase genes were then amplified with success from a cDNA library obtained from the mRNA of the fungus. Those five genes were cloned in the yeast Yarrowia lipolytica. In the conditions of the study, two genes called Lac2 and ITMO2 allowed the production of two active enzymes. In their primary structure, the two enzymes present the characteristic sites of copper coordination of multicopper oxidases. Lac2 and ITMO2 present an optimum pH of 3 and 5 respectively. Those two enzymes show an oxidative activity on various phenolic substrates such as 2.6 dimetoxyphenol, pyrogallol and dopamine but also on non-phenolic substrates including 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) and o-Dianisidine

L’astine C est un peptide cyclique assemblé au cours d’un mécanisme nonribosomique par une synthétase dite NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase). Ce peptide nonribosomique possède des propriétés thérapeutiques intéressantes avec notamment des activités anti-tumorale et anti-inflammatoire. Jusqu’ici ce composé était exclusivement extrait à partir des racines d’Aster tataricus, une plante utilisée traditionnellement en médecine japonaise et chinoise. Récemment, une production d’astine C a été mise en évidence chez Cyanodermella asteris, un champignon endophyte de cette plante. Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives en matière de production d’astine C, qui reste néanmoins très limitée en raison du faible taux de croissance du champignon endophyte. Au cours de cette étude, deux approches ont été développées parallèlement afin d’augmenter les taux de production de l’astine C. La première stratégie consistait à augmenter les rendements en optimisant la production homologue à partir de C. asteris. Dans cette optique, un système de culture a été établi afin de cultiver le champignon exclusivement sur un support en acier inoxydable. Ce mode de culture a favorisé à la fois le développement de la biomasse fongique et la production du composé d’intérêt. En vue d’optimiser ce procédé, l’impact de plusieurs paramètres de culture (modalité de préparation du support, type d’inoculum, pH de culture, et composition du milieu de culture) sur la production d’astine C a été évalué. Les paramètres de culture optimisés ont permis d’améliorer de nouveau les rendements en astine C, ce qui constitue une première étape dans le développement d’un procédé de production à l’échelle industrielle. En parallèle, des travaux ont été menés afin de développer un système de production hétérologue d’astine C chez la levure. Cette approche n’a pu être considérée qu’après avoir identifié, par le biais d’analyses bioinformatiques, les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse de l’astine. Une fois ces gènes identifiés, une revue de la littérature a permis, entre autres, de dresser un bilan des outils moléculaires disponibles pour le clonage des larges séquences nucléiques codant pour les NRPSs, et de sélectionner des hôtes hétérologues appropriés. Des séquences complète ou partielle du gène codant pour l’astine synthétase ont été clonées respectivement chez Saccharomyces cerevisiae et Yarrowia lipolytica. Pour les deux levures considérées, une expression hétérologue a été constatée. Chez S. cerevisiae, la synthèse de la NRPS d’astine n’a pas pu être démontrée. En revanche, pour la première fois, la production d’une structure de type NRPS chez Y. lipolytica a pu être mise en évidence. Bien qu’aucun peptide nonribosomique n’ait été détecté, cette étude a permis de lever une partie des verrous limitant le développement d’un mode de production hétérologue d’astine chez la levure
Astin C is a cyclic peptide assembled through a nonribosomal mechanism by a NonRibosomal Peptide Synthetase (NRPS). This nonribosomal peptide displays promising therapeutic properties including anti-tumor and anti-inflammatory activities. For decades, this compound was only extracted from the roots of Aster tataricus, a well-known plant in traditionnal japanese and chinese medicine. Recently, Cyanodermella asteris, a fungal endophyte of this plant, was demonstrated to be able to synthesize astin C. This discovery offers new opportunities for the production of this compound of interest. Nonetheless the very low growth rate of this endophytic fungus is an obstacle limiting the astin C production. In this study, two distinct approaches were conjointly considered to upscale the production rate of this compound. The first strategy was related to an optimization of the homologous production from C. asteris. For this purpose, an innovative cultivation system has been developed enabling to grow the fungus exclusively on a stainless steel support. This cultivation condition turned out to be favorable both for the fungal biomass development and for the astin C production. In order to further optimize this process, the effects of several culture parameters (i.e. support pre-treatment procedure, inoculum type, pH, medium composition) on the astin C production rates was investigated. Under optimized conditions, astin C yields were further enhanced, constituting a first step towards the development of an astin C production process at industrial scale. Meanwhile, a study was conducted in order to develop a heterologous expression system for astin C production in yeast. The identification, through bioinformatics analyses, of the genes involved in the astin biosynthesis was a precondition for the development of this approach. Once these genes have been identified, a literature review has enabled to compile the molecular tools applicable for the cloning of NRPS long lenght sequence, and to select a proper host to heterologously express them. The whole sequence or a truncated one have been transfered respectively to Saccharomyces cerevisiae or Yarrowia lipolytica. In boh considered yeasts, a heterologous expression of the foreign sequences was confirmed. In S. cerevisiae, the synthesis of the astin NRPS could not be demonstrated. On the other hand, in Y. lipolytica, for the first time, the production of a NRPS-type structure was detected. Although no nonribosomal peptide was detected, this study enabled to overcome several of the hurdles limiting the development of a astin heterologous production way in yeast

La paroi cellulaire de la levure est l'organite le plus externe de la cellule de la levure. Elle est composée d'une couche interne de polysaccharides, constituée de β-glucannes majoritairement réticulés à une quantité mineure de chitine, et à laquelle sont liées des mannoprotéines par des liaisons covalentes ou non. Les mannoprotéines forment la couche externe de la paroi cellulaire de la levure et sont considérées comme son deuxième composant le plus abondant. Les mannoprotéines de la paroi cellulaire de la levure sont des protéines fortement mannosylées par des O- glycannes simples courts et par des N-glycannes complexes et longs. Elles présentent des propriétés fonctionnelles particulières et une valeur nutritionnelle exceptionnelle liées à leur structure moléculaire, mais ont été peu étudiées. Ce travail vise à étudier la structure moléculaire des mannoprotéines de la paroi cellulaire de la levure par différentes techniques basées sur la spectrométrie de masse haute résolution.Les mannoprotéines ont été extraites par des procédés physiques ou chimiques, couplés éventuellement à un traitement enzymatique de la souche de référence S288C cultivées selon différents modes dans des bioréacteurs en présence d’un milieu de culture, ou d'échantillons levure industrielle, ou de produits industriels déjà fractionnés de levure. Ensuite, ces mannoprotéines ont été O- et N-déglycosylées chimiquement ou enzymatiquement. Les peptides obtenus ont été analysés par nanoESI-LC-MS/MS. L’analyse bio-informatique de ces données a permis l'identification et la quantification des mannoprotéines grâce à la base de données de la souche de référence de Saccharomyces cerevisiae S288C. La déglycosylation des peptides a également été vérifiée. Une analyse de l'ontologie des gènes a été ensuite réalisée pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines identifiées. Les O- et N-glycannes ont été chimiquement dérivées par une réaction d’amination réductrice, puis analysées respectivement par µESI-LC-MS et électrophorèse capillaire.Ce travail nous a permis de comparer différentes méthodes d'extraction des mannoprotéines de la paroi cellulaire de levure. Ces méthodes entraînent un enrichissement qualitatif ou quantitatif de différents types de ces mannoprotéines, mais aussi conduisent à la présence d'autres protéines principalement annotées comme étant liées aux membranes des organelles (en particulier mitochondriales et nucléaires). Une purification supplémentaire des isolats de paroi a été appliquée pour réduire le nombre de ces protéines n’appartenant pas à la paroi. Le développement d’un protocole de N-déglycosylation enzymatique utilisant une méthode utilisant un seul contenant sans transfert de l’échantillon a permis l'augmentation de la couverture des mannoprotéines identifiées. Avec d’autres enzymes le même protocole permet une O-déglycosylation douce mais qui dégrade les O-glycannes en monosaccharides. La N-déglycosylation enzymatique combinée avec une O-déglycosylation chimique permet d’isoler simultanément les O- et N-glycannes des mannoprotéines, permettant leur analyse ultérieure par spectrométrie de masse et électrophorèse capillaire après modification chimique avec des marqueurs appropriés par réaction d'amination réductrice. Les profils de protéines diffèrent qualitativement et quantitativement selon la phase de croissance et le mode de culture. Nous avons identifié certains de leurs marqueurs protéiques, qui sont des marqueurs de la privation de glucose exprimée dans la phase de croissance stationnaire de la culture discontinue en lot et de la culture discontinue alimentée.Cette approche glycoprotéomique a également été appliquée à la caractérisation glycoprotéomique et peptidomique des produits générés par différentes méthodes de traitement industriel, destinés à un usage commercial, permettant de déchiffrer leur nature complexe en termes de composition et de structure
Yeast cell wall is the outermost organelle of the yeast cell. It composed of an inner layer of polysaccharides, consisting of β-glucans mostly cross-linked to a minor amount of chitin, and to which are linked mannoproteins by covalent or non-covalent bonds. Mannoproteins form the outer layer of the yeast cell wall and are considered as its second most abundant component. Yeast cell wall mannoproteins are proteins that are highly mannosylated by short simple O-glycans and by large complex N-glycans. They have particular functional properties and exceptional nutritional value related to their molecular structure, but have been little investigated. This work aims to study yeast cell wall mannoproteins at the molecular level by different techniques based on high resolution mass spectrometry.The mannoproteins were extracted by physical, chemical methods eventually coupled to enzymatic methods from the reference strain S288C grown in different modes in bioreactors in the presence of a culture medium, or from industrial yeast samples, or from already fractionated industrial yeast products. These mannoproteins were then O- and N-deglycosylated chemically or enzymatically. The resulting peptides were analyzed by nanoESI-LC-MS/MS. Bioinformatics analysis of these data allowed the identification and quantification of mannoproteins using Saccharomyces cerevisiae S288C reference strain database. The deglycosylation of the peptides was also verified. Gene ontology analysis was then performed to determine the subcellular location of the identified proteins. The O- and N-glycans were chemically derivatized by a reductive amination reaction and then analyzed by µESI-LC-MS and capillary electrophoresis respectively.This work allowed us to compare different methods of extraction of mannoproteins from the yeast cell wall. These different methods result in qualitative or quantitative enrichment of different types of mannoproteins and in the presence of other proteins mainly annotated as being related to organelle membranes (especially mitochondrial and nuclear). Further purification of wall isolates was applied to reduce the number of these non-cell wall proteins. The development of an enzymatic N-deglycosylation protocol using a one-pot method without sample transfer allowed an increase in the coverage of identified mannoproteins. Using other enzymes, the same protocol allows a gentle O-deglycosylation but degrades O-glycans into monosaccharides. Enzymatic N-deglycosylation combined to chemical O-deglycosylation allows the simultaneous isolation of O- and N-glycans from mannoproteins, allowing their subsequent analysis by mass spectrometry and capillary electrophoresis after chemical derivatization with appropriate labels by reductive amination reaction. The protein profiles differ qualitatively and quantitatively according to the growth phase and culture mode. We identified some of their protein markers, which are markers of glucose deprivation expressed in the stationary growth phase of batch and fed batch culture.This glycoproteomic approach was also applied to the glycoproteomic and peptidomic characterization of products generated by different industrial processing methods, intended for commercial use, allowing to decipher their complex nature in terms of composition and structure