Literatura académica sobre el tema "Cellules souches pluripotentes – Embryons"

L’étude du développement humain est indispensable afin d’approfondir nos connaissances et, à long terme, perfectionner nos stratégies thérapeutiques dans les domaines de la médecine de la reproduction et de la médecine régénératrice. Face à la limite d’accès aux embryons surnuméraires et à l’interdiction d’en créer de nouveaux seulement à des fins de recherche, deux stratégies alternatives peuvent être proposées pour étudier le développement embryonnaire humain. La première consiste à fabriquer des pseudo-embryons ou blastoïdes. La seconde consiste à créer des embryons chimères homme/animal par injection de cellules souches pluripotentes, ES ou iPS, dans des embryons d’animaux. Nous expliquons ici l’importance de ces nouveaux paradigmes expérimentaux pour étudier le développement humain, et leur complémentarité.

Les chimères inter-espèces sont à la fois les créatures fantastiques et monstrueuses des mythologies grecque ou égyptienne, et un outil de recherche établi de longue date. Des avancées récentes dans le domaine des cellules souches pluripotentes ont permis d’élargir le répertoire des chimères inter-espèces aux chimères « systémiques » dans lesquelles le mélange des cellules des deux espèces concerne tous les organes, y compris la lignée germinale. Ces embryons et fœtus chimériques ouvrent de nouvelles voies de recherches et des applications médicales potentielles. Dans cette revue, nous ferons le point sur les dernières avancées dans ce domaine. Nous discuterons les concepts de complémentation et d’équivalence développementale. Nous évoquerons également les verrous méthodologiques à débloquer, ainsi que les limites biologiques et éthiques de ces nouvelles techniques.

Les chimères inter-espèces sont à la fois les créatures fantastiques et monstrueuses des mythologies grecque ou égyptienne, et un outil de recherche établi de longue date. Des avancées récentes dans le domaine des cellules souches pluripotentes ont permis d’élargir le répertoire des chimères inter-espèces aux chimères « systémiques » dans lesquelles le mélange des cellules des deux espèces concerne tous les organes, y compris la lignée germinale. Ces embryons et fœtus chimériques ouvrent de nouvelles voies de recherches et des applications médicales potentielles. Dans cette revue, nous ferons le point sur les dernières avancées dans ce domaine. Nous discuterons les concepts de complémentation et d’équivalence développementale. Nous évoquerons également les verrous méthodologiques à débloquer, ainsi que les limites biologiques et éthiques de ces nouvelles techniques.

L’infertilité, les fausses couches précoces et les malformations congénitales sont des problèmes majeurs de santé publique fréquents et relativement méconnus. Jusqu’à présent ce que l’on sait du développement précoce humain provient de deux sources principales : l’étude d’embryons humains et l’étude d’animaux modèles. Bien que certains mécanismes moléculaires soient conservés, il existe des spécificités liées à l’espèce humaine. Ainsi, il est important d’étudier les animaux modèles les plus proches possibles dans la classification phylogénétique, ce qui a mené à l’utilisation de lignées cellulaires de primates. De nos jours, les seuls embryons humains disponibles sont ceux issus de la Fécondation In Vitro, ils sont donc peu nombreux et doivent être détruits au bout de 14 jours. Cela a poussé les chercheurs à développer de nouvelles stratégies. Différentes équipes ont donc utilisé les cellules souches embryonnaires ou les cellules souches pluripotentes induites et leurs propriétés d’auto-organisation in vitro pour recréer des « embryons » et ainsi étudier leur développement. Ces nouvelles stratégies permettent de limiter l’utilisation d’embryons humains mais de nouvelles questions se posent désormais sur le statut légal de ces nouveaux « modèles ». À l’avenir, il sera important de mettre à jour les différentes législations et recommandations de l’International Society for Stem Cell Research (ISSCR) au fur et à mesure des avancées scientifiques pour éviter toute dérive. Un respect des recommandations et le maintien de discussions entre spécialistes et « grand public » permettront une meilleure compréhension du développement précoce humain et la mise en place de stratégies répondant à des enjeux sanitaires.

Depuis la dérivation des premières lignées de cellules souches embryonnaires pluripotentes chez la souris au début des années 1980, une pléthore de lignées a été obtenue chez diverses espèces de mammifères, dont les rongeurs, les lagomorphes et les primates. Ces lignées se distinguent par leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles et correspondent aux différents états de pluripotence observés chez l’embryon, entre les stades blastocyste et gastrula. Ces lignées se répartissent le long d’un gradient, ou continuum de pluripotence, dont les deux extrémités sont symbolisées par les états appelés naïf et amorcé. Les cellules souches pluripotentes humaines sont dans un état de pluripotence amorcé (au bas du gradient), une position qui est sans doute la cause de leur instabilité naturelle. Les recherches récentes visent à obtenir des cellules souches pluripotentes humaines à l’état naïf (en haut du gradient). L’importance de ces recherches dans la perspective d’applications médicales est discutée dans cette revue.

Les organoïdes de rétine dérivés de cellules souches pluripotentes représentent une avancée importante pour l’étude du développement de la rétine et offrent de nouvelles possibilités pour l’étude des maladies associées difficilement modélisables chez l’animal. La compréhension des étapes clefs du développement de la rétine chez les vertébrés a conduit à la mise au point de protocoles permettant d’obtenir, à partir de cellules souches pluripotentes, des structures tridimensionnelles auto-organisées contenant l’ensemble des types cellulaires de la rétine. Outre les applications en recherche fondamentale, ces organes miniatures ouvrent des perspectives encourageantes dans le domaine de la thérapie cellulaire ou le criblage de molécules thérapeutiques

Les maladies génétiques associées à des troubles neurodéveloppementaux (TND) regroupent plusieurs maladies pour lesquelles peu de traitements sont proposés. L’impossibilité d’accéder à des échantillons de cerveaux humains pour des études ex vivo, et les divergences entre l’homme et les modèles animaux rendent nécessaires de nouvelles approches de recherche. L’organoïde cérébral, une structure en trois dimensions, auto-organisée, et générée à partir de cellules souches pluripotentes induites, permet de reproduire les étapes de développement du cerveau humain, de la prolifération des cellules souches neurales à leur différenciation en neurones, en oligodendrocytes, ou en astrocytes. L’intérêt de ce modèle est désormais prouvé pour la compréhension du développement cérébral et pour la recherche de traitements. Après une présentation des cellules souches pluripotentes induites et des organoïdes, nous exposerons comment cette technique est actuellement déployée, en particulier pour étudier les mécanismes physiopathologiques résultant de variations génétiques pathogènes de gènes candidats de TND.

Les cellules souches pluripotentes (PSC) naïves ont la capacité de réintégrer le développement embryonnaire normal et de produire des fœtus chimériques chez les rongeurs. Cependant, les PSC naïves provenant d'espèces autres que les rongeurs présentent une capacité nettement moins efficace à coloniser les embryons. Actuellement, notre compréhension des mécanismes impliqués dans la formation des chimères est limitée. Le projet avait pour objectif de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la capacité des PSC à coloniser l’embryon pré-implantatoire. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux caractéristiques spécifiques des PSC capables de coloniser. Au laboratoire nous avons obtenus des lignées de PSC de lapin et une lignée de PSC de chimpanzé capable de coloniser l’embryon pré-implantatoire de lapin. Nous avons alors séquencé et analysé le transcriptome de ces lignées de PSC de lapin et de chimpanzé pour identifier les caractéristiques moléculaires des PSC capables de coloniser. Ainsi, nous avons montré que les PSC capables de coloniser active la signalisation PI3K, répriment la signalisation Hippo et modulent les voies impliquées dans les interactions cellulaires et la régulation du cytosquelette. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires intervenant durant la colonisation de l’embryon par les PSC. Pour cela, nous avons séquencé des embryons de lapin chimériques 48h après injection de PSC de chimpanzé ou de souris capables de coloniser. L’analyse du transcriptome des PSC injectées a révélé une augmentation de la signalisation PI3K/AKT ainsi que des voies de signalisations impliquées dans les jonctions cellulaires, les adhésions cellulaires et les régulations du cytosquelette, suggérant des interactions hôte-PSC injectés. De plus, l’analyse a également révélé qu’une partie de l’épiblaste de l’embryon hôte est composé de PSC injectées sans altération de l’identité de l’hôte. En conclusion, lors de la colonisation, les PSC et les cellules de l’embryon hôte interagissent et communiquent pour harmoniser leur développement
Naïve pluripotent stem cells (PSC) possess the ability to re-enter normal development and generate chimeric fetuses in rodents. However, naïve PSCs from non-rodent species exhibit a significantly less efficient capacity to colonize embryos. Currently, our understanding of the mechanisms involved in chimera formation is limited. The project aimed to decipher these mechanisms. Firstly, we focused on hallmarks of chimeric competent PSCs. In the lab, we obtained chimeric competent PSCs in rabbit and chimpanzee that we analyzed by RNA sequencing analysis to identify the molecular signature of chimeric competent PSCs. We showed that rabbit, chimpanzee as well as mouse PSCs enhance PI3K/AKT signaling, downregulate Hippo signaling and modulate cellular interactions and regulation of cytoskeleton. Secondly, we investigated mechanisms taking place during embryo colonization by PSCs. To this aim, we performed a single-cell RNA sequencing analysis of rabbit embryos colonized by chimpanzee and mouse PSCs. The analysis revealed that injected PSCs increased PI3K/AKT signaling and other signaling pathways involved in cell junction, cell adhesion, and cytoskeleton regulations, suggesting interactions between host embryo cells and injected PSCs. This analysis also revealed that part of the host epiblast is replaced by injected PSCs without any changes of the host cells’ identity. To conclude, during colonization, PSC and cells from the host embryos interact and communicate for efficient colonization

Les cellules souches hématopoïétiques sont à l'origine de la production de l'ensemble des cellules sanguines dans notre corps. Ces cellules souches sont générées pendant une phase courte du développement au niveau de l'aorte de l'embryon. Cette production aortique est unique et les cellules souches hématopoïétiques produites au cours de cette période sont les fondatrices du système hématopoïétique définitif. Malgré quelques avancées notables, les capacités d'amplification des cellules souches hématopoïétiques restent encore insuffisantes. Quant à la production ex-vivo de cellules souches hématopoïétiques, il n'existe pas encore de protocole utilisable pour des applications cliniques. Mon projet de thèse porte sur l'analyse d'un protocole de différenciation de cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules souches hématopoïétiques. Il est basé sur la formation de corps embryoïdes et leur maturation en une seule étape de 17 jours de culture en utilisant une combinaison nouvelle et spécifique de cytokines et de facteurs de croissance sans stroma et sans transgènes. Ce protocole produit des cellules souches hématopoïétiques capables de prises de greffe sériées dans des souris immunodéprimées irradiées. Grâce à des analyses transcriptomiques en cellules uniques réalisées à différents jours du protocole de différenciation, j'ai pu caractériser les différents types cellulaires produits. A l'issue des 17 jours de différenciation, les corps embryoïdes produisent des cellules des lignages mésodermiques, endodermiques et ectodermiques, ainsi que des cellules présentant un profil extra-embryonnaire dont la présence a pu être confirmée par immunofluorescence. La comparaison avec des jeux de données publics d'aortes embryonnaires humaines séquencées au moment de la production des cellules souches hématopoïétiques a montré la présence de cellules endothéliales présentant un profil similaire entre les cellules aortiques et celles de nos corps embryoïdes. De plus, des cellules présentant une signature transcriptomique proche des cellules souches hématopoïétiques embryonnaires humaines ont pu être identifiées. Ainsi, notre protocole semble récapituler la genèse des cellules souches hématopoïétiques dans l'aorte à partir d'une transition endothélio-hématopoïétique similaire à celle qui se produit in-vivo dans l'embryon humain. Enfin, l'analyse transcriptomique en cellule unique des moelles de souris greffées a pu montrer que les cellules humaines injectées sont capables de récapituler l'ensemble des lignages hématopoïétiques. Mon travail de thèse apporte donc une meilleure compréhension de la production ex-vivo des cellules souches hématopoïétiques à partir de cellules pluripotentes induites, tout en fournissant des éclairages sur les mécanismes développementaux orchestrant leur apparition in vivo
Hematopoietic stem cells are the rare cells that give rise to all hematopoietic cells in the human body. Unfortunately, our organism is not able to produce them outside a short window of embryonic development in the fetal aorta. Therefore, hematopoietic stem cell transplantation is often the only therapeutic solution for many patients. To expand the pool of available hematopoietic stem cells, two solutions have been proposed: proliferation of hematopoietic stem cells and de novo production from pluripotent stem cells. Despite some considerable progress, current methods for proliferation of hematopoietic stem cells are still inadequate. There is still no clinically suitable protocol for ex vivo generation of hematopoietic stem cells from pluripotent stem cells. My PhD project focuses on the analysis of a new differentiation protocol for human induced pluripotent stem cells into hematopoietic stem cells. This one-step protocol is based on the differentiation of embryoid bodies in 17 days of culture using a novel and specific combination of cytokines and growth factors. This stroma- and transgene-free procedure is capable of generating serially transplantable hematopoietic stem cells in irradiated, immunocompromised mice. Using single-cell transcriptomic datasets performed at different time points in the differentiation protocol, I was able to characterize the different cell types that were produced. Embryoid bodies produced cells of the mesodermal, endodermal, and ectodermal lineages after 17 days of differentiation, as well as some cells with an extra-embryonic phenotype, the presence of which was confirmed by immunofluorescence experiments. Our data set was compared with published data sets of human embryonic aorta at the time of hematopoietic stem cell production. Endothelial cells with a similar transcriptomic phenotype between the embryonic aorta and embryoid bodies were detected. In addition, cells corresponding to the transcriptional signature of embryonic hematopoietic stem cells were detected. Thus, our protocol appears to reproduce the generation of hematopoietic stem cells from the aorta through an endothelial-to-hematopoietic transition similar to that in vivo. Finally, single-cell transcriptome analysis of the bone marrow of the transplanted mice showed that the injected human cells recapitulated all hematopoietic lineages. The results of my dissertation provide a better understanding of our protocol for ex vivo production of hematopoietic stem cells while providing insight into the developmental mechanisms that control their production in vivo

Deux états d'autorenouvellement des cellules souches pluripotentes (PSCs) ont été définis, à savoir les états naïf et amorcé. De nombreuses différences existent entre ces deux états dont la plus marquante est la capacité unique des PSCs à l'état naïf, de coloniser l'embryon préimplantatoire et former des chimères. L'objectif de mon projet doctoral a été d'étudier la pluripotence chez le lapin. Dans ce cadre, j'ai d'abord entrepris de fabriquer et de caractériser des cellules souches pluripotentes induites (RbiPSCs), puis d'évaluer leur capacité à coloniser l'embryon et à former des chimères. Trois lignées de RbiPSCs dépendantes du FGF2 ont été obtenues par reprogrammation de fibroblastes de lapin. Leur caractérisation moléculaire et fonctionnelle a révélé des caractéristiques mixtes, naïves et amorcées. En revanche, sur le plan fonctionnel, elles sont incapables de coloniser l'embryon de lapin, une caractéristique de la pluripotence amorcée. La seconde partie de mon projet doctoral a consisté à reprogrammer des RbiPSCs vers l'état naïf. Dans ce but, j'ai surexprimé KLF2 et KLF4, deux gènes appartenant au réseau de pluripotence naïf, et utilisé les conditions de culture des PSCs de souris. Les cellules ainsi obtenues présentent un profil d'expression génique plus proche de celui de l'ICM de lapin, dû notamment à la réactivation de marqueurs spécifiques de la pluripotence naïve. Enfin, les cellules ainsi reprogrammées présentent une capacité accrue pour la colonisation de l'embryon préimplantatoire de lapin. Mes travaux constituent le premier exemple de reprogrammation de cellules souches pluripotentes vers l'état naïf chez le lapin. Les cellules ainsi produites ouvrent la voie à la fabrication de chimères somatiques et germinales
Pluripotent stem cells (PSCs) can self-renew at two distinct states, the naive and primed states. Many differences exist between these two states, the most striking is the unique ability of PSCs naïve to colonize the preimplantation embryo and form chimeras. The purpose of my doctoral project was to study pluripotency in rabbits. In this context, I initially manufactured and characterized induced pluripotent stem cells (RbiPSCs) and then evaluated their ability to colonize the embryo and form chimeras. Three RbiPSCs lines were obtained by rabbit fibroblasts reprogramming. Their molecular characterization revealed mixed characteristics, naïve and primed. However, functionally, they are unable to colonize the rabbit embryo, a feature of primed pluripotency. The second part of my doctoral project was to reprogram RbiPSCs to the naïve state. To this end, I have overexpressed Klf2 and Klf4, two genes belonging to the naïve pluripotency network and the mouse PSCs culture conditions. These new cell lines have a gene expression profile closer to that of the rabbit ICM, particularly due to the reactivation of specific markers of naïve pluripotency. Finally, the reverted cells have an increased capacity of colonization of the preimplantation embryo rabbit. My work represents the first example of pluripotent stem cells reprogramming toward the naive state in rabbits. The cells thus produced pave the way for the production of somatic and germline chimeras

Les cellules souches embryonnaires de souris (mESC) présentent un cycle cellulaire atypique caractérisé par l'absence d'une voie Rb fonctionnelle et la forte expression de la cycline E pendant toutes les phases du cycle cellulaire. En conséquence, les mESC sont constitutivement amorcées pour la réplication de l'ADN. Pour comprendre comment la cycline E, un régulateur clé de la transition de la phase G1 à S, est régulée dans les mESC, nous avons analysé la régulation transcriptionnelle de son gène Ccne1 par des facteurs de transcription du réseau de pluripotence naïve. Nous avons observé que les facteurs Esrrb, Klf4 et Tfcp2l1 se lient à la région du promoteur de Ccne1 sur plusieurs sites situés entre 0 et 1kb en amont du site d'initiation de la transcription. Un test luciférase nous a permis de monter qu'une mutation de ces sites de liaison diminue ou abolie l'activité transcriptionnelle du promoteur. De plus, la surexpression inductible à la doxycycline des facteurs Esrrb, Klf4 et Tfcp2l1 augment le niveau d'expression d'ARNm de Ccne1. Ces résultats suggèrent que Esrrb, Klf4 et Tfcp2l1 contrôlent l'expression de la cycline E. Ils mettent en évidence un lien direct entre le réseau de pluripotence naïve et la régulation du cycle mitotique dans les mESC. Nous avons utilisé le système rapporteur FUCCI pour étudier en fonction du cycle cellulaire l'expression des facteurs de transcription qui forment le réseau de pluripotence naïve. Nous avons observé que l'expression de Esrrb, Klf4, Tfcp2l1 et Nanog oscille au cours du cycle cellulaire avec une diminution de l'expression entre la phase G1 précoce et le début de S, puis une ré-augmentation entre le début de S et la phase G2/M. Ces résultats suggèrent que le réseau de pluripotence naïve est déstabilisé transitoirement lors du passage de la phase G1 à la phase S du cycle cellulaire
Mouse embryonic stem cells (mESCs) display an unorthodox cell cycle characterised by the lack of a functional Rb pathway and robust expression of cyclin E during all cell cycle phases. Therefore, mESCs are constitutively primed for DNA replication. To understand how cyclin E, a key regulator of the G1-to-S phase transition, is regulated in mESCs, we analysed the transcriptional regulation of Ccne1 by transcription factors of the naive pluripotency network. We observed that Esrrb, Klf4 and Tfcp2l1 bound the Ccne1 promoter region on multiple sites between 0 and 1kb upstream transcription start site. Disrupting the binding sites reduced or abolished transcriptional activity in a luciferase assay. Moreover, the doxycyclin-inducible expression of Essrb, Klf4 and Tfcp2l1 up-regulated the Ccne1 mRNA level. Taken together, these results strongly suggest that Essrb, Klf4 and Tfcp2l1 control Cyclin E expression and highlight a direct connection between the naïve pluripotency network and regulation of the mitotic cycle in mESCs. We used the FUCCI reporter system to study cell-cycle dependent expression of the transcription factors that form the naïve pluripotency network. Esrrb, Klf4, Tfcp2l1 and Nanog expression oscillated during the cell cycle with a down-regulated expression between the early G1-phase and the beginning of S-phase, and then up-regulated expression between the beginning of S-phase and the G2/M-phase. These results suggest that the naive pluripotency network is destabilized transiently during the transition from the G1-phase to the S-phase of the cell cycle

La thérapie cellulaire pourrait représenter une alternative à la transplantation hépatique dans certaines pathologies comme les maladies métaboliques sévères. Toutefois, la pénurie de donneurs d’organes implique la nécessité de trouver de nouvelles sources de cellules hépatiques comme les cellules souches pluripotentes qui peuvent être amplifiées extensivement et différenciées en tout type cellulaire. Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) générées à partir des cellules somatiques de patients puis différenciées en hépatocytes représentent une source potentielle d’hépatocytes. Ces cellules permettent en outre d’envisager la transplantation d’hépatocytes autologues génétiquement modifiés comme alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies génétiques du foie. L’hypercholestérolémie familiale (HF) est une maladie autosomale dominante due à des mutations dans le gène codant le Récepteur aux Low Density Lipoproteins (RLDL) qui est à l’origine d’un taux élevé de cholestérol sanguin de patients HF. Les patients homozygotes doivent épurer leur sérum par LDL-aphérèse en moyenne deux fois par mois dès le plus jeune âge pour éviter les infarctus mortels survenant dès l’enfance. Les hépatocytes différenciées à partir des iPSC de patients et leur correction in vitro, permettent d'évaluer la faisabilité de la transplantation d'hépatocytes autologues génétiquement modifiés pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale.Au cours du développement du foie, des hépatocytes et des cholangiocytes, les deux types de cellules épithéliales hépatiques, dérivent de progéniteurs hépatiques bipotents (les hépatoblastes). Bien que les cholangiocytes formant les canaux biliaires intrahépatiques ne représentent qu'une petite fraction de la population cellulaire totale du foie (3%), ces cellules régulent activement la composition de la bile par réabsorption des acides biliaires, un processus qui est important dans des maladies choléstatiques du foie. Dans la première partie de cette étude nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches pluripotentes (hESC et hiPSC) en cholangiocytes fonctionnels. Ces cellules serviront à la modélisation des maladies génétiques touchant les cholangiocytes formant des canaux biliaires. Dans la deuxième partie, nous avons généré des iPSC spécifiques de patients HF (HF-iPSC), différenciées en hépatocytes et corrigé le défaut phénotypique par transfert lentiviral de l’ADNc codant le LDLR dans les HF-iPSC
Cell therapy can be an alternative to liver transplantation in some cases such as severe metabolic diseases. However, the shortage of organ donors implies the need to find new sources of liver cells such as hepatocytes derived from pluripotent stem cells that can be amplified and differentiated extensively into any cell type. Human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells of patients and then differentiated into hepatocytes represent a potential source of transplantable hepatocytes. These cells now make it possible to consider the transplantation of genetically modified autologous hepatocytes as an alternative to liver transplantation for the treatment of genetic diseases of the liver.Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the gene encoding the receptor for Low Density Lipoproteins (LDLR), which is the cause of high blood cholesterol in these patients. Homozygous patients should purify their serum LDL-apheresis on average twice a month starting at a young age to avoid fatal myocardial infarction occurring in childhood.Human hepatocytes differentiated from patient’s induced pluripotent stem cells (iPSCs) allow assessing the feasibility to transplant genetically modified autologous hepatocytes as treatment of familial hypercholesterolemia.During the liver development, hepatocytes and cholangiocytes, the two types of hepatic epithelial cells, derive from bipotent hepatic progenitors (hepatoblasts). Although cholangiocytes, forming intrahepatic bile ducts, represent a small fraction of the total liver cell population (3%), they actively regulate bile composition by secretion and reabsorption of bile acids, a process that is important in cholestatic liver diseases. In the first part of this study we developed an approach to differentiate pluripotent stem cells (hESC and hiPSC) into functional cholangiocytes. These cells could be used for the modeling of genetic biliary diseases. In the second part, we generated FH patient specific iPSCs (HF-iPSC), differentiated them into hepatocytes and tried to correct the disease phenotype by lentiviral introduction of LDLR cDNA cassette in HF-iPSC

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) partagent avec les cellules souches embryonnaires la capacité à se différencier en tous les types cellulaires d'un organisme, mais leur obtention ne nécessite pas l'utilisation d'embryons. Elles sont générées par la surexpression de facteurs de transcription embryonnaires au sein de cellules somatiques. Les iPS représentent un outil de choix en biologie fondamentale et appliquée ainsi qu'en médecine régénérative.La plupart des protocoles de génération d'iPS reposent sur un transfert des séquences nucléotidiques codant les facteurs de transcription embryonnaires impliqués dans la mise en place du réseau de pluripotence. Bien qu'efficaces, ces méthodes présentent des problèmes de sécurité majeurs, incompatibles avec une utilisation clinique des iPS générées. La voie la plus rationnelle pour produire des iPS de manière parfaitement sécurisée est d'apporter les facteurs exogènes directement sous leur forme protéique. Des protocoles de reprogrammation par transfert de protéines ont été récemment développés, mais les efficacités associées sont relativement faibles et les protocoles relativement fastidieux.L'objectif de ce projet de thèse était de mettre au point une nouvelle approche de transfert de protéines, sécurisée et simplifiée, pour la génération de cellules souches pluripotentes induites utilisables en clinique. Les cellules à reprogrammer ont été choisies en fonction des applications potentielles des iPS générées : (i) les fibroblastes, faisant référence dans la bibliographie et permettant d'envisager des thérapies autologues avec notamment de nombreuses applications en hématologie ; (ii) les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, l'un des matériaux biologiques les plus sûrs, afin de générer des globules rouges in vitro, dans la perspective de répondre aux demandes croissantes en terme de transfusion, en particulier pour les groupes sanguins rares.Nous avons donc comparé les différents vecteurs de transduction de protéines développés par l'équipe TheREx du laboratoire TIMC-IMAG, en termes de facilité de production, d'efficacité de transfert ainsi que sur l'activité des facteurs de transcription associés. Le vecteur sélectionné est une micro-seringue naturelle portée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, capable d'injecter les facteurs Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 (facteurs de Thomson) mais aussi c-Myc, directement dans le cytoplasme des cellules cibles, sans étape de purification nécessaire. Les facteurs de transcription injectés sont adressés jusqu'au noyau des cellules en moins de 2h, où ils activent rapidement la transcription des gènes de pluripotence, avec des réponses significatives mesurées dès 24h après injection. Nous avons également mis en évidence le caractère sécurisé et contrôlable du vecteur puisque nous sommes capables d'éliminer complètement les bactéries des cultures grâce à un traitement antibiotique, et ce dès quelques heures après l'injection. Des optimisations des conditions de reprogrammation ont été réalisées en modifiant les principaux paramètres que sont, le choix des facteurs de transcription, la fréquence des injections et le ratio bactéries : cellules.Ainsi, bien que nous ne soyons pas parvenus à générer des iPS à ce jour avec ce système, la micro-seringue naturelle que nous avons développé et optimisé se positionne comme un vecteur de choix pour le transfert de protéines dans l'optique de générer des iPS, en termes d'efficacité de vectorisation et d'induction transcriptionnelle, de sécurité mais aussi de facilité d'utilisation
Like embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS) are characterized by their ability to differentiate into any cell type in an organism. However their use doesn't raise the ethical issue linked to the use of embryos. iPS are generated from somatic cells by overexpression of embryonic transcription factors. iPS are thereby very promising in fundamental and applied biology as well as for regenerative medicine.Most of the protocols used to generate iPS are based on the delivery of nucleic acid sequences encoding embryonic transcription factors responsible for the activation of the pluripotency gene network. In spite of their efficiency, these methods are associated with major safety concerns incompatible with clinical applications. The more rational path to safely produce iPS is to deliver the exogenic transcription factors under their protein form. Recently some protocols using protein delivery have been developed to produce iPS. However associated efficiencies are very low and protocols are quite fastidious.The aim of this Ph.D. project was to develop a new efficient and simplified protein delivery method for the safe generation of iPS compatible with clinical applications. Cell sources were selected depending of the final applications of iPS: (i) fibroblasts, extensively used and described in bibliography and allowing autologous therapies with many applications in the field of hematology; (ii) cord blood hematopoietic stem cells, one of the safest biomaterials, with the aim to generate red blood cells in vitro in order to respond to increasing needs for transfusion products, particularly for rare blood types.First, different protein vectors developed by the TheREx team of the TIMC-IMAG laboratory were compared for their efficiency of production and delivery as well as for the activity of associated factors. The selected vector is a natural micro-syringe expressed by Pseudomonas aeruginosa, able to inject the transcription factors Oct4, Sox2, Nanog and Lin28a (Thomson combination) with c-Myc directly into the cytoplasm of target cells, without the need for any purification step. Once injected, transcription factors are addressed to the nucleus in less than 2 hours where they efficiently activate transcription of pluripotency genes, with significant responses observed as early as 24h after injection. We also highlighted the secured and controllable nature of this vector by completely eliminating the bacteria from the cultures in a few hours after injection with an antibiotic treatment. Optimizations of the reprogramming conditions were also made by adjusting many parameters such as the combination of transcription factors, the injection frequency and the bacteria : cell ratio

La transplantation d’hépatocytes représente une alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies métaboliques dont l’hypercholestérolémie familiale. Les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines représentent de nouvelles sources de cellules hépatiques. Nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches humaines en cellules hépatiques et généré ainsi des cellules dérivées de cellules iPS de patients atteints d’hypercholestérolémie familiale
Hepatocyte transplantation represents an alternative to liver for the treatment of metabolic diseases including familial hypercholesterolaemia. Embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS) represent new sources of hepatic cells. We have developed an approach to differentiate human stem cells into hepatic cells and thus we have generated hepatic cells derived from iPS of familial hypercholesterolaemia patients

Les cellules souches à pluripotence induite (iPSCs) ont considérablement impacté la biologie du développement ainsi que la médecine régénérative, particulièrement parce qu’elles sont une alternative à l’utilisation de cellules d’origine embryonnaire mais surtout parce qu’elles offrent la possibilité de générer des cellules souches pluripotentes spécifiques du patient. Cependant, les protocoles de reprogrammation conventionnels génèrent des iPSCs humaines (hiPSCs) dans un état développemental avancé ou état amorcé, limitant leur utilisation à la modélisation du développement humain post-implantatoire. Ainsi, il est devenu nécessaire d’identifier des hiPSCs qui soient dans un état naïf, représentatif de l’épiblaste de l’embryon humain pré-implantatoire. Nous avons développé un protocole permettant de reprogrammer des cellules somatiques directement en hiPSCs naives par surexpression d’OKMS dans des conditions de culture spécifiques, sans transiter par un état de pluripotence amorcé. Ce protocole permet, en outre, de générer en parallèle des lignées isogéniques arborant différentes potentialités dont l’état amorcé représentant un contrôle majeur. Pour évaluer les hiPSCs naives générées, nous les avons comparé à l’épiblaste pré-implantatoire humain ce qui a montré une remarquable concordance au regard de leur transcriptome, leur dépendance à la respiration mitochondriale, la méthylation de leur ADN ainsi qu’au status du chromosome X. En somme, ces résultats sont essentiels pour comprendre la régulation de la pluripotence au cours du développement préimplantatoire et ouvrent de nouvelles perspectives pour la modélisation de maladies ainsi qu’en médecine régénérative
Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have considerably impacted human developmental biology and regenerative medicine, notably because they circumvent the use of cells from embryonic origin and offer the potential to generate patient-specific pluripotent stem cells. However, conventional reprogramming protocols produce developmentally advanced, or primed, human iPSCs (hiPSCs), restricting their use to post-implantation human development modelling. Hence, there is a need for hiPSCs resembling preimplantation naive epiblast. Here, we developed a method to generate naive hiPSCs directly from somatic cells using OKMS overexpression and specific culture conditions without transitioning through a primed pluripotent state. Besides, this protocol enables parallel generation of isogenic lines bearing different potencies among which the primed state as it is a major control line. To evaluate the generated naive hiPSCs, we benchmarked them against human preimplantation epiblast and reveal a remarkable concordance in their transcriptome, dependency on mitochondrial respiration, DNA methylation and X chromosome status. Collectively, these results are essential for the understanding of pluripotency regulation throughout preimplantation development and will generate new opportunities for disease modeling and regenerative medicine

GNAS est un locus complexe soumis à l'empreinte parentale. Il code pour cinq transcrits alternatifs dont l’expression est régulée de manière parentale, tissulaire et développementale : la sous-Unité alpha stimulatrice de la protéine G hétérotrimérique (Gαs), XLαs, NESP55, et deux ARNnc, A/B et GNAS-AS1. Gαs est une protéine clé dans la transduction hormonale partageant avec XLαs la capacité de produire l'AMPc intracellulaire après stimulation des récepteurs couplés à Gαs.Dans la première partie de ma thèse, je me suis concentrée sur l'étude du rôle des transcrits de GNAS, en particulier XLαs, dans la croissance fœtale et post-Natale. J’ai profité du modèle unique des pseudohypoparathyroïdies (PHPs), pathologies humaines rare de l’empreinte, causées par des anomalies génétiques ou épigénétiques du locus GNAS altérant le dosage génique des transcrits de GNAS. La croissance anormale est une caractéristique majeure des PHPs.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai étudié le profil épigénétique du locus GNAS (méthylation de l'ADN et expression des transcrits) dans les cellules souches humaines embryonnaires -HESCs-, dans les cellules pluripotentes induites dérivées à partir de fibroblastes de sujets sains -IPSCs- et dans les cellules redifférenciées en cellules souches neurales et mésenchymateuses. La caractérisation précise du locus humain GNAS en physiologie (cellules souches) et pathologie (PHP) est essentielle pour une meilleure compréhension des processus développementaux importants comme la croissance. L'exploration du phénotype "croissance" de différents types de PHPs a permis de mieux comprendre le rôle des transcrits du locus GNAS dans la physiologie et la physiopathologie. L'analyse de cellules des PHPs a permis de mieux caractériser l’impact des anomalies moléculaires du locus GNAS en pathologie humaine. Les hiPSCs peuvent être un outil utile pour étudier les modifications épigénétiques au niveau du locus GNAS
GNAS is a complex locus subjected to parental imprinting encoding five parental-, tissue- and developmental-Manner regulated transcripts : the alpha stimulatory subunit of the G protein (Gαs), XLαs, NESP55, and two ncRNAs, A/B and the antisens GNAS-AS1. Gαs is a key protein in hormonal signaling sharing with XLαs the ability to produce intracellular cAMP upon stimulation of Gαs-Coupled receptors. In the first part of my thesis, I focused on studying the role of the GNAS transcripts, particularly XLαs, in fetal and postnatal growth. I took advantage of the unique model of pseudohypoparathyroidism (PHP), a rare human disease, caused by genetic or epigenetic abnormalities at the GNAS locus leading to various combinations of GNAS transcripts alterations. Abnormal growth appears to be a major feature of PHP. In the second part of my thesis, I studied the epigenetic pattern of GNAS (DNA methylation and transcripts expression) in human embryonic stem cells -HESCs-, in induced pluripotent stem cells -IPSCs- derived from fibroblasts from healthy individuals, and in cells re-Differentiated from these stem cells in neuronal and mesenchymal cells. The precise characterization of the human GNAS locus in physiology (stem cells) and pathology (PHP) is critical for a better understanding of major processes like growth. Through exploration of the "growth" phenotype of different groups of PHPs we have participated to the better understanding of the role of the GNAS transcripts in the physiology and pathophysiology. Human iPSCs may be an useful tool to study epigenetic modifications at the GNAS locus