Tesis: "Cellules souche pluripotente induite IPSC"

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Jung, Laura. "Optimisation de protocoles de reprogrammation de cellules somatiques humaines en cellules souches à pluripotence induite (hiPSC)". Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ066.

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Resumen

En 2006 et 2007, les équipes de Yamanaka et Thomson réalisent la reprogrammation de cellules somatiques murines et humaines en cellules souches pluripotentes à partir de deux cocktails de gènes : OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) et OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). Les cellules souches à pluripotence induite générées (iPS) partagent les propriétés fondamentales des cellules souches embryonnaires : l’auto-renouvèlement, le maintien de la pluripotence et la capacité de différenciation. Ces cellules laissent entrevoir des applications considérables tant en recherche fondamentale (compréhension des mécanismes de développement et de pathologies, développement de modèles) qu’en recherche appliquée (médecine régénérative, toxicologie prédictive, criblage de médicaments). L’avantage majeur de l’utilisation des iPS réside dans leur origine non embryonnaire. Les contraintes d’ordre éthique sont écartées et une grande diversité de types cellulaires à partir de n’importe quel donneur a priori est disponible pour une reprogrammation. L’établissement d’une banque d’hiPS issus de donneurs sains ou de patients, serait d’une grande utilité pour la communauté scientifique se consacrant à l’étude des mécanismes physiopathologiques ou de développement et une source considérable pour la dérivation à des fins de thérapie cellulaire. Dans le but de mettre en place une telle banque, nous avons développé avec la société Vectalys des rétrovirus de reprogrammation contenant les cassettes polycistroniques ONSL et OSKM. Dans un premier temps, nous avons établi un protocole de reprogrammation robuste à l’aide des rétrovirus RV-ONSL. Nous avons ensuite mis en évidence la synergie entre les facteurs ONSL et OSKM, la combinaison équimolaire de RV-ONSL et RV-OSKM permettant d’atteindre 2% d’efficacité de reprogrammation. Nous avons également entrepris la reprogrammation propre par transfections d’ARNm polycistroniques ONSL et OKM mettant à profit cette incroyable synergie
In 2006 and 2007, Yamanaka and Thomson teams achieved the reprogramming of mouse and human somatic cells into pluripotent stem cells through the transfection of two cocktails of genes: OCT4, SOX2, KLF4, cMYC (OSKM) and OCT4, NANOG, SOX2, LIN28 (ONSL). The generated cells, called induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) share the same fundamental properties of ESC : self-renewing, pluripotency maintenance and capacity of differentiation into the three germ layers and suggest the same application potential in basic research (developmental and epigenetic biology) as well as in therapy (regenerative medicine, disease modeling for drug development). One of the major advantages of iPSC lies in their non-embryonic origin. Indeed, the use of iPSC resolves the ethical constraints and offers the possibility to work with extensive cell types directly from the patient to treat. Stéphane Viville’s research team aims to develop a hiPSC bank from patient suffering from genetic or other diseases which will be available for the scientific community. We are experienced in human primary fibroblasts reprogramming especially with the use of two polycistronic cassettes: ONSL encoding Thomson’s cocktail and OSKM encoding Yamanaka’s cocktail separated with 2A peptides. Thanks to the combination of RV-ONSL and RV-OSKM retroviral vectors (developed with Vectalys) we are yielding more than 2% of reprogramming efficiency in a highly reproducible way. Indeed, we demonstrated the reprogramming synergy of ONSL and OSKM combination. We are now focusing our effort on non-integrative strategies (ie mRNA) which are more appropriate for clinical usage

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Raguin, Jérémy. "Modélisation de la niche tumorale des gliomes dans des organoïdes cérébraux humains vascularisés et immunocompétents". Electronic Thesis or Diss., Université Paris Cité, 2024. http://www.theses.fr/2024UNIP5148.

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Resumen

Malgré un traitement multimodal agressif associant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, le glioblastome (GBM) récidive systématiquement. Les récidives sont dues, au moins en partie, à la présence de cellules souches de glioblastome (CSG) qui sont résistantes aux traitements et, en particulier, à l'irradiation. En outre, les CSG sont situées dans un microenvironnement tumoral favorisant leur développement. Notamment, les CSG sont associées aux vaisseaux qui régulent leur prolifération, leur survie et favorisent leur invasion. Par ailleurs, les macrophages associés aux tumeurs (MAT) représentent la population la plus abondante des cellules non tumorales au sein des GBM et leur abondance est corrélée à la gravité des GBM. Ces TAM proviennent du recrutement de monocytes circulants et des cellules microgliales (macrophages résidents) qui acquièrent des propriétés immunosuppressives (pro-tumorales). Le développement récent d'organoïdes cérébraux humains obtenus à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (IPSC) permet de modéliser la physiologie et la physiopathologie du cerveau tel que le gliome. Ces organoïdes sont des structures 3D avatars du cerveau et issus de la différenciation de cellules souches embryonnaires ou d'IPSC. Cependant, la plupart des modèles d'organoïdes sont dépourvus de systèmes vasculaire et immunitaire qui jouent un rôle essentiel dans le cerveau sain et dans les mécanismes physiopathologiques. L'objectif de ma thèse a été de développer un nouveau modèle d'organoïdes cérébraux complexes contenant une vascularisation et des cellules immunitaires afin de modéliser le microenvironnement tumoral du GBM. Plusieurs lignées humaines d'IPSC ont été différenciées pour obtenir d'une part des organoïdes cérébraux et d'autre part des hémangioblastes (progéniteurs bipotents hématopoïétiques /endothéliaux). L'incorporation d'hémangioblastes dans les organoïdes cérébraux a été réalisée précocement au cours de leur formation afin de mimer la colonisation du cerveau, au cours du développement cérébral, par les cellules endothéliales et les macrophages primitifs qui sont à l'origine des vaisseaux et des cellules microgliales. Ces organoïdes cérébraux complexes ont été caractérisés par différentes approches d'immunohistologie, FACS et RT-qPCR. De vastes structures vasculaires se sont développées dans les organoïdes et présentaient des caractéristiques de la barrière hématoencéphalique. De plus, ces structures vasculaires étaient perfusées lorsque les organoïdes ont été transplantés dans des souris immunodéficientes. Des cellules présentant un phénotype ainsi que des fonctionnalités caractéristiques des cellules microgliales se sont également développées dans les organoïdes complexes. Des lignées de CSG, dérivées de patients atteints de GBM ou d'astrocytome de grade IV, ont été co-cultivées dans les organoïdes complexes puis irradiés, ou non, afin de mimer la radiothérapie. J'ai montré que les CSG semblaient coopter les structures vasculaires et perturbaient l'expression d'une protéine d'adhésion cellulaire dans les cellules endothéliales. Par ailleurs, la présence de CSG dans les organoïdes complexes provoquait une reprogrammation des cellules microgliales en TAM immunosuppresseurs. Enfin, les CSG avaient une capacité de prolifération accrue après irradiation et présentaient un profil transcriptomique plus agressif. L'ensemble de ces résultats montre que ces organoïdes cérébraux complexes humains permettent de modéliser un microenvironnement tumoral du GBM ainsi que la récurrence après radiothérapie. En conclusion, notre modèle d'organoïdes cérébraux complexes vascularisés et immunocompétents devrait être utile pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de diverses maladies du cerveau comme le GBM et permettra de découvrir de nouvelles thérapies
Despite an aggressive multimodal treatment combining surgery, radiotherapy and chemotherapy, glioblastoma (GBM) systematically recurs. Recurrence is due, at least, to the presence of glioblastoma stem cells (GSC) that are resistant to treatment and, in particular, to irradiation. In addition, GSC are located in a tumour microenvironment that favours their development. Specifically, GSC are associated with vessels, which regulate their proliferation and survival and encourage their invasion. Furthermore, tumour-associated macrophages (TAM) represent the most abundant population of non-tumour cells within GBM and their abundance correlates with GBM severity. These TAM originate from the recruitment of circulating monocytes and microglial cells (resident macrophages) which acquire immunosuppressive (pro-tumour) properties. The recent development of human cerebral organoids obtained from human induced pluripotent stem cells (IPSCs) makes it possible to model the physiology and pathophysiology of the brain, such as gliomas. These organoids are 3D avatars of the brain, derived from the differentiation of embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells (IPSC). However, most organoid models lack the vascular and immune systems that play an essential role in the healthy brain and in pathophysiological mechanisms. The aim of my thesis was to develop a new model of complex cerebral organoids containing vascularisation and immune cells in order to model the tumour microenvironment of GBM. Several human IPSC lines were differentiated to obtain both cerebral organoids and hemangioblasts (bipotent hematopoietic/endothelial progenitors). The incorporation of hemangioblasts into the cerebral organoids was carried out early in their formation to mimic the colonisation of the brain, during cerebral development, by endothelial cells and primitive macrophages that are at the origin of vessels and microglial cells. These complex cerebral organoids were characterised using various approaches (immunohistological, FACS and RT-qPCR). Extensive vascular structures developed in the organoids and showed characteristics of the blood-brain barrier. In addition, these vascular structures were perfused when the organoids were transplanted into immunodeficient mice. Cells with a microglial phenotype and typical functionalities also developed in complex organoids. GSC lines derived from patients with GBM or grade IV astrocytoma were co-cultured in complex organoids and then irradiated, or not, to model radiotherapy. I showed that GSC appeared to co-opt vascular structures and disrupted the expression of a cell adhesion protein in endothelial cells. Furthermore, the presence of GSC in complex organoids induced reprogramming of microglial cells into immunosuppressive TAM. Finally, GSC had an increased proliferation capacity after irradiation and presented a more aggressive transcriptomic profile. Taken together, these results show that these complex human cerebral organoids can be used to model GBM tumour microenvironment and recurrence after radiotherapy. In conclusion, our model of complex vascularized and immunocompetent cerebral organoids should be useful for understanding the pathophysiological mechanisms of various brain diseases, such as GBM, and to discover new therapies

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Telliam, Gladys. "Leucémie myéloïde chronique : modélisation de l'hématopoïèse leucémique par les cellules souches pluripotentes induites". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS273/document.

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Resumen

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif clonal initié par l’activité tyrosine kinase de l’oncoprotéine de fusion BCR-ABL dans une cellule souche hématopoïétique (CSH) très primitive et caractérisée par une instabilité génétique responsable de l’évolution clonale de la maladie. Les mécanismes de survie, d’autorenouvellement et ceux de la progression vers une phase de leucémie aigüe sont difficilement modélisables dans les CSH primaires de patients. La technologie des IPSC ; permettant de reprogrammer les cellules leucémiques à un état pluripotent ; pourrait permettre de générer in vitro des progéniteurs et des cellules leucémiques très primitives, dont l’évolution biologique pourrait être séquentiellement analysée. Dans ce but, nous avons généré une lignée IPSC à partir des cellules leucémiques d’un patient atteint de LMC. Nous avons montré que la lignée IPSC différenciée en hémangioblastes ou en progéniteurs hématopoïétiques présente un potentiel clonogénique accru. Ce potentiel est modulable sous l’action de l’imatinib mesylate ; qui inhibe l’autophosphorylation de BCR-ABL et celle de la protéine CRK-L ; mais également par la manipulation pharmacologique de la voie AHR impliquée dans la quiescence des CSH. En utilisant une stratégie de mutagénèse in vitro, nous avons montré la possibilté d’exacerber le potentiel hématopoietique des cellules hématopoïétiques dérivées des iPSC leucémiques. Les iPSC analysées après traitement par l’agent mutagène ENU présentent des anomalies cytologiques et cytogénétiques additionnelles reminiscentes de la phase blastiques de la maladie. Les analyses moléculaires par aCGH ont permis d’identifier dans les cellules hématopoïétiques dérivées d’IPSC traités par ENU, une signature moléculaire compatible avec celle décrite dans les cellules blastiques de patients. L’ensemble de nos résultats suggèrent qu’il est possible de modéliser certains aspects de la LMC ; notamment un phénotype myéloprolifératif ; et de génerer un modèle de progression blastique in vitro à partir des iPSC leucémiques, permettant ainsi d’identifier de nouveaux biomarquers prédictifs de progression tumorale ou le criblage de médicaments
Chronic myeloid leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative malignancy initiated by tyrosine kinase activity of the fusion oncoprotein BCR-ABL in very primitive hematopoietic stem cell and characterized by a genetic instability leading to clonal progression. Mechanisms of survival, self-renewal and progression of the disease are difficult to model using primary leukemic cells. The use of iPSC technology could allow reprogramming of leukemic cells to pluripotency with generation of primitive leukemic cells whose evolution can be sequentially analyzed. For this purpose, we generated an IPSC cell line from the leukemic cells of a CML patient and analyzed the possibility to generate a myeloproliferative phenotype. We have shown that this iPSC exhibits an increased hematopoietic potential either via EB or Blast-CFC generation. This potential can be modulated by the action of imatinib, inhibiting autophosphorylation of BCR-ABL and that of CRKL. We show that hematopoietic potential of CML iPSC can also be modulated by using AHR antagonists, which allow further amplification of hematopoietic cells. To evaluate the possibility of generating a clonal progression model in vitro, we have used a mutagenesis strategy. CML iPSC treated by ENU for several weeks generated hematopoietic cells with increased efficiency. These cells showed evidence of cytological and cytogenetic abnormalities reminiscent of a blast crisis. aCGH analyses of hematopoietic cells generated revealed genomic abnormalities described in CML blast crisis and a molecular signature compatible with blast crisis described in CML patients. These results suggest the feasibility of using patient specific iPSC for modeling CML blast crisis, which could be used for discovery of novel biomarkers and drug screening

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Secardin, Lise. "Modélisation des néoplasmes myéloprolifératifs grâce aux cellules souches induites à la pluripotence (IPSC)". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC313/document.

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Resumen

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont hémopathies malignes aboutissant à la surproduction d'une ou plusieurs lignées myéloïdes. Elles sont dues à l'acquisition de mutations sur l'axe de signalisation MPL/JAK2 incluant des mutations de JAK2V617F, de MPL et plus récemment de la calréticuline (CALR), dont les deux principales sont CALRdel52 et CALRins5. Ces mutations de signalisations peuvent être accompagnées de mutations de l'épigénétique, les plus importantes étant des mutations dans TET2. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des mutations de TET2 et de la calrdel52 dans les NMP grâce à une technologie de cellules souches induites à la pluripotence (IPSC). Dans la première partie j'ai pu démontrer que TET2 joue un rôle dans le processus de reprogrammation, vraisemblablement de manière indépendante de son activité catalytique. Dans la seconde partie, j'ai démontré que CALRdel52 joue un rôle dans les MPN en provoquant une hypersensibilité et une pousse indépendante de la TPO des progéniteurs mégakaryocytaires ainsi qu'une hyperprolifération des mégacaryocytes, liées à l'activation constitutive de stat3 et de ERK. J'ai également démontré une pousse indépendante du GCSF des granulocytes. Ce travail a donc permis de mettre en lumière le rôle du facteur épigénétique TET2 dans le processus de reprogrammation ainsi que le rôle de CALRdel52 dans les MPN dans un contexte d'expression endogène
Myeloproliferative neoplasms (NMP) are hematological malignancies that lead to an ovrproduction of one or more myeloid lineages. They are driving by mutations in MPLl/jak2 signaling pathway, mainly JAK2V617F, MPL, and more recently calreticulin (CARL), with two main mutations being calrdel52 and calrins5. These signaling mutations are sometimes associated with epigenetic mutations, the major one being in tet2. The objective of my thesis was to study the role of TET2 and CALRdel52 in MPN thanks to an induced pluripotent stem cells (IPSC) model. In the first part i demonstrated the role of TET2 in reprogramming process, probably independently of the catalytic domain. In the second part i demonstrated that CALRdel52 induced a TPO hypersensitivity and a TPO indenpendant growth of the megakaryocytic progenitors as well as a hyperproliferation of the megakaryocytes. This phenotype is associated with a constitutive activation of stat3 and ERK. A G-CSF independent growth of the granulocyte was also demonstrated. In conclusion this work underline the role of an epegenetic factor, TET2, in the reprogramming process and demonstrate the role of CALRdel52in MPN with an endogenous expression model

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Gatinois, Vincent. "Pathologies des hélicases et vieillissement précoce : modèle d'étude par dérivation de cellules souches pluripotentes induites (iPS)". Thesis, Montpellier, 2017. http://www.theses.fr/2017MONTT042/document.

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Resumen

Les hélicases sont des enzymes ubiquitaires catalysant la séparation de l’ADN double-brin et impliquées dans la réplication, la réparation de l’ADN et dans le maintien des télomères. Chez l’Homme, 3 hélicases présentent des mutations responsables de syndromes cliniques : WRN pour le syndrome de Werner, BLM pour le syndrome de Bloom et RECQL4 pour le syndrome de Rothmund-Thomson. Tous ces syndromes associent un vieillissement pathologique accéléré à un risque accru de développement de cancer notamment par une augmentation de l’instabilité génomique. Les connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces maladies du vieillissement sont encore très partielles, notamment en ce qui concerne le lien entre l’instabilité génomique et le vieillissement. Au cours de ce projet, l'utilisation de prélèvements sanguins et cutanés de patients atteints de ces pathologies rares a permis de générer des modèles de cellules souches pluripotentes induites (iPS). Ces cellules présentent l’avantage de s’auto-renouveler et de pouvoir théoriquement se différencier dans tous les types cellulaires d’un organisme. Parallèlement, un témoin de sénescence a été généré de la même manière avec des cellules d’un patient souffrant du syndrome de la progéria de Hutchinson-Gilford. Après caractérisation de ces cellules, nous avons identifié des ensembles de phénotypes cellulaires et moléculaires dans le but de récapituler in vitro les pathologies. Nous avons également engagé les cellules iPS dans des voies de différenciation proches des tissus atteints dans les pathologies in vivo. Enfin, nous avons étudié la stabilité génomique de ces lignées dans les différents types cellulaires cultivés. Ainsi nous avons observé que la lignée Bloom est le siège de recombinaisons particulièrement fréquentes et est caractérisée par une instabilité du génome dans tous les types cellulaires étudiés. Egalement, la lignée Werner semblerait se distinguer par une instabilité de ses télomères. Enfin, l’ensemble des lignées des pathologies du vieillissement prématuré présenterait un défaut mitochondrial
Helicases process the double-stranded DNA dissociation. They are involved in replication, DNA repair and maintenance of telomeres. In human, 3 helicases display mutations responsible for clinical syndromes: WRN for the Werner syndrome, BLM for the Bloom syndrome and RECQL4 for the Rothmund-Thomson syndrome. All these diseases cause premature ageing and high risk of cancer. Molecular and cellular mechanisms involved in these diseases are not well defined. Particularly, little is known concerning the link between genomic instability and ageing. During this project, we used blood samples and skin biopsies of affected patients to generate models by reprogramming cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs). These cells have the advantage of self-renewing and theoretically could be differentiated in all cell types. At the same time, an iPSC senescence control was performed from cells of a Hutchinson-Gilford Progeria syndrome patient. iPSCs were characterized for pluripotency. In the aim of recapitulate these pathologies in vitro, we identified sets of cellular and molecular phenotypes. We also engaged differentiation of iPSCs in cell pathways closed to the affected tissues in vivo. Finally, we studied the genomic stability of iPSCs and derived cells. We observed that Bloom cells are susceptible to frequent recombinations and are characterized by a genome instability through all studied cell types. Werner cells showed an instability of telomeres length. Finally, all premature ageing diseases displayed mitochondrial defects

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Steichen, Clara. "Eléments d'évaluation pour l'utilisation d'hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en thérapie cellulaire". Paris 7, 2014. http://www.theses.fr/2014PA077045.

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Parmi les nombreuses applications potentielles des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ce travail de thèse s'est intéressé à l'utilisation d'hépatocytes dérivés d'iPSC en thérapie cellulaire. Des hiPSC ont d'abord été générées par transfection itérative d'ARN messagers. L'intégrité génomique de ces cellules a été analysée, en comparaison avec des iPSC générées en parallèle par une méthode virale. Le profil SNP des iPSC-ARN ne diffère pas de celui des fibroblastes de départ, contrairement à celui des iPSC virales, mais le nombre de délétions ou duplications (CNV) ne dépend pas de la méthode de reprogrammation. Cette analyse génomique a également permis de mettre en évidence une lignée iPSC-ARN atypique présentant un remaniement caryotypique complexe, équilibré et stable qui comprend une importante disomie monoparentale, ainsi qu'un défaut dans la capacité de formation de tératomes. La seconde partie de ce travail rapporte la génération d'hiPSC à partir de fibroblastes de patients hémophiles B. Pour corriger le déficit génétique, nous avons utilisé, dans ces iPSC, des nucléases artificielles pour insérer une cassette thérapeutique codant le FIX. La différenciation en hépatocytes de ces iPSC modifiées nous permettra de valider la correction in vitro, et in vivo dans un modèle de souris hémophiles B. Le dernier volet de ce travail consiste à différencier des iPSC simiennes en hépatocytes pour une transplantation autologue dans le foie du singe donneur, après embolisation portale partielle. Nous souhaitons ainsi établir la preuve de principe d'une thérapie cellulaire autologue dans un modèle préclinique de primate non humain
Among the various potential applications of induced pluripotent stem cells (iPSCs), this Ph. D project focused on the use of iPSC-derived hepatocytes in cell therapy. Human iPSCs have been generated by repeated transfections of messenger RNAs. The genomic integrity of these cells was analyzed, in comparison with iPSCs generated in parallel by a viral method. The SNP profile of mRNA-iPSC is not significantly different from the parental fibroblasts one, in contrary to what we observed with viral-iPSCs. The number of deletions or duplications (CNVs) is not dependent on the reprogramming method. This genomic analysis also highlighted an atypical mRNA-iPSC line displaying a complex, stable and balanced genomic rearrangement including a large region of de novo uniparental disomy, and a defect in teratoma formation capacity. The second part of this work describes the generation of hiPSCs from hemophilia B patients biopsy. To correct the genetic defect, we used artificial nucleases to drive the insertion of a therapeutic cassette coding the FIX gene. The differentiation of these corrected iPSCs into hepatocytes will allow us to validate this correction approach in vitro first and in vivo in a hemophilia B mouse model. The last part of this PHD work focused on differentiating simian iPSCs into hepatocytes to perform an autologous transplantation into the liver of the donor monkey, alter a portal vein embolization. We would like to establish the proof of principle of an autologous iPSC-based therapy in a non-human primate preclinical model

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Hiriart, Emilye. "Modélisation cellulaire des étapes précoces de la valvulogenèse à partir d'un modèle de cellules souches embryonnaires humaines, et étude de l'implication d'Oct4 dans le phénomène de transition endothélio-mésenchymateuse lors de la formation des coussins endocardiques". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLE011.

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Les cardiopathies représentent la première cause de mortalité dans le monde, près de 30% des décès chaque année sont imputables à ce type de pathologies ; cette incidence a par ailleurs fortement augmentée au cours du siècle dernier (OMS). Les cardiopathies peuvent être classées en plusieurs sous-groupes de maladies cardio-vasculaires en fonction du tissu affecté par la pathologie. On différencie ainsi les maladies affectant les vaisseaux, le muscle cardiaque, le rythme (tissu pacemaker et de conduction) et les maladies des valves cardiaques. Les valvulopathies cardiaques peuvent être causées par des défauts des valves acquis ou innés et représentent près de 30 à 40% des malformations cardiaques recensées. Le pourcentage de patients atteints de valvulopathies augmente avec l’âge du patient, de plus, les valvulopathies représentent la principale cause de morbidité chez l’adulte, et l’enfant dans les pays développés.Ces défauts peuvent être d’origines génétiques, congénitales, toxicologique, ischémiques avec influence de différents facteurs de risques aussi bien génétiques qu’environnementaux, dans certains cas elles peuvent même être provoquées par des médicaments, le cas du Benfluorex (Mediator®) étant probablement le plus connu. Les défauts affectant les valves peuvent avoir de graves conséquences sur le fonctionnement du cœur. Ainsi, en 2008, aux États-Unis, il a été nécessaire de procéder au remplacement de près de 82000 valves cardiaques chez des patients adultes. Si le remplacement de valves cardiaques reste une avancée majeure pour les patients atteints de valvulopathies, l’utilisation de prothèses et de transplants valvulaires présentent néanmoins des limitations, notamment : une absence de croissance des prothèses, l’apparition de thromboses, ainsi que des rejets en cas de transplantation de valves allo-géniques, prélevées sur des donneurs en morts cérébrale. Ainsi, il est nécessaire d’étudier les mécanismes mis en jeu dès le développement embryonnaire, mécanismes qui pourrait avoir un effet délétère à plus ou moins long terme entrainant l’apparition d’une valvulopathie chez l’enfant, le jeune adulte ou chez la personne âgée. Pour cela l’utilisation d’un modèle cellulaire utilisable in vitro serait une avancée remarquable. Ce modèle permettrait à la fois d’élucider un certain nombre de mécanismes biologiques mis en place au cours du développement ou de la pathologie, mais aussi d’espérer la mise en place d’un protocole permettant l’utilisation clinique de cellules autologues reprogrammées pour la thérapie des tissus atteints de valvulopathies voire même une thérapie incluant une réparation endogène
Heart disease is the leading cause of death worldwide, nearly 30% of deaths each year are attributable to such diseases; this incidence has also greatly increased in the last century (WHO).Heart disease can be classified into several subgroups of cardiovascular disease based on the tissue affected by the pathology. It thus differs diseases affecting vessels, cardiac muscle, rhythm (fabric pacemaker and conduction) and heart valve disease. Heart valve disease can be caused by defects of innate and acquired or valves represent about 30-40% of heart defects identified. The percentage of patients with valvular heart disease patients increases with age of the patient, in addition, valvular heart disease is the leading cause of morbidity in adults and children in developed countries.These defects may be of genetic origin, congenital, toxicological, with ischemic influence of various risk factors both genetic and environmental, in some cases they can even be caused by medications, if the Benfluorex (Mediator®) are probably the most known. The defects in the valves can have serious consequences on the functioning of the heart. In 2008, the United States, it was necessary to proceed with the replacement of nearly 82,000 heart valves in adult patients.If the replacement heart valves remains a major advance for patients with valvular heart disease, the use of prostheses and transplants valves nevertheless have limitations, including: no growth prostheses, the occurrence of thrombosis and releases in cases of allo-transplantation of gene valves taken from brain dead donors. Thus, it is necessary to study the mechanisms involved early embryonic development, mechanisms that could have a deleterious effect more or less long term leading the development of valvular disease in children or young adults in the old person. For this the use of an in vitro cell model used is a remarkable achievement. This model would both elucidate a number of biological mechanisms during development or pathology, but also hope the development of a protocol for the clinical use of autologous cells reprogrammed to the therapy of patients with valvular tissue or even a therapy including an endogenous repair

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Sansac, Caroline. "Modélisation de l'épithélium bronchique humain par la technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPS)". Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT014/document.

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Resumen

Les cellules souches pluripotentes (CSP) incluent les cellules souches embryonnaires (ES) et les celles souches pluripotentes induites (iPS). Elles sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier dans tous les types cellulaires. Les ES sont dérivées de la masse cellulaire de l’embryon. Elles soulèvent l’intérêt de la communauté scientifique du fait de leur capacité à générer tous les tissus. Il s’agit d’un outil biotechnologique majeur dont les applications thérapeutiques et pharmacologiques comporteront notamment la médecine régénératrice, la modélisation in vitro de maladies humaines et le criblage de candidat-médicaments. Cependant l’utilisation d’embryons humains pour générer les ES soulève des problèmes éthiques. Les iPS contournent ces difficultés car elles sont dérivées de cellules somatiques différenciées. En effet, S. Yamanaka, qui a reçu le prix Nobel en 2012, a découvert en 2006 une technique simple de reprogrammation cellulaire. L’expression transitoire de quatre gènes (OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4) est suffisante pour reprogrammer des fibroblastes murins en iPS. Ces cellules iPS ont la même morphologie et les mêmes propriétés que les cellules ES. L’année suivante, S. Yamanaka a appliqué avec succès son cocktail à des fibroblastes humains pour produire des iPS humaines (hiPS). Les hiPS peuvent également dépasser les problèmes immunologiques soulevés par l’utilisation d’ES dans la thérapie cellulaire, par le simple fait que les hiPS pourront être dérivées du patient à traiter. De plus, parce qu’il est possible de choisir les cellules du donneur à reprogrammer selon son génotype, il est plus facile de modéliser des maladies génétiques à partir d’hiPS que d’ES. Enfin, d’un point de vue pharmaceutique, les hiPS peuvent fournir une plateforme quasi-infinie pour le criblage de molécules afin de traiter diverses pathologies. Le but de mon projet de recherche est l’utilisation de la technologie hiPS afin de modéliser le développement de l’épithélium bronchique. Premièrement, in vivo, des tératomes ont été générés après injection d’hiPS dans des souris immunodéficientes. Les tératomes démontrent la capacité de nos hiPS à se différencier en épithélium bronchique. Secondairement, in vitro, reproduire le développement embryonnaire et fœtal permet d’offrir une méthode simple pour modéliser l’épithélium bronchique dans un puits. Cette technologie ouvre la voie vers de nombreuses recherches, du criblage de molécules à la production de cellules souches pour réparer l’épithélium bronchique, et in fine à la promotion de nouveaux traitements pharmacologiques ou de thérapie innovante pour les maladies respiratoires
Pluripotent stem cells (PSC) include embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS). They are defined by two fundamental properties: self-renewal and the capacity to differentiate into all cell types. ES cells are derived from the inner cell mass of embryos. They arouse the interest of the scientific community in particular for their ability to generate all tissues. They provide major therapeutic and pharmacological applications, including regenerative medicine, in vitro modelling of human diseases and molecular screening. However, the use of human blastocysts to generate ES cells raises many ethical problems. iPS circumvent these ethical issues as they can be derived from differentiated somatic tissues. Indeed, S. Yamanaka, Nobel Prize in 2012, discovered in 2006 a simple technique of cellular reprogramming. The transient expression of four genes (OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4) is sufficient to reprogram mouse fibroblasts into iPS. These iPS cells have the same morphology and the same properties than ES cells. The following year, S. Yamanaka applied successfully his cocktail to human fibroblasts to produce human iPS (hiPS). hiPS may also overcome immunological problems raised by the use of ES cell for cellular therapy, as hiPS can be derived from the patient to be treated. In addition, it is easier to model genetic diseases from hiPS than ES, because it is possible to choose the donor cells to reprogram according to its genotype. Finally, from a pharmacological point of view, hiPS can provide a broad platform of molecular screening to treat various diseases. The aim of my research project is to use the hiPS technology to model the development of bronchial epithelium. First, in vivo, teratomas were formed by the injection of hiPS into immunodeficient mice. Teratomas highlight the ability of differentiation of our hiPS into bronchial epithelium. Second, in vitro, reproducing embryonic and foetal bronchial development provides a way to model bronchial epithelium in a dish.These techniques open the door to many potential research avenues from screening small molecules to engineering stem cells to repair bronchial epithelium, and will in fine promote new pharmacologic or cell-based treatments for respiratory diseases

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Lemonnier, Thomas. "Modélisation de maladies neurodégénératives à l’aide de cellules souches pluripotentes induites humaines". Thesis, Paris 5, 2012. http://www.theses.fr/2012PA05T074/document.

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La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd’hui l’opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l’accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l’appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l’orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu’il n’existait jusqu’alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d’étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d’étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutique
Reprogramming technology of somatic cells in induced pluripotent stem cells (iPS) now offers the opportunity to model neurodegenerative diseases and to study patient’s neurons. We used this technology for generating two models of neurodegenerative diseases: the muccopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) and the ALS2 form of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the MPSIIIB model, we have shown that iPS and neurons of patients had characteristic defects of the disease such as the accumulation of storage vesicles. Alterations of the Golgi apparatus in these cells were also highlighted. Transcriptome analysis of MPSIIIB neural precursors showed transcriptional changes involving particularly genes implicated in cell-extracellular matrix interactions. Thus, in a subsequent study, alterations of migration and orientation of MPSIIIB mutant mouse cells and MPSIIIB patients’ cells have been demonstrated. These alterations may be responsible for the disruption of neurogenesis and neuritogenesis in sick children. In the ALS2 model, we have shown that patients’ neurons had defects including decreased endosomes’ surface and abnormal neurite outgrowth. As there was previously no relevant cellular model reproducing the disease, this model will now allow the study of physiopathological processes involved in the disease. In conclusion, the generation of iPS cells allows to model neurodegenerative diseases and to study associated physiopathological processes on cultured human neurons. These cell models could allow in the near future the screening of molecules of potential therapeutical interest

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Faye, Pierre-Antoine. "Cellules souches pluripotentes induites (iPSc) différenciées en motoneurones spinaux : vers des modèles cellulaires de neuropathies périphériques d'origine génétique". Thesis, Limoges, 2015. http://www.theses.fr/2015LIMO0051/document.

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Les cellules souches induites à la pluripotence (iPSc) apparaissent comme une solution très intéressante pour créer et observer le comportement de cellules spécifiques et inaccessibles d'un patient. Notre équipe travaille sur les pathologies génétiques des nerfs périphériques et en particulier la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). Un de nos objectifs est le développement de modèles de motoneurones de patients utilisant la stratégie des iPSc afin de mieux comprendre la physiopathologie des neuropathies liées au gène GDAP1. Ce gène a été décrit en 1998 pour être responsable d'une forme axonale de CMT ; il code une protéine de la membrane externe mitochondriale dont la fonction précise reste encore méconnue. Des fibroblastes dermiques (FD) ont été obtenus après une biopsie de peau d'une personne saine (témoin) et d'un patient homozygote porteur de la mutation non-sens p.Gln163* dans le gène GDAP1. Par la suite, les FDs ont été reprogrammés en cellules iPSc en utilisant le cocktail de Yamanaka (plasmides non intégratifs composés d’Oct4, Sox2, Klf4 et l-Myc). Après amplification, tous les contrôles ont été effectués pour conclure que nos iPSc avaient les mêmes propriétés et les mêmes capacités que les cellules souches embryonnaires ainsi qu’un caryotype normal. Enfin, nous avons optimisé le protocole de différenciation avec succès de manière à obtenir à partir des iPSc des rosettes (structures pleines de progéniteurs neuronaux), puis des neurones et finalement des motoneurones pour le contrôle et le patient. Les premières différences entre le contrôle et le patient ont été observées lors de l’obtention de rosettes. Les cellules du patient présentaient de nombreuses gouttelettes lipidiques et la proportion de rosettes obtenue était plus faible. Une fois les motoneurones obtenus, des tests de microscopie confocale et électroniques ont montré des différences du réseau mitochondrial entre le témoin et le patient, ainsi qu’une morphologie des mitochondries se rapprochant de celle observée lors de biopsie de nerf de patient (rondes / accumulées). De manière à réduire la durée de différenciation, une méthode de tri cellulaire a été utilisée la SdFFF. Cette méthode nous a permis de trier différents progéniteurs (neuraux / endothéliaux). La génération de motoneurones à partir de fibroblastes dermiques de patient atteint de CMT axonale via les iPSc était une première étape cruciale pour mieux comprendre le rôle de GDAP1 dans cette pathologie. Ce modèle cellulaire de CMT4A est un premier pas pour réaliser des tests précliniques de médicaments afin d'identifier de futurs candidats pharmacologiques
Induced pluripotent stem cells (iPSc) are a highly interesting tool to create and observe the behavior of specific and unattainable cells from a patient. Our team is interested in genetic peripheral nerves disorders and especially in Charcot-Marie-Tooth disease (CMT). One of our objectives is the development of motor neurons models from patients using the iPSc strategy in order to better understand the pathophysiology of GDAP1-related neuropathies. This gene was found in 1998 to be mutated in an axonal form of CMT and encodes a mitochondrial outer membrane protein, which function remains unclear. We first obtained dermal fibroblasts (DF) from skin biopsies of a healthy person and of a homozygous patient carrying GDAP1 non-sense mutation (p.Gln163*). Then, we reprogrammed DFs into iPSc using non-integrative plasmids (Oct4, Sox2, Klf4 and l-Myc). After amplification, all quality controls were performed to conclude that our iPSc had the same properties and capacities than embryonic stem cells and a normal karyotype. Finally, we optimized protocols to successfully differentiate these iPSc into rosettes (structures full of neural progenitors), then into neurons and finally into motor neurons for control and GDAP1 patients. The first differences between control and patient cells were observed during the rosette formation, where a lot of patient cells were full of lipid droplets, and the rosette proportion was lower than the control cells. Mitochondria morphology was totally different in motor neurons between control and patient, where mitochondria had the same morphology than the mitochondria observed in patient nerve biopsies (round and accumulated). In order to reduce the time of differentiation, a cell sorting method was used (SdFFF). It allowed us to sort different progenitors (neural / endothelial). Generation of motor neurons using axonal CMT-patient-derived iPSc was a first crucial step to better understand the role of GDAP1 in this pathology. This cellular model of CMT4A should ultimately allow us to perform preclinical drug screening in order to identify candidate pharmacological treatments for CMT patients

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Hamidi, Sofiane. "Etudes de la monocytopoïèse issue de cellules hESC ou iPSC". Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077266.

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Mon travail a consisté à caractériser la monocytopoïèse dérivée d'hESC et à confirmer in-vitro que les macrophages obtenus partageaient les mêmes fonctions homéostatiques que ceux dérivés de foetus. J'ai ensuite dérivé des lignées d'iPSC à partir de cellules CD34+ d'un sujet sain et muté JAK2V617F. Ma première étude a consisté à comparer les macrophages issus de la différenciation d'hESC à ceux issus d'iPSC contrôle. Cette partie de mon travail a permis de montrer que les macrophages issues d'IPSC sont très proches de ceux dérivées de hESC mais présentent des différences significatives dans la sécrétion de certaines molécules de la réponse inflammatoire à l'IFN-y et au LPS. Enfm nous avons souhaité étudier grâce à la technologie des iPSC l'implication de la voie JAK/STAT dans le phénotype fonctionnel des macrophages embryonnaires et dans leur défaut de réponse à l'IFN-7 et au LPS. Les résultats préliminaires ne montrent ni de différences dans la polarisation des monocytes/ macrophages JAK2V617F, ni d'altération dans l'activation de STAT1 via l'IFN-7. Les différences ontogéniques sont donc liées soit à des modifications épigénétiques dans les gènes impliqués dans l'inflammation ou dans les partenaires de STAT1. Un travail encore plus préliminaire a été d'explorer les éventuelles indépendances au bFGF des iPS( pluripotentes. En effet un travail de Griffiths et al a montré que les mESC JAK2V617F pouvaient mainteni leur phénotype pluripotent en l'absence de LIF via son action nucléaire indirecte sur le promoteur de Nanog Les résultats préliminaires montrent que les lignées d'IPSC JAK2V617F humaines pouvaient maintenir li phénotype pluripotent et cela en l'absence de bFGF
My work was focused on the monocyte and macrophage lineages. We have shown that Monocyte/macrophage derived from ES cells are cells extremely specialized in tissue remodeling, pro-angiogenesis and immune suppression but with low inflammatory potential. I have investigated the characteristics of monocytes/macrophages from iPS. Those monocyte/macrophage were quite similar to hESC derived, but exhibited more inflammatory potential suggesting some incomplete reprogrammation during derivation of IPS. We hypothesize that the decrease or absence of inflammatory potential of the monocyte/macrophages could be related to a decrease activation of the JAK2/STAT pathway induced by IFN-y and GM-CSF, two cytokines implicated in MI polarization. In this purpose we derive iPS from patient harboring the JAK2V617F mutation, a gain of fonction mutation associated with myéloproliférative neoplasm. In preliminary results, no significant differences were observed in the polarization of JAK2V617F or JAK2WT monocyte/Macrophages derived from IPS. Furthermore we found that IFN-y was capable to normally induce STAT1 activation in these cells suggesting that the blockage in inflammatory response is downstream STAT1 and may be related to epigenetic regulation of inflammatory gens. Finally I have obtained preliminary results showing that JAK2V617F may induce independence to bFGF of the pluripotent iPSC, a result very similar to those reported by Griffiths and al on JAK2V617F mESC who could maintain their pluripotent phenotype without addition of LIF. This was not related to the induction of the canonical STAT pathway but to an effect of nuclear JAK2 on the epigenetic regulation of Nanog

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Beke, Allan. "Modélisation de la leucémie myelomonocytaire chronique par reprogrammation de cellules de patients". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS494.

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La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une hémopathie myéloïde rare attribuée à l’accumulation d’évènements génétiques et épigénétiques dans une cellule souche ou progénitrice hématopoïétique. Les altérations génétiques somatiques récurrentes qui caractérisent cette maladie ont été identifiées: elles associent des altérations cytogénétiques non spécifiques chez 30% des patients et des mutations des gènes de la régulation épigénétique, de l’épissage, de la signalisation et de la transcription. Si certaines mutations influencent le phénotype (les mutations de RUNX1 génèrent une thrombopénie, celles de la signalisation une maladie proliférative, celles de KIT une mastocytose), elles ne sauraient résumer à elles seules l’expression phénotypique de la maladie. D’ailleurs, les médicaments hypométhylants restaurent une hématopoïèse équilibrée en modifiant le contexte épigénétique des cellules malades sans les éliminer. Il n’existe pas de lignée cellulaire de LMMC et les modèles murins n’en récapitulent que très partiellement les caractéristiques. L’objectif de mon travail de thèse a été de générer des cellules modélisant la maladie. J’ai transformé les cellules CD34+ de 2 patients en clones de cellules souches induites reprogrammées. Les clones obtenus à partir de l’un des patients ont été écartés du fait d’altérations génétiques supplémentaires acquises lors de la reprogrammation. Nous avons focalisé nos travaux sur 5 clones établis à partir des cellules CD34+ de l’autre patient et de 5 clones établis à partir de cellules CD34+ de deux sujets sains. Nous avons capturé 2 étapes de l’évolution moléculaire du clone, sans puis avec mutation KRASV12G. La différenciation hématopoïétique de ces clones en milieu semi-solide ou liquide récapitule les principales caractéristiques phénotypiques de la maladie. Par édition de gènes, nous avons ajouté dans certains clones la mutation SRSF2P95H observée dans les cellules de 50% des patients atteints de LMMC mais absente des cellules de la patiente étudiée. Nous montrons que l’hétérogénéité fonctionnelle et épigénétique des clones obtenus dépasse la seule hétérogénéité génétique et que la decitabine, un agent hypométhylant, a un effet cytotoxique faible mais améliorer l’équilibre de la production des cellules hématopoïétiques matures par des cellules génétiquement altérées
Chronic myelomonocytic leukemia (CMML) is a rare hematological malignancy that has been related to the accumulation of genetic and epigenetic alterations in a hematopoietic stem or progenitor cell. Somatic recurrent mutations of coding DNA sequences have been in CMML cells, combining non-specific cytogenetic aberrations in 30% of the patients and mutations in epigenetic regulator, signal transduction, spliceosome and transcription factor genes. While some of these mutations directly affect disease phenotype (mutations in RUNX1 and thrombocytopeny, mutations in signaling pathways and proliferative disease, mutations in KIT and mastocytosis), they do not sum up the complex disease phenotype of this pathology on their own. Accordingly, hypomethylating agents restore a balanced hematopoiesis without eliminating clonal cells. There is no CMML cell line and murine models only partially recapitulate the disease. The objective of my thesis work was to reprogram hematopoietic stem/progenitor cells in order to model the disease heterogeneous expression. The clones established from one patient cells were discarded as their genetic background had been altered by reprogramming and cell culture. We analyzed in more details the behavior of 5 induced pluripotent stem cell lines established from a second patient and 5 other clones established from 2 healthy donor cells. We had captured 2 distinct genetic backgrounds of the patient clone, without or with KRASG12D mutation. Hematopoietic differentiation of these clones in semi-solid and liquid medium recapitulated the main characteristics of disease phenotype. With a gene editing tool, we introduced in some clones the SRSF2P95H mutation, observed in 50% of patient with CMML but missing in the studied patient. We noticed that functional and epigenetic heterogeneity of the clones exceeded their genetic heterogeneity and that the demethylating agent decitabine had limited cytotoxic effect but restored a more balanced production of hematopoietic cells by genetically abnormal cells

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Lemonnier, Thomas. "Modélisation de maladies neurodégénératives à l'aide de cellules souches pluripotentes induites humaines". Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00806699.

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La technologie de reprogrammation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes induites (iPS) offre aujourd'hui l'opportunité de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier des neurones de patients. Nous avons utilisé cette technologie pour générer deux modèles de maladies neurodégénératives : la mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB) et la forme ALS2 de la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Dans le modèle MPSIIIB, nous avons montré que les iPS et les neurones de patients présentaient des défauts caractéristiques de la pathologie telle que l'accumulation de vésicules de surcharge. Des altérations de l'appareil de Golgi dans ces cellules ont également été mises en évidence. Une analyse du transcriptome de précurseurs neuraux MPSIIIB a montré des modifications transcriptionnelles touchant notamment des gènes impliqués dans les interactions de la cellule avec la matrice extracellulaire. Ainsi, dans une seconde étude, des altérations de la migration et de l'orientation de cellules de souris mutantes MPSIIIB ou de patients ont été démontrées. Ces altérations pourraient être responsables des perturbations de la neurogénèse et de la neuritogénèse chez les enfants malades. Dans le modèle SLA/ALS2, nous avons montré que les neurones de patients présentaient des défauts incluant une diminution de la surface des endosomes et des anomalies de la croissance neuritique. Alors qu'il n'existait jusqu'alors aucun modèle cellulaire pertinent reproduisant cette maladie, ce modèle permettra à présent d'étudier les processus physiopathologiques impliqués dans la maladie. En conclusion, la génération de cellules iPS permet de modéliser des maladies neurodégénératives et d'étudier les processus physiopathologiques qui sont associés sur des neurones humains en culture. Ces modèles cellulaires pourraient permettre dans un avenir proche de réaliser des criblages de molécules à visée thérapeutique

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Annab, Karima. "Etude de l’expression génique de différents syndromes progéroïdes en utilisant le modèle des cellules souches à pluripotence induite". Thesis, Aix-Marseille, 2019. http://www.theses.fr/2019AIXM0101.

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Les syndromes progéroïdes regroupent un ensemble de pathologies caractérisées par un vieillissement précoce et accéléré. Le syndrome le plus connu et étudié est la progéria de Hutchinson-Gilford dont l'incidence est de 1 cas sur 8 millions ce qui en fait une maladie très rare. Nous avons étudié trois symptômes progéroïdes dont le syndrome HGPS, un syndrome HGPS-like ainsi qu'un syndrome APS. Ces pathologies ont de nombreux symptômes en commun dont une ostéolyse, une lipodystrophie, ainsi qu'une atteinte cardiovasculaire. Ces trois syndromes sont provoqués par différentes mutations du gène LMNA qui code pour les Lamines A et C. Nous avons utilisé le modèle des iPSCs afin d'étudier in vitro la physiopathologie de ces trois syndromes en les comparant à des cellules contrôles. Les cellules dérivées de la voie mésenchymateuse étant majoritairement altérées dans ces pathologies, nous avons créé des modèles in vitro d'étude de la différentiation en MSCs. De plus, ces patients présentant des altérations arterio-veineuses, nous avons analysé la différenciation en VSMCs. Le phénotype des ces cellules a été analysé et les profils transcriptomiques comparés pour les différentes lignées. Des gènes communs, impliqués dans le stress oxydatif et dans des systèmes de réparation géniques ont été retrouvés comme étant altérés. De plus, nous avons mis en évidence des altérations de voies de signalisation indispensables à la survie et à la prolifération cellulaire en comparant les cellules progéroïdes aux contrôles. Certaines de ces voies biologiques ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension des symptômes observés chez ces patients
Progeroid syndromes are a group of pathologies characterized by accelerated and early aging. One of the most studied of these diseases is HGPS, with an estimated incidence of 1 in 8 millions birth making it an extremely rare disease. We focused our attention on three different progeroid syndromes including classic HGPS, a HGPS-like and an atypical progeroid syndrome. These pathologies share many symptoms, including osteolysis, lipodystrophy, and cardiovascular alterations. These 3 syndromes are caused by 3 different mutations in the LMNA gene that encodes A- and C-type lamins, inducing production of a truncated Lamin A in HGPS and HGPS-like and production of a mutated Lamin with a p.T528M substitution in APS. We produced hiPSCs to create a model of these different diseases and investigate in vitro the physiopathology of these syndromes by comparing them to control cells. Cells derived from mesenchymal stem cells being the most impaired type of tissue, we established in vitro models in order to study the differentiation of hiPSCs into MSCs. In addition given the massive cardiovascular defects in these patients, we also investigated differentiation toward the VSMCs. Cell phenotypes were carefully characterized and we compared the transcripttomic profile of the different cell types. We identified dysregulation in genes involved in oxidative stress response and in DNA repair in progeroid cells. In addition, pathways essential for cell survival and proliferation are also modified when comparing progeroid and controls cells. Altogether, these results might explain some of the symptoms observed in progeroid patients but also reveal pathways involved in ageing

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Hu, Amelie. "Caractérisation des cellules corticales et des neurones sensoriels primaires dérivés des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de patients atteints de l'ataxie de Friedreich, et validation de thérapies potentielles". Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2018. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/271051.

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L’Ataxie de Friedreich (AF) est une pathologie à hérédité autosomique récessive caractérisée par des troubles neurologiques progressifs (atteinte des neurones cérébelleux et des neurones sensoriels primaires (PSN, Primary Sensory Neurons), une hypertrophie cardiaque et un risque élevé de diabète. La cause la plus fréquente de cette maladie est la présence d’une hyperexpansion homozygote de triplets nucléotidiques GAA au sein du premier intron du gène de la frataxine (FXN), qui code pour une petite protéine mitochondriale, la frataxine. Cette expansion GAA induit la formation de structures secondaires de l’ADN ainsi que la formation d’hétérochromatine, provoquant une diminution de la transcription du gène FXN. Plusieurs modèles cellulaires et animaux AF ont été développés sans toutefois reproduire l’ensemble des caractéristiques génétiques, épigénétiques et biochimiques de la maladie retrouvé chez le patient AF, à savoir la présence d’une hyperexpansion GAA, au sein du premier intron du gène FXN, accompagnée de la répression du gène FXN conduisant à la diminution de l’expression de la protéine frataxine. Dans la première partie du projet, nous avons généré deux modèles cellulaires, les cellules corticales et les neurones sensoriels primaires dérivés des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), générées à partir de biopsies de peau de patients AF. Ces deux modèles cellulaires AF présentent les caractéristiques génétiques, épigénétiques et biochimiques décrites chez les patients AF. D’un point de vue biochimique, nous avons montré que le déficit en frataxine induit une perturbation de l’homéostasie du fer avec un déficit de la biosynthèse des centres [Fe-S] et de l’expression des protéines [Fe-S], qui jouent un rôle au sein de la chaine respiratoire mitochondriale et du cycle de Krebs. De plus, le déficit en frataxine entraine la perturbation des voies antioxydantes sensibilisant les cellules AF au stress oxydatif. Nous avons aussi montré que les cellules corticales AF présentent une sensibilité à l’apoptose pouvant être prévenu par un traitement par la forskoline. Enfin, nous avons étudié l’implication éventuelle de mTOR dans la pathogénèse de l’AF au sein des cellules corticales. Les résultats obtenus n’ont pas permis d’attribuer les désordres de l’homéostasie du fer et du métabolisme lipidique observés au sein des cellules corticales AF, au seul déséquilibre de mTORC1, mais sans doute à la déficience en frataxine elle-même. Ces données font de ces deux modèles cellulaires, dérivés des iPSC, des modèles fiables et robustes dans l’étude de l’AF. Dans la seconde partie du projet, nous avons étudié le potentiel effet thérapeutique d’analogues des incrétines ([D-Ala2]-GIP et exendin-4) et de deux générations d’inhibiteurs des HDAC (iHDAC 109 et iHDAC 69, 71 et 89) sur le niveau d’expression de la frataxine, l’homéostasie du fer, le métabolisme protéique et lipidique ainsi que le stress oxydatif, au sein des cellules corticales AF, des PSN AF et de deux modèles murins de l’AF (les souris Knock-In homozygotes (KIKI) et les souris BAC transgéniques). La nouvelle génération d’iHDAC (69, 71 et 89), se distingue du composé 109 par leur capacité supérieure à traverser la barrière hématoencéphalique et leur courte durée de vie prévenant ainsi l’accumulation du composé cardio-toxique au sein de l’organisme. Nous avons observé que l’ensemble des traitements testé dans ce projet, a eu pour effet d’augmenter l’expression de la frataxine et de restaurer l’homéostasie du fer au sein des cellules corticales AF. De la même façon, l’expression de la frataxine a été augmentée suite à l’administration du composé 109 au sein des PSN AF. De plus, nous avons mis en évidence un effet thérapeutique du composé 89 sur le stress oxydatif et le métabolisme lipidique et protéique, au sein des cellules corticales AF. Néanmoins, étant donné l’absence d’un phénotype biochimique de l’AF clair, au sein des deux modèles murins de l’AF utilisés dans cette étude, nous n’avons pas pu étendre l’efficacité des nouveaux iHDAC (69, 71 et 89) au sein de ces deux modèles murins de l’AF. Néanmoins, les résultats obtenus au sein des cellules corticales AF, sur l’induction de l’expression de la frataxine par des analogues des incrétines et par la nouvelle génération des iHDAC, font de ces molécules de nouvelles approches prometteuses dans l’intervention thérapeutique chez les patients AF.
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Pini, Jonathan. "Modélisation du syndrome d'Andersen dans les cellules souches pluripotentes induites : implication du canal potassique Kir2.1 dans la morphogenèse osseuse". Thesis, Nice, 2016. http://www.theses.fr/2016NICE4042/document.

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Le syndrome d’Andersen est une maladie rare et associée à la perte de fonction du canal potassique Kir2.1. Afin d’étudier sa physiopathologie, nous avons généré et caractérisé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) contrôle et Andersen. Nous avons ensuite différencié ces cellules iPS en cellules souches mésenchymateuse (MSC). Les cellules MSC de patients présentent une capacité de différenciation en ostéoblastes et en chondrocytes diminuée par rapport aux cellules contrôle. En effet, la production de matrice extracellulaire et l'expression des master gènes des différenciations osseuses et cartilagineuses, est réduite chez les patients. Ces travaux de thèse montrent que le canal Kir2.1 est essentiel au développement osseux. Les défauts de différentiation observés pourraient expliquer les dysmorphies associées avec le syndrome d’Andersen
Andersen's syndrome is a rare disorder associated with a Kir2.1 potassium channel loss of fuction. To study the pathophysiology, we have generated and characterized induced Pluripotent Stem cells (iPS) from control and patient cells. We have then differentiated those iPS cells into mesenchymal stem cells (MSC). Patient's MSc have a lower osteoblastic and chondrogenic differnciation ability compared to control cells. Indeed, extracellular matrix production and master gene expression of osteoblastic and chondrogenic differenciation are reduced in patient’s cells. Alltogether, these results shown that Kir2.1 channel is required for bone developement. The differenciation defects saw in patient cells could explain the Andersen's syndrome associated dysmorphies

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Pini, Jonathan. "Modélisation du syndrome d'Andersen dans les cellules souches pluripotentes induites : implication du canal potassique Kir2.1 dans la morphogenèse osseuse". Electronic Thesis or Diss., Nice, 2016. http://theses.unice.fr/2016NICE4042.

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Le syndrome d’Andersen est une maladie rare et associée à la perte de fonction du canal potassique Kir2.1. Afin d’étudier sa physiopathologie, nous avons généré et caractérisé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) contrôle et Andersen. Nous avons ensuite différencié ces cellules iPS en cellules souches mésenchymateuse (MSC). Les cellules MSC de patients présentent une capacité de différenciation en ostéoblastes et en chondrocytes diminuée par rapport aux cellules contrôle. En effet, la production de matrice extracellulaire et l'expression des master gènes des différenciations osseuses et cartilagineuses, est réduite chez les patients. Ces travaux de thèse montrent que le canal Kir2.1 est essentiel au développement osseux. Les défauts de différentiation observés pourraient expliquer les dysmorphies associées avec le syndrome d’Andersen
Andersen's syndrome is a rare disorder associated with a Kir2.1 potassium channel loss of fuction. To study the pathophysiology, we have generated and characterized induced Pluripotent Stem cells (iPS) from control and patient cells. We have then differentiated those iPS cells into mesenchymal stem cells (MSC). Patient's MSc have a lower osteoblastic and chondrogenic differnciation ability compared to control cells. Indeed, extracellular matrix production and master gene expression of osteoblastic and chondrogenic differenciation are reduced in patient’s cells. Alltogether, these results shown that Kir2.1 channel is required for bone developement. The differenciation defects saw in patient cells could explain the Andersen's syndrome associated dysmorphies

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Gouder, Laura. "Etude de l'effet de mutations du gène SHANK3 dans les TSA à partir de neurones corticaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCB089/document.

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Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) affectent un individu sur 100 en France et sont caractérisés par des déficits de la communication et des interactions sociales ainsi que par la présence d’intérêts restreints et de comportements répétitifs. Le laboratoire a démontré l’implication de protéines synaptiques dans le développement des TSA et en particulier celle des protéines SHANK. Ces protéines sont des protéines d’échafaudage présentes au niveau de la densité post-synaptique (PSD) des neurones glutamatergiques et interagissant avec différents partenaires. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine SHANK3. Des mutations au sein du gène SHANK3 ont été détectées chez environ 1 à 2% des patients, selon le degré de sévérité du retard mental. Un déficit de SHANK3 altère le fonctionnement synaptique. En effet, des analyses sur modèles de souris invalidées pour le gène SHANK3 ont montré une diminution de la densité des épines dendritiques, de la taille de la densité post-synaptique et de l’expression des partenaires protéiques de SHANK3. Mon modèle principal d’analyse a consisté en la reprogrammation de fibroblastes en cellules pluripotentes induites (iPSC « induced pluripotent stem cells »). Les iPSCs ont ensuite été sélectivement dérivées en neurones corticaux. Nos études se sont focalisées sur l’analyse des conséquences fonctionnelles de mutations de novo du gène SHANK3 retrouvées chez 4 patients à l’état hétérozygote et présentes au sein de l’exon 21. Ces mutations conduisent à un codon stop prématuré. En parallèle, nous avons obtenu des cellules de 4 individus témoins ne présentant aucun trouble psychiatrique identifié. L’analyse a porté d’une part sur des aspects morphologiques et d’autre part sur des aspects fonctionnels. Nous avons étudié l’effet des mutations sur la maturation et les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques. Nous avons établi un protocole permettant une analyse détaillée de la morphologie en 3D des épines dendritiques et suivi leur maturation. Un résultat majeur est l’observation d’une diminution de la densité des épines sur les dendrites des neurones pyramidaux issus des patients par rapport aux témoins. Comme attendu, la maturation des épines n’est pas complètement achevée mais varie peu dans son évolution d’un individu à l’autre (témoins vs. patients). Nous avons poursuivi ces études par deux approches fonctionnelles : l’imagerie calcique et des études d’électrophysiologie. Les données électrophysiologiques sont en cours d’analyse. En conclusion, nous avons pu obtenir des cultures de neurones corticaux glutamatergiques et les maintenir en culture durant 40 jours pour effectuer différentes analyses à un stade de maturation suffisant pour la mise en évidence de phénotypes morphologiques et fonctionnels. Nous avons principalement observé une diminution de des densités synaptiques et de maturation des épines dendritiques au sein des neurones issus de patients liée à des altérations d’oscillations calciques spontanées
Autism Spectrum Disorders (ASD) is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of population ; characterised by impairments in social interaction and reciprocal communication as well as repetitive and stereotyped behaviors. The work of the laboratory lead to the identification of several genes associated with ASD, among which genes of the synaptic pathway such as SHANK. The SHANK proteins are scaffolding proteins of the post-synaptic density (PSD) of glutamatergic neurons and interact with several partners. In my thesis project, we were particularly interested in SHANK3 mutations. First, Shank3 mutations represent up to 2.12% of ASD cases with moderate to high ID. A SHANK3 deficit leads to the alteration of the synaptic functioning. Indeed, studies of mice KO for SHANK3 gene showed a decrease of the dendritic spines density, of the PSD size and of the expression of SHANK3 partners. My principal model of analysis consisted in the reprogrammation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Then, the iPSCs were selectively derived into cortical neurons. Our studies were focus on the analysis of functional consequences of SHANK3 de novo mutations found within 4 patients. These mutations are heterozygous and within the exon 21. They result in a premature stop codon. In parallel, we obtained cells from 4 healthy individuals. The work was about the morphological and functional aspects. We analysed the mutations effects on the maturation and morphological caracteristics of the dendritic spines. We finalized a protocol that enabled a detailed analysis of the spine dendritic 3D morphology and their maturation follow-up. A important result was the observation of a decrease of the spine density on pyramidal neurons dendrites from patients compared to those from controls. Moreover, spines maturation was not fully accomplished but was not much different in its evolution between individuals (controls vs patients). Then, we used two functional skills : calcium imaging and electrophysiological experiments. The electrophysiological data are in progress. To conclude, we succeeded in the obtention of glutamatergic cortical neurons and to maintain them in culture during 40 days in order to realize some analysis at a sufficient maturation stage to observe morphological and functional phenotypes. We mainly observed a decrease of the dendritic spines density and maturation for the neurons from patients, with alterations of the spontaneous calcium oscillations

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Saliba, Joseph. "Modélisation des néoplasmes myéloprolifératifs sporadiques et familiaux avec les cellules de patients induites à la pluripotence". Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA11T061.

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Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des maladies acquises touchant la cellule souche hématopoïétique et qui aboutissent à une hyperproduction de cellules sanguines dont le phénotype dépend du type du NMP. La mutation la plus proéminente des NMP est JAK2V617F. Elle peut être associée à différents NMP sporadiques et familiaux.Une des problématiques, non résolue, des NMP est de comprendre comment une même mutation JAK2V617F peut donner plusieurs maladies. Notre hypothèse est que le phénotype observé pourrait dépendre du nombre de copies de JAK2V617F. Une autre inconnue concerne la cause génétique des formes familiales.Pour ces raisons, nous avons modélisé des NMP sporadiques et un cas familial par les iPS. Cette approche devrait nous permettre d’une part, de comparer les effets de JAK2V617F à l’état hétérozygote et homozygote sur l’hématopoïèse et d’autre part, d’avancer dans la compréhension des effets d’une duplication de 5 gènes que nous avons identifiée, par une approche de génétique, comme un facteur de susceptibilité chez 2 familles.Dans la première partie du travail, concernant la modélisation des NMP sporadiques, nous avons montré que JAK2V617F augmente la prolifération des cellules myéloïdes obtenues à partir des iPS. D’autre part, nous avons pu mettre en évidence une différence marquée dans l’hypersensibilité à la TPO et à l’EPO entre les lignées hétérozygotes et homozygotes pour JAK2V617F permettant d’expliquer le phénotype des PV et des TE. Dans la deuxième partie concernant les NMP familiaux, nous avons pu mettre en évidence un phénotype spécifique attribuable à la seule duplication. Grace à ce modèle, nous allons pouvoir identifier le(s) gène(s) responsable(s) du phénotype. Ce travail apporte la preuve de concept que les iPS sont un bon outil pour modéliser les NMP sporadiques et familiaux et qu’elles peuvent servir comme outils de criblage de petites molécules développées à des fins thérapeutiques
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal hematologic diseases which lead to an overproduction of blood cells. The affected myeloid lineage depends on the type of MPN. JAK2V617F is the most predominant mutation in MPN and can be associated with various sporadic and familial cases.One main issue to address in MPN is to understand how a single mutation JAK2V617F can give rise to several diseases. Our hypothesis is that this phenotypic heterogeneity might be due to the JAK2V617F gene dosage. Another goal is to identify the genetic cause of familial MPN.For these reasons, we modeled sporadic and familial MPN cases with iPS technology. This approach allowed us i) to compare the impact of heterozygous and homozygous JAK2V617F mutation on hematopoiesis and ii) to get insight into the effects of a 5 genes duplication that we identified as a susceptibility locus uncovered by a genetic approach in 2 families.In the first part of the work concerning sporadic MPN modeling, we showed that JAK2V617F increases iPS myeloid potential. Furthermore, we showed a marked difference in the TPO and EPO hypersensitivity between heterozygous and homozygous JAK2V617F iPS cell lines that could be linked to the difference between PV and ET. In the second part of the work, we demonstrated a specific phenotype due to the sole duplication. This model will allow us to identify the gene(s) responsible of the phenotype. This study brings the proof of concept that iPS can be used for sporadic and familial MPN modeling and drug screening

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Ahmed, Engi. "Modélisation de l'épithélium bronchique par les cellules souches pluripotentes induites humaines dans la Bronchopathie Pulmonaire Chronique Obstructive (BPCO)". Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT070.

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La BPCO (bronchopathie pulmonaire chronique obstructive) est un problème majeur de santé publique et représentera la 3ème cause de mortalité dans le monde en 2030. L’âge, le tabagisme, ainsi que la pollution atmosphérique via l’exposition aux particules de diesel mais également la pollution domestique – majoritairement représentée par la combustion domestique de biomasse – sont des facteurs de risque bien identifiés d’apparition d’une BPCO. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pouvant interférer avec l’histoire naturelle de la maladie.Les cellules souches pluripotentes, et notamment les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier en tous les types cellulaires de notre corps. Elles offrent une opportunité sans précédent de modéliser le développement humain normal et pathologique de l’appareil respiratoire.Ce projet de recherche a pour objectif de modéliser in vitro les trajectoires de la BPCO, en lien avec une origine développementale (racines pédiatriques) et/ou une susceptibilité au tabac. Afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie de la BPCO et de la susceptibilité au tabac, nous avons constitué deux groupes caricaturaux : i) 4 patients atteints d’une forme sévère de la BPCO, constituant le groupe « hautement susceptibles », ii) 4 patients fumeurs indemnes de BPCO ou tout autre comorbidité liée au tabac « hautement résistants » au tabac.Nous avons utilisés deux modèles de culture cellulaires in vitro : les hiPSCs et la culture de cellules épithéliales primaires bronchiques humaines (HBECs) cultivées en ALI (interface air liquide).Dans un premier temps, nous avons généré des lignées hiPSCs par reprogrammation cellulaire à partir du sang périphérique d’un sujet sain (contrôle), et de trois patients BPCO sévères hautement caractérisés. Dans un second temps, la différenciation dirigée des hiPSCs a permis de récapituler le développement pulmonaire précoce (génération de progéniteurs bronchiques NKX2.1) par la mise au point d’un protocole de différenciation dirigée robuste et reproductible sur plusieurs lignées hiPSCs. La maturation de ces progéniteurs bronchiques en culture 2D ou 3D a permis d’obtenir des structures épithéliales exprimant les marqueurs de cellules basales (KRT5), de cellules Club (CCSP), et ciliées (FOXJ1). Dans un second temps, ces épithélia seront exposés au tabac (CSE- cigarette smoke extract) afin d’induire un phénotype « BPCO-like ». Enfin, la culture des HBECs cultivées en ALI des patients BPCO sévères a été réalisée en condition exposée (CSE) et non exposée. La résistance transépithéliale, la motilité ciliaire, le profil sécrétoire et la diversité ARN ont été collecté.Ce travail a permis de mettre en place les outils nécessaires pour reproduire les trajectoires in vitro de la BPCO et élucider les origines de la pathologie. Les outils de séquençage à haut débit (transcriptomique dans notre étude), permettront de découvrir de nouveaux candidats, représentants de potentielles cibles en vue d’un criblage pharmacologique
COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is a major public health problem and will be the 3rd leading cause of death in the world in 2030. Age, smoking, and air pollution through the exposure to particulate matter but also domestic pollution - mostly represented by domestic biomass combustion - are well-identified risk factors for the development of COPD. To date, there is no cure that can interfere with the natural history of the disease.Pluripotent stem cells, including induced pluripotent human stem cells (hiPSCs), are defined by two fundamental properties: self-renewal and the ability to differentiate into all cell types in our body. They offer an unprecedented opportunity to model the normal and pathological human development of the respiratory system.This research project aimed to model in vitro the trajectories of COPD, related to a developmental origin (pediatric roots) and / or susceptibility to tobacco. In order to elucidate the underlying mechanisms of COPD and tobacco susceptibility, we established two extreme groups: i) 4 patients with a severe form of COPD, the "highly susceptible" group, ii) 4 patients who are free of COPD or other tobacco-related comorbidity despite heavy smoking, called as "highly resistant" to tobacco.We have used two different but complementary in vitro cell culture models: hiPSCs and human bronchial primary epithelial cell cultures (HBECs) grown in ALI condition (Air Liquid Interface).First of all, we generate hiPSCs cell lines by reprogramming cells from peripheral blood of a healthy subject (control), and three highly characterized severe COPD patients. In a second step, the directed differentiation of hiPSCs allowed to recapitulate the early pulmonary development (NKX2.1 generation of bronchial progenitors) by the development of a robust and reproducible directed differentiation protocol of several hiPSCs lines. The maturation of these bronchial progenitors in 2D or 3D culture allows the generation of epithelial structures expressing markers of KRT5 + basal cells , CSSP + Club cells and FOXJ1 + ciliated cells. In a second step, these epithelia will be exposed to tobacco (CSE-cigarette smoke extract) in order to induce a "COPD-like" phenotype. Finally, ALI culture of HBECs of severe COPD patients was performed in unexposed and exposed condition (CSE). Transepithelial resistance, ciliary motility, secretory profile, and RNA diversity were collected.This work allowed to put in place the necessary tools to reproduce the in vitro trajectories of COPD and to clarify the origins of this pathology. The high throughput sequencing tools (transcriptomic in our study), will allow the discovery of new candidates, that represent potential targets for future pharmacological screening

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Jost, Mousseau Coline. "Propagation et toxicité de la superoxide dismutase 1 dans la Sclérose Latérale Amyotrophique modélisée par des neurones moteurs dérivés de cellules souches pluripotentes induites". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2024SORUS275.pdf.

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La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative rapidement fatale et sans traitement curatif, qui entraîne la mort des neurones moteurs (MN) via des mécanismes encore mal identifiés. La dégénérescence des MN provoque une paralysie progressive, qui débute localement avant d'atteindre l'ensemble des muscles squelettiques. La progression de la paralysie ne semble pas suivre un schéma aléatoire, mais se propage en suivant le tractus nerveux. On peut donc faire l'hypothèse que la mort des MN pourrait impliquer la propagation de déterminants pathologiques toxiques. Parmi les nombreux gènes causaux de la SLA, il a été montré que plusieurs d'entre eux codent pour des protéines ayant un domaine ou des propriétés prion-like. C'est le cas du gène codant pour la superoxyde dismutase 1 (SOD1), qui est la deuxième cause génétique de SLA. Il a été montré que des mutations de SOD1 engendraient la formation de protéines mal repliées (misSOD1), capables de transmettre leur mauvaise conformation à d'autres protéines SOD1. Cependant, à ce jour, il n'existe aucune étude sur la sécrétion de SOD1 et misSOD1 dans des MN humains et dans un contexte proche des conditions physiologiques des patients. Ainsi, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d'étudier l'expression et la sécrétion des protéines SOD1 dans des MN dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de sujets contrôles et de patients mutés SOD1, et d'analyser les voies possibles de la sécrétion de ces protéines. Dans un premier temps, j'ai différencié des iPSC en MN spinaux et j'ai montré que misSOD1 s'accumulait dans les MN mutants. J'ai ensuite montré que SOD1 était sécrétée à la fois par des MN contrôles et des MN mutés, mais la voie classique médiée par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi ne semblait pas impliquée. J'ai aussi observé que les MN sécrétaient des exosomes mais que ceux-ci ne contenaient apparemment pas SOD1. Dans un second temps, je me suis intéressée à une voie de sécrétion non conventionnelle spécifique aux protéines mal repliées : la voie MAPS (Misfolded-Associated Protein Secretion), majoritairement étudiée dans la sécrétion de l'α-synucléine. Cette voie est initiée par la deubiquitinase USP19 qui redirige les protéines mal repliées destinées à une dégradation protéasome par déubiquitination. La protéine chaperonne DNAJC5 forme ensuite des cargos avec les protéines déubiquitinées, qui sont alors dirigés par l'intermédiaire de différents organites, vers la membrane pour être sécrétés. J'ai montré que misSOD1 colocalisait avec DNAJC5 dans les MN SOD1 mutés, suggérant un rôle de la voie MAPS dans la sécrétion de SOD1. Pour confirmer cela, des vecteurs lentiviraux ont été produits pour transduire les MN et moduler l'expression de USP19. La surexpression de USP19 n'a pas affecté les colocalisations misSOD1-DNAJC5, tandis que sa diminution a réduit le nombre de colocalisations. En réalisant une analyse transcriptomique sur les MN transduits, j'ai observé que seulement 30 gènes étaient dérégulés lors de la surexpression de USP19. Cependant, en diminuant USP19, plus de 3000 gènes étaient dérégulés et sept voies étaient significativement dérégulées dont la voie de sécrétion protéique, suggérant l'importance de USP19 dans cette voie. Les perspectives de cette étude incluent d'explorer la propagation de la misSOD1 dans des cocultures entre des MN contrôles et mutants, pour investiguer l'importance de USP19 et de la voie MAPS dans la propagation. En conclusion, mes travaux ont montré que SOD1 était sécrétée par des MN de patients mutés SOD1 et que la voie MAPS pourrait être impliquée pour que les MN en souffrance se débarrassent des protéines mal repliées. Pouvoir moduler la sécrétion de SOD1 pourrait représenter une cible thérapeutique prometteuse pour ralentir la progression de la SLA, mais un équilibre devra être trouvé pour permettre de limiter à la fois la toxicité intracellulaire et la propagation des protéines toxiques
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rapidly fatal neurodegenerative disease with no curative treatment, leading to the death of motor neurons (MN) through mechanisms that are still poorly understood. The degeneration of MN causes progressive paralysis, which begins focally before affecting all skeletal muscles. The progression of paralysis does not follow a random pattern but spreads along the nerve tract. Therefore, it can be hypothesized that the death of MN could involve the propagation of toxic pathological determinants from one cell to another.Among the many causal genes of ALS, several have been shown to code for proteins with a prion-like domain or properties. This is the case for the gene coding for superoxide dismutase 1 (SOD1), which is the second most common genetic cause of ALS. It has been demonstrated that mutations in SOD1 result in misfolded proteins (misSOD1) capable of transmitting their misfolded conformation to other SOD1 proteins. However, to date, there are no studies on the secretion of SOD1 and misSOD1 in MN under conditions close to the physiological context of patients. Therefore, the aim of my thesis work was to study the expression and secretion of SOD1 and misSOD1 in MN derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) from control subjects and SOD1-mutated patients and to analyze the possible pathways of these proteins' secretion. First, I differentiated iPSCs into spinal MN and showed that misSOD1 accumulated in mutant MN. I then showed that SOD1 was secreted by both control and mutant MN, but the classical pathway mediated by the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus did not seem to be involved. I also observed that MN secreted exosomes, but they apparently did not contain SOD1. In the second phase, I focused on an unconventional secretion pathway specific to misfolded proteins: the MAPS pathway (Misfolded-Associated Protein Secretion), which has mainly been studied in the context of α-synuclein secretion. This pathway is initiated by the deubiquitinase USP19, which redirects misfolded proteins destined for proteasomal degradation by deubiquitination. The chaperone protein DNAJC5 then forms cargos with the deubiquitinated proteins, which are progressively directed via different organelles to the membrane for secretion. I showed that misSOD1 colocalized with the DNAJC5 protein in SOD1 mutant MN, suggesting a role for the MAPS pathway in SOD1 secretion. To confirm this, lentiviral vectors were produced to transduce the MN and modulate USP19 expression. Overexpression of USP19 did not change the number of colocalizations between misSOD1 and DNAJC5; however, decreasing USP19 reduced these colocalizations, suggesting the involvement of the MAPS pathway in misSOD1 secretion. By performing RNA sequencing on transduced MN, I observed that only 30 genes were deregulated with USP19 overexpression. However, with USP19 downregulation, 1758 and 1410 genes were respectively upregulated and downregulated. Seven pathways were significantly deregulated, including the protein secretion pathway, suggesting the importance of USP19 in protein secretion. The perspectives of this study include exploring the propagation of misSOD1 in cocultures between control and mutant MN to investigate the importance of USP19 and the MAPS pathway in propagation. In conclusion, my work has shown that SOD1 is secreted by MN from SOD1-mutated patients and that traditional secretion pathways are not involved, in contrast to the MAPS pathway. Therefore, the ability to modulate SOD1 secretion could represent a promising therapeutic target for slowing the progression of ALS

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Duchartre, Yann. "Biothérapies des porphyries érythropoïétiques : thérapie cellulaire, thérapie génique et approche pharmacologique". Thesis, Bordeaux 2, 2012. http://www.theses.fr/2012BOR21994/document.

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Les porphyries érythropoïétiques (PE) : Porphyrie Erythropoïétique Congénitale -PEC- et Protoporphyrie Erythropoïétique -PPE- sont caractérisées par le déficit d’une des enzymes de la voie de biosynthèse de l’hème. Le traitement curatif des formes sévères de PE est la transplantation de moelle osseuse allogénique (TMOA). La PPE est parfois compliquée d’une insuffisance hépatique majeure nécessitant une greffe hépatique. Dans un modèle murin de PPE (Fechm1Pas/Fechm1Pas), nous avons démontré l’apparition progressive de lésions hépatiques dès la 2ème semaine de vie. Une TMO précoce (nouveau-né) a permis de prévenir l’apparition de ces lésions hépatiques et de corriger la photosensibilité cutanée démontrant l’efficacité de cette approche thérapeutique pour les formes sévères de PPE. La thérapie génique par greffe de cellules souches hématopoïétiques autologues corrigées représente une alternative à la TMOA en l’absence de donneur HLA-compatible. Nous avons développé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) à partir de cellules épidermiques issues de modèles murins de PE et d’un patient PEC. La correction génique a été obtenue par transfert du gène lentiviral (ferrochélatase ou uroporphyrinogène III synthase (UROS). La pluripotence des cellules iPS a été caractérisée in vitro par la formation de corps embryoïdes et in vivo par la formation de tératomes. In vitro, la correction métabolique a été obtenue après différenciation des cellules iPS humaines en progéniteurs hématopoïétiques. Enfin dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés à une approche pharmacologique de la PEC. Nous avons montré que les mutations C73R et P248Q entraînaient une instabilité et une dégradation accélérée de l’UROS par la voie du protéasome. Le traitement de souris UrosP248Q par un inhibiteur du protéasome (Velcade®) a permis la correction de la photosensibilité cutanée. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement des porphyries érythropoïétiques
Erythropoietic porphyrias (EP) : Congenital Erythropoietic Porphyria -CEP- and Erythropoietic Protoporphyria -EPP-) are characterized by a deficit of one enzyme implicated in heme biosynthetic pathway. The curative therapy for severe cases of EP is an HLA-compatible Bone Marrow Transplantation (BMT). EPP is sometimes complicated by a major hepatic failure requiring hepatic graft. In a murine model of EPP (Fechm1Pas/Fechm1Pas), we have demonstrated that hepatic lesions progressively appear 2 weeks after birth. Early BMT (in neonates) has made it possible to prevent hepatic lesions and correct skin photosensitivity, demonstrating the efficiency of this therapeutic approach in severe cases of EPP. The gene therapy by graft of corrected autologous hematopoietic stem cells represents an alternative to BMT when HLA-compatible donors are lacking. We have developed induced pluripotent stem cells (iPSC) from epidermic cells of murine models of EP and of one PEC patient. The gene correction was obtained by lentiviral gene transfer (ferrochelatase and uroporphyrinogen III synthase -UROS). The pluripotency of iPSC was characterized in vitro by the formation of embryoid bodies and in vivo by the formation of teratomas. In vitro, the metabolic correction was obtained after differentiation of human IPSC into hematopoietic progenitors. In the last part of this thesis, we have focused on a pharmacological approach of CEP. We have shown that C73R and P248Q mutations lead to instability and accelerated degradation of the UROS protein via the proteasome. Treating UrosP248Q mice with a proteasome inhibitor (Velcade®) has allowed the correction of skin photosensitivity. These works offer new prospects for the treatment of erythropoietic porphyrias

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Rabesandratana, Oriane. "Les cellules ganglionnaires rétiniennes dérivées de cellules souches pluripotentes humaines : de la caractérisation à la transplantation". Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS322.

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Parmi les stratégies en développement de nouveaux traitements pour les neuropathies optiques, la thérapie cellulaire par transplantation de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGRs) dérivées de cellules pluripotentes humaines est l’un des axes de recherche les plus prometteurs. Au cours de la réalisation du projet présenté dans ce document, nous avons validé la production optimisée de CGRs, à partir de quatre lignées de cellules souches pluripotentes induites (iPS) humaines, par une double sélection selon les conditions de culture in vitro et un protocole de tri magnétique basé sur l’expression de l’antigène de surface CD90/THY1. Nous avons caractérisé les CGRs enrichies par ce double protocole de sélection selon leurs propriétés morphologiques, moléculaires et fonctionnelles. Ces résultats furent validés pour un total de quatre lignées cellulaires iPS, dont une lignée rapportrice fluorescente ubiquitaire, générée par stratégie Crispr-Cas9. La transplantation par injection intravitréenne des CGRs dérivées de cette lignée rapportrice, sur un modèle murin ayant subi un écrasement du nerf optique, a permis d’observer une intégration partielle des cellules survivantes dans la rétine hôte permettant d’établir la preuve de concept quant à la possibilité de réaliser ce type de transplantation. Ce travail devra être poursuivi afin d’étudier la capacité de ces cellules à établir des contacts fonctionnels avec les partenaires rétiniens et cérébraux
Among the different treatments for optic neuropathies, cell therapy using transplantation of retinal ganglion cells (RGCs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC) is one of the most promising strategy. In this project, we validated the optimized production of RGCs from retinal organoids derived from four different hiPSC lines. Our methodology included a double selection process, comprising the culture of retinal dissociated cell in adherent conditions and a magnetic sorting protocol, based on the expression of surface antigen CD90/THY1. We identified enriched RGCs resulting from this double protocol, according morphological, molecular and functional properties. These results were validated for all four hiPSC lines, including a ubiquitous fluorescent reporter cell line, using Crispr/Cas9 strategy. Intravitreal injection of reporter hiPSC line-derived RGCs into an optic nerve crush mouse model led to a partial integration of surviving cells into the host retina establishing the possibility to performed RGC transplantation. This work will be continued in order to explore the capacity of hiPSC-derived RGCs to reconnect with both retinal partners and with the different targets in the brain

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Huyghe, Matthias. "Approche thérapeutique anticancéreuse par immunothérapie basée sur les cellules NK dérivées de cellules iPS". Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL104.

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Les cellules Natural Killer (NK) sont des cellules spécialisées dans l'immunosurveillance, capables de reconnaître et de lyser les cellules transformées ou infectées par des virus. En raison de leurs propriétés biologiques spécifiques, le transfert adoptif de cellules NK pour l'immunothérapie contre le cancer représente une alternative prometteuse à l'utilisation des cellules CAR-T chez certains patients. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) se sont imposées comme une source attractive pour la génération de cellules NK à des fins thérapeutiques. En effet, les iPSC peuvent être facilement modifiées génétiquement pour produire des cellules NK clonogéniques exprimant des modifications spécifiques.Les cellules NK dérivées d'iPSC modifiées génétiquement ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'immunothérapies « prêtes à l'emploi ».Dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, j'ai étudié et optimisé des protocoles de différenciation afin d'optimiser les méthodes pré-existantes (Partie 1). J'ai également participé au développement d'une thérapie basée sur l'utilisation des cellules NK dérivées de cellules iPS exprimant un CAR de troisième génération pour traiter les patients atteints de leucémie myéloïde chronique (LMC) réfractaire ou récidivante en phase de crise blastique (Partie 2)
Natural Killer (NK) cells are specialized cells involved in immunosurveillance, capable of recognizing and lysing transformed or virus-infected cells. Due to their spécifie biological properties, the adoptive transfer of NK cells for cancer immunotherapy represents a promising alternative to the use of CAR- T cells in certain patients.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) hâve emerged as an attractive source for generating NK cells for therapeutic purposes. Indeed, iPSCs can be easily genetically modified to produce clonogenic NK cells expressing spécifie modifications.Genetically modified NK cells derived from iPSCs pave the way for the development of "off-the- shelf" immunothérapies.As part of the development of new therapeutic strategies, I hâve studied and optimized différentiation protocols to enhance existing methods (Part 1). I also participated in the development of a therapy based on the use of NK cells derived from iPS cells expressing a third- generation CAR to treat patients with refractory or relapsed chronic myeloid leukemia (CML) in blast crisis (Part 2)

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Mianné, Joffrey. "Thérapie génique par CRISPR/Cas9 pour corriger des épithéliums bronchiques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) de patients atteints de dyskinésie ciliaire primitive (DCP) : une preuve de concept". Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT045.

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La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une maladie génétique rare et hétérogène affectant la structure et la fonction des cils motiles. Dans l'épithélium des voies respiratoires, l’altération du mouvement ciliaire entraîne des infections chroniques responsables du déclin progressif et définitif des fonctions pulmonaires. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la DCP. Par ailleurs, la recherche de nouvelles thérapies reste limitée par le manque de modèles fiables.Dans ce contexte, les deux objectifs de cette thèse sont : 1) de développer un nouveau modèle in vitro de la DCP basé sur la différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en épithélium des voies respiratoires multiciliées, et 2) d'utiliser ce modèle pour étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9.Dans ce but, nous avons dérivé deux lignées de CSPi, une d'un individu sain et une seconde d'une patiente atteinte de la DCP contenant des mutations hétérozygotes composites dans le gène CCDC40. En utilisant la lignée « saine » et la technologie CRISPR/Cas9, nous avons généré des contrôles isogéniques knock-out pour trois gènes impliqués dans la DCP incluant CCDC40, DNAH5 et MCIDAS. Parallèlement, la lignée de CSPi dérivée de la patiente a été corrigée à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 et de l'approche de réparation dirigée par homologie. En appliquant à ces lignées cellulaires notre protocole de différenciation préalablement optimisé, nous générons efficacement un épithélium multicilié fonctionnel des voies aériennes récapitulant les phénotypes ciliaires en fonction du génotype. En outre, ce nouveau modèle nous a permis d'étudier le potentiel d'une approche de thérapie génique basée sur la technologie CRISPR/Cas9 pour restaurer le cadre de lecture et de rétablir le phénotype ciliaire dans la lignée DCP.En conclusion, le nouveau modèle développé dans ce travail pourrait représenter un outil majeur pour la modélisation de la DCP in vitro. Ce modèle sera particulièrement intéressant pour étudier directement sur le tissu humain concerné la faisabilité et l'efficacité de thérapies innovantes. Notre pipeline pourrait donc permettre d’accélérer la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la DCP ainsi que d'autres pathologies pulmonaires
Primary Ciliary dyskinesia (PCD) is a rare and heterogeneous genetic disorder affecting the structure and function of motile cilia. In the airway epithelium, impaired ciliary motion results in chronic airway infections responsible for progressive and definitive decline of lung functions. There is currently no effective treatment for PCD, and research is limited by the lack of convenient models to study this disease and investigate innovative therapies.In this context, the main goals of this thesis are: 1) to develop a new in vitro PCD model based on the directed differentiation of patient-derived or genetically-engineered induced pluripotent stem cells (iPSC) into multiciliated airway epithelium, and 2) to use this model to investigate the potential of an innovative CRISPR/Cas9 gene therapy approach.To this aim, we have derived two iPSC lines, one from an healthy individual and a second from a PCD patient harbouring compound heterozygous mutations in the CCDC40 gene. Using the “healthy” iPSC line and the CRISPR/Cas9 technology we have generated isogenic knock-out controls for three PCD genes including CCDC40, DNAH5 and MCIDAS. In parallel, using the CRISPR/Cas9 technology and the homology directed repair approach, we have corrected the patient-derived iPSC line. By applying our optimized differentiation protocol to these cell lines, we are efficiently generating functional multiciliated airway epithelium recapitulating the ciliary phenotypes in function of the genotype. Furthermore, this new model has allowed us to investigate the potential of a CRISPR/Cas9-mediated reframing gene therapy approach to rescue ciliary phenotype in the patient line.In conclusion, the new model developed in this work could represent a major tool for in vitro PCD modelling. This model will be of particular interest for investigating the feasibility and efficacy of personalized therapies directly on the relevant human tissue. Our pipeline could therefore accelerate the development and translation of new therapeutics for PCD and other lung diseases

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Raïs, Célia. "Analyse histologique et fonctionnelle du développement de précurseurs neuraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines greffés dans le cortex de la souris". Thesis, Sorbonne université, 2019. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=http://theses-intra.upmc.fr/modules/resources/download/theses/2019SORUS333.pdf.

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Les anomalies du neurodéveloppement sous-tendent entre autres les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou l’autisme. L'hétérogénéité génétique de l'être humain rend cependant complexe l'établissement d'un lien entre un génome donné et les programmes de développement qui peuvent mener à une maladie. Pour répondre à ce problème, les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont un outil ethique et efficace. Elles sont capables de se développer et de se différencier en neurones fonctionnels, en utilisant un mécanisme similaire au développement in vivo. J’ai étudié un modèle permettant de suivre l’intégration et la migration de précurseurs neuraux issus d’iPSC humaines dans le cortex de souris. En marquant les cellules greffées par immunofluorescence, j’ai pu montrer qu’elles se différencient principalement en neurones des couches supérieures du cortex. J’ai étudié les relations entre l’hôte et la greffe, et montre que les cellules de la souris participent au développement de la greffe, en apportant une vascularisation, et en myélinisant les neurones humains en développement. Enfin, j’ai suivi le développement fonctionnel des neurones humains en utilisant une lignée exprimant un indicateur calcique, le GCaMP6f, et en observant chroniquement les souris injectées au microscope 2-photons. Cette activité évolue au cours du temps, et reflète un cerveau prénatal humain. Ce modèle offre des possibilités nouvelles de modélisation in vivo du developpement cortical humain, notamment dans l’étude de l’impact d’altérations génétiques dans le cadre de maladies psychiatriques
Neurodevelopmental abnormalities underlie psychiatric diseases such as schizophrenia or autism, among others. However, the genetic heterogeneity of human beings makes it difficult to establish a link between a given genome and development programs that can lead to a disease. To address this problem, induced pluripotent stem cells (iPSCs) are an ethical and effective tool. They are able to develop and differentiate into functional neurons, using a mechanism similar to in vivo development. I studied a model enabling the integration and migration of neural precursors from human iPSCs into the mouse cortex. By labelling the cells grafted by immunofluorescence, I was able to show that they differentiate mainly into upper layer cortical neurons. I have studied the relationship between host and grafted cells , and show that mouse cells participate in the development of the graft, providing vascularization, and myelinating developing human neurons. Finally, I followed the functional development of human neurons using a cell line expressing a calcium indicator, GCaMP6f, and chronically observing injected mice under a 2-photon microscope. This activity changes over time, and reflects a prenatal human brain. This model offers new possibilities for in vivo modelling of human cortical development, particularly in the study of the impact of genetic alterations in the context of psychiatric diseases

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Cereso, Nicolas. "Preuve de concept de thérapie génique d’une dystrophie rétinienne en l’absence de modèle animal de la pathologie : cas de la Choroïdérémie". Thesis, Montpellier 1, 2014. http://www.theses.fr/2014MON1T019/document.

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Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont des maladies qui conduisent à une perte de la vision au cours de leur évolution. Les premiers essais cliniques utilisant la thérapie génique pour traiter ces maladies ont été réalisés et apportent des résultats encourageants. En amont de telles études, les essais précliniques s'effectuent le plus souvent sur modèle animal. Cependant, pour un certain nombre de DRH, il n'existe pas de modèle animal approprié ce qui compromet l'arrivée d'un traitement à un stade clinique. C'est le cas de la Choroïdérémie, qui représente 2% des DRH. La choroïdérémie est caractérisée par une perte de la vision nocturne dès la petite enfance et conduit à la cécité autour des 40-50 ans. Son diagnostic précoce et son évolution lente résultent en une grande fenêtre thérapeutique qui fait de la choroïdérémie une bonne candidate pour la thérapie génique. Sur le plan génétique, la maladie est causée par une mutation dans le gène CHM qui est localisé sur le chromosome X et code pour la Rab Escort Protein 1 (REP1). Cette protéine est impliquée dans le processus de prénylation de petites protéines GTPases, les protéines Rab. Afin de pallier au manque de modèle animal, nous avons généré au cours de ce travail de thèse, un modèle cellulaire humain de la choroïdérémie pour évaluer l'efficacité d'un protocole de thérapie génique sur le tissu réellement atteint in vivo. Pour cela, nous avons reprogrammé des fibroblastes de patient CHM-/y en cellules souches pluripotentes induites (iPS), que nous avons ensuite différenciées en Epithélium Pigmentaire Rétinien (EPR). Nous avons caractérisé cet EPR, montrant que c'est une couche monocellulaire polarisée possédant une morphologie et une expression de marqueurs caractéristiques. De plus, ce tissu est fonctionnel, sur le plan du transport de fluide et de la phagocytose, et possède le même phénotype biochimique que celui observé chez les patients. Dans un but de thérapie génique et afin d'évaluer le vecteur viral le plus efficace sur nos cellules, j'ai testé un panel de 5 sérotypes d'AAV et démontré que l'AAV2/5 est le plus efficient pour transduire un EPR dérivé de cellules iPS humaines. J'ai ensuite utilisé un AAV2/5-CAG-CHM afin d'évaluer l'efficacité fonctionnelle du vecteur et j'ai pu montrer qu'outre une expression correcte du transgène, le traitement de cellules de patients déficientes pour REP1 avec ce vecteur permet de restaurer une activité normale de prénylation. Nous avons donc démontré la supériorité d'efficacité de transduction de l'AAV2/5 dans des cellules d'EPR humain et soulignons le potentiel d'un modèle d'EPR pathologique dérivé de cellules iPS pour apporter une preuve de concept de thérapie génique en absence d'un modèle animal approprié
Inherited retinal dystrophies (IRDs) lead to a progressive vision loss. The first clinical trials using gene transfer to treat such diseases have been performed with positive results. Prior to clinical trials, preclinical studies are usually performed on animal models. However, for many IRDs, appropriate animal models do not exist, which compromises their progress towards a clinical trial. An example of an IRD that lacks an appropriate model is choroideremia, which represents 2% of IRD patients. It is characterized by night blindness in childhood, followed by progressive loss of the visual field resulting in blindness by 40–50 years of age. Its early diagnosis and slow evolution result in a large therapeutic window making choroideremia a good candidate for gene therapy. Genetically, the disease is caused by a mutation in the CHM gene located on the X chromosome and encoding the Rab Escort Protein 1 (REP1). This protein is involved in the prenylation of small GTPases, the Rab proteins. To palliate the lack of an animal model, we generated a human cellular model of choroideremia in order to evaluate the efficacy of a gene therapy approach in the tissue that is affected in vivo.Towards this aim, we reprogrammed REP1-deficient fibroblasts from a CHM-/y patient into induced pluripotent stem cells (iPScs), which we differentiated into retinal pigment epithelium (RPE). We characterized the iPSc-derived RPE that is a polarized monolayer with a classic morphology, expresses characteristic markers, is functional for fluid transport and phagocytosis, and mimics the biochemical phenotype of patients. In terms of gene therapy and to evaluate the most efficient viral vector, I assayed a panel of 5 adeno-associated virus (AAV) vector serotypes and showed that AAV2/5 is the most efficient at transduce the iPSc-derived RPE. I then transduced the iPSc-derived RPE of a choroideremia patient with an AAV2/5-CAG-CHM and demonstrated that this vector is able to restore a normal prenylation function to the cells.To conclude, I demonstrated the superiority of the transduction efficiency of AAV2/5 in the iPSc-derived RPE and highlight the potential of a diseased RPE model derived from iPS cells to provide a proof of concept of gene therapy in the absence of a suitable animal model

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Auboyer, Laura. "Génération de cellules souches pluripotentes induites de patients Alzheimer et production d'un modèle de culture en trois dimensions de neurones pour les recherches diagnostiques et thérapeutiques de la maladie d’Alzheimer". Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT004/document.

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La maladie d’Alzheimer est une maladie très complexe, aujourd’hui encore mal comprise et cette démence est devenue un réel problème de santé publique. La protéine précurseur de l’amyloïde (APP) et la protéine Tau sont deux acteurs majeurs impliqués dans la maladie. De nombreuses recherches se sont investies dans la compréhension du métabolisme, de l’action et de l’implication de ces deux protéines dans les mécanismes pathologiques de la maladie et d’autres maladies neurodégénératives. Elles sont notamment l’objet de la plupart des approches thérapeutiques passées et actuelles, et étudiées pour le diagnostic biologique de la maladie. Dans ce projet de thèse, notre objectif fut d’explorer le métabolisme des protéines APP et Tau au cours de la différenciation neuronale à l’aide d’outils biochimiques et de systèmes innovants d’immunodétection multiplex très sensibles (MSD®) dans plusieurs modèles de culture cellulaire de la maladie. L’objectif était d’obtenir une vision globale des processus physiopathologiques au travers d’analyses d’échantillons générés au cours de la différenciation neuronale de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de patients Alzheimer comparées aux cellules souches embryonnaires humaines (hESC). Nous avons ainsi généré et caractérisé plusieurs lignées cellulaires d’IPSC d’une personne saine contrôle et de patients atteints des formes sporadiques et familiales de la maladie. Ce projet offre l’opportunité unique de combiner des approches innovantes pour tenter de comprendre comment les fragments et les peptides Ab sont générés, ainsi que les modifications de Tau en conditions normales et pathologiques
Amyloid precursor protein (APP) and Tau protein are two main molecular actors of the Alzheimer’s disease (AD), which is of prime importance in Human Health. Intensive research is ongoing to understand these proteins’ metabolism, action and implication in the pathological mechanism of these affections. They are the target of most therapeutic approaches and are used for biological diagnosis. In the present PhD project, our objective was to investigate neuronal APP and Tau protein processing and metabolism using biochemical tools and innovative multiplex immunodetection system (MSD®) in diverse cell culture models of AD. The goal was to get a comprehensive view oh physiopathological processes based on the analysis of samples generated in neuronal differentiated human embryonic stem cell and induced pluripotent stem cells derived from AD-patients. We generated several cell lines from an healthy control individual, and AD patients showing sporadic and familial forms of the disease. This project offer the unique opportunity to combine state-to-the-art approaches to understand how the APP fragments and peptides are generated as well as the modifications of the Tau protein in normal and pathological situation

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Mouka, Aurélie. "Analyse des variations du nombre de copies d'ADN dans une cohorte d'hommes infertiles et génération de modèles génétiques d’étude de la méiose à partir de cellules iPS de patients infertiles". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS300/document.

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L’infertilité représente un problème majeur de santé publique en concernant 10 à 15% des couples en âge de procréer. Un facteur masculin est responsable de l’infertilité du couple dans près de la moitié des cas. Pour environ 30% d'entre eux, l'étiologie reste inexpliquée. Le premier axe du travail a concerné l’étude moléculaire d’une cohorte de patients infertiles (azoospermie non-obstructive/cryptozoospermie ou désordre du développement sexuel ou DSD) pour lesquels les analyses du caryotype standard et/ou des microdélétions des régions AZF par PCR n’ont pas permis d’expliquer le phénotype. L'impact des variations de nombre de copies de l'ADN (CNV) détectées par l'hybridation génomique comparative sur puce à ADN est peu documenté. Un design personnalisé de puce à ADN de format 400K, pangénomique et enrichi sur un large panel de 445 gènes liés à l'infertilité et à un DSD a été développé. Cette puce a permis l’identification de 171 CNV d’intérêt. Ces résultats soulignent l’intérêt de ce design comme outil diagnostic dans le cadre du bilan de l’infertilité masculine. Le second axe du travail a été de modéliser l’infertilité masculine in vitro dans un contexte d’anomalie génétique. Des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) ont été générées à partir d’érythroblastes de deux patients infertiles porteurs d’un remaniement chromosomique complexe ou d’un caryotype 46,XX-SRY négatif avec mutation du gène de l’AMH. Dans un deuxième temps, la fonctionnalité des lignées de cellules hiPS générées a été testée par différenciation in vitro en cellules germinales primordiales (CGP). Elles expriment les marqueurs clés du stade CGP dont SOX17, le déterminant germinal le plus précoce des CGP. Les perspectives de ce travail seront de poursuivre la différenciation germinale vers des stades plus matures et ainsi de pouvoir étudier le processus méiotique dans un contexte d’anomalie génétique
Infertility represents a major public health problem and concerns 10 to 15% of couples in the general population. A male factor is responsible for the infertility of the couple in about half of all cases. In approximately 30% of them, the etiology remains unexplained.The first working axis concerned the molecular study of a cohort of infertile patients (nonobstructiveazoospermia/ cryptozoospermia and disorder of the sex development or DSD) for whom analyses of standard karyotype and/or microdeletions of AZF regions were not able to explain the phenotype. The impact of copy number variations of DNA (CNVs) detected by comparative genomic hybridization (CGH-array) is poorly documented. A custom design 400K micoarray, genome-wide and enriched on a wide panel of 445 genes linked with infertility and DSD has been achieved. This array allowed the identification of 171 CNVs of interest.These results underline the potential of this design for diagnosis of male infertility. The second objective of this work was the in vitro modelisation of male infertility in a context of genetic abnormality. For that purpose, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were generated from erythroblasts by means of not integrative Sendaï virus, in two patients carrying genetic abnormalities (complex chromosomal rearrangement and 46,XX-SRY negative karyotype associated with AMH gene mutation). Secondly, functionality of hiPSCs generated was tested by germ cells in vitro differentiation. Primordial germ cell (PGC) stage was successfully obtained. Cells expressed key PGC markers such as SOX17. The perspectives of this work will be to continuethe germinal differentiation towards more mature stages and so to be able studying the meiotic process in a context of genetic abnormality

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Louçã, Mathilde. "Functional impacts of Huntingtin lowering on the synaptic maturation and activity of neuronal networks derived from human induced pluripotent stem cells". Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL054.

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La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative causée par la mutation de la Huntingtine (HTT). La réduction de l'expression de la HTT mutante est une piste thérapeutique évidente en cours d’exploration chez les patients. Le ciblage de la HTT mutante s’accompagne cependant le plus souvent d’une réduction concomitante de la HTT non mutée. Les conséquences de la perte de cette protéine sur la santé des neurones restent mal connues.Mon travail de thèse traite cette question en utilisant des modèles in vitro de réseaux neuronaux humains différenciés à partir de cellules souches induites à la pluripotence. Mes travaux démontrent que la perte de HTT induit des anomalies de développement et d’homéostasie de ces réseaux. Mes résultats suggèrent que les thérapies ciblant indifféremment la HTT mutante et non mutante pourraient compromettre la santé des circuits neuronaux ciblés
Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative disorder caused by a mutation in the Huntingtin gene (HTT). Reducing the expression of mutant HTT is an obvious therapeutic approach explored in patients. However, targeting mutant HTT often leads to a simultaneous reduction in non-mutant HTT. The consequences of losing this protein on neuronal health remain poorly understood.My doctoral work addresses this question using in vitro models of human neuronal networks differentiated from induced pluripotent stem cells. My research demonstrates that HTT loss induces developmental and homeostatic abnormalities in these networks. My results suggest that therapies targeting both mutant and non-mutant HTT indiscriminately could compromise the health of targeted neuronal circuits

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Estève, Julie. "Transfert de gènes dans les cellules souches pluripotentes induites : application à la thérapie génique de l'hyperoxalurie primitive de type 1". Thesis, Bordeaux, 2018. http://www.theses.fr/2018BORD0280/document.

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L’hyperoxalurie primitive de type 1 (ou HP1) est une maladie héréditaire du métabolisme liée à un déficit en enzyme hépatocytaire AGT (alanine:glyoxylate aminotransférase), codée par le gène AGXT. Ce déficit entraîne, chez les patients atteints d’HP1, une excrétion hépatique accrue d’oxalate ; celui-ci est ensuite éliminé dans les urines où il se complexe avec le calcium pour former des néphrolithiases oxalo-calciques massives, pouvant conduire à une insuffisance rénale chronique. Le seul traitement curatif disponible pour cette pathologie est la greffe allogénique combinée hépatorénale, actuellement limitée par la disponibilité des donneurs de greffons, une morbi-mortalité significative et la nécessité d’un traitement immunosuppresseur au long cours. L’objectif du projet de recherche est de développer une thérapie génique de l’HP1 par greffe de cellules hépatiques autologues génétiquement corrigées. La faible disponibilité et la difficulté d’amplification in vitro des hépatocytes adultes nous a conduit à explorer la piste des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) pour produire des cellules hépatiques humaines utilisables en médecine régénérative. Nous avons dérivé et caractérisé des lignées de cellules iPSCs à partir de fibroblastes de patients atteints d’HP1, après expression transitoire des facteurs de reprogrammation par des vecteurs Sendai. Nous avons développé deux stratégies de thérapie génique additive par insertion d’un minigène codant une séquence optimisée de l’ADNc AGXT au moyen (1) d’un vecteur lentiviral à expression hépato-spécifique et (2) d’un processus de recombinaison homologue au locus AAVS1 facilité par le système de clivage ciblé de l’ADN « CRISPR/Cas9 ». Enfin, nous avons mis en évidence l’expression de la cassette thérapeutique après différenciation hépatocytaire des iPSCs génétiquement corrigées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives de médecine régénérative pour l’HP1 par transplantation de cellules hépatocytaires autologues génétiquement corrigées dérivées d’iPSCs de patients
Primary hyperoxaluria type 1 (or PH1) is an inherited metabolic disorder related to the deficiency of the hepatic AGT enzyme (alanine:glyoxylate aminotransferase), which is encoded by the AGXT gene. In PH1 patients, this deficiency leads to oxalate overexcretion by liver, followed by urine filtration and complexation with calcium to form massive calcium-oxalate nephrolithiasis potentially leading to chronic renal failure. The only available curative treatment is combined hepatorenal allogeneic engraftment, which is currently limited by the availability of transplant donors, significant morbidity and mortality, and the need for long-term immunosuppressive treatment. The aim of our research project is to develop gene therapy for PH1, consisting in engraftment of genetically corrected autologous liver cells. Considering that adult hepatocytes are hardly available and expandable in vitro, we chose to explore the use of induced pluripotent stem cells (iPSCs) to produce human liver cells for application in regenerative medicine. We derived and characterized iPSC lines from PH1 patient fibroblasts after transient expression of reprogramming factors delivered by Sendai virus vectors. We developed two additive gene therapy strategies by inserting a minigene encoding an optimized AGXT cDNA sequence using (1) a lentiviral vector designed for liver-specific expression and (2) homologous recombination process at the AAVS1 locus favoured by the targeted DNA cutting system “CRISPR/Cas9”. Finally, we highlighted therapeutic cassette expression after hepatic differentiation of genetically corrected iPSCs. These results pave the way for regenerative medicine for PH1 by transplantation of genetically modified autologous hepatocyte-like cells derived from patient-specific iPSCs

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Pavoni, Serena. "Mise au point d’un nouveau modèle d’organoïde cérébral humain pour l’étude des mécanismes d’interaction de la protéine prion et de l’amyloïde β". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS427.

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Les mécanismes de type prion sont désormais reconnus comme sous-tendant la plupart des maladies neurodégénératives humaines, avec en premier lieu la maladie d’Alzheimer (MA) au niveau de ses 2 marqueurs spécifiques, l’amyloïde β (Aβ à l’origine de l’hypothèse étiopathogénique de la cascade amyloïde) et la protéine Tau phosphorylée. Par ailleurs la protéine du prion (PrPC) est décrite comme interagissant à de multiples niveaux avec le métabolisme de l’Aβ sans que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents n’aient pu être expliqués. Pour sortir de l’impasse actuelle concernant le développement d’approches thérapeutiques efficaces pour la MA, l’industrie pharmaceutique a besoin de modèles expérimentaux innovants. En effet, à ce jour aucun modèle in vivo, en dépit des progrès réalisés avec les souris transgéniques, n’arrive à refléter la complexité cérébrale humaine ni à mimer une MA clinique. Les cultures in vitro en 2D sont quant à elles très éloignées des situations conduisant à l’accumulation d’agrégats protéiques pathologiques. Le but de notre thèse a été d’utiliser dans le domaine des neurosciences les nouvelles perspectives de recherche ouvertes par les technologies des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) en développant un modèle de différentiation en 3D pour obtenir des organoïdes cérébraux humains (OC) (mini cerveaux). Leur capacité d’auto-organisation en 3D de tissu neuroectodermique nous a permis de recréer un système complexe mimant différentes structures cérébrales humaines dans lesquelles nous avons pu caractériser les marqueurs attendus. L’étude de l’expression des protéines d’intérêt APP et PrPC pendant la différentiation neurale a permis de caractériser la modulation des niveaux des deux protéines en fonction du temps de culture. Afin d’orienter le modèle vers des mécanismes d’accumulation protéique de type MA, nous avons testé différents inducteurs chimiques dont l’Aftin-5 qui est capable de moduler les voies post-traductionnelles de l’APP. Plusieurs stratégies de traitement ont été adoptées pour induire le clivage de l’APP et la génération d’Aβ. La production des fragments solubles Aβ38, Aβ40, Aβ42 a été mise en évidence par ELISA. Les niveaux générés sont reproductibles et l’augmentation du ratio Aβ42/Aβ40 est cohérente avec les données extrapolées des modèles murins et humains, ce qui a permis de valider notre modèle. Les niveaux d’expression génique et protéique de PrPC et de APP suite au traitement ont été analysés afin de mieux déterminer le rôle de l’interaction entre ces deux facteurs. L’objectif à long terme consiste à améliorer ce modèle, dont les limites actuelles sont notamment l’absence de vascularisation et le niveau de maturation du tissu neural. Le défi majeur dans le cadre de la culture des OC consiste donc à favoriser l’intégration du système vasculaire, et par ailleurs à accélérer le vieillissement in vitro pour l’étude de maladies neurodégénératives. La perspective de pouvoir automatiser le système de culture des OC permet d’envisager l’utilisation de ce modèle à plus grande échelle dans le cadre de test de cytotoxicité et/ou de criblage pharmacologique à haut débit pour identifier de nouvelles molécules thérapeutiques pour la MA
Prion-like mechanisms are known to underlie most of human neurodegenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD), which is characterized by two important pathological markers, β amyloid (or Aβ at the origin of the etiopathogenic amyloid cascade hypothesis) and phosphorylated tau protein. Furthermore, the prion protein (PrPC) interacts at multiple levels with the metabolism of Aβ, by mechanisms which are not well understood. To overcome the current limits in the development of efficient strategies to treat AD, the pharmaceutical industry requires innovative experimental models. However, even if a lot of progress has been achieved by using transgenic mouse models, to date no in vivo model can reflect the complexity of human brain or reproduce a clinical context. 2D in vitro cell culture models are unable to allow the aggregation and accumulation of pathological proteins as observed in vivo. The aim of this study consists in taking advantage of the research prospects offered by induced pluripotent stem cell (iPSCs) in the field of neurosciences. iPSCs can be used to generate 3D models of differentiation also called human cerebral organoids or mini-brains (MBs). Their ability to self-organise in 3D neuroectodermic tissue leds to a complex system that mimics different human cerebral structures in which we were able to characterize the expected markers. The study of the two proteins of interest (APP and PrPC) during neural differentiation has allowed us to follow the modulation of protein expression level occurring during the in vitro development of the human MBs. In order to use this model to reproduce the protein accumulation mechanisms seen in AD, we have tested chemical inductors such as Aftin-5 in order to modulate the APP post-transcriptional pathway towards a pathological outcome. Many strategies of treatment are adopted to lead APP cleavage and Aβ generation. The production of soluble fragments Aβ38, Aβ40, Aβ42 in the supernatant of organoids has been showed using ELISA technique. The levels generated are reproducible and the increase of Aβ42/Aβ40 ratio is consistent with extrapolated data from mouse and human models thus validating our model. Analysis at the gene and protein level has been assessed in order to understand the interaction between PrPC and APP after treatment. The long-term goal consists in improving this model which is notably hampered by the absence of vascularization and the low level of maturation of the neural tissue. The main challenge in MB culture thus consists in the integration of the vascular system, and also in increasing the speed of ageing process in vitro for the study of neurodegenerative diseases. In the long term, the prospect of automating the culture of MBs would allow the use of the system for cytotoxicity testing and/or high throughput screening for the discovery of new drugs for AD

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Leleu, Ambre. "Les organoïdes cérébraux : nouvelle plateforme pour la modélisation de pathologies neurodéveloppementales et neurodégénératives". Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL110.

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Les désordres du système nerveux central sont des pathologies qui peuvent se développer dès le neurodéveloppement du fœtus jusqu'à la mort de l'individu. La capacité d'évaluer la façon dont les cellules humaines reprogrammées (iPSCs) peuvent se développer et s'autoorganiser en trois dimensions en se transformant en organoïdes cérébraux a le potentiel de révolutionner notre approche à la fois de la recherche scientifique fondamentale et du traitement des maladies neurologiques humaines qui s'avèrent désormais comme la première cause de morbidité mondiale Nous avons exploré ce potentiel pour modéliser deux de ces pathologies : le syndrome MARCH, un syndrome neurodéveloppemental caractérisé par une hydranencéphalie, et la maladie d'Alzheimer, pathologie neurodégénérative. Nous décrivons la mise en place de ces modèles pathologiques ainsi que leurs avantages pour reproduire les symptômes physio-pathologiques associés, tout en soulignant les limites inhérentes à l'utilisation de cellules souches pluripotentes pour modéliser ces pathologies complexes
Central nervous system disorders are pathologies that can develop from fetal neurodevelopment through to individual death. The ability to assess how reprogrammed human cells (iPSCs) can develop and self-organize in three dimensions into brain organoids has the potential to revolutionize our approach to both basic scientific research and the treatment of human neurological diseases, now emerging as the leading cause of overall disease burden in the world. We have explored this potential to model two of these pathologies: MARCH syndrome, a neurodevelopmental syndrome characterized by hydranencephaly, and Alzheimer's disease, a neurodegenerative pathology. We describe the set-up of these pathological models and their advantages in reproducing the associated physio- pathological symptoms, while highlighting the inherent limitations of using pluripotent stem cells to model these complex pathologies

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Eilers, Smith Olivia. "Dérivation de cellules souches pluripotentes induites autologues à partir du clonage somatique équin". Thèse, 2013. http://hdl.handle.net/1866/11564.

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Resumen

Le recours aux cellules souches pour améliorer la réparation et guérison des blessures et maladies musculosquelettiques chez le cheval est de plus en plus fréquent. Les développements récents dans la reprogrammation cellulaire ont permis le développement de nouvelles sources de cellules souches pour ces thérapies régénératives. Des cellules souches pluripotentes induites (iPS) autologues peuvent être dérivées de cellules adultes par la reprogrammation directe à travers l'expression induite des gènes de pluripotence. Le clonage par transfert nucléaire (SCNT) suivi de la dérivation de cellules souches embryonnaires (ES) permet la reprogrammation indirecte des cellules adultes. Cependant, l’efficacité de ces deux méthodes pour la dérivation de cellules pluripotentes génétiquement stables est faible. Nous avons donc combiné les techniques SCNT et iPS dans le but de développer un protocole efficace de dérivation de cellules iPS autologues à partir de fibroblastes de la peau équine. Quatre facteurs de reprogrammation ont été introduits dans les cellules fibroblastes de fœtus clonés (ntFF) ainsi que les cellules ES provenant d’embryons clonés (ntES) pour induire leur reprogrammation en cellules iPS autologues. Les cellules ntFF-iPS et ntES-iPS ont des capacités prolifératives avancées et expriment des marqueurs de pluripotence importants. Par contre, les cellules ntES ont une efficacité de reprogrammation significativement supérieure aux cellules nt-FF et forment des colonies trois fois plus rapidement. Contrairement aux cellules ntES, les cellules ntES-iPS démontrent une augmentation de l’expression des marqueurs de pluripotence et survivent à la culture cellulaire prolongée. Les résultats présentés dans ce mémoire attestent que l’utilisation de la reprogrammation secondaire de cellules FF et ES clonées permet la production de cellules souches pluripotentes autologues stables chez le cheval.
For veterinarians, regenerative medicine in horses has focused mainly in the use of stem cells for arthritis, tendon and ligament repair, indicating a need for treating musculoskeletal injuries. The recent developments in cell reprogramming have paved the way for alternative cell sources for stem cell therapies. Autologous pluripotent stem cell lines can be derived from adult cells either by direct reprogramming through induced expression of pluripotency genes (iPS) or indirectly by reprogramming through somatic cell nuclear transfer (SCNT) followed by the derivation of embryonic stem cells (ESC). However, outcome efficiencies of SCNT and iPS protocols are invariably low, indicating that alone neither of these reprogramming routes is sufficient for deriving genetically and epigenetically stable pluripotent stem cells. We hereby report on the production of autologous equine iPS cells by combining SCNT and iPS reprogramming protocols. Adult skin fibroblasts were used for SCNT, and the resulting cloned embryos were either used to obtain cloned fetal fibroblast cells (ntFF), or used for ESC culture (ntES). Cells were then transfected with reprogramming factors to derive autologous iPS cells. Both ntFF-iPS and ntES-iPS cells are capable of extensive proliferation and express important pluripotency factors. However, ntES reprogramming efficiency is significantly higher than ntFF cells, with ntES-iPS colonies forming three times faster. Additionally, ntES-iPS cells showed improved pluripotency marker expression when compared with ntES cells. The results presented in this memoir indicate that stable equine iPS cell lines may be readily obtained from secondary reprogramming of cloned ntFF and ntES cells, opening novel avenues for developing autologous pluripotent stem cell therapies.

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Désaulniers-Langevin, Cynthia. "Caractérisation de fibroblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites". Thèse, 2018. http://hdl.handle.net/1866/22151.

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Tesis sobre el tema "Cellules souche pluripotente induite IPSC"

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