Tesis sobre el tema "CaVβ1"

L’atrophie du muscle squelettique résulte d’une dégradation protéique importante qui entraîne à terme une perte de la masse et de la fonction musculaire. Cependant, le muscle est capable de mettre en place une réponse moléculaire qui tend à limiter la perte de la masse musculaire. Ces mécanismes sont aujourd’hui très peu décrits et les facteurs mis en jeu demeurent encore mal connus. Un des composants de cette réponse compensatoire a tout de même été identifié chez la souris. Il s’agit du facteur GDF5 (Growth Differentiation Factor 5), un membre de la famille des BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) qui joue un rôle déterminant dans le maintien musculaire à la suite d’une dénervation. Néanmoins, la molécule qui initie et déclenche cette réponse reste à ce jour inconnue. Nous avons émis l’hypothèse que cette molécule pourrait être une protéine musculaire sensible à l’activité électrique. Nous nous sommes donc focalisés sur la protéine Cavβ1, qui est impliquée dans le couplage excitation-contraction et qui joue un rôle crucial dans l’activité « senseur de l’activité électrique » du DHPR, un canal calcique dépendant du voltage. Notre étude a révélé l'existence d'une nouvelle isoforme embryonnaire de Cavβ1 (Cavβ1-E) dans le muscle adulte dont l’expression augmente après la dénervation. Cavβ1-E limite l'atrophie musculaire en déclenchant l’activation génique du GDF5 dans le muscle dénervé. Puisque Cavβ1-E joue un rôle clé dans le maintien de la masse musculaire, nous nous sommes intéressés à cette protéine dans un contexte de perte de la masse musculaire liée au vieillissement. Nous avons mis en évidence une diminution de l’expression de Cavβ1-E dans le muscle âgé ainsi qu’une altération de l’axe Cavβ1-E/GDF5 en réponse à la dénervation. Ces données suggèrent que ces deux protéines sont essentielles dans le maintien de la masse musculaire au cours du vieillissement. En effet, nos expériences montrent que la surexpression de Cavβ1-E ou de GDF5 dans le muscle âgé permet de contrecarrer la perte musculaire. Nous avons également découvert l’homologue humain de Cavβ1-E (hCavβ1-E) et nos données mettent en évidence une corrélation positive entre l'expression de hCavβ1-E dans le muscle humain et la masse musculaire des sujets. Ces résultats suggèrent que des stratégies thérapeutiques visant à augmenter l’expression de Cavβ1-E ou de GDF5 dans le muscle âgé pourraient être envisagées pour lutter contre la perte de masse musculaire liée à l’âge
Skeletal muscle atrophy caused by disuse, nerve damage or other diseases are characterized by an increased protein breakdown leading to the progressive loss of muscle mass and function. However, it has been shown that skeletal muscle is able to activate a compensatory response in order to limit excessive muscle wasting. These compensatory mechanisms are still poorly described and the factors involved are not fully understood. To date, an important component of the compensatory response has been identified in mice : GDF5 (Growth Differenciation Factor 5), a member of the BMP (Bone Morphogenetic Protein) family, playing a critical role in muscle maintenance after a nerve damage. However, the first trigger of this molecular response remains unknown. We have hypothesized that this player could be a protein sensitive to electrical activity in skeletal muscle. We therefore focused our study on Cavβ1 protein, a regulatory subunit of the DHPR, a calcium channel described as essential in excitationcontraction coupling in skeletal muscle. Our study revealed the existence of a novel embryonic isoform of Cavβ1 (Cavβ1-E) in adult skeletal muscle, which expression increases after denervation. We discovered that Cavβ1-E stimulates GDF5 gene expression in skeletal muscle to counteract atrophy induced by nerve damage. Since we demonstrated that Cavβ1-E plays a key role in muscle maintenance, we studied its function during age-related muscle wasting. We observed that aged mouse muscle expresses lower quantity of Cavβ1-E and displays an altered Cavβ1-E/GDF5-dependent response to denervation compared to young muscle. These evidences suggested the involvement of this axis in skeletal muscle mass and function decline during ageing. Indeed, we found that overexpression of Cavβ1-E or GDF5 counteracts muscle mass loss and prevents the decrease of force generation in aged muscles. We also identified the human analogous of Cavβ1-E (hCavβ1-E) and our data showed a positive correlation between hCavβ1-E expression in human muscle and subject’s lean mass. These results suggest that strategies targeting Cavβ1-E or GDF5 could contribute to prevent agerelated skeletal muscle wasting

Quatre protéines CaVβ (CaVβ1 à CaVβ4) sont connues comme des sous-unités régulatrices des canaux Ca2+ dépendants du voltage (Voltage-gated Ca2+ Channels, VGCC), chacune ayant des profils d'expression spécifiques selon leur fonction. Bien qu'elles soient principalement reconnues pour leur rôle dans la régulation des VGCC, les protéines CaVβ peuvent également agir indépendamment de ces canaux, en tant que régulateurs de l'expression génique. Parmi ces protéines, CaVβ1 est exprimée dans le muscle squelettique sous différentes isoformes. L'isoforme adulte constitutive, CaVβ1D, est localisée au niveau du sarcolemme et plus précisément à la triade, où elle joue un rôle crucial dans la régulation de CaV1 et ainsi du mécanisme de Couplage Excitation-Contraction (CEC), essentiel à la contraction musculaire. Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur les isoformes embryonnaires/périnatales de CaVβ1, moins étudiées, y compris la CaVβ1E précédemment décrite. Nous avons étudié leurs rôles dans les systèmes neuromusculaire et musculaire. En effet, la protéine CaVβ1 s'est révélée essentielle au développement correct de la Jonction NeuroMusculaire (JNM), mais l'implication spécifique de ses isoformes y reste inconnue. Notre étude a donc évalué le rôle des isoformes CaVβ1 à différents stades de la formation et de la maturation/maintien de la JNM. Parallèlement, étant donné la dérégulation de CaVβ1 dans la dystrophie myotonique de type 1 (DM1), nous avons exploré son rôle fonctionnel dans ce contexte pathologique. Nous avons tout d'abord identifié CaVβ1A comme une isoforme exprimée pendant l'embryogenèse et les stades périnataux. Nos résultats ont révélé que l'expression des isoformes CaVβ1 est régulée par l'activation différentielle des promoteurs au cours du développement : un promoteur1 dans l'exon 1 contrôle l'expression de CaVβ1A/E, tandis qu'un promoteur2 dans l'exon 2B contrôle l'expression de CaVβ1D. Il est intéressant de noter qu'un endommagement du nerf déclenche une réactivation du promoteur1, conduisant à la réexpression des transcrits de CaVβ1A/E.De plus, nous avons découvert que les isoformes embryonnaires/périnatales de CaVβ1 sont essentielles pour la pré-empreinte in vitro des myotubes et que leur expression postnatale influence la maturation/maintien de la JNM. Dans le contexte pathologique de la DM1, nous avons observé une augmentation de l'expression de CaVβ1A/E, qui semble atténuer la myotonie, un symptôme caractéristique de cette pathologie. De plus, nous avons trouvé que la modulation de leur expression est liée aux protéines MBNL, centrales dans la physiopathologie de la DM1. En conclusion, ce travail de thèse a permis de clarifier les connaissances sur les différentes isoformes de CaVβ1 dans le muscle squelettique et d'apporter de nouveaux éléments sur leur rôle dans deux contextes indépendants : le développement de la JNM et de la physiopathologie de la DM1. Comprendre la régulation des isoformes protéiques de CaVβ1 dans le muscle squelettique est essentiel pour déchiffrer les mécanismes de l'homéostasie musculaire et potentiellement identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour faire face aux pathologies musculaires
Four CaVβ proteins (CaVβ1 to CaVβ4) are described as regulatory subunit of Voltage-gated Ca2+ channel (VGCC), each exhibiting specific expression pattern in excitable cells based on their function. While primarily recognized for their role in VGCC regulation, CaVβ proteins also function independently of channels, acting as regulators of gene expression. Among these, CaVβ1 is expressed in skeletal muscle as different isoforms. The adult constitutive isoform, CaVβ1D, is located at the sarcolemma and more specifically at the triad, where it plays a crucial role in regulating CaV1 to control Excitation-Contraction Coupling (ECC) mechanism, essential for muscle contraction.In this thesis, we further explored the less studied CaVβ1 isoforms, with a particular focus on embryonic/perinatal variants, including the previously described CaVβ1E. We investigated their roles in the neuromuscular and muscular systems. Indeed, CaVβ1 proteins have been showed as essential for NeuroMuscular Junction (NMJ) development, though the involvement of specific isoform remains unclear. Our investigation assessed the role of CaVβ1 isoforms at different stages of NMJ formation and maturation/maintenance. Additionally, given the deregulation of CaVβ1 in Myotonic Dystrophy Type 1 (DM1), we explored its functional role in this muscular pathological context.First, we identified CaVβ1A as another isoform expressed during embryogenesis and perinatal stages. Our findings revealed that CaVβ1 isoforms expressions are regulated by the differential activation of promoters during development: a promoter1 in exon 1 drives CaVβ1A/E expressions, while a promoter2 in exon 2B controls CaVβ1D expression. Interestingly, nerve damage in adult muscle triggers a shift toward the promoter1 activation and leading to the re-expression of CaVβ1A/E transcripts. Furthermore, we found that CaVβ1 embryonic/perinatal isoforms are critical for proper in vitro pre-patterning of myotubes and that their postnatal expressions influences NMJ maturation/maintenance. In the pathological context of DM1, we observed the increased expression of CaVβ1A/E, which appears to mitigate myotonia symptoms. In addition, we found that the modulation of their expression is linked with MBNL proteins, which are central in the pathophysiology of DM1. In conclusion, this thesis work has clarified knowledge of the various CaVβ1 isoforms in skeletal muscle and provides new insights into their role in two independent contexts of NMJ development and DM1 pathophysiology. Understanding CaVβ1 protein regulation in skeletal muscle is essential to decipher muscle homeostasis mechanisms and potentially identify new therapeutic targets to face muscular disorders

Les canaux calciques dépendants du voltage sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la contraction musculaire, la libération des neurotransmetteurs et la régulation de l’expression génique. Ces canaux sont constitués d’une sous-unité canalaire α1, qui permet l’entrée des ions calciques dans le milieu intracellulaire, généralement associée à différentes sous-unités auxiliaires (α2δ, γ et β) qui régulent les fonctions du canal. La sous-unité auxiliaire β (Cavβ) joue un rôle capital dans l’adressage membranaire du canal et dans la régulation de ses propriétés biophysiques. Des études récentes décrivent cette sous-unité comme une protéine multifonctionnelle capable d’accomplir des fonctions indépendantes du canal. Quatre différentes isoformes de Cavβ sont codées par 4 gènes différents et caractérisées par des similarités structurales mais une distribution tissulaire différente. L’isoforme Cavβ4 est principalement exprimée dans le cerveau et le cervelet jouant ainsi un rôle important dans la régulation des courants calciques neuronaux. L’importance des fonctions neuronales de Cavβ4 a été soulignée par le fait que la mutation R482X de Cavβ4 a été associée à une forme d’épilepsie humaine.Mon travail de thèse a porté sur l’étude du rôle de Cavβ4 dans le contrôle de la division cellulaire et son implication dans la voie de signalisation Wnt. J’ai également étudié l’influence de la mutation R482X sur cette nouvelle fonction de Cavβ4.Dans ce but, des cellules CHO exprimant de manière stable Cavβ4 ou son mutant épileptique (Cavβ1-481) ont été générées et la localisation subcellulaire des deux protéines ainsi que leur implication dans la prolifération et la progression du cycle cellulaire ont été étudiées. Dans ces cellules, Cavβ4 subit une translocation nucléaire et se retrouve préférentiellement dans les nucléoles. Néanmoins, la délétion de 38 acides aminés de l’extrémité C-terminale de Cavβ4, correspondante à la mutation R482X, empêche sa translocation nucléolaire. L’expression de Cavβ4 réduit considérablement la capacité proliférative des cellules. Cette réduction semble être dépendante de la localisation nucléaire, voir nucléolaire de Cavβ4, parce que le mutant Cavβ1-481 n’induit aucune inhibition de la prolifération. D’un autre côté, l’expression de chacune de ces protéines entraine une modification du cycle cellulaire et l’altération de l’expression de certains gènes liés au cycle.Étant donné que la voie de signalisation Wnt/β-caténine est connue comme l'une des voies les plus importantes contrôlant la prolifération cellulaire, j’ai étudié l'effet de l’expression de Cavβ4 sur cette voie. J’ai ainsi pu montrer que Cavβ4, mais pas Cavβ1-481, réduit considérablement la transcription des gènes cibles de la β-caténine et ralenti la prolifération cellulaire. Cette inhibition est due à une interaction directe entre Cavβ4 et TCF4 qui empêche l’interaction de TCF4 avec la β-caténine et prévient la transcription des gènes cibles.L’ensemble de ces résultats suggèrent que Cavβ4 peut jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération au cours du développement, en particulier dans les cellules neuronales
The voltage gated calcium channels are involved in many cellular processes such as muscle contraction, neurotransmitter release and regulation of gene expression. These channels consist of the pore-forming subunit α1 usually associated with different regulatory subunits: α2δ, β and γ. The auxiliary subunit β (Cavβ) plays a key role in regulating membrane trafficking of the channel and its biophysical properties. Recent studies describe this subunit as a multifunctional protein that can also perform calcium channel-independent functions such as gene regulation. Four different isoforms of Cavβ are encoded by 4 different genes and are characterized by structural similarities but different tissue distribution. Cavβ4 isoform is mainly expressed in the brain and cerebellum, thus, playing an important role in the regulation of neuronal calcium currents. The importance of Cavβ4 neuronal functions has been highlighted by its R482X mutation that was associated to a form of human epilepsy.The aim of my thesis was to study the role of Cavβ4 in the control of cell division and its involvement in the Wnt signaling pathway. I also studied the influence of the R482X mutation on this new function of Cavβ4.To this end, CHO cells stably expressing Cavβ4, or its epileptic mutant (Cavβ1-481), were generated and the subcellular localization of the two proteins and their implication in the proliferation and cell cycle progression were studied. In these cells, Cavβ4 undergoes nuclear translocation and is found preferentially in the nucleoli. However, the deletion of 38 amino acids in the C-terminus domain of Cavβ4, corresponding to the R482X mutation, prevents its nucleolar translocation. In addition, the expression of Cavβ4 significantly reduces the proliferative rate of the cells. This reduction seems to be linked to Cavβ4 nuclear localization because the epileptic mutant is unable to slow down cell proliferation. On the other hand, the expression of each of these proteins is able to deregulate cell cycle progression and to alter the expression of many genes linked to the cycle.Since the Wnt/β-catenin pathway is known as one of the most important pathways controlling cell proliferation, I studied the effect of Cavβ4 expression on this signaling pathway. Indeed, Cavβ4, but not Cavβ1-481, substantially reduces the transcription of β-catenin-dependant genes and therefore slows down cell proliferation. This inhibition is due to a direct interaction between Cavβ4 and TCF4 that prevents the interaction of TCF4 with β-catenin, and thereafter negatively regulates the transcription of targeted genes.These findings suggest that Cavβ4 can play a role in the control of proliferation during development, particularly in neuronal cells

Les canaux calciques neuronaux activés par la dépolarisation membranaire contrôlent diverses fonctions cellulaires telles que l’excitabilité neuronale et la transmission synaptique. Les canaux calciques sont formés d’une sous-unité principale Cav associée à 3 sous-unités régulatrices (b, a2d et g). La sous-unité auxiliaire Cavb joue un rôle crucial dans la régulation des propriétés biophysiques du canal et dans l’adressage membranaire de la sous-unité Cav. Chez l’homme, un isoforme de cette sous-unité Cavb4 est l’objet de mutations qui conduisent à des phénotypes épileptiques. L’une de ces mutations est une délétion d’une partie du domaine carboxy-terminal de Cavb4 (R482X). Les efforts effectués pour comprendre les mécanismes cellulaires du phénotype épileptique des patients concernés n’ont pas encore aboutit à des explications probantes. Ainsi, le phénotype neurologique ne semble pas lié à une altération de l’activité du canal, mais plus vraisemblablement à des fonctions cellulaires inconnues de Cavb4. Ma thèse porte sur la caractérisation des déterminants moléculaires et cellulaires du mutant humain R482X impliqué dans le phénotype neurologique des patients qui portent la mutation. Etant donné que l’épilepsie implique essentiellement les neurones du lobe temporal, je me suis particulièrement intéressée à l’étude des fonctions et de la localisation de Cavb4 dans les neurones d’hippocampe. Dans ces cellules, une translocation de la sous-unité Cavb4 du cytoplasme vers le noyau est notée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l’intégrité structurale de la sous-unité Cavb4, elle est perdue dans le cas de la mutation R482X. La perte du fragment carboxy-terminal conduit à une altération de la structure de Cavb4 suite à la rupture de l’interaction intramoléculaire entre les deux domaines conservés, au sein de la protéine native. Dans les neurones d’hippocampe, cette déstructuration empêche la localisation nucléaire de la protéine mutante. Etant donné que la sous-unité Cavb4 ne possède aucun signal d’adressage nucléaire, la technique du double hybride a été réalisée afin de déterminer les partenaires protéiques capables d’adresser la sous-unité Cavb4 vers le noyau. Parmi les trois protéines criblées qui interagissent spécifiquement avec Cavb4 et pas avec le mutant, une est capable d’adresser Cavb4 dans le noyau alors que l’autre la retient dans le cytoplasme. Afin d’étudier l’effet de la localisation nucléaire de la sousunité Cavb4 sur la régulation génique, une étude transcriptomique a été réalisée. La sousunité Cavb4 montre un effet répressif sur l’expression génique. Cette répression est inversée dans le cas du mutant incapable de s’adresser vers le noyau des neurones. Parmi ces gènes, plusieurs sont des candidats potentiels pour expliquer l’altération d’activités neuronaux impliquée dans le phénotype épileptique. Enfin, l’absence de l’adressage nucléaire de la sous-unité Cavb4 mutante (R482X) due à la déformation de sa structure native, altèrerait la régulation transcriptionnelle des gènes, qui serait à la base du phénotype épileptique des patients qui portent cette mutation
High voltage-activated (HVA) calcium channels are hetero-multimeric complexes that translate electrical signals into Ca2+ influx, a secondary messenger that mediates essential neuronal processes such as neurotransmitter release and neuronal excitability. HVA calcium channels are composed of four subunits: Cavα1 subunit, the pore forming of the channel and the auxiliary subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. The Cavß subunit has focused much of the interest owing to its regulatory functions within the complex. By masking an endoplasmic retention signal on the Cavα1 subunit, Cavß subunit targets the mature calcium channel to the plasma membrane and contributes to the increase in number of functional calcium currents. In humans, pathologic mutations have been identified in CACNAB4 that produce epileptic phenotype. One of these mutations is a premature termination mutation (R482X). Mutations produced minor biophysical effects on calcium channels in spite of their preponderant pathological phenotypes, which tend to indicate that cellular functions other than channel regulation may be responsible for the predominant neurological effects of the R482X mutation. My thesis focuses on the molecular and cellular determinants of the Cavb4 mutant (R482X) inducing the human neurological phenotype. Studies were realized in hippocampal neurons which are particularly implicated in epilepsy. A translocation of endogenous Cavß4, from the cytoplasm to the nucleus is observed during neuronal differentiation and synaptogenesis. This translocation is conditioned by the native structural conformation of Cavß4 subunit; carboxy-terminal deletion inhibits the nuclear localization of the mutant. The 38 amino acids deletion disturbs the structure of Cavß4 by altering the intramolecular interaction between the two conserved domains in Cavß4 subunit. In hippocampal neurons, this structural distortion prevents the nuclear localization of the mutant Cavß4. In order to identify the impact of the nuclear localization of the Cavß4 subunit on transcriptional regulation, a study on gene expression generated by microarray is realized. Profiles of gene expression revealed a differential gene regulation between wild-type and mutant Cavß4. Cavß4 subunit seems to have a repressive action on gene regulation; on the other hand, the lack of nuclear localization of the mutant reverses this repressive impact. Among the specific transcripts differentially expressed, some genes are primordial keys in neuronal activities, thus alterations in the regulation of these genes could be involved in neuronal diseases. Since no NLS consensus sequence has been identified on Cavß4, two-hybrid assay was realized in order to identify partners responsible of the Cavß4 nuclear targeting. A specific protein holding a NLS sequence interacts specifically with Cavß4 subunit, but not with the mutant, and is able to target Cavß4 to the nucleus. The other protein which specifically interacts with the WT Cavß4 sequesters Cavß4 in the cytoplasm. Finally, the lack in nuclear targeting of the R482X mutant due to the structural distortion appears to alter the transcriptional gene regulation which is maybe implicated in the epileptic phenotype of patients holding the mutation

Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une cible rationnelle pour les traitements anticancéreux des carcinomes épidermoïdes (CE). Cependant, seule une petite fraction de patients présente des avantages cliniques. Afin de comprendre l’échec de ces thérapies, j’ai étudié la voie de signalisation de l’EGFR en présence de fibroblastes associés aux carcinomes (FAC), principales cellules non malignes au sein des tumeurs. J'ai démontré que dans les CE, la voie de signalisation de l’EGFR coopère avec la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) induite par les FAC. Par la suite, j'ai cherché à résoudre les voies moléculaires qui sous-tendent cette coopération afin d'identifier de nouvelles cibles pharmaceutiques. Grâce à un criblage d'inhibiteurs pharmacologiques, j’ai identifié le vérapamil et le diltiazem, bloqueurs des canaux calcique CaV1, comme étant de puissants inhibiteurs de l'invasion des CE. Au niveau moléculaire, j'ai révélé que la rigidité de la MEC dérivée de la tumeur et la signalisation de l'EGFR déclenchent l'augmentation du calcium intracellulaire par le canal CaV1.1 dans les CE. Le blocage de l'activité de ces canaux inhibe l’invasion et la prolifération des cellules tumorale in vitro. Plus important encore, je démontre une forte réduction du développement des tumeurs dans deux modèles in vivo, à la fois dans un modèle de xénogreffe de cellules dérivées de patient atteint de carcinome de la tête et du cou, et dans un modèle CE cutané chez la souris. Par conséquent, je suggère une réaffectation du vérapamil et du diltiazem en tant qu’agents anticancéreux
Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a rational target for squamous cell carcinoma (SCC) anticancer therapies, nevertheless; only a subset of patients shows clinical benefits. I demonstrated a cooperation between EGFR signaling and extracellular matrix (ECM) stiffness that could explain this phenomenon. I sought to resolve the molecular pathway underlying this cooperation in SCC proliferation and expansion in order to identify new pharmaceutical targets. Screening of pharmacological inhibitors, in an in vitro 3-D assay, identified verapamil and diltiazem, FDA approved L-type calcium channels inhibitors, as potent blockers of SCC invasion. Mechanistically, I revealed that tumor-derived ECM stiffness and EGFR signaling trigger increased of intracellular calcium through the L-type CaV1.1 channel in SCC. Blocking L-type calcium channels activity resulted in reduced SCC cells invasion and proliferation in vitro. More importantly, I also demonstrate a strong reduction in tumor development in two in vivo models, both head and neck patient derived xenograft and skin SCC mice model. Consequently, I suggest a repurpose of verapamil and diltiazem to anti-cancer agents

L'asthme est une maladie pulmonaire qui touche environ 10% de la population. Les lymphocytes T helper de type 2 jouent une rôle important dans la physiopathologie de l'asthme en produisant de l'interleukine 4,5,13. Mon équipe a montré dans une étude précédente que les cellules Th2 mais pas Th1 de souris exprimaient des canaux CaV1. Un oligonucléotide antisens (CaV1AS) inhibe la réponse calcique et la production de cytokines Th2 sous stimulation par le TCR sans toucher les cellules Th1 chez la souris. De plus, CaV1AS prévient l'asthme allergique expérimental. Durant ma thèse, j'ai montré que les cellules T au repos expriment CaV1. 4. Les isoformes CaV1. 2 et CaV1. 3 prédominent dans les cellules Th2 et leur expression est perdue dans les Th1. Un inhibiteur pharmacologique des canaux CaV1, un CaV1AS et CaVbAS diminue l'expression protéique de CaV1. 2 suggérant que CaVb est requis pour la stabilité des lymphocytes Th2. Finalement, l'inhibition de la PKCa/b diminue la réponse calcique et la production de cytokines par les lymphocytes Th2 mais pas Th1 suggérant que la PKC pourrait contribuer à la régulation de CaV1 dans les lymphocytes Th2. Ces résultats suggèrent que la PKC pourrait contribuer à la régulation de CaV1 dans les lymphocytes Th2. Ces résultats suggèrent que l'inhibition des canaux CaV1. 2 pourrait être bénéfique dans les maladies allergiques
Asthma is an allergic pulmonary disease which affects around 10% of the population. Allergen-specific type 2 T helper lymphocytes Th2 have a crucial role in the asthma physiopathology by producing interleukin IL4,5,13. Previously, my team reported that mouse Th2 but not Th1 cells express voltage gated calcium CaV1 channels. CaV1 channel specific antisense oligonucleotide CaV1AS inhibit calcium response and Th2 cytokine production (IL4,5,13) upon TCR stimulation without any effect on Th1 cells in mice. In addition, CaV1AS prevent experimental allergic asthma. During my PhD, I showed the CaV1. 4 expression in human resting cells. Conversely, CaV1. 2 and CaV1. 3 predominated in Th2 cells and were lost in Th1 cells. CaV1 channel inhibitors, CaV1. 2 AS and CaVbAS decreased calcium signaling and cytokine production in Th2 but not in Th1 cells. Moreover, CaVbAS decrease the CaV1. 2 protein suggesting that CaVb is required for CaV1. 2 stability in Th2 cells. Finally selective PKCa/b inhibition decreased calcium response and cytokine production by Th2 but not Th1 cells suggesting that PKC may contribute to CaV1 regulation in Th2 cells. These results suggest that the inhibition of CaV1. 2 channels could be beneficial in allergic diseases while sparing Th1 cell responses

Les canaux calciques incluent notamment les canaux dépendants des stocks (ORAI) et dépendants du voltage (Cav) qui sont considérés de première importance pour l'entrée du calcium dans les cellules non-excitables et excitables, respectivement. Les canaux calciques voltage-dépendants tels que Cav1 sont essentiels pour le fonctionnement des cellules excitables, notamment la transmission neuronale, la contraction musculaire ou la sécrétion hormonale. Cependant, de nombreuses études montrent désormais que les canaux Cav1 sont aussi exprimés dans des cellules non excitables, et sont importants pour les fonctions effectrices des lymphocytes T. Les canaux Cav1 sont constitués de la sous-unité a1 formant le pore ionique et des sous-unités auxiliaires ß et a2δ. Ces sous-unités sont importantes pour l'activité électrique du canal, mais aussi pour sa régulation, sa stabilité et son expression à la membrane plasmique dans les cellules excitables. Les travaux de notre groupe ont clairement identifié les sous-unités a1 de Cav1.2 et Cav1.3 comme essentielles pour la fonction des lymphocytes Th2, une sous-population de cellules T responsable des maladies allergiques. L'inhibition pharmacologique et génétique de ces canaux réduit de manière significative l'expression des cytokines dans les lymphocytes Th2 chez la souris, mais pas dans les Th1. Le but de mon travail a été de comprendre si les sous-unités auxiliaires des canaux Cav, et plus particulièrement la sous-unité ß, sont nécessaires au fonctionnement des canaux Cav1 dans les lymphocytes Th2 qui ne sont pas des cellules excitables. Nous avons utilisé des oligonucléotides antisens ciblant toutes les sous-unités ß afin de réduire l'expression de ß1 et ß3, les deux sous-unités exprimées dans des lymphocytes Th2. La transfection de Th2 murines et humaines avec ces oligonucléotides diminue l'influx de calcium dépendant du TCR et l'expression des cytokines. En outre, l'effet des oligonucléotides antisens semble résulter de la perte d'expression de la sous-unité a1 selon un mécanisme similaire à celui décrit dans les neurones. De plus, L'utilisation de shRNA spécifiques de ß1 et ß3 dans les Th2 de souris montre un rôle essentiel la sous-unité ß1 dans la réponse fonctionnelle des lymphocytes Th2. Enfin, les antisens Cavß diminuent l'inflammation dans un modèle d'asthme allergique chez la souris, de même qu'un inhibiteur pharmacologique des sous-unités a2δ. Ce travail a donc permis d'identifier les sous-unités auxiliaires des canaux Cav comme de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cadre des maladies allergiques telles que l'asthme
Calcium channels include store-operated (ORAI) and voltage-gated (Cav) channels that are considered to be important for calcium entry in non-excitable and excitable cells, respectively. Voltage-gated calcium channels such as Cav1 are essential for excitable cell function, including neuronal transmission, muscle contraction or hormone secretion. However, numerous studies show that Cav1 channels are expressed in non-excitable cells as well, and are important for T cell effector functions. Cav1 channels are composed of the a1 subunit forming the ion pore and auxiliary subunits ß and a2δ. These subunits are important for the electric activity of the channel but also for its regulation, its stability and its expression at the plasma membrane in excitable cells. Our group clearly identified the a1 subunit of Cav1.2 and Cav1.3 channels as essential for the function of Th2 lymphocytes, a T cell subset responsible for allergic diseases. Pharmacological and genetic inhibition of these channels significantly reduces the expression of cytokines in mouse Th2 cells, but not in Th1 cells. The goal of my work was to understand whether the auxiliary subunits of Cav channels, particularly the ß subunit, are necessary for the function of Cav1 channels in Th2 lymphocytes that are not excitable cells. We used antisense oligonucleotides targeting all ß subunits to reduce the expression of ß1 and ß3, the two subunits expressed in Th2 lymphocytes. Transfection of murine and human Th2 with these oligonucleotides decreases TCR-dependent calcium influx and cytokine expression. In addition, the effect of the Cavß antisense oligonucleotides seems to result from the loss of expression of the a1 subunit, as similarly described in neurons. In addition, the use of shRNA specific to ß1 and ß3 in mouse Th2 shows a critical role the ß1 subunit in the functional response of Th2 lymphocytes. Finally, the Cavß antisense oligonucleotides reduce the airway inflammation in an allergic asthma model in mice, as well as a pharmacological inhibitor of a2δ subunits. This work has identified auxiliary subunits of Cav channels as new potential therapeutic targets in allergic diseases such as asthma

Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une cible rationnelle pour les traitements anticancéreux des carcinomes épidermoïdes (CE). Cependant, seule une petite fraction de patients présente des avantages cliniques. Afin de comprendre l’échec de ces thérapies, j’ai étudié la voie de signalisation de l’EGFR en présence de fibroblastes associés aux carcinomes (FAC), principales cellules non malignes au sein des tumeurs. J'ai démontré que dans les CE, la voie de signalisation de l’EGFR coopère avec la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) induite par les FAC. Par la suite, j'ai cherché à résoudre les voies moléculaires qui sous-tendent cette coopération afin d'identifier de nouvelles cibles pharmaceutiques. Grâce à un criblage d'inhibiteurs pharmacologiques, j’ai identifié le vérapamil et le diltiazem, bloqueurs des canaux calcique CaV1, comme étant de puissants inhibiteurs de l'invasion des CE. Au niveau moléculaire, j'ai révélé que la rigidité de la MEC dérivée de la tumeur et la signalisation de l'EGFR déclenchent l'augmentation du calcium intracellulaire par le canal CaV1.1 dans les CE. Le blocage de l'activité de ces canaux inhibe l’invasion et la prolifération des cellules tumorale in vitro. Plus important encore, je démontre une forte réduction du développement des tumeurs dans deux modèles in vivo, à la fois dans un modèle de xénogreffe de cellules dérivées de patient atteint de carcinome de la tête et du cou, et dans un modèle CE cutané chez la souris. Par conséquent, je suggère une réaffectation du vérapamil et du diltiazem en tant qu’agents anticancéreux
Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a rational target for squamous cell carcinoma (SCC) anticancer therapies, nevertheless; only a subset of patients shows clinical benefits. I demonstrated a cooperation between EGFR signaling and extracellular matrix (ECM) stiffness that could explain this phenomenon. I sought to resolve the molecular pathway underlying this cooperation in SCC proliferation and expansion in order to identify new pharmaceutical targets. Screening of pharmacological inhibitors, in an in vitro 3-D assay, identified verapamil and diltiazem, FDA approved L-type calcium channels inhibitors, as potent blockers of SCC invasion. Mechanistically, I revealed that tumor-derived ECM stiffness and EGFR signaling trigger increased of intracellular calcium through the L-type CaV1.1 channel in SCC. Blocking L-type calcium channels activity resulted in reduced SCC cells invasion and proliferation in vitro. More importantly, I also demonstrate a strong reduction in tumor development in two in vivo models, both head and neck patient derived xenograft and skin SCC mice model. Consequently, I suggest a repurpose of verapamil and diltiazem to anti-cancer agents

L'incidence des maladies allergiques ne cesse de croître dans les pays industrialisés. Si les lymphocytes Th2 sont essentiels à l'élimination des pathogènes extracellulaires, leur réponse exacerbée peut les transformer en chefs d'orchestre des réponses immunitaires allergiques. Nous montrons que les lymphocytes Th2, à la différence des lymphocytes Th1, expriment un profil particulier de canaux calciques Cav1 qui contrôlent l'influx de calcium dans la cellule et ainsi la production des interleukines 4, 5 et 13 après stimulation via le TCR. Nos résultats soulignent l'intérêt thérapeutique potentiel d'inhibiteurs de ces canaux dans le contrôle des maladies allergiques, puisqu'un antagoniste de ces canaux ou l'inhibition spécifique de leur expression prévient le développement de désordres immunopathologiques de type Th2 chez le rat et la souris, en particulier dans un modèle d'asthme allergique
The prevalence of asthma has risen drastically in the last two decades, with a worldwide impact on health care systems. T-helper (Th) lymphocytes orchestrate the immune response and are divided into two subsets, Th1 cells that produce IFN-g and Th2 cells which synthetize IL-4. Th2 lymphocytes play an important role in the pathogenesis of allergic asthma. We show that Th2 lymphocytes, unlike Th1 cells, express a unique profile of Cav1 calcium channels that control calcium influx and Th2 cytokine production upon TCR stimulation. Our results underline the therapeutic potential of Cav1 channel antagonists or specific inhibition of Cav1 expression by antisense oligonucleotides in Th2-dependent immunopathological disorders in mice and rats. Capitalizing on these unique attributes is important for drug development in allergic asthma

L'activation des LT induit une entrée de Ca2+ par les canaux CRAC/ORAI. Cette augmentation de la concentration calcique intracellulaire ([Ca2+]i) est nécessaire à l'expression de gènes tels que ceux codant pour les cytokines. Il existe des différences au niveau de la [Ca2+]i entre les sous-populations de LT suggérant que les composants de la signalisation calcique diffèrent entre les populations. Des récentes études ont montré que d'autres canaux pouvaient être impliqués dans la biologie des LT, notamment les canaux calciques CaV1. Ma thèse a consisté à étudier le rôle des canaux CaV1 dans le fonctionnement des LT. Nous avons montré que les isoformes CaV1. 2 et CaV1. 3 étaient exprimés par les Th2, une population produisant de l'IL-4 et impliquée dans l'asthme allergique. L'inhibition de l'expression de ces canaux par des oligonucléotides anti-sens (CaV1AS) a montré qu'ils permettaient l'augmentation de la [Ca2+]i et la production de cytokines. Les Th2 ayant un rôle central dans la physiopathologie de l'asthme, nous avons également testé l'effet de l'inhibition de ces canaux dans les Th2 dans un modèle d'asthme expérimental. Les Th2 transfectés avec CaV1AS ne permettaient plus le développement de l'asthme. De plus, l'administration des CaV1AS par voie aérienne prévenait le développement de l'inflammation et de l'hyperréactivité bronchique. D'autre part, nous avons montré que les Th2 humains exprimaient également les canaux CaV1. 2 et CaV1. 3 contrairement aux Th1, une population produisant de l'IFN-upsilon, responsables de l'élimination des pathogènes intracellulaires. Leur inhibition pharmacologique et par les AS ont révélé l'importance de ces canaux dans la signalisation calcique induite par l'engagement du TCR et la production de cytokines. Nous avons également démontré que la sous-unité bêta des canaux CaV1 était importante pour l'expression du canal et sa localisation à la membrane. De plus, il semblerait que le fonctionnement de CaV1 soit sous le contrôle de la PKC, puisqu'un inhibiteur pharmacologique réduit fortement l'entrée de Ca2+ après activation, et la production de cytokines associée. Nos travaux montrent qu'il existe une expression différentielle des canaux CaV1 entre les sous-populations de LT puisqu'ils sont présents et fonctionnels dans les Th2 et sont absents des Th1. De plus ces canaux s'avèrent être indispensables au fonctionnement des Th2
LT activation induce Ca2+ entry by CRAC channels. This increase in intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) is necessary for the expression of genes such as those encoding cytokines. There are differences in the [Ca2+]i between subsets of LT suggesting that calcium signaling components differ between populations. Recent studies have shown that other channels could be involved in the biology of LT, including CaV1 calcium channels. My thesis was to investigate the role of CaV1 channels in the biology of LT. We have shown that CaV1. 2 and CaV1. 3 isoforms were expressed by Th2. The inhibition of the expression of these channels by antisense oligonucleotides (CaV1AS) showed that they allowed the increase in [Ca2+]i and production of cytokines. Th2 having a central role in the pathophysiology of asthma, we also tested the effect of inhibition of these channels in a Th2 in a model of experimental asthma. Th2 transfected with CaV1AS no longer allowed the development of asthma. In addition, the administration of CaV1AS by intranasal route prevents the development of inflammation and bronchial hyperreactivity. On the other hand, we have shown that human Th2 also expressed CaV1. 2 and CaV1. 3 channels in contrast to Th1. Their pharmacological inhibition by AS revealed the importance of these channels in calcium signaling induced by TCR engagement and cytokine production. We also demonstrated that the beta subunit of CaV1 channels is important for the expression of the channel and its location at the plasma membrane. In addition, it appears that the function of CaV1 is under the control of PKC, since pharmacological inhibitor strongly reduced Ca2+ entry after activation and cytokine production associated. Our work shows that there is a differential expression of CaV1 channels between subsets of LT since they are present and functional in Th2. In addition, these channels appear to be essential to the functioning of Th2

The Rem, Rem2, Rad, and Gem/Kir GTPases, comprise a novel subfamily of the small Ras-related GTP-binding proteins known as the RGK GTPases, and have been shown to function as potent negative regulators of high voltage-activated (HVA) Ca2+ channels upon overexpression. HVA Ca2+ channels modulate Ca2+ influx in response to membrane depolarization to regulate a wide variety of cellular functions and they minimally consist of a pore-forming α1 subunit, an intracellular β subunit, and a transmembrane complex α2/δ subunit. While the mechanisms underlying RGK-mediated Ca2+ channel regulation remain poorly defined, it appears that both membrane localization and the binding of accessory Ca2+ channel β subunits (CaVβ) are required for suppression of Ca2+ channel currents. We identified a direct interaction between Rem and the L-type Cavα1 C-terminus (CCT), but not the CCT from CaV3.2 T-type channels. Deletion mapping studies suggest that the conserved CB-IQ domain is required for Rem:CCT association, a region known to contribute to both Ca2+-dependent channel inactivation and facilitation through interactions of Ca2+-bound calmodulin (CaM) with the proximal CCT. Furthermore, both Rem2 and Rad GTPases display similar patterns of CCT binding, suggesting that CCT represents a common binding partner for all RGK proteins. While previous studies have found that association of the Rem C-terminus with the plasma membrane is required for channel inhibition, it is not required for CaVβ- subunit binding. However, Rem:CCT association is well correlated with the plasma membrane localization of Rem and more importantly, Rem-mediated channel inhibition upon overexpression. Moreover, co-expression of the proximal CB-IQ containing region of CCT (residues 1507-1669) in HIT-T15 cells partially relieves Rem blockade of ionic current. Interestingly, Ca2+/CaM disrupts Rem:CCT association in vitro. Moreover, CaM overexpression partially relieves Rem-mediated L-type Ca2+ channel inhibition and Rem overexpression alters the kinetics of calcium-dependent inactivation. Together, these data suggest that the association of Rem with the CCT represents a crucial molecular determinant for Rem-mediated L-type Ca2+ channel regulation and provides new insights into this novel channel regulatory process. These studies also suggest that instead of acting as complete Ca2+ channel blockers, RGK proteins may function as endogenous regulators for the channel inactivation machinery.

Ce projet de recherche translationnelle sur les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) a permis d’identifier la cavéoline-1 (Cav1) comme un biomarqueur pronostique de l’évolution d’une tumeur primitive des VADS. En effet, une surexpression de cette protéine favorise une rechute locorégionale alors qu’un déficit de Cav1 engage la tumeur vers un processus métastatique. De plus, nous avons mis en évidence l’implication de l’axe Cav1 / EREG / YAP dans la résistance au traitement (cétuximab et radiothérapie). Enfin, nous avons identifié l’épireguline (EREG) comme la protéine clé de la résistance au cétuximab. Ainsi, un déficit d’EREG sensibilise les cellules au cétuximab par activation de la ferroptose et l’association de cette thérapie ciblée à la molécule de RSL3 ou à la metformine restreint drastiquement la survie cellulaire en accentuant cette mort cellulaire programmée. Ces derniers résultats ont pu être confirmés grâce à un modèle 3D complexe récapitulant l’hétérogénéité intra- et inter-tumorale, à savoir le modèle tumoroïde établi à partir de pièces opératoires de patients atteints d’un cancer des VADS
This translational research project on head and neck cancers has identified caveolin-1 (Cav1) as a prognostic biomarker for the evolution of a primary tumor of these cancers. Indeed, an overexpression of this protein favors a locoregional relapse whereas a deficiency of Cav1 engages the tumor towards a metastatic process. Moreover, we have highlighted the involvement of the Cav1 / EREG / YAP axis in the resistance to treatment (cetuximab and radiotherapy). Finally, we identified epiregulin (EREG) as the key protein in cetuximab resistance. Thus, a deficiency of EREG sensitizes cells to cetuximab by activation of ferroptosis and the association of this target therapy with the RSL3 molecule or metformin drastically restricts cell survival by accentuating this programmed cell death. These last results could be confirmed thanks to a complex 3D model recapitulating the intra- and inter-tumoral heterogeneity, namely the tumoroid model established from surgical parts of patients with head and neck cancer

碩士
國立成功大學
生理學研究所
105
Two mechanisms are proposed to maintain homeostasis in epithelial cells monolayer: growth arrest caused by contact inhibition and cell extrusion caused by crowding induced delamination. It is highly likely that perturbation of these homeostatic systems lead to the formation of epidermal masses in cancer development. In this study, we showed that IPTG-inducible expression of oncogenic Ha-RasV12 in MK4 cells (a clone of MDCK cells) causes the formation of multilayer cellular aggregation. The Hippo-YAP pathway has recently been shown to be an important regulator of contact inhibition. Induction of Ha-RasV12 triggered YAP nuclear translocation and subsequently YAP-targeted gene expression. Expression of Ha-RasV12 induced elevation of LATS1 and MST1, suggesting that canonical Hippo pathway may not be the cause of Ha-RasV12-induced activation of YAP. Next, we showed inhibition of p-ERK or actomyosin cytoskeleton impeded Ha-RasV12-induced activation of YAP. Treatment of Verteporfin (VP), a YAP/TEAD binding inhibitor, failed to abolish Ha-RasV12 induced multilayer cellular aggregates, indicating the involvement of other molecules. Overexpression of Cav1 inhibited Ha-RasV12 induced cellular and mechanical transformation. In addition, we showed that overexpression of Cav1 inhibited Ha-RasV12-induced YAP activation and multicellular cell aggregates. However, knockdown of Cav1 in MDCK cells only resulted in activation of YAP, but not cellular aggregates. Moreover, Rac and RhoA, both associated with cell extrusion, were increased in Ha-RasV12 overexpressed MK4 cells. EHT1864 (Rac inhibitor) abolished multilayer cellular aggregates in Ha-RasV12-overexpressed MK4 cells, whereas Y27632 (ROCK inhibitor) induced multilayer cellular aggregates in MK4 cells. Inhibition of p-ERK and overexpression of Cav1 also inhibited Ha-RasV12 induced Rac activation. Furthermore, overexpression of Rac1 resulted in cellular aggregates. Taken together, these data indicate that Ha-RasV12-induced YAP activation is not required for multicellular aggregates. On the other hand, Rac activation is essential for Ha-RasV12-induced multilayer cellular aggregate.

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1.
Voltage-activated Ca2+ channels (CaV) are membrane proteins that play a key role in promoting Ca2+ influx in response to membrane depolarization in excitable cells. They form oligomeric complexes that are classified according to the structural properties of the pore-forming CaVα1 subunit. Auxiliary CaVβ subunits modulate cell-surface expression and voltage-dependent gating of high-voltage-activated (HVA) CaV1 and CaV2 α1 subunits. CaVβ subunits are formed by a Src homology-3 (SH3) domain and a guanylate kinase-like (GK) domain connected through a variable HOOK-domain. In order to identify the residues responsible for the CaVβ3-induced membrane density of CaV2.3, we produced mutants along CaVβ3’s fonctionnal domains. Complete deletion of the SH3 domain as well as deletion of the HOOK domain did not alter plasma membrane targeting of CaV2.3 nor its typical activation gating. In contrast, 5-residue deletions in the GK domain disrupted cell surface trafficking and functional expression of CaV2.3. Mutations of residues known to carry nanomolar affinity binding in the GK domain of CaVβ did not significantly alter cell surface density. Mutations of a quartet of leucine residues in the α3, α6, β10, and α9 regions of the GK domain, each expected to curtail protein-protein interaction, were found to significantly impair cell surface targeting of CaV2.3 channels. Altogether, our results confirm that the GK domain includes the molecular determinants carrying the chaperone function of CaVβ. However, CaVβ-induced cell surface targeting appears to be determined by structural elements that are not strictly dominated by high-affinity binding of CaVβ onto CaVα1.