Literatura académica sobre el tema "Caractérisation génétique, protéomique"

Les lysosomes contiennent environ soixante hydrolases différentes, qui peuvent dégrader une grande variété de macromolécules. L’activité de ces enzymes est dépendante du pH, maintenu dans les lysosomes entre 4.5 et 5.0 par une pompe à protons : la v-ATPase. Les produits de dégradation sont recyclés dans le cytoplasme par des transporteurs actifs secondaires de la membrane des lysosomes.Les maladies de surcharges lysosomales sont causées par des mutations de gènes codant pour des protéines lysosomales, souvent des enzymes. Elles sont caractérisées par un engorgement des lysosomes avec des agrégats ou des cristaux. Les symptômes associés à ces maladies sont variés, mais la moitié d’entre elles induisent des défauts neurologiques. L’étude de ces maladies a permis d’élucider la fonction de nombreuses enzymes, mais la connaissance des transporteurs lysosomaux reste parcellaire. Peu de ces transporteurs sont ainsi caractérisés au niveau moléculaire.Je me suis intéressé à deux gènes dont la mutation provoque une maladie de surcharge particulière : CLN3 et CLN7. Leur mutation provoque des céroïdes lipofuscinoses neuronales, des maladies de surcharge lysosomales caractérisées par une neurodégénérescence précoce et par l’accumulation dans les lysosomes d’un pigment autofluorescent, la lipofuscine. La mutation de 14 gènes différents cause une céroïde lipofuscinose neuronale. J’ai étudié CLN3 et CLN7 car ils codaient pour des protéines membranaires du lysosome, qui pourraient donc être des transporteurs.Sur CLN7, j’ai effectué des tests de transport en utilisant les acides aminés comme substrats potentiels, sans résultats probants. Concernant CLN3, le contenu métabolique de lysosomes a été étudié par spectrométrie de masse dans des souris WT ou de souris où le gène CLN3 était déficient. Les lysosomes des cellules déficientes contenaient moins de produits de la protéolyse, ce qui suggérait que CLN3 était important pour la protéolyse lysosomale. Cela a été confirmé par des mesures plus directes sur des neurones et des fibroblastes primaires, et sur des fibroblastes immortalisés. Ces résultats pourraient aider à comprendre les premières étapes de la physiopathologie dans les cellules où des gènes CLN sont déficients.Pour accroître le nombre de transporteurs lysosomaux potentiels, j’ai participé à la finalisation d’une étude par protéomique de la membrane lysosomale. Elle a révélé 46 potentiels transporteurs de fonction encore inconnue. Dans cette liste, j’ai étudié TMEM104, SPINSTER, MFSD1, SLC37A2, TTYH3 et SNAT7. Pour ce faire, j’ai d’abord muté les motifs d’adressage de ces protéines pour les rediriger, lors de leur synthèse, vers la membrane plasmique, afin de faciliter leur étude. Aucune fonction claire n’a pu être identifiée par cette approche.SNAT7 appartenait cependant à une famille de transporteurs de glutamine, ce qui était suffisamment encourageant pour envisager d’autres approches. Sa fonction a ainsi été étudiée en développement un nouveau test indirect basé sur la détection d’une surcharge artificielle des lysosomes en acides aminés. Un test fonctionnel plus direct a ensuite été mis au point sur des fractions enrichies en lysosomes en utilisant des acides aminés radiomarqués. Ces deux tests ont montré que SNAT7 était un transporteur spécifique de l’asparagine et de la glutamine.J’ai enfin étudié l’hypothèse suggérant que SNAT7 pourrait jouer dans la nutrition de cellules cancéreuses. En effet, certaines utilisent la glutamine comme nutriment principal à la place du glucose ; mais les apports sanguins en glutamine, dans les tumeurs, sont parfois insuffisants. La glutamine est donc obtenue par macropinocytose de protéines extracellulaires et dégradation lysosomale de ces protéines, avant un recyclage vers le cytoplasme. J’ai montré qu’en l’absence de SNAT7, ce phénomène était bloqué. SNAT7 est donc une cible thérapeutique intéressante pour tenter de bloquer l’approvisionnement des cellules cancéreuses en glutamine
Within lysosomes, about sixty different hydrolases degrade macromolecules. This degradation is dependent on the acidity of the lysosomal lumen, which pH ranges between 4.5 and 5.0. The lysosomal pH is maintained by the v-ATPase, a proton pump. Lysosomal degradation generates catabolites, which can be recycled to cytosol by secondary active transporters: lysosomal transporters.The dysfunction of lysosomal proteins leads to lysosomal storage disorders (LSDs), rare inherited metabolic diseases characterised by accumulation of material inside lysosomes. Depending on the mutated gene, symptoms of LSDs vary greatly, although about half of LSD patients display some kind of neurodegenerative symptoms. Studying the physiopathology of LSDs has led to a good understanding of the function of lysosomal enzymes, but the knowledge of lysosomal transporters remain poor, since only a few LSDs has been shown to be linked with a mutation in a lysosomal transporter gene.I focused on two proteins which dysfunction causes a special type of LSDs: CLN3 and CLN7. Mutations in CLN3 and CLN7 cause neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs), a special type of LSD which has mostly neurodegenerative symptoms and which is characterized by the accumulation of a specific pigment inside lysosomes: lipofuscin. There are fourteen NCL genes, but CLN3 and CLN7 are the two only proteins of the family which are resident proteins of the lysosomal membrane, suggesting they might be transporters.Amino acids were screened as possible substrates for CLN7, but none could be shown to be transported. For CLN3, the content in metabolites of lysosomes from Cln3-deficient mice and from WT mice were compared by mass spectrometry, revealing a specific decrease in the amount of catabolites of proteins in lysosomes from Cln3-deficient mice. This suggested a lack of lysosomal proteolysis, which was checked in neurons, in primary fibroblasts and in immortalized fibroblasts. These results suggested that CLN proteins could take part to a metabolic pathway important for lysosomal proteolysis and, more generally, for neuronal health. These results could help improve the understanding of the early steps of NCL physiopathology.To extend the number of candidates for lysosomal transporters, I took part to the validation step of an extensive proteomic study of the lysosomal membrane, which revealed forty-six new candidates for lysosomal transporters. I studied in more details TMEM104, SPINSTER, MFSD1, SLC37A2, TTYH3 and SNAT7. Proteins were overexpressed in HeLa cells to check for lysosomal localization. Then, their putative sorting motifs were mutated to misroute their expression to plasma membrane and to enable their functional study. No function could elucidate for the first five candidates.SNAT7 could not be misrouted to plasma membrane either, but, since it belonged to a family of transporters for glutamine, its function was studied by an indirect assay based on a lysosomal overload in amino acids and a direct transport measure on lysosome-enriched cellular fractions. Thus, SNAT7 was shown to be a lysosomal transporter selective for glutamine and asparagine.The function of SNAT7 is the nutrition of cancer cells was then studied. Many cancer cells use glutamine as their main source of carbon, nitrogen and energy. Because of insufficient blood supply, they use macropinocytosis to uptake extracellular proteins, which degradation in lysosomes generates glutamine. Then, glutamine is recycled to the cytosol. SNAT7 was shown to be critical in this process: in glutamine-dependent cancer cells, when SNAT7 expression is reduced, cells cannot obtain glutamine from extracellular proteins. Thus, blocking SNAT7 is a promising approach to target specifically the metabolism of cancer cells

L'Océan Pacifique sud-ouest et les eaux de la Nouvelle-Calédonie sont caractérisés par de fortes abondances en cyanobactéries. Parmi ces cyanobactéries, certaines ont la capacité de fixer l'azote atmosphérique (N2), et sont appelées cyanobactéries diazotrophes. Ces organismes sont connus pour contenir en proportions variables des métabolites et nutriments à haute valeur ajoutée qui leur confèrent un potentiel de valorisation économique possiblement intéressants pour la Nouvelle-Calédonie. Plusieurs de ces cyanobactéries ont été isolées en culture depuis les eaux côtières et hauturières du Pacifique·Sud-Ouest mais la caractérisation précise de leur diversité et de leur potentiel de valorisation restent encore inconnus. Dans l 'optique d'une meilleure connaissance de la diversité et d'une éventuelle valorisation économique, les objectifs de ce travail doctoral étaient (i) d'étudier la variabilité saisonnière de la diversité/activité des cyanobactéries diazotrophes dans le lagon de Nouméa, (i) d'effectuer une caractérisation morpho-génétique et protéomique de souches autochtones récemment isolées en culture et (iii) d'évaluer leurs potentiels de valorisation
The southwest Pacific Ocean and the waters of New Caledonia are characterized by high abundances of cyanobacteria. Among these cyanobacteria, some have the ability to fix atmospheric nitrogen (N2), and are called diazotrophic cyanobacteria. These organisms are known to contain high added value metabolites and nutrients in varying proportions, which give them potential for economic development that may be of interest to New Caledonia. Several of these cyanobacteria have been isolated in culture from the coastal and offshore waters of the Southwest Pacific, but the precise characterization of their diversity and their potential for recovery are still unknown. With a view to a better knowledge of diversity and a possible economic valuation, the objectives of this doctoral work were (i) to study the seasonal variability of the diversity / activity of diazotrophic cyanobacteria in the lagoon of Noumea, (i) to carry out a morphogenetic and proteomic characterization of indigenous strains recently isolated in culture and (iii) to evaluate their potential for valorization

AtMYB30, qui appartient à la famille des facteurs de transcription de type MYB-R2R3, est un régulateur positif de la mort cellulaire hypersensible, une réponse de résistance mise en place par la plante en réponse à l'attaque par un agent pathogène. Ce travail de thèse s'est focalisé sur la recherche et la caractérisation d'interacteurs protéiques d'AtMYB30. Précédemment, dans un crible double-hybride chez la Levure, plusieurs interacteurs putatifs d'AtMYB30 avaient été identifiés : une protéine de type phospholipase A2 secrétée (AtsPLA2-a) et une protéine de type RING finger avec une fonction d'E3 ubiquitine ligase putative (MIP1). AtsPLA2-a et MIP1 interagissent physiquement avec AtMYB30 in planta et sont des régulateurs négatifs de la résistance conférée par AtMYB30. Par ailleurs, une recherche sans a priori des protéines interagissant avec AtMYB30 a été effectuée par une approche protéomique. La validation fonctionnelle des partenaires putatifs identifiés est actuellement en cours
AtMYB30, a member of the MYB-R2R3 transcription factor family, is a positive regulator of the hypersensitive cell death associated to plant response to pathogen attack. This thesis has focused on the search and characterization of AtMYB30 interacting partners. In a previous yeast two-hybrid screen, two AtMYB30 putative interacting proteins had been identified: a secretory phospholipase A2 (AtsPLA2-a) and a RING finger protein with a putative E3 ubiquitin ligase function (MIP1). AtsPLA2-a and MIP1 physically interact with AtMYB30 in planta and have been characterized as negative regulators of AtMYB30-mediated resistance responses. Finally, a proteomic approach was used to identify new AtMYB30 interacting partners. Functional validation of these AtMYB30 putative partners is in progress

La littérature indique que les miARN sont régulés à plusieurs niveaux de leur biogenèse et de leur activité. Cependant, il existe très peu d’information concernant la régulation de la stabilité des miARN. Le projet de thèse a consisté à étudier la dégradation spécifique d’un miRNA cellulaire (miR-27) induite par un transcrit viral (m169) au cours de l’infection par le cytomégalovirus murin (MCMV). Ce miARN est déstabilisé par un mécanisme moléculaire appelé ‘target-RNA directed miRNA degradation’ (TDMD). En suivant deux grands axes de recherche j’ai entrepris : premièrement l’étude et la caractérisation des déterminants moléculaires et des facteurs cellulaires impliqués dans le mécanisme de TDMD ; puis dans un second temps, la mise en place d’une approche protéomique permettant l’identification des partenaires de la protéine AGO2 potentiellement impliqué dans le TDMD dans des cellules infectées ou non par le MCMV
Several regulatory mechanisms have been uncovered at every level of the biogenesis and the activity of miRNAs. However, there is less information about the regulation of the stability of miRNAs. The PhD project entailed the study of a process, which specifically enables the degradation of a cellular miRNA (miR-27) induced by a viral transcript (m169) during an infection by the mouse cytomegalovirus (MCMV). This miRNA is destabilized by a process called ‘target-RNA directed miRNA degradation’ (TDMD). I first undertook the study and the characterization of the molecular determinants and the cellular factors implicated in TDMD. Moreover, I started to set up a protocol in order to identify AGO2 partners of viral or host origin during MCMV infection, which would potentially be implicated in TDMD

Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes de spectrométrie de masse (MS) structurale pour la caractérisation de systèmes protéiques complexes, souvent réfractaires aux approches biophysiques classiques. Dans ce contexte, les développements entrepris furent notamment focalisés sur la caractérisation de complexes impliqués dans la biogénèse des ribosomes et dans la régulation transcriptionnelle, fonctions cellulaires essentielles pouvant être liées à de nombreuses pathologies humaines dont certains cancers. Ainsi, les approches par MS native, pontage chimique et d’HDX-MS ont permis de renseigner sur la connectivité, les proximités spatiales ou encore la dynamique conformationnelle retrouvées au sein des complexes étudiés. Parmi ces techniques, l’HDX-MS permet une approche comparative basée sur les mesures d’incorporations en deutérium renseignant sur la dynamique conformationnelle d’une protéine sous différents états. Aussi, la combinaison d’approches de MS structurale a permis d’approfondir la caractérisation des systèmes complexes étudiés, démontrant ainsi l’intérêt d’une approche intégrative dans ce contexte
This PhD thesis focuses on developing methods in structural mass spectrometry (MS) to characterize complex protein systems, given their size and their heterogeneity, frequently inaccessible by classical biophysic approaches. In this context, methodological developments have particularly focused on the characterization of protein complexes involved in ribosomes biogenesis and transcriptional regulation. These fundamental cellular processes are related to numerous diseases such as cancers and genetic diseases. Thus native MS, crosslink, and hydrogen/deuterium exchange coupled to MS (HDX-MS) allowed gaining insights about the stoechiometry, spatial proximities and conformational dynamics of studied systems. Among these approaches, HDX-MS enables a comparative approach based on deuterium incorporation measurements giving information about the conformational dynamics of labeled proteins in various experimental conditions. Finally, the combination of structural approaches enables to deeply characterize complex protein systems, highlighting the advantages of an integrative approach in this context

La texture est un critère essentiel dans la perception de la qualité organoleptique du fruit de tomate. Cependant, il s’agit d’un caractère complexe dont les différentes composantes (fermeté, farinosité, jutosité) sont essentiellement évaluées par analyses sensorielles. L’objectif de la thèse est d’identifier des mécanismes contrôlant les variations de texture du fruit de tomate, tant au niveau génétique que moléculaire, afin de fournir, à long terme, des outils intéressants pour assister la sélection de ces caractères dans le cadre de l’innovation variétale. Au niveau génétique, la caractérisation des QTL de texture est abordée en cherchant à savoir comment les régions porteuses de QTL interagissent entre elles et comment le fonds génétique peut influencer l’expression de ces QTL. A l'exception de la fermeté, les effets des QTL de qualité ont été retrouvés au niveau des lignées quasi-isogéniques correspondantes dans le fonds génétique utilisé à l’origine pour la détection de QTL. Néanmoins, de fortes interactions entre QTL et fonds génétiques ont été mises en évidence ainsi qu’un effet fort de l’environnement sur l’expression de ces QTL. Parallèlement, la cartographie fine de deux régions où sont localisés des QTL associés à la texture, a été initiée. Les effets des QTL contrôlant la fermeté du fruit ont été détectés au niveau de certaines familles de recombinants et la localisation de ces QTL a été précisée. Au niveau moléculaire, la recherche de gènes candidats dont la fonction et/ou le niveau d’expression sont associés aux variations de texture a été réalisée par des analyses du protéome et du transcriptome. Plusieurs gènes candidats ont été identifiés et la cartographie de certains d’entre eux a révélé une co-localisation avec les QTL ciblés.

Chez les mammifères l’initiation de la traduction et, plus particulièrement, la formation du complexe eIF4F, est principalement régulée par la protéine kinase TOR (Target of rapamycin). Cette voie de régulation fait intervenir les protéines 4E-BP (eIF4E-binding proteins) dont l’activité est modulée par la phosphorylation par TOR. Sous leur forme non-phosphorylée, les 4E-BP se lient au facteur d’initiation eIF4E, empêchent son recrutement dans le complexe eIF4F et inhibent ainsi l’initiation de la traduction. Phosphorylées par TOR, les 4E-BP perdent leur affinité pour eIF4E et sont remplacées par eIF4G ce qui active la traduction. La régulation de l’initiation de la traduction par TOR via 4E-BP a été bien décrite dans plusieurs modèles eucaryotes, tels que la levure, les insectes et les mammifères, mais reste encore obscure chez les plantes. Les recherches réalisées au cours de ma thèse ont permis l’identification de deux protéines homologues de 4E-BP chez Arabidopsis. Ces protéines, que nous avons appelées ToRP1 et ToRP2 (TOR Regulatory Proteins), sont caractérisées par la présence d’un motif consensus indispensable pour la liaison à eIF4E, et qui existe chez les protéines 4E-BP des mammifères ainsi que chez eIF4G et eIFiso4G d’Arabidopsis. La protéine ToRP1 est capable d’interagir spécifiquement avec eIF4E, mais aussi avec TOR via son extrémité N-terminale en système double-hybride de levure. ToRP1 et ToRP2 ont également été caractérisées comme étant des cibles directement phosphorylées par TOR chez Arabidopsis. Deux sérines, en position 49 et 89 dans la protéine ToRP1, ont été identifiées comme des sites potentiels de cette phosphorylation. De plus, l’état de phosphorylation de ces sites affecte l’interaction avec eIF4E en système double-hybride de levure. Par ailleurs, des plants d’Arabidopsis déficients en ToRP1 et ToRP2 renforcent la traduction strictement coiffe-dépendante de l’ARNm CYCB1;1, alors que la surexpression de ToRP1 ou de ToRP2 réprime sa traduction. Ces résultats suggèrent donc que les protéines ToRP, identifiées chez Arabidopsis, sont de nouvelles cibles directes de TOR, qui, par leur phosphorylation, régule l’initiation de la traduction coiffe-dépendante
The target of rapamycin (TOR) is an evolutionarily conserved kinase that is a critical sensor of nutritional and cellular energy and a major regulator of cell growth. TOR controls cap-dependent translation initiation, in particular the assembly of the eIF4F complex, by modulating the activity of eIF4E-binding proteins (4E-BPs). In their unphosphorylated state 4E-BP proteins sequester eIF4E and repress translation. Upon phosphorylation by TOR, 4E-BPs have a low affinity binding to eIF4E and are replaced by eIF4G thus activating translation initiation. 4E-BPs have been discovered in yeast and mammals but remain to be obscure in plants. Here, we identified and characterized two Arabidopsis proteins termed TOR Regulatory Proteins (ToRPs 1 and 2) that display some characteristics of mammalian 4E-BPs. ToRP1 and ToRP2 contain a canonical eIF4E-binding motif (4E-BM) found in mammalian 4E-BPs and Arabidopsis eIF4G and eIFiso4G. ToRP1 interacts with eIF4E, and, surprisingly, the N-terminal HEAT domain of TOR in the yeast two-hybrid system. ToRP1 and ToRP2 are highly phosphorylated at several phosphorylation sites in TOR-dependent manner in planta. Two of these phosphorylation sites have been identified as—S49 and S89—their phosphorylation status modulates ToRP1 binding to eIF4E in the yeast two-hybrid system. In plant protoplasts, ToRP2 can function as translation repressor of mRNAs that are strictly cap-dependent. Our results suggest that ToRPs can specifically bind the Arabidopsis cap-binding proteins (eIF4E/eIFiso4E) and regulate translation initiation under the control of TOR

Le soja, culture d’intérêt agronomique mondiale et bientôt Normande, doit faire face à l’attaque de nombreux phytopathogènes et notamment à l’oomycète Phytophthora sojae Kaufm. & Gerd., qui engendrent chaque année d’importantes pertes économiques. Le RET (Root Extracellular Trap) est situé à l’apex racinaire, est constitué de cellules détachées de la racine appelées cellules frontières ou AC-DC (root Associated Cap-Derived Cells) et de leur mucilage associé. On retrouve au sein de ce mucilage des glycomolécules, des protéines, ou encore de l’ADN extracellulaire (ADNex). Cet ensemble, formant un territoire racinaire particulier, va permettre la protection de la racine et notamment de son apex contre les stress biotiques et abiotiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes de défense racinaires, et notamment de certains acteurs du RET, une analyse transcriptomique et protéomique des AC-DC et de la racine et une analyse génomique de l’ADNex ont été réalisées en conditions témoin et élicitée avec PEP-13, un éliciteur provenant des oomycètes du genre Phytophthora sp. Les analyses transcriptomique et protéomique ont montré une spécificité des AC-DC par rapport aux racines et une réponse à PEP-13 qui semble différente entre ces deux zones. Le séquençage génomique de l’ADNex du RET a été réalisé afin de déterminer l’origine de celui-ci et savoir s'il existe une spécificité de séquences entre les deux conditions. Il semblerait que l'ADNex ait une meilleure couverture lors de l'alignement sur l’ADN mitochondrial et l’ADN plastidial comparé à l’ADN chromosomique. Cette différence de couverture peut indiquer une différence de persistance de l’ADNex dans le RET en fonction de son origine (chromosomique ou mitochondrial et plastidial), ou une libération dans le RET par ces organites. Il semblerait également qu’il n’y ait pas de différences entre les séquences d’ADNex du RET en condition élicitée avec PEP-13 ou témoin
Soybean, a crop of Normand and world agronomic interest, is threatened by numerous phytopathogens like the oomycete Phytophthora sojae Kaufm. & Gerd., wich generate high levels of economical losses. The RET (root extracellular trap) is located at the root apex and is composed of border cells or AC-DC (root associated cap-derived cells) and their mucilage. This mucilage is made up of glycomolecules, proteins or also extracellular DNA (exDNA). The RET play a role in root protection against biotic stresses. In order to better understand the role of the RET in root protection, a transcriptomic and a proteomic analysis where done on AC-DC and roots in controle condition and in elicited condition with PEP-13 (an elicitor from Phytophthora sp.). The results show a specificity of AC-DC compared to the root, and an answer to PEP-13 wich seems to be different between these two tissues. An other experiment was to sequence RET exDNA in controle and elicited conditions, in order to define the origin of this exDNA. We show that the coverage of mitochondrial and plastidial DNA where much better than the coverage of chromosomic DNA. It could mean that chromosomic DNA isn’t conserved as well as organelles DNA, or exDNA could originate from organelles. Furthermore, results seems to show no differences between the sequences of elicited or control exDNA