Literatura académica sobre el tema "Capteur enzymatique"

RésuméLa découverte simultanée de l’action antidépressive de l’imipramine ainsi que la mise en évidence d’une action sur la transmission sérotoninergique au niveau du système nerveux central a renforcé l’idée d’une perturbation biologique concomitante des dépressions. Devant l’impossibilité d’accéder in vivo aux structures cérébrales, ces explorations ont porté en périphérie sur la mesure du neurotransmetteur, de son précurseur le tryptophane, de son catabolite le 5 HIAA, des activités enzymatiques de synthèse et de son catabolisme, de sa vitesse de capture ou de stockage. Dans les dépressions, le tryptophane libre plasmatique serait abaissé chez les patients par rapport aux sujets témoins, mais d’autres auteurs ne retrouvent pas de modification voire même une augmentation de ce paramètre. Une distribution bimodale du tryptophane chez les sujets dépressifs et une variation saisonnière différente de ses taux plasmatiques entre sujets dépressifs et témoins sont deux explications possibles de ces résultats contradictoires. L’anorexie fréquemment présentée par les patients déprimés pourrait entraîner une baisse de cet acide aminé chez ces patients. À la suite des travaux d’Ashcroft et al en 1966, de nombreuses études ont montré que la concentration de 5 HIAA dans le LCR est abaissée chez certains déprimés comparativement à des témoins. Cette diminution de 5 HIAA lombaire pourrait refléter une diminution du turnover de la sérotonine. En fait, elle n’a pas été mise en évidence par tous les auteurs. Ceci pourrait s’expliquer par la mise en évidence d’une distribution bimodale du 5 HIAA chez les patients déprimés. Environ 30% des patients présenterait une baisse du taux de 5 HIAA dans le LCR et serait caractérisé par des conduites suicidaires plus fréquentes, une agressivité plus marquée. Les concentrations de sérotonine et de 5 HIAA ont été mesurées postmortem chez des patients décédés après une tentative de suicide de même que chez des patients décédés d’autres causes. Ces études qui ne sont toutefois pas concordantes tendent à mettre en évidence une diminution des taux cérébraux de sérotonine et de 5 HIAA. Il semble bien que les résultats soient beaucoup plus nuancés selon les régions explorées et que de nombreux facteurs non spécifiques de variation soient à prendre en compte. Cette diminution des taux cérébraux de 5 HT chez les suicidés « peut aussi bien résulter d’une activation du turn-over de I’antine que d’une diminution de sa synthèse » (Tissot, 1975). Divers auteurs ont relevé une baisse significative du taux de la sérotonine sérique chez les patients déprimés majeurs. Environ 60% des travaux montre une diminution des concentrations plaquettaires en 5HT. Après quelques travaux négatifs n’utilisant pas de faibles concentrations de substrats, Tuomisto et Tukiainen (cité in Loo, 1987) ont été les premiers à mettre en évidence une diminution de la capture plaquettaire de 5 HT chez des patients déprimés. Depuis, un consensus semble s’être établi sur cette baisse d’activité chez les déprimés endogènes. Tous ces résultats doivent être interprétés avec une grande prudence. Les modifications objectivées sont inconstantes et variables et it reste difficile de déterminer si elles peuvent être considérées comme une cause ou une conséquence de la maladie. Il s’agit, très certainement, d’un chaînon intermédiaire dans la perpétuelle régulation d’un système plurifactoriel complexe aux multiples connexions.

Nous avons mis au point un capteur immunoenzymatique pour la détection ampérométrique de l'alpha-foetoproteine avec lequel peuvent être pratiquées des mesures successives sans avoir à changer la phase solide. Deux systèmes différents ont été comparés : les anticorps sont soient liés irréversiblement à une membrane de gélatine, soient liés réversiblement en utilisant une membrane liée covalemment au p-aminophényl-béta-D-thiogalactopyranoside (PAPTG) et des complexes IgG-béta-D-galactosidase. Chaque système de détection est simple, facile à manipuler et possède de grandes possibilités d'automatisation. La sensibilité obtenue (0,5 ng/ml) est essentiellement due au choix de la catalase comme enzyme marqueur. Il a été démontré que le système dans lequel les anticorps sont liés réversiblement à un temps de vie plus long puisque les membranes sont moins susceptibles à la dénaturation. De plus, le temps de mesure est plus court (5 minutes au lieu de 15) puisque la réaction antigène anticorps qui nécessite du temps n'a pas lieu sur le capteur immunoloqique. Ces deux avantages favorisent l'utilisation de ce dernier système
We have developed an enzyme immunosensor for the amperometric detection of alpha-fetoprotein with which repeated measures may be practised without exchanging the solid phase. Two different systems have been compared : the antibodies are either irreversibility bound to the gelatin membrane or reversibility bound using a p-aminophenyl-beta-D-thiogalactopyranoside (PAPTG) covalently bound membrane and IgG-beta-D-galactosidase complexes. Each system of detection is simple, easy to handle and possesses great possibilities for automation. The obtained sensitivity (0,5 ng/ml) is essentially effected by the choice of catalase as marker enzyme. It was shown that the system in which the antibodies are reversibly bound has a longer lifetime because the membranes are less susceptible to denaturation. Furthermore, the measurement time is shorter (5 minutes instead of 15) because then antigen!antibody reaction which is time consuming does not occur on the immunosensor. These two advantages further the utilization of this last system

La présence de métaux lourds, et du mercure en particulier, est un facteur important de la pollution des eaux. Leur détection et leur dosage nécessitent des techniques et des compétences qui se prêtent mal à l'analyse de terrain. Nous avons développé un biocapteur sensible au mercure en immobilisant la pyruvate oxydase de P. Species sur un transducteur optique. Nous avons étudié la cinétique d'inhibition de l'enzyme en solution par le mercure et proposé un schéma simplifié du mode d'action de cet inhibiteur. Nous avons mis au point une nouvelle technique d'immobilisation sur membrane d'affinité et défini les conditions optimales de l'immobilisation, ainsi que les paramètres intervenant sur la sensibilité des films d'enzyme immobilisée au mercure. Le biocapteur final est constitué d'un film de pyruvate oxydase couplé à un fluorophore sensible à l'oxygène. Plusieurs familles de fluorophores ont été testées et de nouveaux composes synthétisés. Nous avons étudié les caractéristiques spectroscopiques des composés finalement retenus (phtalocyanines de zinc) soumis à différents procédés de mise en œuvre, et conçu un appareillage opto-électronique permettant d'obtenir une optrode enzymatique portable et automatisée pour le dosage du mercure.

La première partie de ce travail concerne le greffage d'enzymes sur l'oxyde de nickel NiO et les oxydes de silicium SiO et SiO₂. Le greffage sur l'oxyde de nickel est obtenu après activation au chlorure de cyanuryle. L'enzyme test est l'uréase. Le greffage sur les oxydes de silicium est effectué en 2 étapes. Les oxydes ont d'abord été silanisés puis l'uréase et la butyrylcholinestérase sont respectivement greffées sur ces oxydes silanisés, par l'intermédiaire du glutaraldéhyde, SiO et SiO₂. Les méthodes de Lineweaver-Burk et Infra-Rouge à Transformée de Fourier sont utilisées pour l'exploitation des expériences, et la détermination des conditions optimales de travail (solvant, temps d'immobilisation,. . .). La seconde partie concerne la mise au point d'un biocapteur, basé sur une électrode en palladium/oxyde de palladium. L'uréase et la butyrylcholinestérase ont été immobilisées en surface par réticulation. Le greffage d'uréase en monocouche utilisant le chlorure de cyanuryle est aussi effectué. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux fournis par le greffage en multicouches. Les réponses de l'électrode à uréase greffée en monocouche et en multicouches ont été explicitées à l'aide d'un modèle théorique.

La première partie de ce travail concerne le greffage d'enzymes sur l'oxyde de nickel NiO et les oxydes de silicium SiO et SiO₂. Le greffage sur l'oxyde de nickel est obtenu après activation au chlorure de cyanuryle. L'enzyme test est l'uréase. Le greffage sur les oxydes de silicium est effectué en 2 étapes. Les oxydes ont d'abord été silanisés puis l'uréase et la butyrylcholinestérase sont respectivement greffées sur ces oxydes silanisés, par l'intermédiaire du glutaraldéhyde, SiO et SiO₂. Les méthodes de Lineweaver-Burk et Infra-Rouge à Transformée de Fourier sont utilisées pour l'exploitation des expériences, et la détermination des conditions optimales de travail (solvant, temps d'immobilisation,. . . ). La seconde partie concerne la mise au point d'un biocapteur, basé sur une électrode en palladium/oxyde de palladium. L'uréase et la butyrylcholinestérase ont été immobilisées en surface par réticulation. Le greffage d'uréase en monocouche utilisant le chlorure de cyanuryle est aussi effectué. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux fournis par le greffage en multicouches. Les réponses de l'électrode à uréase greffée en monocouche et en multicouches ont été explicitées à l'aide d'un modèle théorique.

En vue de l'optimisation des performances d'un biocapteur, une couche sensible fine a ete deposee et formee directement sur le transducteur. Pour cela, l'enzyme a ete incluse dans un polymere electro- ou photo- polymerisable. Cette methode permet de fixer a l'avance la composition de la couche sensible et de controler chaque etape de sa formation. L'etude a ete realisee avec un capteur amperometrique a h#2o#2 a l'aide d'un systeme potentiostatique a trois electrodes, comprenant l'electrode de travail (platine) sur laquelle est forme le film polymerique contenant l'enzyme choline oxydase, une contre-electrode (fil de platine) et l'electrode de reference au calomel. Dans un premier temps, la matrice d'immobilisation a ete un polypyrrole issu de l'electropolymerisation d'un monomere amphiphile, le 12-(pyrrol-1-yl) dodecyltriethylammonium tetrafluoroborate (pyam). Le capteur forme a montre un temps de reponse court, mais le poly-pyam a un effet legerement inactivateur sur l'activite enzymatique. Par la suite, l'enzyme a ete protegee par un environnement phospholipidique. Neanmoins, le biocapteur a montre une stabilite assez faible. C'est pourquoi, dans un deuxieme temps, le poly-pyam a ete remplace par un polymere photoreticulable, poly(vinyl alcool) porteur de groupements styrylpyridinium (pva-sbq), presentant de bonnes proprietes mecaniques. Les electrodes modifiees ont montre des performances interessantes: la sensibilite est de 100 ma. L. Mol#-#1. Cm#-#2, avec une limite de detection de 1,5. 10#-#8 m pour la choline (atteignant 2,5. 10#-#9 m en tampon phosphate), la gamme de linearite s'etend jusqu'a 10#-#4 m, le temps de reponse est de quelques dizaines de secondes et la sensibilite reste stable pendant trois mois. Au vu des resultats, une co-immobilisation a pu etre envisagee avec la phospholipase d dans le but de doser la phosphatidylcholine, molecule importante dans les fluides biologiques. La choline oxydase s'est averee avoir un comportement different de celui qu'elle montre lorsqu'elle est immobilisee seule, tant du point de vue de la sensibilite a la choline que de la stabilite des reponses. Malgre les difficultes rencontrees, cette technique permet la co-immobilisation de systemes multienzymatiques travaillant en sequence et permet d'envisager une miniaturisation ulterieure du systeme

Depuis 4 décennies, un modèle intermédiaire entre les traditionnelles approches in vivo et in vitro émerge : les Systèmes MicroPhysiologiques (SMP). Ils sont construits pour recréer différents niveaux de physiologie humaine, du simple organe à leurs interactions. Ils améliorent l’environnement de culture grâce à des microstructures accueillant des modèles d’architecture 3D et multicellulaire, et intègrent des microcapteurs monitorant l’activité cellulaire et leur environnement.Ce nouvel outil d’investigation est d’intérêt pour la recherche fondamentale sur les maladies comme le diabète. Dans le cas de cette maladie incurable, la régulation du glucose sanguin, résultant d’interactions complexes entre les îlots pancréatiques, le foie, les adipocytes et les muscles, est altérée. Un Multi-Organe-sur-Puce (MOsP) est un SMP pouvant reproduire ces interactions, et représente donc un modèle pertinent pour la recherche sur le diabète. En effet, la régulation inter-organe n’est pas entièrement reproduite par les modèles in vitro usuels, et requiert de multiples capteurs, ce qui est éthiquement et techniquement impossible in vivo. Dans le contexte du diabète, il n’existe aucun MOsPs reproduisant l’action des îlots sur les muscles, malgré l’importance des muscles squelettiques dans la régulation glycémique.Cette thèse propose une méthodologie pour construire un MOsP étudiant les interactions d’îlot à muscle dans la régulation glycémique. Les 3 objectifs du MOsP étaient : atteindre des concentrations physiologiques d’insuline grâce à des îlots sécrétant en réponse à une élévation physiologique de glucose, induisant une prise de glucose mesurable par les muscles, et monitorer l’expérience en direct. Pour cela, les investigations ont été menées avec une approche interdisciplinaire, utilisant et confrontant des résultats venant d’expériences biologiques in vitro et de simulations modélisant la biologie et la physique.Ce manuscrit détaille les étapes de la méthodologie, et délivre différents designs pour progressivement construire un MOsP comprenant: une puce microfluidique contenant les cellules et un capteur de glucose connecté directement au flux. Les principales découvertes ont été :- Un milieu et procédure de co-culture entre îlots primaires et LHCN-M2 myotubes ont été démontrés.- Un substrat de culture commun de type MicroElectrodes Array a été trouvé.- Des îlots ont été cultivés en puce microfluidique, et ont présenté une sécrétion d’insuline en réponse au glucose durant des expériences en fluidique. Des myotubes ont pu se différentier en puce, et ont présenté une prise de glucose basale (insuline indépendant).- Une stratégie in vitro-in silico pour dimensionner le MOsP a été développée et implémentée. Un modèle in silico simplifié d’îlot a été développé pour rapidement explorer 2 designs de puce. Des expériences in vitro correspondantes, de sécrétion d’insuline, ont été menées et confrontées aux expériences in silico. Les résultats ont soulevé l’hypothèse que les îlots n’avaient pas une fonctionnalité optimale dans nos petits volumes de culture. La même constatation a été faite concernant les myotubes, où la prise de glucose insuline dépendante a été démontrée en macro volumes, mais en micro volumes, la réponse observée (uniquement à concentration physiologique d’insuline) doit être reproduite avec des expériences plus robustes pour démontrer leur présence.- Un capteur de glucose compatible avec le système microfluidique a été caractérisé à l’aide d’expériences in vitro et in silico.- Un multi-potentiostat a été développé dans la perspective de futures mesures électrochimiques multiples et intégrées.Les bases et perspectives présentées ici permettront d’achever le MOsP îlot-muscle par de futurs travaux. La méthodologie peut aussi être réutilisée pour l’ajout de nouveaux organes (foie, adipocytes) complétant le MOsP, qui permettra de mieux comprendre les dérégulations intervenant dans le diabète de type 2
Over the past 4 decades, an intermediate model between the traditional in vivo and in vitro approaches has emerged: the MicroPhysiological Systems (MPS). MPS are designed to recapitulate different levels of human physiology, from the single organ to organs crosstalk. They upgrade the culture environment by patterning microstructures hosting 3D and multicellular architecture models and integrate microsensors monitoring cell activity and environment.This new investigation tool is of interest in fundamental research on diseases such as diabetes. In this incurable disease, blood glucose regulation, resulting from a complex organs interplay between the pancreatic islets, the liver, the adipocytes and the muscles, is impaired. A Multi-Organ-on-a-Chip (MOoC) is a MPS that can recapitulate these organs crosstalk and represents a relevant model for diabetes research. Indeed, inter-organ regulations are not recapitulated by usual in vitro models, and deciphering these interactions requires multiple sensors, which is not ethically and technically possible in vivo. In the context of diabetes, MOoCs reproducing the islets to skeletal muscles communication do not exist so far, despite the importance of the skeletal muscles impact on blood glucose, under islets action.In this thesis, we propose a methodology to design a MOoC deciphering islets to muscles interactions in blood glucose regulation. The MOoC objectives were to: (i) attain physiological insulin concentration secreted by islets in response to physiological glucose elevation, (ii) that induces a measurable glucose uptake by the muscle cells, (iii) monitor online relevant parameters. To that end, the investigations were conducted with an interdisciplinary approach, using and confronting results from both in vitro biological experiments and in silico modelling of biology and physics.This manuscript details the methodology steps, delivering different designs for progressive validation toward a complete MOoC that comprises a microfluidic chip with cells and an online glucose sensor. During the MOoC construction, our main findings were the following:- A co-culture medium and procedure for primary islets and LHCN-M2 myotubes were demonstrated.- A common MicroElectrodes Array-based substrate was found suited for co-culture in a single microfluidic chip.- Islets were cultured in microfluidic chips, and presented an insulin secretory response to glucose during fluidic experiments. Myotubes were successfully differentiated in microfluidic chips, and presented a measurable basal (insulin-independent) glucose uptake.- An in silico and in vitro informed MOoC scaling strategy was developed and implemented. A simplified in silico islet model was developed to rapidly explore chip designs. Corresponding in vitro insulin secretion experiments were conducted and confronted to the in silico experiments. Results raised the hypothesis that islets function was sub optimal when cultured in our low volume. Similar observation was made concerning myotubes scaling, where insulin-dependent glucose uptake was demonstrated in macro volumes experiments, but in micro volumes, the observed insulin response (only at physiological insulin concentration) has to be further repeated with improved experiments to explicitly demonstrate its presence.- A glucose biosensor compatible with microfluidic was characterized under different injection protocols, using in vitro and in silico experiments.- A multi-potentiostat was developed in the perspective of multiple and integrated electrochemical sensing in the MOoC.From the grounds and perspectives presented in this thesis, future work can be conducted to further complete this islet-muscle MOoC. The methodology can be re-used and extended in the perspective of adding new organs (liver, adipocytes) in this MOoC in order to better address the interorgan crosstalk deregulations in type 2 diabetes pathophysiology

Cette thèse s'est inscrite dans le cadre du projet ACACIA (Amélioration du CAptage du CO2 Industriel et Anthropique) soutenue par le pôle de compétitivité AXELERA et financé par " FUI " et " LE GRAND LYON ". Notre objectif était d'immobiliser l'anhydrase carbonique dans des gels inorganiques, en particulier la silice afin de préserver la structure de l'enzyme, sa fonctionnalité et de la protéger de l'environnement physico-chimique environnant. Pour cela, des essais préliminaires simples nous ont permis d'élaborer et de construire une cellule, comprenant membrane polymérique poreuse imprégnée de solution enzymatique aqueuse, ou de gel de silice lui-même imprégné de solution aqueuse d'enzyme. A partir de ce montage, nous avons étudié des paramètres importants de la membrane, comprenant un tampon, sa nature, molarité et son pH, ainsi que la taille des pores de la membrane et la concentration en enzyme. Il a été trouvé qu'un tampon à base de bicarbonate permet de déplacer l'équilibre de déprotonation du CO2(aq) vers un pH plus élevé, par l'apport des ions HCO3- équilibrés par des cations comme Na+, et favorise une contribution plus importante à la diffusion du CO2 à travers la membrane. Nous avons également observé que quelque soit le gaz de captage (100 % et / ou 10 % de CO2), le tampon et le type de membrane, une perméance maximum a été observée pour une concentration en enzyme de 0.2 mg mL-1.