Tesis sobre el tema "Bactéries associées"

Laccaria bicolor S238N est un champignon ectomycorhizien utilisé commercialement en France dans le cadre de la mycorhization contrôlée. Lors de la production de l'inoculum en fermenteur, des contaminations bactériennes apparaissent régulièrement. La technique d'hybridation in situ associée à la microscopie confocale a permis de détecter plusieurs types de bactéries intracellulaires dans les cultures pures du champignon. La majorité des endobactéries était affiliée aux Firmicutes. Certaines ont été identifiées comme des Paenibacilli appartenant à la même espèce que des bactéries isolées à partir d'une culture en fermenteur de L. Bicolor S238N. En revanche, dans des échantillons de mycélium non axéniques comme les mycorhizes, les endobactéries détectées étaient majoritairement des a-protéobactéries. Comme les observations suggèrent que certaines endobactéries colonisent des cellules fongiques vivantes, il pourrait s'agir d'un cas d'endosymbiose bactérienne
Laccaria bicolor S238N is an ectomycorrhizal fungus used commercially in France for controlled mycorrhization. During the production of the inoculum in fermentor, bacterial contaminations occur recurrently. Fluorescent in situ hybridization associated with confocal microscopy has allowed to detect several types of intracellular bacteria in the pure cultures of the fungus. Most of these endobacteria belong to the Firmicutes. Some have been identified as Paenibacilli, and belong to the same species as bacteria isolated from a L. Bicolor S238N culture in fermentor. In contrast, in non axenic mycelium samples such as mycorrhizas, endobacteria affiliated to the a-proteobacteria were detected. Since some observations suggest that the endobacteria sometimes colonize live fungal cells, it could be a case of bacterial endosymbiosis

L’accumulation des métaux toxiques dans l’environnement représente une forte menace environnementale et sanitaire. Les éponges marines, invertébrés sessiles qui filtrent activement l’eau de mer environnante, peuvent concentrer des composés toxiques comme les métaux lourds (Pérez et al., 2005) et être utilisés comme bioindicateurs de pollution métallique (Patel et al., 1985). Elles hébergent une biomasse bactérienne importante (Websterand Taylor, 2012), dont le rôle dans la séquestration de polluants environnementaux reste encore mal connu.Notre étude s’est portée sur les bactéries tolérantes aux métaux lourds (Cu2+, Pb2+, Ni2+ etZn2+) associées à l’éponge méditerranéenne Spongia officinalis (classe : Demospongia, ordre :Dictyoceratida, famille : Spongiidae) connue pour son accumulation de métaux toxiques(Pérez et al., 2005). Nous avons d’abord développé une étude de la communauté bactérienne associée à l’éponge S. officinalis récoltée dans un environnement pollué en métaux par la combinaison d’approches moléculaire (DGGE, CARD-FISH) et culturale. Afin de comprendre les mécanismes d’accumulation et/ou de résistance vis‐à‐vis des métaux d’une souche de Pseudovibrio sp. isolée de S. officinalis pour sa tolérance au cuivre nous avons développé des approches combinées de protéogénomique (électrophorèse bidimensionnelle,séquençage du génome) et de microscopie (microscopie électronique à balayage couplée à une analyse élémentaire EDX). Enfin, la diversité chimique associée à l’éponge S. officinalis,sa variabilité spatiale et temporelle ont ensuite été caractérisées par couplage d’analyse chromatographique et de spectrométrie de masse (LC-MS, LC-MS/MS)
The accumulation of toxic metals in the environment is a strong environmental and health threat. Marine sponges are sessile invertebrates that actively filter the surrounding seawater.They can concentrate toxic compounds such as heavy metals (Perez et al. 2005) and are used as bioindicators of metal pollution (Patel et al. 1985). They host an important bacterial biomass (Webster and Taylor 2011), whose role in the sequestration of environmental pollutants is still unclear.Our study focused on bacteria tolerant to heavy metals (Cu2+, Pb2+, Ni2+, Zn2+) associated with the Mediterranean sponge Spongia officinalis (class: Demospongia, order Dictyoceratida,family: Spongiidae) known for its accumulation of toxic metals (Perez et al. 2005). We first developed a study of bacterial community associated with the sponge S. officinalis harvested in a metal polluted environment by the combination of cultural and molecular approaches(DGGE, CARD-FISH). The mechanisms of accumulation and/or resistance to copper of a sponge isolated strain, Pseudovibrio sp. was investigated by combined approaches of proteogenomics (two-dimensional electrophoresis, sequencing of the genome) and microscopy (scanning electron microscopy coupled with elemental analysis EDX). A final approach was developed to characterize the chemical diversity associated with this sponge and spatial and temporal variability by coupling chromatographic analysis and mass spectrometry (LC-MS, LC-MS/MS)

Au cœur des préoccupations régionales, les problèmes de turbidité rencontrés au niveau des systèmes de distribution en eau potable suscitent un grand intérêt, autant sur le plan économique que sur le plan sanitaire, et ont donné lieu à de nombreux travaux. Un des objectifs de cette étude, a été d'évaluer la validité de la turbidité, et des bactéries fécales, comme indicateurs de la qualité sanitaire de l'eau. L'origine du déclenchement des épisodes turbides et la nature des matériaux restitués ont également été étudiées. Dans ce but, les relations entre la nature et les quantités des matières en suspension (MES) et les concentrations en bactéries planctoniques et adhérentes aux particules en suspension ont été analysées sur le système karstique de Norville, constitué d'un point d'introduction, d'une source de surverse et d'un forage exploitant les eaux de la craie sous les alluvions. Cette approche originale, couplant des données hydrologiques et bactériologiques, a permis (i) de montrer que les conditions de transfert et/ou stockage partiel des communautés bactériennes dans le système karstique sont dépendantes de l'historique des chroniques hydrologiques et (ii) d'appréhender l'influence de l'exploitation du forage sur la dégradation de la qualité de la ressource. La mise en évidence de la présence récurrente dans le système karstique d'une espèce bactérienne (Pseudomonas oryzihabitans), spécifiquement associées aux MES, et de sa résistance exceptionnelle au chlore sous la forme adhérente, a en outre conduit à poser le problème des risques sanitaires liés aux biofilms
In the heart of the regional concerns, the problems of water turbidity occurring in the drinking water supply systems cause a great interest at an economic and sanitary point of view, and consequently give place to many studies. One of the objectives of this study was to evaluate the sanitary significance of the water turbidity and bioindicator concentration. The origin of the turbid events and the nature of the discharged materials were also investigated. In this aim, relations between the turbidity and the concentration of planktonic and sessile bacteria were analysed on the karstified site of Norville that comprises a sinkhole, a spring and a well-bore working chalk waters under alluvium. This original approach, that associated hydrogeological and microbiological measurements, allowed (i) to show that transfer and/or storage of bacterial populations within the karstified system are dependent of the previous hydrological events and (ii) to evaluate the influence of the well-bore exploitation on the deterioration of the water quality. Moreover, the recurring presence in the karstified system of a bacterial species (Pseudomonas oryzihabitans) that was always associated with suspended particles, and its high resistance to chlorine in the sessile status, questioned on the biofilm sanitary risk

Le fucane, constitué de L-fucose sulfaté, est extrait d'algues brunes. Depuis 1987, ce polysaccharide bioactif est étudié par le Laboratoire de Recherches sur les Macromolécules (CNRS, Université Paris 13) et le Centre IFREMER de Nantes dans le cadre de l'unité de Recherche marine n°2. A l'heure actuelle, ses propriètés n'ont jamais étè exploitées à des fins thérapeutiques en raison du manque de connaissance de sa structure fine et des mécanismes moléculaires gouvernant ses activités. L'objectif de ce travail était de développer une approche enzymatique pour la caractérisation de sa structure. Le Centre d'étude et de Valorisation des Algues, désireux de développer un pôle de production d'oligosaccharides, a mis ses moyens techniques à la disposition de ce projet de recherche d'enzymes bactérienne de dégradation du fucane. Nos travaux ont permis de disposer de deux bactéries associées à l'algue Ascophyllum nodosum, nommées B et C, capables de dégrader le fucane. Après optimisation de leurs conditions de culture et de stockage, ces bactéries ont été caractérisées comme appartenant à la famille des Flavobacteriaceae. Elles représentent deux nouvelles espèces bactériennes. Ces bactéries sont capables de produire une activité sulfatase et des fucanases extracellulaires. L'activité fucanase de la bactérie B aurait un mécanisme exolytique et l'activité fucanase de la couche C serait endolyptique. Le niveau d'activité des enzymes extracellulaires étant relativement faible, nous avons recherché des enzymes intracellulaires et périplasmiques chez la souche C. Les résultats obtenus nous ont laissé penser que l'activiité fucanase de cette bactérie serait intracellulaire et pourrait même avoir une localisation périplasmique. La caractérisation des enzymes mises en évidence doit être poursuivie. En effet, ces enzymes purifiées devraient s'avérer utile dans la compréhension des propriètés biologiques du fucane et permettre une modification selective du polysaccharide
Fucan constituted of sulfated L-fucose is extracted from brown seaweeds. Since 1987, this bioactive polysaccharide is studied by the Unity of Marine research n°2 constituted of the Research Laboratory on Macromolecules (CNRS, Paris 13) and IFREMER (Nantes). Currently its properties have never been used for therapeutic purposes. This is partly due to the lack of knowledge about its fine structure and moleculary mecanisms responsible for its activities. The aim of this work was to develoop enzymes for the characterisation of the structure of fucan. The Seaweed Manufacturing Technology Center, inclined to diversify its production of oligosaccharides, made its technical means available for this research about bacterial enzymes able to degrade fucan. Our research enable us to find two bacteria called B and C and associated to the brown seaweed Ascophyllum nodosum, able to degrade fucan. We optimized their culture conditions and their storage. Then we found that these bacteria belonging to the Flavobacteriaceae correspond to two new bacterial species. These bacteria produce an extracellular sulfatase activity and extracellular enzymes responsible for fucan degradation. The fucanase activity of the bacteria B could have an exolytic mecanism and the fucanase activity of the bacteria C could be endolytic. The grade of activity of the extracellular enzymes was low. So we look for intracellular and periplasmic enzymes associated to the bacteria C. The results let us thinks that the fucanase activity of this bacteria could be intracellular and could have a periplasmic localisation. The characterisation of these enzymes should be continued. The purified enzymes should indeed be useful for the understanding of biological properties of the fucan. They could also enable a selective depolymerisation of this polysaccharide

299 bacteries heterotrophes ont ete isolees sur des milieux additionnes de metaux. Ces bacteries, qui colonisent l'epiderme et le tube des alvinellidae preleves sur un site hydrothermal du 13#on (dorsale du pacifique oriental), ont ete identifiees comme membres des genres pseudomonas, alteromonas et vibrio. La determination de leur cmi a montre que 92,3% d'entre elles sont resistantes a au moins un des metaux testes et que 57% sont resistantes a plus d'un metal. La capacite de 40 d'entre elles a accumuler les metaux a ete demontree. Une fraction de ces bacteries (19,1%) contient un a cinq plasmides dont les tailles s'echelonnent de 4,6 a 156,9 kb. Les bacteries concernees presentent de fortes resistances pour les metaux testes, et en particulier pour l'arseniate. Elles sont de plus pour la plupart resistances a la penicilinne et au chloramphenicol. Le plasmide le plus frequemment rencontre (45,3 kb) determine la resistance a l'arsenite et a l'arseniate. Ces resistances sont inductibles par chacun de ces composes. La resistance a l'arsenic est egalement inductible chez les souches partiellement curees, ce qui suggere que les plasmides remanents ainsi qu'un ou des genes d'origine chromosomique seraient impliques dans ce mecanisme, l'ensemble des caracteristiques mises en evidence montre l'adaptation de ces micro-organismes a un environnement enrichi en matiere organique et contenant de fortes concentrations en metaux. Leur capacite a accumuler les metaux les rend susceptibles de contribuer au transfert de ces elements toxiques du milieu exterieur vers les cellules epidermiques des polychetes

Il est plus que nécessaire aujourd'hui d'apporter de nouvelles avancées dans le domaine des traitements anti-cancéreux. Il est également bien établi que dans la famille des produits bioactifs d'origine naturelle, les composés azotés sont largement représentés et ce dans la plupart des classes thérapeutiques. Aussi, ces travaux se sont concentrés sur l'obtention de composés azotés bioactifs d'origine naturelle en ciblant des produits cytotoxiques. Ce travail est divisé en trois parties. Tout d'abord, nous avons choisi d'étudier les souches bactériennes associées aux lichens. En effet, le réseau symbiotique complexe que représente le lichen est d'un grand intérêt pour l'identification de nouvelles souches bactériennes avec des potentiels de production de composés d'intérêt et notamment d'un point de vue biotechnologique. Dans un premier temps, un travail d'optimisation des conditions de culture d'une souche d'Actinobactérie, Nocardia sp, isolée à partir d'un lichen, Collema auriforme, a été réalisé dans le but de favoriser la production de composés cytotoxiques. Dans un second temps, l'étude bactériochimique de cette souche a permis l'isolement de 13 composés azotés, dont deux dicétopipérazines bromées qui sont nouvellement décrites ainsi que des dérivés puriques et pyrimidiques. Enfin, un travail de ciblage des composés actifs, par réseaux moléculaires et analyses multivariées de données de spectrométrie de masse, a mis en évidence des molécules potentiellement responsables de l'activité. La seconde partie de ce travail apporte des éléments de réponse sur la nature de la relation bactérie-lichen en observant les effets de certains composés lichéniques sur la croissance et le métabolisme bactériens ainsi qu'en étudiant le potentiel de biotransformation de trois bactéries associées aux lichens (une Firmicutes, une beta-protéobactérie et une Actinobactérie). Les souches sélectionnées ont toutes montré des capacités de biotransformation des composés lichéniques testés (notamment acide usnique et méthyl-beta-orcinolcarboxylate). Enfin, la troisième partie de ce travail décrit une nouvelle méthode d'obtention de composés azotés bioactifs d'origine naturelle par la voie synthétique. Ainsi, une nouvelle méthode de synthèse de la bgugaine, la coniine et la tylophorine a été étudiée et a permis d'obtenir la N-Boc-2-heptylpyrrolidine, démontrant la possibilité de synthétiser des alcaloïdes de type pyrrolidine et d'envisager la synthèse des cibles sélectionnées
New advances in anti-cancer therapeutic are today more than necessary. It is also well establish that amongst bioactive natural compounds, nitrogen compounds are widely represented and that, in all therapeutic classes. Thus, these works are focused on obtaining bioactive nitrogen compounds from natural sources targeting cytotoxic products. This work is divided in three parts. First of all, we chose to study bacterial strains associated with lichen. Indeed, lichens are a complex symbiotic network of great interest for the discovery of new bacterial strains. Especially for strains with a great biotechnological potential particularly in the production of compounds of interest. At first, culture conditions of an Actinobacteria, Nocardia sp, isolated from a lichen, Collema auriforme, were optimised in order to produce cytotoxic compounds. Secondly, the study of the secondary metabolites patterns of this strain allows the isolation of 13 nitrogen compounds, including 2 brominated diketopiperazines which are newly described, along with purine and pyrimidine derivatives. Finally, a targeting work of bioactive compounds was realised by establishing molecular networking and multivariate analysis of mass spectrometry data, highlighting molecules potentially responsible for activity. The second part of this work bring some answers about the nature of the relationship between bacteria and lichen, by observing effect of some lichen compounds on bacterial growth and metabolism as well as studying the biotransformation potential of three lichen-associated bacteria (a Firmicutes, an beta-proteobacteria and an Actinobacteria). All selected strains showed ability for the biotransformation of tested lichen compounds (usnic acid and methyl-beta-orcinolcarboxylate). Finally, the third part of this work describes a new method for obtaining bioactive nitrogen compounds by a synthetic way. Thus, a novel synthesis method of bgugaine, coniine and tylophorine was studied and led to N-Boc-2-heptylpyrrolidine, showing the possibility to synthesize pyrrolidine alkaloids and to consider the synthesis of selected targets

Le biofilm est à l’origine d’infections nosocomiales et d’intoxications alimentaires dans les secteurs alimentaire et hospitalier. Les bactéries structurées en biofilm peuvent se détacher et coloniser de nouvelles surfaces. Le risque microbiologique associé aux bactéries détachées de biofilm est peu étudié. Les travaux de thèse ont concerné, l’étude de l’effet des conditions de croissance sur les propriétés physicochimiques de surface de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa sous leurs formes détachées de biofilm et planctoniques, ainsi que leurs adhésion sur l'acier inoxydable (SS) et le polycarbonate (PC). Le pouvoir pathogène des deux populations bactériennes a été étudié. Les résultats ont montré que les conditions et le mode de croissance influencent les propriétés de surface et par conséquent l’adhésion de S. aureus et P. aeruginosa sur le SS et le PC. De plus, la température de croissance, le type de surface et l’âge physiologique des bactéries influencent significativement leur production des facteurs de virulence et leur cytotoxicité envers les cellules HeLa. Dans un deuxième temps, l'effet de température de croissance sur la résistance des cellules détachées de biofilm et planctoniques au chlorure de benzalkonium (BAC) a été évalué. Pour comprendre les mécanismes de résistance à l’échelle cellulaire, les lésions des membranes bactériennes associées au BAC ont été suivies par l’efflux des ions K+ intracellulaires. En outre, la fluidité membranaire de deux populations bactériennes a été caractérisée à travers l'étude de profils d'acides gras membranaires. Les résultats ont montré que la résistance au BAC dépend de la température et de l’état physiologique des bactéries
The biofilm formation in food and medical sectors represents a significant source of foodborne and nosocomial diseases. Bacteria structured in biofilm can detach and colonize new surfaces. The microbiological risk associated with biofilm-detached bacteria is poorly studied. On one hand, the thesis concerned the study of growth conditions effect on the bacterial surface physicochemical properties as well as the adhesion of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilm-detached and planktonic cells to stainless steel (SS) and polycarbonate (PC). The pathogenicity of both bacterial populations has also been studied. The results showed that the conditions and the mode of growth influence the surface properties and consequently the adhesion of S. aureus and P. aeruginosa on the SS and the PC. In addition, growth temperature, surface type and physiological age of bacterial cells significantly influence their production of virulence factors and their cytotoxicity towards HeLa cells. On the other hand, the effect of growth temperature on the resistance of biofilm-detached and planktonic cells to benzalkonium chloride (BAC) was assessed. In order to understand the mechanisms of resistance at the cellular level, bacterial membrane damage associated with BAC was assessed by the efflux of intracellular K+ ions. In addition, the membrane fluidity of bacterial populations was characterized through the study of membrane fatty acid profiles. The results showed that resistance to BAC depends on the temperature and physiological state of the studied bacteria

La production inductrielle de ferments nécessite une étape de stabilisation qui affecte la qualité des cellules. Ce phénomène étroitement lié à l’espèce, voire à la souche bactérienne considérée, dépend également des conditions mises en œuvre lors de la conduite du procédé de production. Dans ce contexte, ce travail de thèse vise à améliorer les performances de Lactobacillus buchneri R1102 et Bifidobacteium longum R0175 à la lyophilisation et au stockage, et à identifier les réponses physiologiques associées.Dans une première partie, l’effet du temps de récolte sur les caractéristiques membranaires et les performances industrielles de Lb. Buchneri R1102 et B. lolngum R0175 a été anlysé. Une récolte en phase stationnaire conduit à une meilleure tolérance au cours de la congélation pour B. longum R0175 mais ne permet pas de maintenir une activité acidifiante élevée pour Lb. Buchneri R1102. Ces résultats sont reliés à une rigidificatioin de la membrane et à une augmentation de la proportion en acides gras saturés et cycliques en phase stationnaire de croissance.Dans une deuxième étape, les cellules de Lb. Buchneri R1102 ont été soumises à différentes conditions de stress osmotique. Un stress osmotique avec du KCl 0.1 M augmente la survie au cours de la lyophilisation mais ne modifie les caractéristiques membranaires des cellules. Un ajout de KCl 0.6 M en début de fermentation améliore la survie au cours du stockage à l’état lyophilisé. Ce phénomène est expliqué par une rigidification de la membrane lié à une augmentation de la concentration en acides gras cycliques et à une accumulation de bétaïne intracellulaire.Dans une troisème partie, l’effet de différentes atmosphères de culture sur l’état physiologique et les performances de Lb. Buchneri R1102 et B. longum R0175 a été étudié.Pour Lb. Buchneri R1102, l’apport d’air accélère significativement la croissance et la concentration bactérienne (air à 1.2 vvm) en fluidifiant les membranes cellulaires et en orientant le flux métabolique vers la production d’acétate. A l’inverse, l’apport d’azote ou d’un mélange de gaz N2H2 allonge les fermentations en diminuant le potentiel d’oxydoréduction. Enfin, l’apport des gaz air, N2 et N2H2 dégrade l’activité acidifiante de Lb. Buchneri R1102 mais augmente sa survie au cours du stockage, en lien avec des modifications de composition an acides gras et de synthèse protéique. Pour B. longum R0175, une concentration cellulaire plus élevée est obtenue lorsqu’un bullage N2 ou N2CO2 est effectué en début de culture. L’activité acidifiante des ferments est préservée au cours du procédé pour toutes les conditions testées, en lien avec une augmentation de la proportion d’acides gras insaturés et cycliques, mais sans variation de fluidité membranaire.Enfin, une meilleure survie cellulaire est obtenue lorsque les cellules sont cultivées avec du N2CO2 pendant toute la fermentation.Ce travail se conclut par la validation, à l’échelle pilote, des conditions conduisant à une amélioration de la stabilité biologique des ferments lyophilisés, tout en préservant les performances des fermentations
Industrial starter’s production requires a stabilization step that affects the quality of the cells. This phenomenon is closely linked to the used species and strains, and depends on the procedures applied during the production process. In this context, this thesis aims at improving the performances of Lactobacillus buchneri R1102 and Bifidobacterium longum R0175 during freeze-drying and storage, and to identify the corresponding physiological responses.In the first part of this work, the effect of the harvesting time on membrane characteristics and industrial performances of Lb. buchneri R1102 and B. longum R0175 has been analyzed. Harvesting the cells in stationary phase led to a better tolerance during freezing of B. longum R0175 but did not allow the maintenance of elevated acidification activity for Lb. buchneri R1102. These results have been related to a rigidification of the membrane and to an increase of the proportion of saturated and cyclic fatty acids in cellular membranes of cells recovered in stationary growth phase.In a second step, cells of Lb. buchneri R1102 have been submitted to different conditions of osmotic stress in order to improve their performances. An osmotic stress with 0.1 M KCl increased the cells survival during freeze-drying, without changing their membrane characteristics. In addition, adding 0.6 M KCl in the beginning of the fermentation improved the survival during storage on freeze-dried form. This phenomenon was explained by a rigidification of the membrane that was linked to an increase of cyclic fatty acids content and intracellular betaine concentration.The third part was devoted to the study of the effect of various gaseous atmospheres during the cultures, on the physiological state and the performances of Lb. buchneri R1102 and B. longum R0175. For Lb. buchneri R1102, aeration (air at 1.2 vvm) significantly accelerated the growth and the final cell concentration by increasing membrane fluidity and by directing metabolic flux towards acetate production. Conversely, adding nitrogen or the gas mixture N2H2 delayed the fermentations by decreasing redox potential. Lastly, injecting different gases (air, N2, N2H2) decreased acidification activity Lb. buchneri R1102 but increased its survival during storage, as a result of modifications of fatty acids composition and proteins synthesis. For B. longum R0175, a higher cell concentration was obtained when the culture medium was bubbled with N2 or N2CO2 at the beginning of the fermentation. In addition, acidification activity of these starters was well maintained for all tested conditions, which was linked to an increase of unsaturated and cyclic fatty acids proportion, but without any change in membrane fluidity. Lastly, a better cell survival was obtained for cells grown with N2CO2 all along the fermentation.Finally, this work is concluded finish with the validation, at pilot scale, of the conditions leading to an improvement of the biological stability of freeze-dried starters, while maintaining their performances during fermentation

Crambe crambe (Schmidt, 1862), espèce largement retrouvée en Méditerranée, est la source de nombreuxalcaloïdes guanidiniques (crambescines et crambescidines). Les voies de biosynthèse de ces métabolitessecondaires n’ont pas encore été démontrées. Il a cependant été proposé que les crambescidines seraientproduites à partir de polycétides, suggérant ainsi la possible implication de micro-organismes dans leurbiosynthèse. Cependant les quelques études portant sur la présence ou non de bactéries associées à cette épongesont contradictoires. Durant cette thèse, nous avons caractérisé la communauté bactérienne associée à C. crambepar l’utilisation de techniques à la fois moléculaires et microscopiques, mettant en évidence l’associationspécifique entre une bêtaprotéobactérie et cette éponge méditerranéenne. La présence d’un micro-organismespécifique au sein du mésohyle de l’éponge pose alors la question du rôle de ce dernier au sein de son hôte etplus particulièrement sa possible implication dans la synthèse des alcaloïdes guanidiniques. L’étude de ladiversité microbienne cultivable par la mise en place d’une procédure d’acclimatation et la conception de diversmilieux de cultures, a permis l’isolement de micro-organismes minoritairement associés à C. crambe, mais n’acependant pas conduit à l’isolement de la bêtaprotéobactérie spécifique. La comparaison des empreinteschimiques (CLHP/DAD/ELSD – CLHP/ESIMS) des extraits de l’éponge et des bactéries cultivées, a révélé queces micro-organismes minoritaires n’étaient pas à eux seuls producteurs de ces métabolites bioactifs. La bactériemajoritaire, principale candidate dans la synthèse des métabolites n’étant pas cultivable, nous avons développédeux études complémentaires afin d’apporter des éléments de réflexion quant à sa possible implication. Laculture ex situ de colonies C. crambe accompagnée d’un stress pH ainsi que l’étude de la distribution spatiale insitu des composés par imagerie par spectrométrie de masse se révèlent prometteuses bien qu’elles n’aient pas, àce jour permis d’identifier le possible rôle de la bêtaprotéobactérie dans la biosynthèse de ces métabolites
Crambe crambe (Schmidt, 1862), is a marine sponge widely distributed in the Mediterranean Sea and known toproduce bioactive guanidine alkaloids (crambescins and crambescidins). While the biosynthetic pathways ofthese metabolites remains unknown, bio-mimetic chemical synthesis of crambescidins suggested a possiblecontribution of microorganisms in their biosynthesis. Contrastingly, it had been reported via electron microscopythat bacteria were absent in the tissues of this sponge. Thus to shed light onto these contrasting results I studiedthe microbial community associated with C. crambe using alternative approaches. Using molecular andmicroscopic techniques, we demonstrated that a single bacterial species affiliated to the Betaproteobacteria ispresent in abundances commonly found in low microbial abundance sponges, and dominates the bacterialcommunity associated with C. crambe. This finding suggests a possible implication of bacteria the biosynthesisof C. crambe’s guanidine alkaloids. The use of acclimatization procedure and diverse cultivation approachesallowed the isolation of associated microorganisms which were rare or absent among the community describedvia tag pyrosequencing but not isolation of the dominant betaproteobacterium. CLHP/DAD/ELSD andCLHP/ESIMS fingerprints of extracts from C. crambe and from the isolated bacteria showed no evidence of theimplication of these cultured micro-organismes in the synthesis of C. crambe’s metabolites. Finally in order toevaluate the potential role of the uncultivated betaproteobacterial symbiont in the biosynthesis of guanidiniumalkaloids, preliminary experiments using two alternative approaches were attempted. In the first I subjectedsponges to a pH stress and evaluated changes in secondary metabolite profiles, while collecting samples formicrobial community analysis. In the second I tried different mass spectrometry imaging techniques to localizeguanidinium alkaloids in C. crambe tissues. While these experiments did not allow to resolve the question of apossible implication of the dominant betaproteobacterium in the biosynthesis of the pentacyclic guanidinealkaloids, I was able to gather interesting results that will guide future studies towards resolving this question

Les écosystèmes ultramafiques (serpentiniques) de Nouvelle-Calédonie sont considérés comme des « hotspots » de la biodiversité, notamment en raison des pressions adaptatives exercées par des conditions édaphiques drastiques. En effet, ces sols, résultant de l'altération naturelle du manteau océanique, sont composés de plus de 85% d'oxydes de fer, sont déficients en N, P, K, déséquilibrés en Ca/Mg et riches en métaux lourds (Ni, Cr, Mn, Co). Dans les associations entre végétaux et microorganismes du sol, les deux partenaires jouent un rôle essentiel dans l'adaptation aux conditions édaphiques, essentiellement au niveau de la tolérance aux métaux lourds. Dans notre étude, nous avons choisi des espèces endémiques du genre Tristaniopsis (Myrtaceae) comme plantes modèles pour étudier le rôle des champignons ectomycorhiziens et des bactéries associées à l'adaptation des plantes au nickel. Pour étudier l'effet des sols ultramafiques sur la diversité des ectomycorhizes et des bactéries mycorhizosphériques, ainsi que sur les déterminants génétiques de résistance/adaptation des bactéries associées, environ 150 ectomycorhizes ont été échantillonnées à partir de quatre sites ultramafiques (trois au massif du Koniambo et un dans la forêt de Desmazures) et deux non-ultramafiques reposant sur des sols volcano-sédimentaires (site d'Arama). La caractérisation génotypique et phylogénétique des ectomycorhizes et des bactéries mycorhizosphériques obtenues a révélé la présence d'une grande diversité de champignons (principalement Cortinarius, Pisolithus, Russula, Boletellus) et de bactéries (Pseudomonas, Burkholderia, Bacillus) dans les deux types de sols, avec une richesse spécifique particulièrement élevée dans les sols ultramafiques. De plus, les bactéries mycorhizosphériques provenant des sols ultramafiques avaient des proportions significativement plus élevées d'isolats portant les gènes nreB et cnrT que celles issues des sols volcano-sédimentaires. Une forte corrélation positive a également été observée entre l'occurence de ces gènes, connus pour conférer la tolérance aux métaux lourds chez les bactéries, et la tolérance des isolats au nickel en culture pure. La récente mise en évidence de souches bactériennes mycorhizosphériques Ni-tolérantes et promotrices de la croissance de Pisolithus albus en co-culture doivent permettre d'identifier des bactéries auxiliaires de la mycorhization qui pourront être ensuite exploitées dans le cadre de programmes de revégétalisation de sites ultramafiques miniers en Nouvelle Calédonie
New Caledonian ultramafic (serpentine) ecosystems are considered as hotspots of biodiversity, partly because of the adaptative pressure exerted by drastic edaphic conditions. Indeed these soils resulting from natural weathering of oceanic mantle could be composed of up to 85 % of iron oxides and are deficient in N.P.K., unbalance for the Ca/Mg ratio and rich in heavy metals Ni, Cr, Mn, Co. Both plant and soil microbes play a vital role in the adaptation to soil conditions mainly heavy metal uptake and tolerance. In our study, we choose endemic species of the genus Tristaniopsis (Myrtaceae) as model plant to study the role of ectomycorrhizal fungi and associated bacteria in plant adaptation to nickel. To investigate the effect of ultramafic soils on ectomycorrhiza and mycorrhizosphere bacteria diversities as well as on the genetic determinants of resistance/adaptation of associated mycorrhizosphere bacteria, 200 ectomycorrhizas were sampled from four different ultramafic sites (3 in Koniambo and 1 in Desmazures forest) vs two non-ultramafic ones from volcano-sedimentary soils (Arama). Molecular characterization of ectomycorrhiza (rRNA ITS) and associated mycorrhizosphere bacteria (16S rRNA) from these samples showed the presence of different fungi (Pisolithus albus, Russula spp., Boletellus spp.) and bacteria (Burkholderia spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.) that can be found in both soils. However, bacteria isolated from ultramafic soils could grow in the presence of Ni up to 20 mmol L-1 and contained cnrA and nreB genes, known to confer heavy metal tolerance, contrary to bacteria isolated from non-ultramafic soils. Moreover, we found a strong positive correlation between heavy metal tolerance and P-solubilizing ability. Further knowledge on functional diversity of ectomycorrhiza-mycorrhizosphere bacteria associations and its role in the adaptation of plants to ultramafic soils would help in the understanding of plant functioning on New Caledonian mine sites

La maladie de Crohn (MC) est une affection inflammatoire chronique du tube digestif dont l'étiologie reste mal connue. Les lésions iléales de MC sont anormalement colonisées par des souches pathogènes de Escherichia coli appartenant au pathovar AIEC pour Adherent-Invasive E. Coli. Ces souches sont capables d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales et ont la capacité de survivre et de se multiplier fortement en macrophages, en induisant une synthèse intense de TNF-α. L'objectif de ce travail s'inscrit dans la compréhension des mécanismes permettant aux bactéries AIEC d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales. Le criblage de la banque de mutants d'insertion du transposon Tn5phoA de la souche AIEC de référence LF82 a permis de mettre en évidence le rôle de la lipoprotéine YfgL dans le pouvoir invasif de la souche LF82. En effet, cette lipoprotéine participe à la formation de vésicules membranaires qui pourraient constituer un système de sécrétion et de transport de protéines bactériennes effectrices délivrées dans la cellule hôte et nécessaires à l'invasion des cellules par les bactéries. De plus, l'oxydoréductase DsbA est impliquée dans l'adhésion de la souche AIEC LF82 en régulant l'expression des flagelles et des pili de type 1, mais est également essentielle à la survie des bactéries AIEC LF82 en macrophages. Enfin, la protéine de membrane externe OmpC est essentielle chez la souche AIEC LF82 à l'adhésion et l'invasion des cellules épithéliales intestinales, mais son rôle dans la virulence est indirect. L'expression de la protéine OmpC est fortement induite à forte osmolarité, condition rencontrée par les bactéries AIEC au sein du tube digestif. Une surexpression de OmpC permet, chez la souche AIEC LF82, l'activation de la voie de régulation dépendante du facteur sigma alternatif RpoE (ou σE) qui régule l'expression des pili de type 1, des flagelles et d'autres facteurs nécessaires au processus d'adhésion et d'invasion des cellules épithéliales intestinales. En conclusion, sur la base des facteurs de virulence identifiés chez la souche AIEC LF82 et de leur régulation, les souches aIEC semblent avoir évolué de façon à pouvoir coloniser et envahir la muqueuse intestinale.

L’objectif de cette thèse a été d’évaluer les possibilités de réhabilitation de sols dégradés, contaminés par des HAP ou à faible qualité agronomique (parc à cendres volantes), en couplant la bioremédiation de ces sols à la culture de Miscanthus x giganteus (MxG). Dans un premier temps, la mise au point d’une série de bioessais in vitro au format microplaque a permis de témoigner de la contribution spécifique des exsudats racinaires de MxG et plus particulièrement de la quercétine (identifié parmi les métabolites secondaires racinaires) dans la biostimulation de bactéries HAP-dégradantes. Afin d’appréhender l’effet rhizosphérique de MxG sur la qualité des sols, des cultures en microcosmes de sols reconstitués puis de sols de friches ont été menées en laboratoire. D’une part, la dissipation significative des HAP à 4 cycles a pu être mesurée dans le compartiment racinaire des sols contaminés. D’autre part, l’augmentation des teneurs en carbone organique observée dans les cendres volantes, associée à une dynamisation du cycle de l’azote suggèrent une accélération des processus pédogénétiques liés au « vieillissement » du substrat. En outre, le développement d’un protocole d’extraction et de purification d’acides nucléiques a permis de suivre l’évolution de la diversité des communautés bactériennes des sols par méthode PCR-TTGE des ADNr 16S microbiens. La sélection de phylotypes bactériens a été mise en évidence au niveau rhizosphérique, en particulier à l’interface sol-racine (rhizoplan), soulignant l’influence de processus racinaires sur la structuration des communautés bactériennes in vivo. Enfin, un dernier volet, rendant compte d’expériences exploratoires sur deux saisons de croissance en champs (sols pollués et parc à cendres), a permis de confirmer l’adaptation de MxG à la variété de substrats étudiés, suggérant que sa culture pourrait constituer une alternative d’agriculture durable sur sites contaminés
The aim of this work was to investigate the potential of Miscanthus x giganteus (MxG) for PAH polluted soils remediation and fly ash revegetation. In vitro studies through microplate assays demonstrated the contribution of MxG root exudates and particularly of quercetin (following the identification of root secondary metabolites) to the selective biostimulation of PAH-degrading bacteria. To get insights into bioremediation processes and rhizosphere effects on soil quality, microcosm experiments were conducted at a laboratory scale, using artificially reconstituted soils and collected industrial soils. On the one hand, significant dissipations of four-ring PAH were noticed in the rhizosphere of contaminated soils. On the other hand, significant organic carbon and nitrite inputs could be measured in fly ash, indicating a “restart” of nitrogen cycle and suggesting an enhancement of fly ash weathering processes in the long term. Besides, the development of a soil nucleic acid extraction and purification method permitted to study the evolution of bacterial community diversity in all types of soils, based on PCR-TTGE of eubacterial 16S rDNA. Specific enrichments of bacterial phylotypes could be reported in rhizoplanes, confirming root-associated processes on the selection of soil bacterial communities. Finally, plant adaptation to the broad range of studied substrates in situ lead us to suggest that MxG cultivation could be an effective strategy for a new system of sustainable agricultural activities in wasteland soils

Les bactéries des microbiotes vivent avec l'homme une interaction mutualiste et tout facteur perturbant l'un ou l'autre des protagonistes peut rompre l'équilibre établi engendrant diverses modifications des interactions existantes. Dans ce contexte instable, les bactéries pathogènes opportunistes d'origine endogène et environnementale qui ont une grande adaptabilité vont pouvoir étendre leur niche écologique ou trouver une nouvelle niche. La diversité des bactéries atypiques ainsi que l'évolution génétique et génomique des bactéries du microbiote respiratoire des patients atteints de mucoviscidose (CF) illustrent ces phénomènes d'adaptation. Le déficit de l'immunité innée locale va en effet être à l'origine d'une colonisation des voies respiratoires (VRCF) par des bactéries endogènes et exogènes qui vont alors mettre en jeu divers mécanismes d'adaptation à cette niche écologique particulière. Le but de notre travail était d'étudier des marqueurs phénotypiques, génétiques et génomiques, témoins potentiels de l'adaptation bactérienne, en particulier au cours de la mucoviscidose. Pour cela, l'étude de la diversité intragénomique des copies du gène de l'ARN ribosomique 16S (rrs), reflétant la capacité d'adaptation bactérienne à des conditions environnementales fluctuantes, a été réalisée par une méthode de PCR et d'électrophorèse avec dénaturation en gradient de température (PCR-TTGE) sur un grand nombre de Veillonella spp. (n=149), d'Achromobacter xylosoxidans (n=164), ainsi que sur 6 autres espèces impliquées dans la colonisation des VRCF (Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis et Streptococcus pneumoniae). L'étude de la dynamique du génome de 90 isolats de 12 patients colonisés chroniquement par A. xylosoxidans a été menée par PCR-TTGE, analyse du polymorphisme des fragments de restriction après électrophorèse en champ pulsé et PCR sur séquences répétées. Enfin, l'effet de contraintes environnementales chimiques sur la croissance d'une partie du microbiote CF a été évalué, incluant une étude approfondie de l'effet du NaCl sur 85 isolats de P. aeruginosa.Ces différentes approches nous ont permis de mettre en évidence : i) la diversité intra-génomique des copies de rrs chez Veillonella (74% d'isolats présentant des copies divergentes), H. influenzae (61%), S. maltophilia (38%), A. xylosoxidans (28%), et S. aureus (17%), ii) la clonalité des isolats d'A. xylosoxidans colonisant chroniquement les patients CF associée à une évolution génétique et/ou génomique intra-clonale, iii) l'effet de contraintes environnementales telles que la salinité, le pH et la température sur le microbiote cultivable des VRCF, iv) l'effet antimicrobien du NaCl inhibant la croissance de 100% des P. aeruginosa isolés des VRCF à une concentration de 6%, inférieure à celle utilisée en thérapeutique, et montrant une action bactéricide sur 90% des isolats à une concentration de 10%, v) l'effet multiple du NaCl sur la croissance, le biofilm et la mobilité de P. aeruginosa. Les rrs et le génome constituent des témoins de l'adaptation des bactéries au sein des microbiotes et permettent de mettre en évidence l'importance et la diversité de ces phénomènes dans la niche pathologique que représentent les VRCF. Les contraintes environnementales de la niche écologique influencent cette adaptation. Au cours de la mucoviscidose, le potentiel thérapeutique de la modification de facteurs environnementaux tels que la salinité ou le pH doit être considéré compte tenu de l'impact de ces perturbations sur les communautés microbiennes pathologiques adaptées aux VRCF
Bacterial microbiotae and human beings developed mutualist interactions. All disrupting factors impacting this equilibrium can modify relationships among microbiota members with diverse consequences. In such an unstable context, opportunistic bacterial pathogens (OBPs) of endogenous or environmental origin showing great adaptability may find favorable conditions leading to ecological niche extension or to new niche colonization. This is illustrated by the diversity of atypical bacteria as well as by genetic and genomic evolution of members of the cystic fibrosis (CF) respiratory tract (CFRT) microbiota. The deficit in local innate immunity allowed colonization by endogenous and exogenous bacteria that will further develop adaptation processes to this particular ecological niche. The aim of this study was to evaluate phenotypic, genetic and genomic potential adaptation markers in different models of OBPs, particularly in CF. For this purpose, we described the variability in the multiple rrs gene copies using PCR and temperature-based denaturing electrophoresis (PCR-TTGE) on large collections of Veillonella (n=149) and Achromobacter xylosoxidans (n=164), as well as on isolates of six other species involved in the CFRT colonization (Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis and Streptococcus pneumoniae). Genome dynamics of 90 isolates from 12 patients chronically colonized by A. xylosoxidans was studied by PCR-TTGE, restriction fragment length polymorphism analysis after pulsed-field gel electrophoresis and PCR on repetitive sequences. Finally, the effect of environmental stress was evaluated on part of the growing CF microbiota and a thorough study of NaCl effect on 85 CF P. aeruginosa isolates was performed.These different approaches highlight: i) the intragenomic heterogeneity of the rrs gene copies in Veillonella (74% of isolates), H. influenzae (61%), S. maltophilia (38%), A. xylosoxidans (28%), and S. aureus (17%), ii) a clonal chronic colonization with A. xylosoxidans in 12 CF patients associated with rrs genetic and/or genomic intra-clonal evolution, iii) the effect of environmental stress such as salinity, pH and temperature on the CFRT microbiota, iv) the antimicrobial effect of NaCl on CF P. aeruginosa isolates, a 6% NaCl concentration inhibiting the growth of all the isolates and a bactericidal action being observed for 90% of the isolates with 10% NaCl, v) multiple effects of NaCl on growth, biofilm and mobility of P. aeruginosa. This study shows that rrs genes and genome dynamics witness for bacterial adaptability within microbiota according to environmental constraints and underlines the diversity and importance of adaptation processes in the long-term pathological adapted microbial communities of the CFRT. Modification of environmental factors such as salinity or pH of the CFRT niche may impact the microbiota and should be considered as targets for CF therapeutics

Le processus de photo-oxydation induite a été étudié au laboratoire en conditions contrôlées à l’aide de cultures non-axéniques sénescentes de diverses souches phytoplanctoniques. Le suivi de la dégradation de l’acide cis-vaccénique (marqueur bactérien) nous a permis de confirmer l’existence d’un flux d’1O2 des phytodétritus vers les bactéries attachées et de mettre en évidence une corrélation significative entre l’état de photodégradation des bactéries et la concentration en chlorophylle a (photosensibilisateur) des cellules phytoplanctoniques. Nous avons également démontré que les photoproduits formés au sein des bactéries et du phytoplancton (hydropéroxyacides) étaient rapidement dégradés dans nos conditions expérimentales en cétoacides et hydroxyacides correspondants. L’effet des matrices siliceuses et carbonatées sur l’efficacité du transfert d’1O2 des phytodétritus vers les bactéries attachées a également été étudié. Les résultats ont montré que contrairement aux matrices carbonatées (coccolithes) des coccolithophoridés, les matrices siliceuses (frustules) des diatomées, inhibaient fortement le transfert de l’1O2 limitant ainsi la photodégradation des bactéries attachées. L’étude des effets de l’1O2 sur la dynamique des communautés bactériennes attachées aux phytodétritus a montré que près de 90 % des bactéries attachées étaient mortes dans une culture d’E. huxleyi en phase stationnaire prolongée et que les bactéries vivantes étaient dominées par des bactéries pigmentées dont la résistance à l’1O2 serait liée à leurs fortes teneurs en caroténoïdes. Des analyses en DGGE ont montré que la diversité bactérienne était affectée par l’irradiation lumineuse
Induced photo-oxidation processes were studied in the laboratory under controlled conditions using non- axenic senescent cultures of several phytoplankton strains. The monitoring of the cis- vaccenic acid (bacterial marker) degradation allowed us to confirm the existence of a 1O2 flow from phytodetritus to the attached bacteria and to highlight a significant correlation between the photodegradation state of bacteria and chlorophyll a (photosensitizer) concentration in phytoplankton cells. We also demonstrated that photoproducts formed, within bacteria and phytoplankton (hydroperoxyacids), were rapidly degraded under our experimental conditions into corresponding ketoacids and hydroxyacids. The effect of siliceous and carbonate matrices (mineral polar medium) on the efficiency of singlet oxygen transfer from phytodetritus to the attached bacteria was also studied. Results showed that, in contrast to the carbonate matrix (coccoliths) of coccolithophorids, siliceous matrix (frustules) of diatoms, strongly inhibited the transfer of 1O2, thus limiting the photodegradation of attached bacteria. The study of the effects of 1O2 on the dynamics of bacterial communities attached to phytodetritus showed that nearly 90 % of attached bacteria were killed in a culture of E. huxleyi in late stationary phase and showed that living bacteria were dominated by pigmented bacteria whose resistance toward 1O2 results likely from their high carotenoid contents. DGGE and lipid tracer analyses showed that bacterial diversity was significantly affected by light irradiation

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif caractérisée par un état d'hyperactivation du système immunitaire intestinal et évoluant par poussées aigües entrecoupées de périodes de rémission. Les données cliniques et expérimentales montrent que l'étiologie de la MC serait une réponse immunitaire aberrante en réponse à des facteurs environnementaux tels que la consommation de nourriture riche en graisses et en sucres, et infectieux chez un hôte génétiquement prédisposé. Les patients atteints de MC présentent une perméabilité intestinale anormalement élevée, pouvant expliquer la stimulation du système immunitaire intestinal par des bactéries et antigènes de la flore intestinale. La muqueuse iléale des patients atteints de MC est anormalement colonisée par des souches de Escherichia coli ayant la propriété d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales, de survivre et de se multiplier dans les macrophages en entraînant la sécrétion de TNF-α (Tumor Necrosis factor-alpha). Un pathovar de E. coli associé à la MC et dénommé AIEC pour "Adherent-Invasive E. coli" a été défini. Les souches AIEC utilisent, pour adhérer, la molécule CEACAM6, anormalement exprimée au niveau de l'épithélium iléal des patients atteints de MC. Le travail présenté dans ce document a permis de mettre en évidence la capacité des bactéries AIEC à altérer la fonction de barrière de l'épithélium intestinal dans un modèle de souris transgénique exprimant le récepteur CEACAM6 humain. Cette altération est associée à une forte induction de l'expression de la protéine de jonction Claudine-2, comme observé chez les patients atteints de MC. Une 2ème étude a mis en évidence qu'un régime alimentaire de type occidental entraîne une modification de la composition de la flore intestinale chez les souris CEABAC10 aboutissant à l'apparition d'un micro-environnement inflammatoire favorisant l'implantation des bactéries AIEC et le développement d'inflammation. Enfin, la dernière étude met en évidence les mécanismes de régulation de l'expression du gène CEACAM6 par le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inductible Factor-1), de façon dépendante de la méthylation de l'ADN. L'ensemble de ces travaux a permis de mettre en évidence les conséquences d'une infection par les bactéries AIEC et d'un régime de type occidental sur la fonction de barrière intestinale
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L'efficacité des antibiotiques actuellement utilisés dans le monde entier est en baisse à un rythme inquiétant. La majorité des produits actifs naturels sont isolés des ascomycètes ou des Actinobactéries. Parmi les 10 000 antibiotiques connus, plus de la moitié sont produits par des bactéries du genre Streptomyces. Il est donc intéressant de rechercher de nouvelles molécules actives dans des niches encore sous explorés, tels que les symbioses microbiennes mutualistes. Ainsi, les lichens sont des organismes complexes abritant des communautés bactériennes à la surface et, plus rarement, à l'intérieur de leurs thalles et constituent un modèle d’étude pour la découverte de nouvelles molécules d’intérêts. Une optimisation des conditions d'extraction des lichens a été développée. Le profilage chimique par LC / MS de neuf lichens (2 à algues vertes : Roccella fuciformis et R. phycopsis et de 7 cyanolichens: Lichina confinis, L. pygmaea, Leptogium lichenoides, Synalissa symphorea, Collema auriforme, C. cristatum et C. fuscovirens) ont été effectués et comparés avec des approches de «molecular network". Cela a permis de souligner la similitude chimique entre tous les cyanolichens d’une part et les espèces lichéniques à algues vertes d’autre part. Une étude chimique plus approfondie de R. fuciformis et R. phycopsis a été par la suite effectuée et dix composés différents ont été isolés et identifiés. Neuf d'entre eux ont été isolés et identifiés par RMN et des voies de fragmentation ont été proposés pour cinq d'entre eux. Une étude de localisation in situ de leurs métabolites majeurs respectifs (érythrine et acide roccellique pour R. phycopsis et érythrine, acide léprarique et acetylportentol pour R. fuciformis) a été réalisée et a démontré leur emplacement spécifique au sein des thalles lichéniques. Les communautés bactériennes cultivables associées à trois lichens de la côte bretonne (France) (Roccella fuciformis, Lichina confinis, L. pygmaea) et un lichen terrestre récolté en Autriche (Collema auriforme) ont été étudiées afin de trouver de nouveaux métabolites d'intérêts. L'abondance et la diversité des communautés bactériennes associées à ces lichens a été montré: 247 souches ont été isolées et identifiées par l’étude du gène de l'ARNr 16S. Ainis, plus de 30% de toutes les souches expriment des gènes permettant la production potentielle des composés bioactifs et 12% appartiennent probablement à de nouvelles espèces bactériennes. Les métabolites secondaires de deux bactéries cultivables associées ont été étudiés (MOLA1488, Streptomyces sp. et MOLA1416, Hoeflea sp.) et certains métabolites spécialisés actifs ont été isolés (des dicétopipérazines, des alcaloïdes, des dérivés phénoxazine par exemple ...) présentant des propriétés biologiques intéressantes. Enfin, pour mettre en évidence les interactions possibles entre les lichens et leurs bactéries associées, une approche de culture (extraits lichéniques et bactéries associées) a été réalisée à partir de 4 souches bactériennes les plus abondantes associées à Roccella fuciformis pour (1) évaluer l'impact de ces métabolites sur la croissance de ces quatre souches et également, (2) à évaluer la capacité de bioconversion de l'acide leprarique et de l’érythrine. Ces bactéries ont montré la capacité de bio-converser l’érythrine en acide orsellinique, mais aucun des quatre métabolites testés n’a affecté leur croissance
Efficiency of currently used antibiotics is worldwide decreasing at a worrying rate, while we are faced with new and emerging pathogens. The majority of active natural products are isolated from the Ascomycetes or from the Actinobacteria. Among the 10000 known antibiotics, more than half are produced by bacteria of one single genus, Streptomyces. It is therefore most interesting to search for novel active molecules in yet under explored niches, such as mutualistic microbial symbioses. Lichens are complex organisms harboring bacterial communities on the surface and, more rarely, inside their thalli and present a model to discover new biomolecules. Optimization of extraction conditions of lichens has been developed. Chemical profiling by LC / MS of nine lichens (2 green algae Roccella fuciformis and R. phycopsis and 7 cyanolichens: Lichina confinis, L. pygmaea, Leptogium lichenoides, Synalissa symphorea, Collema auriforme, C. cristatum and C. fuscovirens) were made and compared with a "Molecular network" approach. This has allowed to identify the chemical similarity between all cyanolichens and between two lichen species containing green algae. On the other hand, further chemical study on R. fuciformis and R. phycopsis was conducted and ten different compounds were isolated. Nine of them have been isolated and identified by NMR and mass fragmentation pathways have been highlighted for five of them. In situ localization of their major respective metabolites (erythrin and roccellic acid for R. phycopsis and erythrin, lepraric acid and acetylportentol for R. fuciformis) was performed and showed a specific location in the lichen thallus. We focused also on the cultivable bacterial communities associated to three lichens from Brittany coast (France) (Roccella fuciformis, Lichina confinis, L. pygmaea) and one inland lichen from Austria (Collema auriforme) to find new secondary metabolites of interest. The abundance and the diversity of the bacterial communities associated to these lichens were showed: 247 strains were isolated and identified by 16S rRNA gene analysis. More than 30% of all strains express potential bioactive compounds and 12% represent probably new species. The secondary metabolites patterns of their cultivable associated bacteria were studied (MOLA1488, Streptomyces sp. and MOLA1416, Hoeflea sp.) and some active secondary metabolites were isolated (e.g. dicetopiperazines, pyrrole alkaloïds, phenoxazine derivatives …) showing biological properties. Finally, to highlight potential interactions between lichens and their associated bacteria, an approach of culture (lichen extracts and bacteria) was performed from 4 most abundant bacterial strains associated with Roccella fuciformis to (1) assess the impact of major metabolites (compounds 4) of this lichen on the growth of these four strains by a an optimized method of viability using MTT; and also to evaluate (2) the ability to bioconversion of these four strains of lepraric acid and erythrin. These bacteria have shown the ability to metabolize erythrin in orsellinic acid, but none of the four tested metabolites has affected their growth

Acacia mangium Willd. est une légumineuse ligneuse introduite dans de nombreux pays tropicaux à partir de son aire d'origine (Australie), avec ou sans inoculations volontaires par des rhizobiums sélectionnés. Des campagnes d'échantillonnage des bactéries symbiotiques fixatrices d'azote ont été réalisées dans sa zone d'origine à différentes époques (1986, 2007 et 2009) et dans trois zones d'introduction (Brésil, Sénégal et Malaisie). Après isolement et test de nodulation homologue, la diversité de plus de 500 souches a été analysée sur un gène de ménage (recA) et un gène symbiotique (nodA). Nous avons confirmé qu'A. mangium était essentiellement nodulé par des Bradyrhizobium. La comparaison des communautés symbiotiques issues de la zone d'origine et des zones d'introduction montre une importante diversité dans la région d'origine et une diversité plus réduite dans les zones d'introduction. En Australie, quelques génotypes sont majoritaires et persistent durant 20 ans. Une structuration phylogéographique et un isolement par la distance à une échelle mondiale ont été mis en évidence pour le gène symbiotique nodA. Enfin, lorsque A. mangium a été introduit conjointement avec une souche sélectionnée, le devenir de cet inoculum est variable en fonction des essais d'introduction. De plus, nous mettons en évidence des phénomènes de transfert du gène symbiotique nodA entre une souche introduite et les bactéries autochtones. Les résultats acquis nous permettent d'émettre des recommandations en termes de sauvegarde de la biodiversité microbienne symbiotique en zone naturelle, et sur la pertinence de procéder à des inoculations lors de la mise en place de plantations d'A. mangium
From Australia, its native area and since three decades, the legume tree Acacia mangium Willd. has been introduced in many tropical countries, sometimes with selected rhizobium strains. A. mangium symbiotic nodule bacteria have been sampled in Australia at different times (1986, 2007, 2009), as well as in countries where it was introduced for inoculation trials (Brazil, Senegal and Malaysia). More than 500 isolates were obtained and checked for homologous nodulation. They were then characterized on the housekeeping recA and symbiotic nodA genes. We demonstrated through this study that A. mangium was almost always nodulated by Bradyrhizobium. Phylogenies of the obtained sequences were made, showing a high level of bacterial diversity in the native area, and a much more reduced diversity in introduced areas. In Australia, some genotypes were predominant and persist over 20 years. A phylogeographic structuration and isolation by distance at a global scale were demonstrated for the nodA symbiotic gene. Among introduced areas, the main result was the unsystematic occurrence of inoculated strains. We highlighted horizontal nodA symbiotic gene transfer between inoculated and indigenous bacterial strains. These data allow to make recommendations in terms of microbial diversity conservation in natural areas and on the need for inoculation of A. mangium in forestry practices

Le sol est une ressource non renouvelable à conserver en raison de son importance socio-économique et environnementale. Mais, les activités (bio)industrielles peuvent le dégrader et entraîner l'apparition de friches à pollutions persistantes. La capacité de Miscanthus x giganteus à s'adapter aux sols de friches pollués en éléments traces métalliques (ETM), tout en favorisant la consolidation des processus de bioremédiation des polluants, sans entraîner d'impact négatif sur l'environnement, est étudiée. Des terrains lorrains, très impactés par l'activité industrielle passée, sont utilisés. Considérant la complexité des relations sol-plante-microorganismes, différents outils d'évaluation complémentaires (i.e. in vitro, en mésocosme et sur le terrain) sont employés afin de déterminer la réponse de chaque composante et de leurs interactions et ainsi déduire la durabilité de la méthode. La culture de M. x giganteus a un potentiel pour la réhabilitation des sols de friche à pollutions multimétalliques ou mixtes (+HAP), avec un double bénéfice : la phytostabilisation des ETM au niveau racinaire et la production d'une biomasse aérienne revalorisable (transfert limité des ETM). La plante n'altère pas les caractéristiques du sol qui participent à la mobilité des ETM (pH, CEC) ; les variations de celles liées à la fertilité du sol, de la toxicité (fraction liquide) et de l'accumulation des ETM par d'autres organismes, attestent de l'interaction avec le milieu qui rendrait les éléments plus disponibles. L'activité végétale est à l'origine des associations avec les bactéries du sol, où les phylotypes potentiellement métallorésistants (Zn, Cr) semblent communs aux sols utilisés
Soil is a nonrenewable resource to maintain because of its socio-economic and environmental importance. However, (bio)industrial activities can degrade soil and cause the appearance of persistent pollution brownfields. The ability of Miscanthus x giganteus to adapt to brownfield soils polluted with heavy metals (HM), while promoting the consolidation process of bioremediation of polluants, without causing a negative impact on the environment, is studied. Soils from Lorraine region (France), very affected by past industrial activity, are used. Considering the complexity of soil-plant-microorganisms relationships, various complementary assessment tools (i.e. in vitro,mesocosm and field) are used to determine the response of each component and their interactions, and thus deduce the sustainability of the method. The culture of M. x giganteus has great potential for rehabilitation of brownfield soils having a multimetallic pollution or mixed (+PAH) with a double benefit: phytostabilisation of HM at the root level and the production of biomass reclaimable (limited transfer of HM). The plant does not alter the characteristics of the soil involved in the mobility of HM (pH, CEC) ; but changes from those related to soil fertility, toxicity (liquid fraction) and the accumulation of HM by other organisms attest to the interaction of the plant with the elements that would make them more available. Plant's activity is causing associations with soil bacteria, for which the phylopes potentially métalloresistants (Zn, Cr) seem common in soils used

Ce travail est une contribution à l'évaluation du risque induit par les bacillus (sensu lato) dans les produits pasteurisés réfrigérés à base de légumes. L'étude menée au cours de la 1ère partie de cette thèse a montré, par une approche d'identification polyphasique intégrant la rep-pcr, le système api50ch/20e et l'analyse des séquences d'adnr 16s, que les conditions de conservation de purées de légumes pasteurisées influençaient fortement la composition de leur microflore et que les températures de conservation proches de 4°c pouvaient prévenir le risque de développement de pathogènes comme b. Cereus, b. Licheniformis et b. Subtilis. Cette étude soulignait également l'apparition possible de fausses identifications par le système api50ch/20e. Le séquençage partiel semblait être une étape nécessaire pour l'identification fiable des bacillus (sensu lato). Au cours de la 2ème partie de cette thése, les légumes et agents de texture (protéines de lait et amidon) étaient identifiés comme les principales sources de contamination des purées. Le typage moleculaire des souches de b. Cereus et leurs propriétés de croissance au froid, indiquaient que les contaminants psychrotrophes présents dans les produits conservés provenaient des courgettes elles-mêmes contaminées par le sol de culture, tandis les contaminants non psychrotrophes provenaient des protéines de lait. En 3ème partie, la détection, par pcr et transferts de southern, des gènes des entérotoxines présents chez b. Cereus (hbl, nhe, cytk et bcet) ainsi que la production d'entérotoxines mesurées par 2 tests immunologiques, montraient que le gène cytk, l'association des génes cytk/hbl/nhe et la production forte d'entérotoxines étaient beaucoup moins fréquents chez les souches de b. Cereus issues d'aliments comparé aux souches issues de toxi-infections alimentaires. Ces resultats appuyaient l'hypothèse selon laquelle les souches issues d'aliments à base de légumes étaient moins propices aux toxi-infections alimentaires

Halymenia floresii, une Rhodophycée présente une surface remarquablement exempte d'épiphytes dans les conditions de l'Aquaculture MultiTrophique Intégrée (AMTI). Ce phénomène traduit la présence potentielle en surface de composés actifs allélopathiques. L'objectif de ce travail a été d'explorer les mécanismes de défense développés par H. floresii contre l'épibiose, de détecter et d'identifier les métabolites secondaires produits à la surface de l’algue et d'étudier les relations avec les bactéries épiphytes. Nous avons ainsi pu isoler la communauté épibactérienne de H. floresii cultivée dans des conditions contrôlées (AMTI) et non contrôlées (échantillons collectés in situ). Les épibactéries isolées ont été criblées in vitro pour analyser les signaux de détection de Quorum Sensing (QS). Les extraits produits en surface ont été analysés pour détecter toute interférence avec le Quorum Sensing. Les épibactéries pathogènes et non-pathogènes ont été différenciées par leur capacité à induire une maladie algale, le blanchiment. Vibrio owensii, ainsi que son signal C4-HSL QS, a été identifié comme pathogène opportuniste induisant un blanchiment. Les métabolites extraits de la surface et de cellules entières de H. floresii ont été analysés par LC-MS. Une base de données a été constituée à partir d’une analyse métabolomique non ciblée. Quarante et un métabolites actifs ont été identifiés, parmi lesquels les composés halogénés, des furanones et divers inhibiteurs étaient surreprésentés. Fait intéressant, les deux premières classes sont connues comme de puissants composés interférant avec le QS. La présence relativement élevée de métabolites allélopathiques à la surface de H. floresii soutient fortement l'hypothèse selon laquelle ils doivent être impliqués dans la protection de l'hôte. Des recherches supplémentaires seront nécessaires pour explorer l’ensemble des métabolites secondaires produits par H. floresii et leurs rôles chez l’algue
The surface of Halymenia floresii, a Mexican Rhodophyta, was observed to be remarkably free of epiphytes under Integrated MultiTrophic Aquaculture (IMTA) conditions. This suggests the presence of allelopathic active compounds released by this macroalgae. The aim of this work was to explore the defence mechanisms developed by H. floresii against surface epibiosis, to detect and identify the secondary metabolites produced at the surface of the algae, and to study its relation with surface associated bacteria. For the first time, we isolated the epibacterial community of H. floresii cultivated under controlled conditions (IMTA) and uncontrolled ones (beach-cast material collected in the area). The isolated epibacteria were screened in vitro to analyse Quorum Sensing (QS) signals, and others H. floresii surface extracts were assayed for any QS interference with them. We differentiated the epibacteria significant pathogens from the non- pathogens ones by their ability to induce bleaching, a well-known algal disease. Vibrio owensii was identified as an opportunistic pathogen inducing bleaching in H. floresii which was also associated to the presence of its C4-HSL QS signal. The surface and whole cell metabolites extracts from H. floresii specimens cultivated under controlled conditions were analysed by means of LC/MS. An untargeted metabolomic analysis of H. floresii was performed to provide a global metabolic profile as a first database. We identified ‘41’ active metabolites in H. floresii, among which halogenated compounds, furanones and various inhibitors were overrepresented. Interestingly, the first two classes are well known potent QS interfering compounds. The relatively higher occurrences of allelopathic metabolites at the surface of H. floresii strongly supports the hypothesis that they must be involved in the host protection. Further investigations are needed to explore the secondary metabolites of H. floresii et their role in the seaweed

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), comme leur tu l'indique, sont caractérisées par une inflammation chronique de l'intestin. Elles son\\ principalement constituées de deux grandes maladies : la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse ou rectocolite hémorragique (RCH). L'étiologie de ces MICI reste toutefois incertaine et sujette à différentes polémiques. Il existe plusieurs facteurs génétiques et environnementaux, tels que des changements dans la composition de la flore intestinale (dysbiose) et/ou une augmentation de la perméabilité intestinale qui jouent un rôle primordial dans le dysfonctionnement de l'immunité intestinale et peuvent également provoquer des lésions gastro-intestinales. Par ailleurs, les colites sont souvent associées à une altération de l'équilibre oxydo/réducteur qui est lié à la perturbation de la production des formes réactives de l'oxygène (FRO) produites par les complexes NADPH oxydases (NOX), donc elles sont liées à l'implication de ces complexes dans la défense de la muqueuse. Nos résultats convergent pour montrer que la bactérie AIEC LF82, qui a été prélevée et isolée d'un patient atteint de la MC, serait capable à la fois d'augmenter l'expression de NOX1 et sa sous-unité organisatrice NOXO1, ainsi que l'induction de la production des FRO dans les cellules épithéliales intestinales T84 en culture. Cette souche de E. Coli invasive augmente la production des FRO par les cellules T84 parmi d'autres souches de E. Coli testées. Cet effet de LF82 est inhibé par iodonium diphénylène (DPI) qui est un inhibiteur des flavoprotéines tels que les (NOX's), et de la N -acétylcystéine (NAC), qui est un antioxydant qui capte le H₂0₂. Cette production des FRO pourrait confirmer l'implication de NOX1 dans la production de H202 par les cellules intestinales, secondairement à la stimulation par la souche AIEC LF82. Notons qu'une telle production de FRO est absente avec le mutant LF82 ΔFimA, qui n'exprime pas le pili de typel et qui est connu pour avoir perdu la capacité d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales de l'intestin et les macrophages. Une autre souche de E. Coli non invasive Y54-1 semblerait aussi incapable d'induire la production des FRO ainsi que l'expression de NOX1. L'ensemble de ces résultats suggère que la production de 11202 par la NOX1 intestinale en réponse à l'invasion par la bactérie LF82 peut être impliquée lors des MICI. Nous avons également étudié l'effet des inhibiteurs de la production des FRO sur l'invasion, par la souche LF82, des cellules T84 ; nous avons montré que le DPI pourrait inhiber l'invasion par cette souche des cellules T84, ce qui suggère un rôle très important des flavoprotéines dans l'invasion bactérienne lors des MICI. Par ailleurs, les bactéries LF82 induisent une inhibition de l'expression des gènes codant pour les mucines (MUC2 et MUC5AC) des ales T84. Mais en présence du DPI, la bactérie devient moins efficace à inhiber expression des mucines suggérant un processus dépendant des FRO et de NOX1
Chronic inflammatory bowel diseases (IBD) are characterized by chronic inflammation of the intestine. They represent two major diseases: Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC). The etiology of IBD remains unclear. There are several genetic and environmental factors and changes in the composition of the intestinal fora (dysbiosis) and / or increased intestinal permeability, which play a crucial role in the dysfunction of intestinal immunity and can also cause gastrointestinal lesions. Moreover colitis are often associated with an alteration of the Red/Ox balance, related to the disturbance of the production of reactive oxygen species (ROS) produced by the NADPH oxidase complex or NOX, so the involvement of this complex in the mucosal defense. Our results show among the different bacteria tested, an invasive and adherent strain: AIEC LF82 which was isolated from a patient with CD is able to increase the expression of NOX1, NOXO1 and the induction of ROS production in intestinal epithelial T84 cells in culture. This effect of AIEC LF82 is inhibited by diphenylene iodonium (DPI), which is an inhibitor of NADPH oxidase flavoproteins, and N-acetylcysteine (NAC), which is a scavenger of ROS. This ROS production could support the involvement of NOX1 in H202 production following stimulation by AIEC LF82. This production is absent with the mutant LF82 AFimA, which does not express pili typel and is known to have lost the ability to adhere and invade epithelial cells of the intestine and macrophages. Taken together, these results suggest that H202 production by intestinal NOX1 in response to the invasion of AIEC LF82 bacteria may be involved in IBD. We also studied the effect of ROS inhibitors on the invasion of the LF82 strain, in T84 cells; we showed that DPI could inhibit the invasion of this strain in T84 cells. This suggests an important role of flavoproteins in bacterial invasion in IBD. Furthermore, the AIEC LF82 induced an inhibition of mucin gene expression (MUC5AC and MUC2) in T84 cells. However, in the presence of DPI, this effect was less effective suggesting a process likely to be dependent on ROS and NOX1

Les milieux arctiques sont menacés par le réchauffement global. La perspective d’une disparition totale de la banquise d’ici 2050 pose d’importantes questions quant au devenir de ces écosystèmes. Premiers maillons de la chaîne alimentaire, les algues de glace jouent un rôle capital dans le fonctionnement de ces milieux. De par leur chute rapide et la faible activité des bactéries dans ces eaux, les algues de glace contribuent à l’export du carbone vers les sédiments. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l’impact de l’état physiologique des bactéries associées aux algues de glace et des différents stress subits par ces dernières sur le devenir du matériel algal. Si nos résultats ont démontré l’importance des stress halin, chimique et photochimique sur le mauvais état physiologique des bactéries associées aux algues de glace, les interactions trophiques au sein de la glace restent complexes et l’impact du réchauffement global sur ces dernières reste à investiguer
Arctic environments are highly endangered by global warming. The view of ice-free waters by 2050 raises important questions about the future of these ecosystems. Ice algae are the roots of the Arctic food chain and play a crucial role in the functioning of these environments. Because of their rapid fall and the low biodegradation activity of bacteria in these waters, ice algae contribute to the export of CO2 to the sediments. This study focuses on the effects of the physiological state of the bacteria associated with ice algae and the different stresses they undergo on the fate of the algal material. If our results showed the importance of haline, chemical and photochemical stresses on the poor physiological state of bacteria associated with ice algae, trophic interactions within the ice remain complex and the impact of global warming on them still needs to be investigated

Les systèmes de communication chimique constituent un élément indispensable dans l'établissement des relations intra- ou inter-espèces en milieu marin, tissant un réseau de relations entre individus, au sein d'un écosystème. Les invertébrés dépourvus de système immunitaire à mémoire et au mode de vie sessile produisent des métabolites bioactifs jouant un rôle essentiel dans la réponse aux pressions environnementales telles que la prédation et la défense vis-à-vis d'autres organismes potentiellement pathogènes. L'objectif de ces travaux a été d'identifier la présence de peptides antimicrobiens chez des mollusques bivalves et des gastéropodes d'importance commerciale. Ainsi, la recherche de molécules de défense antimicrobiennes de nature peptidique a été conduite dans des extraits acides des mollusques bivalves, Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis et gastéropodes, Buccinum undatum, Littorina littorea et Crepidula fornicata, ainsi qu'à partir de l'hémolymphe de Crassostrea gigas. Les extraits ont été pré-purifiés par extraction sur phase solide C18 (SPE) et l'élution a été réalisée par 3 paliers successifs de 10%, 40% et 80% d'ACN-0,1% TFA. L'activité antibactérienne a été évaluée via la détermination de la CMI sur un ensemble de bactéries à Gram+ et à Gram- ; et l'activité antivirale a été déterminée in vitro sur le modèle virus Herpes simplex type 1/cellules Vero via la viabilité cellulaire. Les espèces C. edule, L. littorea et C. gigas se sont révélées être les espèces les plus efficaces et non cytotoxiques. Une caractérisation partielle de l'activité détectée chez ces espèces a permis de déterminer la nature peptidique des molécules actives. La purification des peptides antimicrobiens a été conduite sur l'hémolymphe de C. gigas et a permis l'identification d'un peptide dont la structure de type lantibiotique laisse présager une origine bactérienne. L'hypothèse d'une association entre C. gigas et des bactéries nous a conduit, à partir de cultures d'huîtres non axéniques, à rechercher des bactéries antagonistes dans l'hémolymphe et a permis d'isoler 2 Vibrio spp. et 3 Pseudoalteromonas spp. A partir de la bactérie Pseudoalteromonas spp. souche hCg 5, un composé actif a été partiellement caractérisé. L'ensemble de ces résultats suggère que les bactéries associées au système immunitaire pourraient jouer un rôle essentiel dans la défense des bivalves.

Les systèmes de communication chimique constituent un élément indispensable dans l’établissement des relations intra- ou inter-espèces en milieu marin, tissant un réseau de relations entre individus, au sein d’un écosystème. Les invertébrés dépourvus de système immunitaire à mémoire et au mode de vie sessile produisent des métabolites bioactifs jouant un rôle essentiel dans la réponse aux pressions environnementales telles que la prédation et la défense vis-à-vis d’autres organismes potentiellement pathogènes. L’objectif de ces travaux a été d’identifier la présence de peptides antimicrobiens chez des mollusques bivalves et des gastéropodes d’importance commerciale. Ainsi, la recherche de molécules de défense antimicrobiennes de nature peptidique a été conduite dans des extraits acides des mollusques bivalves, Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis et gastéropodes, Buccinum undatum, Littorina littorea et Crepidula fornicata, ainsi qu’à partir de l’hémolymphe de Crassostrea gigas. Les extraits ont été pré-purifiés par extraction sur phase solide C18 (SPE) et l’élution a été réalisée par 3 paliers successifs de 10%, 40% et 80% d’ACN-0,1% TFA. L’activité antibactérienne a été évaluée via la détermination de la CMI sur un ensemble de bactéries à Gram+ et à Gram- ; et l’activité antivirale a été déterminée in vitro sur le modèle virus Herpes simplex type 1/cellules Vero via la viabilité cellulaire. Les espèces C. Edule, L. Littorea et C. Gigas se sont révélées être les espèces les plus efficaces et non cytotoxiques. Une caractérisation partielle de l’activité détectée chez ces espèces a permis de déterminer la nature peptidique des molécules actives. La purification des peptides antimicrobiens a été conduite sur l’hémolymphe de C. Gigas et a permis l’identification d’un peptide dont la structure de type lantibiotique laisse présager une origine bactérienne. L’hypothèse d’une association entre C. Gigas et des bactéries nous a conduit, à partir de cultures d’huîtres non axéniques, à rechercher des bactéries antagonistes dans l’hémolymphe et a permis d’isoler 2 Vibrio spp. Et 3 Pseudoalteromonas spp. A partir de la bactérie Pseudoalteromonas spp. Souche hCg 5, un composé actif a été partiellement caractérisé. L’ensemble de ces résultats suggère que les bactéries associées au système immunitaire pourraient jouer un rôle essentiel dans la défense des bivalves
The chemical communication systems constitute an essential element in the establishment of intra- or inter-species relationships in marine environment, weaving a dense network of relations between individuals, in ecosystem. The invertebrates lacking of an immune system and usually sessile produce this type of bioactive metabolites playing a crucial role in the answer to the environmental pressures like the predation and the defence against potentially pathogens organisms. The aim of this work was to identify antimicrobial peptides in commercially bivalve and gastropod marine molluscs. Thus, the search for antimicrobial molecules from peptidic nature was undertaken in acid extracts of bivalve molluscs Cerastoderma edule, Ruditapes philippinarum, Ostrea edulis, and gastropods Crepidula fornicata, Buccinum undatum and Littorina littorea and from Crassostrea gigas hemolymph. The extracts were pre-purified by Solid Phase Extraction C18 (SPE) and elution was ensured by three successive steps of 10%, 40% and 80% of ACN-0. 1% TFA. The antibacterial activities were assayed by determination of the CMI against a panel of target bacteria including Gram+ and Gram- bacteria. In parallel, antiviral activities were assayed in vitro against Herpes simplex virus type 1 and Vero cells by cell viability. The species C. Edule, L. Littorea and C. Gigas proved to be the most effective and non cytotoxic species. A partial characterization of the activity detected in these species allowed determining the protenaceous nature of the active molecules. The purification of antimicrobial peptides realised on the C. Gigas hemolymph led us to the identification of a peptide which structure lets foresee a bacterial origin. The hypothese of an association between C. Gigas and bacteria led us from non axenic oysters culture to search for antagonist bacteria in C. Gigas hemolymph and has conduced to isolate 2 Vibrio spp. And 3 Pseudoalteromonas spp. The Pseudoalteromonas spp. HCg 5 strain, allowed to partially characterized an active compound. Whole of these results suggests that the bacteria associated with the immune system could play an essential function of defence in bivalves

La conception de nouveaux produits laitiers fermentés fonctionnalisés avec les peptides bioactifs est l'une des stratégies prometteuses pour le développement d'aliments fonctionnels. L'objectif de cette thèse s'inscrit ainsi dans une démarche de production d'un lait fermenté contenant un peptide anxiolytique, l'alpha-casozépine (alpha-CZP ; f91-100 de la CN-alpha s1 bovine) ou du fragment plus court (f91-97). Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité des peptides bioactifs vis-à-vis des souches ayant le phénotype PrtS+ (LMD-9) et PrtS- (CNRZ1066) de S. thermophilus. Il s'est avéré que les deux souches sont capables d'hydrolyser le peptide en fragments plus courts par l'activité peptidasique de surface. Il a été vérifié que l'hydrolyse n'est due ni aux peptidases intracellulaires issues d'une éventuelle lyse cellulaire ni à la protéase chaperonne HtrA. Les activités de type amino-, X-prolyl dipeptidyl-, carboxy-peptidases et peptidyl dipeptidase de surface ont été mises en évidence. L'ajout de peptides bioactifs dans des laits fermentés nécessite donc la caractérisation préalable du potentiel protéolytique des bactéries lactiques. Afin de n'ajouter qu'un type de peptides et non pas une fraction peptidique, nous avons exprimé de manière hétérologue l'alpha-CZP sous forme multimérique chez L. lactis en utilisant le système d'induction NICE. Il a été révélé par le test ELISA qu'une petite quantité d'alpha-CZP multimérique a été produite par les cellules induites mais également non induites par la nisine. Le ralentissement important de la croissance des cellules de L. lactis recombinante induites par la nisine suggère que le multimère peptidique a des effets toxiques sur les cellules
The designing of novel fermented milk products functionalized with bioactive peptides is one of the promising strategies to develop functional foods. The objective of the thesis is thus the development of fermented milks comprising of an anxiolytic peptide, alpha-casozepine (f91-100 of bovine alpha s1 CN) or its shorter fragment (f91 97). Firstly, we studied the stability of different bioactive peptides towards two strains, with PrtS+ (LMD¬9) and PrtS- (CNRZ1066) phenotypes, of S. thermophilus, a starter bacterium widely used for the manufacture of yogurt. It was revealed that both strains hydrolysed the peptides into shorter fragments by surface peptidases. The hydrolysis was neither due to intracellular peptidases eventually released from cell lysis nor to extracellular chaperone protease HtrA, since mutant LMD-9-deltahtrA also showed the same type of hydrolysis. Aminopeptidase, X-prolyl dipeptidyl peptidase, peptidyl dipeptidase and carboxypeptidase activities associated to the cell-surface of both strains were observed. Therefore, addition of bioactive peptides in fermented milks requires well prior characterization of the proteolytic potential of lactic acid bacteria. Finally, in order to add only one type of peptides instead of a peptide fraction, we expressed heterologously alpha-CZP in multimeric form in L. lactis using NICE system. It was revealed by ELISA test that a small quantity of recombinant alpha-CZP multimer was produced by both nisin-induced as well as non-induced cells. The significant decrease in the growth of nisin-induced recombinant L. lactis suggests that the peptide multimer has toxic effects on the cells

L’entérobactérie Dickeya dadantii est responsable de la maladie de la pourriture molle sur de nombreux hôtes végétaux. Ce symptôme est essentiellement dû à la production d’un arsenal d’enzymes qui dégradent la pectine, ciment des parois des cellules végétales. Parmi ces enzymes, les pectate lyases (Pels) ont un rôle majeur dans le pouvoir pathogène en raison de leur capacité àreproduire, sous forme purifiée, le symptôme de la pourriture molle. La synthèse des Pels est soumise à un contrôle très fin qui fait intervenir différents régulateurs agissant de manière intégrée via un réseau de régulation. De nombreuses conditions environnementales modulent la synthèse des Pels via l’action de ces régulateurs. La température est un facteur qui agit sur leur synthèse et pour lequel les mécanismes moléculaires restaient non élucidés. Lors de cette étude, nous avons montré que le régulateur PecT, un répresseur du réseau de régulation, intervient dans la thermorégulation de la synthèse des Pels. PecT s’est avéré être également impliqué dans la thermorégulation de deux autres fonctions de virulence : la mobilité et la synthèse desexopolysaccharides de surface. La quantification des transcrits des gènes de ces 3 fonctions de virulence a permis de montrer que l’action de PecT dans ce contrôle a lieu au niveau transcriptionnel. Le mécanisme moléculaire de la thermorégulation exercée par PecT a été étudié plus en détail sur les gènes pel. Des résultats obtenus in vivo ont montré que la fixation de PecT sur les régionsrégulatrices des gènes pel est plus efficace quand la température augmente. La croissance de D. dadantii à hautes températures induit un relâchement de l’ADN. De manière remarquable, un relâchement artificiel de l’ADN par un traitement inhibant la gyrase entraine une augmentation de la fixation de PecT sur les gènes pel même pour des cellules cultivées à basses températures. De plus, la délétion de PecT se traduit par une augmentation de la capacité de D. dadantii à induire la pourriture molle à hautes températures. Ainsi la topologie de l’ADN et PecT agissent de manière concertée pour moduler la synthèse des Pels en fonction de la température.L’ensemble de ces données apporte une preuve supplémentaire de l’importance de la dynamique structurale de la chromatine dans l’ajustement de la physiologie bactérienne en réponse aux variations des conditions environnementales
Bacteria are colonizers of various environments and host organisms, and they are often subjected to drastic temperature variations. Dickeya dadantii is a Gram-negative pathogen infecting a wide range of plant species. Soft rot, the visible symptom, is mainly due to the production of pectate lyases (Pels) that can destroy the plant cell walls. Production of Pels is controlled by a complex regulation system and responds tovarious stimuli, such as presence of pectin, plant extracts, growth phase, temperature or iron concentration. Although many studies have been carried out, the mechanisms of control of Pels production by temperature have not yet been elucidated. In bacteria, thermoregulation acting at the level of transcription initiation occurs usually both via transcription factors and DNA topology. We show that PecT, a previously identified repressor, is involved in the thermoregulation of the pel gene expression. Using in vivo Chromatin ImmunoPrecipitation (ChIP) coupled to quantitative RT-PCR(qRT-PCR), we reveal that PecT binding to the pel gene promoters is modulated by temperature. By manipulating the DNA topology in vivo, we further show that DNA supercoiling state is involved in the thermoregulation of pel gene expression by PecT. In addition, we show that the development of the pathogenicity of the pecT mutant according to changes in temperature is different from that of the parental strain. This report presents a new example of how plant pathogenic bacteria use transcription factor and DNA topology to adjust synthesis of virulence factors in response to temperature variation

Les bacteries fixatrices d'azote du genre azospirillum sont associees aux racines de graminees, et sont d'interet agronomique en favorisant la croissance des cereales. Les azospirilles possedent des plasmides de grande taille moleculaire et cette etude porte plus particulierement sur ceux des bacteries appartenant a l'espece lipoferum. Des plasmides de 150 mda (appeles p150) sont retrouves exclusivement dans l'espece lipoferum. Une region homologue aux genes nodpq d'a. Brasilense a ete localisee sur le p150 d'a. Lipoferum 4b. Ce p150 utilise comme sonde radioactive hybride avec tous les plasmides de cette taille moleculaire contenus mans des souches isolees d'origines geographiques differentes. Cependant, bien que partageant de nombreuses regions conservees, ces p150 ne sont pas identiques. Afin d'associer des phenotypes aux plasmides indigenes de la souche 4b, la mobilisation, le transfert, et la replication du p150 prealablement marque par le transposon tn5-mob dans agrobacterium mtumefaciens ont ete obtenus. La propriete d'utiliser la tyrosine comme seule source de carbone est une des fonctions trouvee sur le p150. Le marquage des plasmides indigenes de la souche 4b par le tn5-mob-sac a ete realise dans le but d'une selection directe des clones gueris. Cependant, l'impossibilite de guerir azospirillum de ces plasmides indigenes montre leur grande stabilite. Une region homologue aux genes mel (melanine) a ete localisee sur deux plasmides de 270 mda presents dans deux souches isolees de la meme niche ecologique: la souche 4b et pseudomonas paucimobilis 5aj. Les polyphenol-oxydases sont les enzymes responsables de la production de melanine; cette activite a ete detectee chez la plupart des souches d'a. Lipoferum. Chez les formes immobiles d'azospirillum, une activite phenol-oxydase de type laccase a ete mise en evidence

Les infections associées au soins (IAS) sont un problème majeur de santé publique, notamment du fait qu’elles participent à la menace mondiale que représente l’antibiorésistance qui devrait en 2050 causer 10 millions de décès par an et se placer comme la première cause de mortalité dans le monde. La forte consommation d’antibiotiques, la promiscuité et la vulnérabilité des patients font de l’hôpital un lieu privilégié pour la transmission de bactéries notamment résistantes aux antibiotiques, et pour les phénomènes épidémiques. Les surfaces de l’environnement hospitalier jouent un rôle important dans ces phénomènes, en servant de réservoir et de relais aux agents responsables d’IAS. Mieux connaitre la diffusion des bactéries responsables d’IAS sur les surfaces de soins apparait alors comme un axe majeur de recherche. Dans ce travail, afin d’observer la circulation et la persistance, sur les surfaces hospitalières, des bacilles à gram négatifs (BGN) responsables d’IAS, et d’identifier les raisons de la diffusion et du succès épidémique de certaines espèces bactériennes et sous-populations bactériennes responsables d’IAS, des prélèvements intensifs de surfaces, au total 5329, ont été réalisés. Deux sources de contamination des surfaces de l’environnement hospitalier ont été considérées : l’origine hydrique avec P. aeruginosa comme chef de file, et l’origine humaine avec les bactéries productrices de carbapénèmases (BPC).Ce travail nous a permis de collectionner 567 souches environnementales issues d’un échantillonnage de terrain. Pour chaque souche, des données clinico-éco-épidémiologiques ont été recueillies. Cette collection de souches isolées en conditions réelles est le socle de cette thèse et constitue toute son originalité. Elle nous a permis de tracer, au plus près des conditions réelles, les routes de transmission des bactéries responsables d’IAS sur les surfaces de soins. Ainsi nous avons pu identifier des réservoirs environnementaux de BGN et analyser la circulation entre l’eau du point d’eau, les surfaces de soins et les patients pour les bactéries d’origine hydrique, et entre les surfaces de soins et les patients pour les bactéries d’origine humaine. Lors de l’analyse de ces circulations sur les surfaces de soins, les différents niveaux de complexité de la diversité des populations et sous-populations bactériennes ont pu être intégrés. Considérer cette complexité dans sa globalité semble être la clef pour mieux comprendre le rôle de l’environnement de soins dans la transmission de bactéries responsables d’IAS et les phénomènes épidémiques. De plus ce travail, a démontré que l’environnement proche des patients était le reflet des bactéries colonisant/infectant les patients tout en apportant des informations supplémentaires sur sa diversité. Ainsi le patient au sein de son environnement de soins devrait être considéré comme une seule unité de transmission afin de mieux anticiper la diffusion des bactéries dans l’environnement de soins et les phénomènes épidémiques
Healthcare-associated infections (HAI) are a major concern of Public Health because of their involvement in the global threat of antibiotic resistance, predicted to become the first cause of mortality in 2050 with about 10 million deaths a year. The high antibiotic consumption associated with both patients’ promiscuity and vulnerability make hospital an ideal place for cross-transmission of bacteria, especially drug-resistant bacteria, and for outbreak occurrence. Surfaces within hospital environment play an important role in these phenomena, serving as reservoir or relay for bacteria responsible of HAI. Better understand the diffusion of bacteria responsible of HAI onto hospital surfaces appears as a major axe of research.In order to observe the circulation and persistence of gram-negative bacteria (GNB) involved in HAI onto hospital surfaces, and to identify the reasons of diffusion and outbreak successes of certain bacterial species and sub-species, we performed intensive samplings of hospital environment, with a total of 5329 surfaces sampled. Two sources of contamination were considered: the hydric origin with Pseudomonas aeruginosa in leading position, and the human origin with carbapenemase-producing bacteria (CPB).During this work, we collected 567 strains by sampling the hospital environment. For every strain, both clinical, ecological and epidemiological data were gathered. The strains collection isolated in real conditions of hospital activities is the foundation of this thesis and constitutes its originality. It permitted to retrace, as close as possible to real-life conditions, the routes of transmission of bacteria responsible of HAI on hospital surfaces. This allowed us to identify environmental reservoirs of GNB and analyze the circulation of hydric bacteria between water and water point-of-use, surfaces and patients, as well as the circulation of human bacteria between patients and hospital surfaces. These analyses integrated the different levels of complexity of bacteria through the diversity of bacterial population and sub-populations. Considering this complexity as a whole seems to be the key to better understand the involvement of hospital environment in the transmission of bacteria responsible of HAI. Furthermore, we demonstrated that the close environment of patients reflected the bacteria colonizing/infecting patients, while providing further information on its diversity. Thus, the patient within its healthcare environment must be considered as a unique entity of transmission in order to better anticipating the diffusion of bacteria in hospital environment and the occurrence of outbreaks

Le cytosquelette bactérien des homologues d'actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L'organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l'actine eucaryote, des implications dans d'autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d'explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d'interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d'éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l'interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d'E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l'interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n'a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d'autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L'existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l'orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire.

L'avènement des méthodes de séquençage moléculaire à large échelle a permis l'identification d'altérations du microbiote digestif spécifiquement associés à l'obésité notamment un ratio Bacteroidetes/Firmicutes diminué chez les obèses. Depuis, de nombreux travaux ont décrit de nouvelles altérations associées à l'obésité, notamment une augmentation des représentants du genre Lactobacillus mais l'ensemble de ces résultats sont souvent l'objet de controverses. Afin de clarifier si le genre Lactobacillus était associé à l'obésité, nous avons réalisé deux études cas témoins (la deuxième étant le prolongement de la première avec un effectif de 263 individus) qui nous ont permis d'identifier que les altérations du microbiote digestif sont plus reproductibles au niveau de l'espèce. A ce titre nous avons retrouvé une plus grande concentration de Lactobacillus reuteri dans le microbiote digestif de sujets obèses alors que les concentrations de Bifidobacterium animalis, Methanobrevibacter smithii et Escherichia coli étaient diminuées. Nous avons pu établir une relation dose-dépendante entre la concentration de Lactobacillus reuteri et l'indice de masse corporelle. Par ailleurs, nous avons réalisé une méta-analyse sur les résultats des études publiées et avons retrouvé une association entre les genres Bifidobacterium (6 études, 348 individus) et Methanobrevibacter (3 études, 195 individus) avec l'absence d'obésité (…)
The revolution of large scale molecular sequencing methods allowed the identification of specific alterations in the gut microbiota associated with obesity such as a decreased Bacteroidetes / Firmicutes ratio in obese individuals. Since then, many studies have described different alterations associated with obesity, including an increase in members of the Lactobacillus genus, but results are often controversial. To clarify whether the genus Lactobacillus was associated with obesity, we conducted two case-control studies (the second being the follow-up of the first study with a total of 263 individuals) allowing us to understand that gut microbiota alterations are more reproducible at the species level. We found a greater concentration of Lactobacillus reuteri in the gut microbiota of obese while concentrations of Bifidobacterium animalis, Methanobrevibacter smithii and Escherichia coli were reduced. We were able to establish a dose-dependent relationship between the concentration of Lactobacillus reuteri and body mass index. In addition, we performed a meta-analysis on the results of published studies and we found an association between the Bifidobacterium (6 studies, 348 individuals) and Methanobrevibacter (3 studies, 195 individuals) with absence of obesity. (…)

Dans un contexte de destruction des zones humides à l’échelle mondiale, conséquence des activités d’origine anthropique, la restauration écologique de ces milieux et de leurs fonctions est devenue un enjeu écologique et sociétal. L’objectif de ce projet est de recréer des prairies humides à vocation agricole aux caractéristiques pédologiques et floristiques aussi proches que possible de celles des prairies totalement détruites par l’exploitation de matériaux alluvionnaires. L’étude présentée ici se focalise sur l’incidence des matériaux pédologiques utilisés pour la recréation de quatre sols sur les fonctions du sol et les cortèges floristiques associés. L’hypothèse principale est que la recréation d’un sol morphologiquement proche de celui détruit devrait permettre d’orienter la restauration écologique.L’hypothèse sous-jacente est qu’en utilisant différents matériaux pédologiques locaux, on hérite de leurs caractéristiques physico-chimiques et biologiques ce qui permettait de conserver les fonctions pédologiques qui leur sont associées et favorisait le retour d’un cortège floristique compatible avec un usage agricole. La première partie est consacrée à l’étude de deux fonctions remplies par les sols de zones humides à savoir le stockage du carbone organique et la dénitrification. Deux années et demi après la fin des travaux de comblement de ballastières, ces deux fonctions sont conservées au sein des quatre types de sols recréés. Les principaux résultats montrent un niveau d’efficience des matériaux pédologiques testés, fonction de leur sol origine et de leurs caractéristiques physico-chimiques. La deuxième partie est consacrée à l’étude des mécanismes de structuration des communautés végétales. Le suivi de la colonisation spontanée de la végétation a permis d’appréhender la forte contribution de la banque de graines issue des matériaux pédologiques locaux. Malgré la mise en évidence d’un début de trajectoires dynamiques au sein des quatre sols recréés, la similarité entre les communautés obtenues et les communautés cibles des prairies de référence n’excède pas 50 %. Les productions de biomasses aériennes associées à ces communautés sont comparables en quantité à celles des prairies de référence mais pas en qualité. La mise en place d’une gestion par semis associée à une fauche montre dès la première année une production de biomasses de qualité se rapprochant de celles des prairies locales.La dernière partie de ce manuscrit est consacrée à l’effet de trois niveaux d’engorgement des sols sur le processus de dénitrification et sur les traits de réponse d’une espèce prairiale, Holcus lanatus. Placer les quatre matériaux pédologiques dans des conditions identiques d’engorgement permet de souligner l’importance de l’héritage des communautés bactériennes dénitrifiantes sur le processus de dénitrification. Parallèlement, ces conditions expérimentales permettent de mettre en évidence les traits de réponses morphologiques et fonctionnels de l’espèce considérée. À l’issue de ces suivis, le meilleur compromis de restauration alliant sol, végétation et coûts économiques doit prendre en considération l’origine et l’histoire (i.e. gestion) des matériaux utilisés lors de la recréation écologique
In a worldwide context of wetland destruction, a consequence of anthropic activities, ecological restoration of such habitats and their functions has become a societal and ecological issue. The objective of this project is to recreate agriculture-oriented wet grasslands with pedological and floristical properties as similar as possible to typical grasslands destroyed by alluvial materials extraction. The study presented here focuses on the impact of pedological materials, used in the re-creation of four soils, on soil functions and associated floristic processions. The main hypothesis is that re-creation of a soil morphologically similar to the previously destroyed one should drive ecological restoration. The underlying hypothesis is that different local pedological materials inherit their previous physicochemical and biological properties. This should conserve associated pedological functions and favor the return of a floristic procession compatible with agricultural exploitation. The first part is dedicated to the study of carbon storage and denitrification, two wetlands soils functions. These two functions are retained within the four re-created soils two and a half year after gravel-pit filling. Main results highlight functional efficiency levels of tested pedological material inherited from their respective initial topsoil physico-chemical properties. The second part is devoted to the study of mechanisms structuring plant communities. The high contribution of local pedological materials seed bank during the colonization process and its impact on aforementioned mechanisms was highlighted from our monitoring. Despite demonstration of the start of a dynamic trajectory in the four created soils similarity between obtained and target communities never exceeds 50%. Aerial biomass production associated to these communities is comparable to the production in reference wet grasslands in terms of quantity, but not quality. Implementation of management (sowing and mowing) shows biomass production of comparable quality to reference grassland from the first year onwards. The last part focuses on the effect of three soil waterlogging levels on the denitrification process and the response traits of Holcus lanatus, a meadow species. Pedological materials placement in identical waterlogging conditions highlights the importance of denitrifying bacteria communities inheritance on the denitrification process. These experimental conditions also enabled us to highlight the considered species morphological and functional response traits. To conclude and following our monitoring the best compromise for concurrent restoration of soil and vegetation while considering cost-effectiveness needs to account for topsoils origin and history (i.e. management)

Les microbiotes humains sont considérés comme des organes supplémentaires impliqués dans des pathologies diverses, y compris infectieuses. Les déséquilibres des microbiotes, ou dysbioses, créent des niches écologiques pathologiques ou pathobiomes. Ce nouveau paradigme de l'infection s'applique tout particulièrement aux infections opportunistes. Dans ce travail, nous considérons des infections associées aux soins (IAS), les infections du site opératoire en chirurgie cardiaque, comme le résultat d'une pathologie de niche et nous étudions la dynamique des communautés et des populations microbiennes comme conditions d'émergence et de succès de l'agent infectieux. La diversité et la dynamique du microbiote chirurgical superficiel et profond de patients opérés pour pontage aorto-coronarien montrent un remplacement partiel du microbiote pré-opératoire par un microbiote spécifique avec une résilience partielle lors de la cicatrisation. Un lien significatif est observé entre la composition microbiotique et les marqueurs de risque infectieux. Le suivi de la structure de population d'un agent pathogène reconnu en chirurgie cardiaque, Propionibacterium acnes, montre des fréquences différentielles de phylotypes selon les phases opératoires. La spécificité du microbiote opératoire consiste en une forte diversité de bactéries à Gram négatif dont certaines ont été décrites dans le microbiote de la peau saine. Nous avons réalisé une identification au niveau de l'espèce de ces bactéries de la peau saine qui s'avèrent atypiques parmi les bactéries humaines connues car elles évoquent une origine environnementale. Le réservoir cutané et non environnemental d'un pathogène opportuniste, Roseomonas mucosa, est démontré et trois populations de pathogène opportuniste à réservoir environnemental et/ou humain (Pseudomonas aeruginosa, Ochrobactrum antropi, O. intermedium) sont étudiés en termes de structure de population pour préciser les conditions de leur transmission et leur succès infectieux dans le contexte général du pathobiome et des niches écologiques perturbées. Ce contexte général permet d'organiser les résultats obtenus à diverses échelles (communauté, populations, espèces, phylotypes) pour proposer une vision intégrée et originale de la microbiologie des IAS
Human microbiota are now considered as supplementary organs involved in diseases such as infections. Microbiota disequilibrium named dysbiosis creates impaired ecological niches (pathobiomes). This new paradigm of infection is particularly relevant for opportunistic infections. In this study, we consider one major type of healthcare associated infection (HAI), the surgical site infections after cardiothoracic surgery as a pathology of niche. We study the dynamics of microbial communities and populations as conditions for emergence and success of infectious agents.The diversity and dynamics of superficial and deep surgical microbiota in patients undergoing coronary artery bypass grafting show a partial replacement of the pre-operative microbiota by a specific surgical microbiota with partial resilience during healing. Significant links are found between microbiota composition and scores for infectious risk. The population structure of Propionibacterium acnes, a pathogen complicating cardiac surgery, shows variable frequencies of phylotypes according to operative stages. Surgical microbiota appears specific with high diversity of Gram-negative bacteria, some of them being previously described in healthy skin microbiota. At the species-level, these bacteria appear atypical among known human bacteria because they are related to environmental bacteria. We demonstrate the cutaneous reservoir of the opportunistic pathogen Roseomonas mucosa deemed, until now, to be environmental. Three populations of opportunistic pathogens (Pseudomonas aeruginosa, Ochrobactrum anthropi, O. intermedium) are structured in order to precise their transmission and their infectivity in the general context of impaired ecological niche and pathobiome.The results obtained at various microbiological scale (community, population, species, phylotype) are organized in this general context in order to delineate an original integrative vision of HAI

La crevette Rimicaris exoculata est une espèce hydrothermale endémique des sites de la Ride Médio-Atlantique. Elle représente I’espèce majoritaire sur la plupart des sites qu’elle colonise. Ce crustacé possède la particularité d’avoir un céphalothorax hypertrophié â l’intérieur duquel se développe une communauté épibiotique bactérienne dense. Ce travail de thèse s’est concentré sur l’observation des changements dans la communauté épibiotique du céphalothorax de R. Exoculata au cours de son cycle de vie. Pour ensuite, rechercher qu’elles étaient les métabolismes bactériens mis en jeu dans cette communauté. Ce travail a permis de confirmer que cette communauté épibiotique est dominée par deux phylotypes, les Epsilonproteobacteria et les Gammaproteobacteria. Ils sont éliminés et recolonises le céphalothorax après chaque mue de l’hôte et sont détectés dans l’environnement (transmission horizontale). Cependant, la proportion relative de ces deux phylotypes semble varier au cours du cycle de vie de l’hôte. Les voies productrices d’énergie que sont la méthanotrophie, la sulfo-oxydation/réduction et l’hydrogénotrophie ont été détectées chez les épibiontes du céphalothorax ainsi que les voies autotrophes (cycles rTCA et Calvin) qu’elles sont supposées alimenter. Les résultats ont également montré que les voies basées sur l’oxydation des composés soufrés sembleraient majoritaires et en activité constante, alors que les voies basées sur l’oxydation du méthane et de l’hydrogène seraient dépendantes des conditions géochimiques du milieu de vie de l’hôte. Cette étude apporte de nouvelles hypothèses sur la relation entre les épibiontes du céphalothorax et Rimicaris exoculata
The shrimp Rimicaris exoculata is an endemic hydrothermal species of the Mid-Atlantic Ridge sites. It‘s the dominant species on several hydrothermal vent sites. This crustacean has an enlarged gill chamber, harboring a dense ectosymbiotic community. Until now, their acquisition and their metabolic pathways were not fully understood. This study focused on the analyses of the possible differences in the epibiotic community among the gill chamber epibiotic community along R. Exoculata life cycle. Then, we have looked for the bacterial metabolisms suspected to occur among this community. This work confirmed that the epibiotic community is dominated by two phylotypes: Epsilonproteobacteria and Gammaproteobacteria. They are eliminated and then recolonised the cephalothorax after each moult. In addition, they were detected in the environment (horizontal transmission). However, the relative proportion of these phylotypes seemed to vary along the host life cycle (eggs/larvae versus juvenile/adult). The energetic pathways such as the methanotrophy, the sulfur-oxidation/reduction and the hydrogenotrophy were detected from the cephalothorax epibionts as well as the autotrophic pathways (rTCA and Calvin cycles). Results also showed that the oxidation of the sulphur compounds seemed to be the major pathways with constant activity, whereas the oxidation of methane and hydrogen seemed to be threshold dependent and so linked to the geochemical conditions of the host life environment. This study broadened our view on the relations between the cephalothorax epibionts and the hydrothermal shrimp Rimicaris exoculata

Dans le cadre de l’étude des facteurs impliqués dans l’immobilisation des bactéries,nous nous sommes intéressés à deux polymères de la paroi, cruciaux pour la formation des biofilms : les exopolysaccharides (EPS) et le peptidoglycane (PG). Nous avons étudié le rôle des EPS de la capsule (CPS) dans la croissance immobilisée de Streptococcus pneumoniae en utilisant un milieu modèle semi-liquide. Nos résultats (i) montrent que des mutants CPS- s’échappent des colonies immobilisées, (ii) suggèrent un mécanisme de variation de phase impliquant le gène tts de la synthèse de la CPS et (iii) indiquent l’existence d’une pression de sélection contre l’immobilisation. Puisque l’intégrité du PG affecte la formation des biofilms, nous avons cherché de nouveaux facteurs moléculaires impliqués dans sa synthèse ou sa dégradation en utilisant la bactérie modèle Lactococcus lactis. L’un de ces facteurs est le gène aslA, responsable de l’incorporation du D-Aspartate dans le PG, que nous avons identifié grâce à une analyse soustractive de génome. L’inactivation conditionnelle de ce gène nous a permis de confirmer son rôle prédit et de montrer qu’il est essentiel. Nous avons également cherché les gènes permettant de réguler l’activité lytique des hydrolases du PG. Parmi eux, nous avons identifié les gènes codant pour une dé-N-acétylase (pgdA) et une O-acétylase (oatA) du PG ainsi qu’un régulateur de oatA : SpxB. Nos résultats nous ont permis de caractériser la cascade de régulations qui permet à la cellule, à partir d’un signal transduit par le système à deux composantes CesSR, de contrer l’hydrolyse de son PG en le modifiant par une O-acétylation accrue
We studied two cell wall polymers implicated in biofilm formation: exopolysaccharide (EPS) and peptidoglycan (PG). Our investigation of capsule exopolysaccharides (CPS) of Streptococcus pneumoniae revealed that (i) CPS- mutants emerge from immobilized colonies in semi-liquid medium, (ii) a phase variation mecanism may be implied in appearance of mutations in tts gene, responsible for CPS synthesis, (iii) immobilisation is the factor providing a selective pressure. Since PG integrity affects biofilm formation, we looked for new molecular factors affecting PG synthesis or degradation. One of these factors, identified by subtractive genome analysis, is the gene aslA, responsible for D-Asp incorporation in the PG. Its conditional inactivation allowed us to confirm its function as D-Asp ligase and to show that it is indispensable. We also identified genes which could regulate lytic activity of PG hydrolysis and in thus affect PG integrity. We found three genes, overexpression if which leads to more resistant to hydrolysis PG: pgdA , oatA and spxB, encoding respectively for a PG de-acetylase, a PG O-acetylase, and the positive regulator of oatA. Our results allowed us to reveal the multi-step cascade of regulatory mechanisms, provoked by cell wall stress. It starts with induction of two component system CesSR in response to cell wall stress, and ends up with O-acetylation of PG by OatA as a mean of rendering it more resistant to hydrolytic damage. SpxB appeared to be a missing link between response to cell envelope stress and PG modification

Au champ, le manque d'efficacité de la protection biologique reposant sur l'introduction de souches de Pseudomonas spp. Fluorescent a été associé au mauvais maintien dans la rhizosphère des microorganismes inoculés. Il est donc nécessaire de mieux connaître les caractères microbiens impliqués dans la compétence rhizosphérique de ces bactéries. L'objectif de notre thèse était donc d'identifier les caractères communs aux populations de Pseudomonas spp. Fluorescents compétitives dans la rhizosphère. La stratégie suivie a consisté à mettre en relation la diversité taxonomique et métabolique d'une collection de Pseudomonas spp. Fluorescents avec leur niveau de compétitivité dans la rhizosphère. L'identification taxonomique polyphasique des souches nous a conduits à décrire une nouvelle espèce (P. Lini sp. Nov). La caractérisation métabolique a porté sur leur métabolisme carboné et énergétique (utilisation de différents composés organiques comme donneurs d'électrons, et de fer et d'oxydes d'azote comme accepteurs d'électrons). Certains aspects du métabolisme secondaire ont également été pris en compte (synthèse d'antibiotiques phénazines et de NAHLs impliquées dans le phénomène de " quorum sensing "). Enfin, le taux de survie des souches a été comparé dans la rhizosphère de tomate cultivée en sol naturel. La mise en relation de l'ensemble des caractères étudiés à l'aide de méthodes statistiques adaptées (ACM) a permis de montrer que la bonne compétitivité des souches dans la rhizosphère est principalement associée au système d'acquisition du fer (sidérotype), à l'aptitude à réaliser toutes les étapes de la dénitrification et à l'aptitude à synthétiser des NAHLs. Par contre, il n'a pas été possible d'établir de relation entre la compétitivité rhizosphérique et un profil trophique particulier même si les populations présentant un bon taux de survie dans la rhizosphère sont toutes capables d'utiliser le tréhalose.

Cette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d’abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d’intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d’intervention. La détection et l’identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l’échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l’identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d’armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C’est pourquoi la première étude traite de l’interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d’enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d’exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d’échantillons par rapport à l’art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d’extraire l’ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d’une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d’un essai de détection basé sur l’amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l’identification sur biopuce de séquences d’ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d’acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d’apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d’analyse totale. Par conséquent, l’automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation.
This doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.

Cette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d’abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d’intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d’intervention. La détection et l’identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l’échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l’identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d’armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C’est pourquoi la première étude traite de l’interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d’enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d’exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d’échantillons par rapport à l’art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d’extraire l’ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d’une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d’un essai de détection basé sur l’amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l’identification sur biopuce de séquences d’ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d’acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d’apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d’analyse totale. Par conséquent, l’automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation.
Cette thèse de doctorat présente quatre études portant sur la détection des agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme. Tout d’abord, un rappel historique des guerres biologiques et du bioterrorisme permettra de mieux comprendre cette menace. Pour cibler la problématique actuelle, les agents biologiques, les procédures d’intervention des organisations de sécurité et de santé publique ainsi que les méthodes de détection seront ensuite introduites. La capacité de détection rapide des agents biologiques est une des lacunes importantes des procédures d’intervention. La détection et l’identification de ces agents biologiques nécessitent plusieurs étapes critiques interreliées. Elles consistent en l’échantillonnage, la préparation des analytes contenues dans des matrices complexes et finalement l’identification du micro-organisme en décodant des macromolécules signatures, et ce, notamment par des méthodes génotypiques. Certaines particules peuvent potentiellement être employées pour la préparation d’armes biologiques aéroportées. De plus, des poudres inoffensives (p. ex., farine) peuvent être utilisées pour terroriser certains individus, des organisations ou la population. Ces composés peuvent toutefois interférer avec les méthodes de détection moléculaire. C’est pourquoi la première étude traite de l’interférence sur la détection par la PCR de 23 échantillons poudreux ou environnementaux autres. Cet article présente une méthode séparant des spores de Bacillus de matrices poudreuses afin d’enlever ces particules nuisibles à la détection. La procédure conceptualisée est simple d’exécution (10 étapes), rapide (≤ 10 minutes), peu coûteuse (~ 10 $) et permet de traiter une plus grande variété d’échantillons par rapport à l’art antérieur. En second lieu, une lyse de spores bactériennes basée sur la sonication rapide (45 secondes) a permis d’extraire l’ADN génomique avec des rendements comparables à une autre méthode de lyse commercialisée performante nécessitant cinq minutes. Le Module fluidique de lyse ultrasonique a été confectionné pour être décontaminé et transféré d’une zone contaminée à une zone sécurisée, ce qui est un avantage important dans le contexte du bioterrorisme. Le troisième projet concerne le développement d’un essai de détection basé sur l’amplification PCR de type large spectre du gène tuf et l’identification sur biopuce de séquences d’ADN signatures grâce à une hybridation en microfluidique. Cet essai a permis de détecter rapidement (75 minutes) 12 des 13 agents bactériens aéroportés associés au bioterrorisme listés par les CDC. Finalement, les analyses de séquences du gène cible, tuf, chez le genre Yersinia, ont montré un haut niveau de divergence entre les gènes dupliqués intragénomiques, tufA et tufB (8,3 à 16,2 %). Ce résultat inattendu pourrait montrer les circonstances particulières permettant à des gènes dupliqués d’acquérir de nouvelles fonctions. De plus, cette étude a permis de faire une analyse phylogénétique de 14 des 17 espèces décrites du genre Yersinia et d’apporter des informations sur leur classification taxonomique. Prochainement, il serait intéressant de juxtaposer les différentes étapes de détection des agents biologiques présentées ici dans un système intégré d’analyse totale. Par conséquent, l’automatisation pourrait faciliter leur utilisation sur le terrain pour détecter et identifier rapidement (~1 h) des agents biologiques associés au bioterrorisme permettant de prendre en charge les victimes plus efficacement et de contribuer à enrayer la propagation.
This doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.
This doctoral thesis presents four studies regarding the detection of airborne bacterial biothreat agents. First of all, a historical review of biological warfare and bioterrorism will allow for better understanding of this threat. To focus on the current problematic, biological agents, intervention procedures of public security and health organisations, as well as detection methods will then be introduced. The lack of systems for the reliable and rapid detection of biological agents is an important limitation of intervention procedures. Many interrelated steps are required to detect and identify biological agents. They consist of sampling, sample matrix processing, and finally, microbial identification by decoding macromolecule signatures, notably using genotyping methods. Some particles potentially employed to produce airborne biological weapons could interfere with molecular detection methods. Moreover, inoffensive powders (e.g. flour) can be used as hoaxes to terrorise individuals, organisations, or the population. Therefore, the first article studied the interference on PCR detection of 23 powdery or other environmental samples. This study presents a method to separate Bacillus spores from powdery matrices to alleviate the impact of these interfering compounds. The developed procedure is fast (≤10 minutes), inexpensive (~ 10$), allows easy handling (10 steps) and treatment of a wider sample variety compared to prior art. Secondly, a bacterial spore lysis based on rapid sonication (45 seconds) allowed extraction of genomic DNA in yields comparable to a robust commercialised lysis procedure requiring 5 minutes. The Fluidic Ultrasonic Lysis Module can be decontaminated and transferred from a contaminated to a secured area, which is advantageous in the context of bioterrorism. The third project shows the development of a detection assay based on a bacterial broad-spectrum PCR amplification of the target gene tuf and the identification of signature DNA sequences using a microfluidic microarray system. This assay allowed the rapid (75 minutes) detection of 12 of the 13 airborne bacterial biothreat agents listed by the CDC. Finally, analyses of tuf gene sequences from the Yersinia genus showed a high level of divergence between intra-genomic tufA and tufB sequences (8.3 to 16.2 %). This unexpected result could reveal particular circumstances allowing duplicated genes to acquire new functions. Moreover, this study allowed a phylogenetic analysis of 14 of the 17 described Yersinia species and added information about their taxonomical classification. In the near future, it would be interesting to combine the different biothreat detection steps presented here into a total analysis system. Hence, automation could facilitate its utilisation in the field to detect and identify (~1 h) biothreat agents resulting in more efficient medical management of victims and contribute to stop propagation.

Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène causant des pertes économiques importantes. Une colonisation efficace de l’hôte requiert l’action séquentielle des facteurs de virulence dont certains sont requis dans les étapes précoces de l’infection, d’autres, par contre, agissent dans les étapes tardives. Cette thèse a consisté à caractériser le rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez E. Chrysanthemi. La protéine Fis est requise pour une synthèse appropriée des facteurs de virulence impliqués aussi bien dans les phases précoces que tardives de l’infection. L’action de Fis sur la majorité de ces facteurs se fait en partie par un mécanisme direct. Le mutant fis présente un pouvoir pathogène in planta fortement diminué. Fis a donc un rôle pivot dans la coordination de la synthèse des principaux facteurs de virulence d’E. Chrysanthemi
Erwinia chrysanthemi is a Gram-negative bacterium that causes soft rot in plants and attacks a wide range of plant species, including many crops of economical importance. Efficient host colonisation requires a sequential action of various virulence factors. Some of these factors are required in the early steps of infection, whereas other factors act in later steps. The main aim of this thesis was to evaluate the role of the nucleoid associated protein Fis in the control of Erwinia chrysanthemi virulence. Fis protein is required for appropriate synthesis of various early and late virulence factors. The mechanism used by Fis is mainly direct. Moreover, a fis mutant is severely impaired in virulence. Together, these data indicate that Fis plays a pivotal role in the coordination of the synthesis of the main virulence factors of E. Chrysanthemi during pathogenesis

A partir des caracteristiques phenotypiques et de l'analyse de la sequence de l'arn ribosomal 16s, une bacterie marine halotolerante a ete denommee marinobacter hydrocarbonoclasticus nov. Gen. Nov. Sp. (atcc 49840). La croissance sur acetate ou sur eicosane est affectee par la salinite: le temps de latence et le temps de generation sont augmentes, bien que la biomasse ne varie pas significativement. La biodegradation de l'eicosane (80-90%) n'est pas modifiee par la salinite. La souche presente une adherence moderee (40% des cellules adherees a l'hexadecane) et produit un emulsifiant extracellulaire, sans toutefois pseudosolubiliser le substrat insoluble. M. Hydrocarbonoclasticus accumule la glycine betaine a partir du milieu et ne la degrade pas. Une inhibition de la croissance et de la biodegradation par la glycine betaine a ete mise en evidence. Toutefois, la glycine betaine exerce un effet positif sur l'activite specifique de degradation ainsi que sur l'activite emulsifiante a basses osmolarites. C'est la premiere fois qu'un effet negatif de la glycine betaine sur la croissance d'une bacterie est rapporte. La souche synthetise de l'ectoine comme osmolyte principal. M. Hydrocarbonoclasticus est donc capable de s'adapter aux hautes concentrations en nac1 par l'accumulation de solutes compatibles principalement l'ectoine

La prolifération bactérienne requiert la coordination entre les grands processus du cycle cellulaire qui sont la réplication et la ségrégation de l’ADN, l’élongation et la division cellulaire. Durant leur vie, les bactéries sont exposées à différents stress endogènes ou exogènes (antibiotiques, pH, manque de nutriments…) qui peuvent perturber le cycle cellulaire. Ces conditions défavorables activent alors une réponse cellulaire qui vise à améliorer la survie aux stress. Chez E. coli, la formation de cassures sur le chromosome induit la réponse SOS qui inhibe la division des cellules. Dans ce contexte, la bactérie continue à s’allonger ce qui aboutit à la formation d’une cellule filamenteuse. La filamentation a longtemps été considérée comme un symptôme de mort cellulaire, mais des études récentes suggèrent qu’il s’agirait plutôt d’un changement de morphologie transitoire qui améliorerait la survie en conditions défavorables. L’objectif principal de cette thèse est de caractériser le processus de filamentation et surtout le redémarrage de la division du filament, permettant un retour à une croissance normale de la bactérie. J’ai pour cela mis en place une approche combinant la microscopie en cellules vivantes en chambre microfluidique, la cytométrie en flux, la microbiologie traditionnelle et la génétique bactérienne. L’association de ces techniques constitue une approche globale permettant de caractériser l’effet d’un stress sur la viabilité, la morphologie et le contenu en ADN des bactéries, et ce de la cellule unique à l’échelle de la population. Cette approche a permis de décrire comment les cellules filamenteuses se divisent rapidement en cellules viables et de comprendre comment cet état de différenciation cellulaire transitoire et réversible constitue une stratégie efficace de survie aux stress. Par ailleurs, l’expertise développée au cours de ces travaux m’a permis d’être impliqué dans l ‘étude du transfert de gène de résistance à la tétracycline par conjugaison bactérienne. Ces mêmes expertisent ont aussi permis la caractérisation de l’effet de biocides induisant la réponse aux stress de l’enveloppe et la visualisation de l’effet de la production chez E. coli de deux toxines prédites pour être impliquées dans un système d’inhibition de croissance contact-dépendant chez A. baumannii
Bacterial growth requires coordination between the main cell cycle processes that are DNA replication and segregation, elongation and cell division. During their life, bacteria are exposed to different endogenous or exogenous stresses (antibiotics, pH, nutrients starvation…) that can disturb the bacteria cell cycle. Those hostile life conditions trigger a cellular response aiming at improving survival in stress conditions. In E. coli, DNA breaks induce the SOS response that inhibits cell division while the bacteria continue to elongate, resulting in the formation of a filamentous cell. Filamentation has long been considered as a symptom of cell death, however recent studies suggest that this phenotype could instead be a transient morphology change improving the survival in hostile environments. The main objective of this thesis is to characterize the filamentation process, especially the restart of the filament division allowing to resume normal bacterial growth. To do so, I developped an approach combining live-cell microscopy in microfluidic chamber, flow cytometry, traditional microbiology technics and bacterial genetics. Association of those techniques constitutes a global approach allowing characterization of the stress effect on bacterial viability, morphology and DNA content, from the single cell to the population level. This experimental framework allowed to describe how filamentous cells quickly divide into viable cells, thus understanding how this transient and reversible cellular differentiation state constitute an efficient stress-survival strategy. Furthermore, the expertise I developed during this ph.D. project allowed me to be involved into the study of drug-resistance acquisition by gene transfer through bacterial DNA conjugation. Besides, I contributed to the characterization of the effects of biocides inducing envelop stress response and to the characterize the impact on E. coli of the production of Acinetobacter baumannii toxins predicted to be involved in contact-dependant growth inhibition

Depuis une quinzaine d'années, une étude des sédiments marins profonds a montré la présence de communautés microbiennes étonnement importante. La diversité bactérienne cultivable de sédiments profonds de la fosse Nankai (site 1173, Leg 190, ODP) a été suivie grâce à l'analyse de l'ARNr 16S. L'utilisation de la technique d'empreinte génétique en DGGE nous a permis de contrôler une évolution des populations cultivables dans différentes conditions de cultures non- sélectives (dilution de l'inoculum et concentrations croissantes de sources carbonées). Cette étude a montré la présence d'une microflore cultivable dominante de type anaérobie facultative, composée de souches bactériennes capables d'utiliser différents accepteurs terminaux d'électron. Des bactéries ont été isolées des niveaux sédimentaires situés à 4 et 300 m sous le plancher océanique et à 25, 50 et 70;C. La caractérisation de leur métabolisme respectif nous renseigne sur une activié et la survie des bactéries profondément enfouies dans les sédiments océaniques. L'analyse phylogénétique de l'ARNr 16S montre la présence de Firmicutes, de Proteobacteria gamma, delta et epsilon et quelques séquences affiliées aux CFB et aux Spirocheates. L'origine des cellules dans les sédiments du site 1173 de la fosse Nankai est incertaine mais une migration verticale à partir des habitats de surface ne peut être exclue
During the past 15 years, investigations on deep marine sediments have shown abundant microorganisms in deeply buried oceanic sediments. Bacterial diversity in Nankai Trough (site 1173, ODP, leg 190) was estimated trough cultivation and 16S rRNA analysis. Non-selective enrichment cultures were also performed in order to investigate the effects of organic carbon concentrations and inoculum dilution on microbial diversity in enrichment cultures. Moreover, to avoid bias due to strain isolation, we combined traditional cultivation methods with 16S rRNA gene based techniques. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of PCR-amplified 16S rRNA gene fragments was used to monitor the changes in culturable bacterial populations. Isolates were obtained at 4 and 300 meters below the seafloor from Nankai Trough. Pures cultures of fermentatives anaerobic heterotroph were isolated at 25, 50 and 70!C. Sequences analysis revealed 6 groups of bacterial 16S rDNAs related mostly to the Firmicutes and Proteobacteria gamma, delta and epsilon subdivision and few were identified as CFB and Spirochaetales. Metabolism and growth characteristics of three new species were determined and confirmed their adaption to deep environements

Ce travail repose sur l'etude d'une souche, nommee sgly2, isolee d'un reacteur anoxique, qui presente un comportement particulier vis-a-vis de l'oxygene. Elle est, en effet, capable de reduire simultanement nitrate (ou nitrite ou protoxyde d'azote) et oxygene, et ce, jusqu'a des concentrations en oxygene dissous non limitantes. Le principal produit de la reduction du nitrate est alors l'azote moleculaire. Les cultures en mode continu n'ont fait que confirmer ces premieres observations. Les effets compares d'inhibiteurs de la chaine respiratoire et de la synthese proteique, de detergent, sur la souche sgly2 soumise a differentes conditions d'aeration, ont permis de mettre en evidence une partie des mecanismes grace auxquels cette souche est capable de fonctionner en presence d'oxygene: (i) expression d'une nitrate reductase quelles que soient les conditions de culture, (ii) existence d'un double systeme enzymatique. Ces proprietes particulieres de co-respiration de la souche sgly2 ont ensuite ete utilisees dans la realisation d'une co-culture associant, dans un meme reacteur aerobie, une flore nitrifiante complexe et le denitrifiant aerobie. Le maintien de la souche sgly2 s'est fait par ajout de facon intermittente de la source de carbone. Dans ces conditions, une activite simultanee de la flore nitrifiante et du denitrifiant a ete observee, avec reduction aerobie des n-oxydes produits par les autotrophes en protoxyde d'azote et azote

L'etude de la degradation des composes aromatiques naturels et xenobiotiques par la flore associee au termite champignonniste pseudacanthotermes spiniger a mis en evidence les capacites de cette flore a degrader ce type de composes. Le champignon exosymbiote du termite, termitomyces eurhizus, presente des capacites degradatives en aerobiose limitees aux monoaromatiques naturels trisubstitues comportant au moins un oh (syringate, gallate), et a un type de tanins hydrolysables. Seule la degradation du syringate fait apparaitre un intermediaire aromatique majeur (3 - o- methylgallate). Le gallate et les tanins sont directement mineralises. Cette flore exosymbiotique presente egalement de fortes capacites a degrader certains xenobiotiques halogenes toxiques (2,4 dichlorophenol ; 2,4,6 trichlorophenol ; pcp et 2,4 dichlorophenoxyacetate), depassant celles de certaines souches fongiques commerciales. Leur biodegradation aboutit a l'ouverture du cycle aromatique. La numeration de la flore bacterienne mesenterique et proctodeale, aerobie et anaerobie, revele une forte densite de bacteries ( 10#+#1#0 bact. /ml eq. Tube digestif) capables de degrader les composes aromatiques. La microflore aerobie (mesenterique et proctodeale) degrade les monomeres mono (coumarate), di (ferulate, vanillate), et trisubstitues (syringate) ainsi que des tanins hydrolysables. Leur degradation passe par des voies classiques connues. Par contre, la microflore anaerobie (mesenterique et proctodeale) presente la particularite de degrader le syringate en passant par le protochatechuate, ceci constitue une nouvelle voie de degradation anaerobie. Le pcp et le 2,4 dichlorophenoxyacetetate sont degrades aerobiquement par la flore intestinale du termite. Quatre souches bacteriennes anaerobies isolees du tube digestif de p. Spiniger sont capables de degrader en culture pure des tanins hydrolysables. Ce sont des bacilles sporulants gram-positifs, formant des chaines atteignant parfois 100 de long.

Ce travail est composé de 3 parties. La première est une étude épidémiologique avec la détection moléculaire des spécimens appartenant à six espèces d’Argasidés collectées en Algérie et identifiées morphologiquement et par biologie moléculaire. Nous avons pu détecter Borrelia hispanica dans des Ornithodoros occidentalis et Borrelia cf turicatae dans des Carios Carpensis. Dans des Argas persicus nous avons pu identifier un nouveau génotype de Bartonella spp ainsi qu’un génotype appartenant à une nouvelle espèce dans la famille des Anaplasmataceae. Dans la 2e partie, nous avons évalué la capacité vectorielle des punaises de lit à transmettre Borrelia recurrentis, l’agent de la fièvre récurrente. Pour ce fait, nous avons utilisé un modèle expérimental d’infection artificielle de Cimex lectularius par B. recurrentis pour ensuite détecter la présence de la bactérie dans les fèces. Nous avons utilisé quatre approches : la détection par qPCR, la culture à partir des fèces, la FDA (Fluorescein Diacetate) et l’inoculation des fèces aux souris. Nous avons également utilisé l’Immunofluorescence pour localiser la bactérie dans le corps de la punaise. Nous avons constaté que les punaises de lit acquièrent la bactérie et excrètent des microorganismes vivants dans les fèces. Elles peuvent être considérées comme vecteur potentiel de Borrelia recurrentis. La troisième partie s’intéresse à l’évaluation de la capacité du MALDI-TOF MS à identifier les puces, les punaises et les pathogènes associés
This work focuses on three main parts, a first part presents an epidemiological study of bacteria associated with soft ticks in Algeria, or we identified morphologically and confirmed by molecular biology six species of Argasidae. In addition, looking further we could detect Borrelia hispanica in Ornithodoros occidentalis and Borrelia cf turicatae in Carios Carpensis. On the other hand, in Argas persicus a new genotype of Bartonella spp has been identified as well as a new species of Anaplasmatacea bacteria.A second part evaluates the vectorial capacity of bed bugs to transmit Borrelia recurrentis, the agent of the relapsing fever. For this reason an experimental model of artificial infection of Cimex lectularius by Borrelia recurrentis has been developed, to study the presence of bacteria in feces. In this model, four approaches were used: qPCR, fece’s culture, FDA (Fluorescein Diacetate) and fece’s inoculation to mice. Immunofluorescence was also used to detect the location of the bacteria in the body of the bed bug. We confirmed that bed bugs acquire the bacteria and excrete live microorganisms in the feces. They can be considered as potential vector of Borrelia recurrentis.The third part is an assessment of the capacity of MALDI-TOF MS to identified fleas, bed bugs and associated pathogens. This innovative tool, which has revolutionized medical entomology and has shown its efficiency to identify several species of arthropods, has also been able to distinguish between infected and uninfected fleas and bugs, and even distinguish between fleas and bugs infected by the same species of bacteria

La maladie de Crohn (MC) est une affection inflammatoire chronique du tube digestif dont l'étiologie est multifactorielle. Les lésions iléales des patients atteints de MC sont anormalement colonisées par des souches pathogènes de Escherichia coli appartenant au pathovar AIEC pour " Adherent-Invasive E. coli ". Ces souches sont capables d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales, et ont la capacité de survivre et de se multiplier fortement en macrophages en induisant une synthèse intense de TNF-α. L'objectif de ce travail s'inscrit dans la compréhension des mécanismes permettant aux bactéries AIEC de coloniser la muqueuse intestinale et d'induire les stades précoces de la pathologie. Une précédente étude menée au laboratoire avait permis de mettre en évidence l'importance de l'activation de la voie de régulation dépendante du facteur bactérien sigma alternatif RpoE (ou σE) dans le processus d'adhésion et d'invasion des cellules épithéliales intestinales par la souche AIEC de référence LF82 via l'expression des pili de type 1 et des flagelles. En continuité de ces travaux, nous montrons que l'activation de la voie de signalisation dépendante du facteur σE est également primordiale pour la capacité des souches AIEC à former des biofilms, et une analyse bioinformatique ayant pour but d'identifier les gènes régulés par σE a montré que l'opéron waaWVL, impliqué dans la biosynthèse du lipopolysaccharide, est primordial pour la formation de biofilm par les souches AIEC. De plus, nous avons mis en évidence que les long polar fimbriae (LPF) sont impliqués dans le ciblage de l'épithélium associé aux plaques de Peyer par les bactéries AIEC, et ceci en leur permettant de cibler spécifiquement les cellules M. L'inactivation du gène Nod2, gène de susceptibilité à la MC, conduit à une augmentation du nombre de plaques de Peyer ainsi que des cellules M à leur surface, indiquant que les bactéries AIEC pourraient tirer avantage d'une susceptibilité génétique pour cibler les plaques de Peyer.