Tesis sobre el tema "Attivita' farmacologica"

Spiro-beta-lactams were syntetized by means of the "Staudinger ketene-imine" reaction between non-symmetrical bisobstituted cyclic ketenes, generated from N-acyl-1,3-thiazolidine-2-carboxilic acids, and imines. The opening of the 1,3-thiazolidine ring was studied obtaining azetidine-2,3-diones. Antibacterial activity of spiro-beta-lactams were tested.

The transition metal-catalyzed allylic alkylation (Tsuji-Trost type reaction) is a powerful tool for C-C, C-N, and C-O bond formation, which has been widely applied to organic chemistry over the last decades. Typical substrates for this transformation are activated allylic compounds such as halides, esters, carbonates, carbamates, phosphates, and so on. However, use of these substrates is associated with the disadvantage of generating a stoichiometric amount of chemical waste. Furthermore, these starting materials have to be prepared in an extra step from the corresponding allylic alcohol. Thus, ideal substrates would be the allylic alcohols themselves, with water being the only byproduct in this case. However, the scarse propensity of the hydroxyl moiety to act as good leaving group has significantly limited their use so far. During the last decade significant efforts have been made in order to develop more atom-economical and environmentally-friendly allylic alkylation protocols by employing allylic alcohols directly. In this PhD dissertation two main projects addressing this topic are presented. “Project 1” deals with the development of new metal-catalyzed intramolecular Friedel-Crafts (FC) allylic alkylations of electron-rich (PAPER A), as well as challenging electron-poor arenes (PAPER B) with alcohols. In “Project 2”, gold(I)-catalyzed intramolecular and stereoselective allylic alkylation reactions are reported. In particular, a FC alkylation of indole-containing allylic alcohols is presented in PAPER C. While, an O-alkylation of aminol-containing allylic alcohols is reported in PAPER D. To the best of knowledge, these reports represent the first example of gold(I)-catalyzed stereoselective alkylations with alcohols.

The transition metal-catalyzed allylic alkylation (Tsuji-Trost type reaction) is a powerful tool for C-C, C-N, and C-O bond formation, which has been widely applied to organic chemistry over the last decades. Typical substrates for this transformation are activated allylic compounds such as halides, esters, carbonates, carbamates, phosphates, and so on. However, use of these substrates is associated with the disadvantage of generating a stoichiometric amount of chemical waste. Furthermore, these starting materials have to be prepared in an extra step from the corresponding allylic alcohol. Thus, ideal substrates would be the allylic alcohols themselves, with water being the only byproduct in this case. However, the scarse propensity of the hydroxyl moiety to act as good leaving group has significantly limited their use so far. During the last decade significant efforts have been made in order to develop more atom-economical and environmentally-friendly allylic alkylation protocols by employing allylic alcohols directly. In this PhD dissertation two main projects addressing this topic are presented. “Project 1” deals with the development of new metal-catalyzed intramolecular Friedel-Crafts (FC) allylic alkylations of electron-rich (PAPER A), as well as challenging electron-poor arenes (PAPER B) with alcohols. In “Project 2”, gold(I)-catalyzed intramolecular and stereoselective allylic alkylation reactions are reported. In particular, a FC alkylation of indole-containing allylic alcohols is presented in PAPER C. While, an O-alkylation of aminol-containing allylic alcohols is reported in PAPER D. To the best of knowledge, these reports represent the first example of gold(I)-catalyzed stereoselective alkylations with alcohols.

A reduced cancer risk associated with fruit and vegetable phytochemicals initially dictated chemopreventive approaches focused on specific green variety consumption or even single nutrient supplementations. However, these strategies not only failed to provide any health benefits but gave rise to detrimental effects. In parallel, public-health chemoprevention programmes were developed in the USA and Europe to increase whole vegetable consumption. Among these, the National Cancer Institute (NCI) sponsored plan “5 to 9 a day for a better health” was one of the most popular. This campaign promoted wide food choice through the consumption of at least 5 to 9 servings a day of colourful fruits and vegetables. In this study the effects of the diet suggested by NCI on transcription, translation and catalytic activity of both xenobiotic metabolizing (XME) and antioxidant enzymes were studied in the animal model. In fact, the boost of both antioxidant defences and “good” phase-II together with down-regulation of “bad” phase-I XMEs is still considered one of the most widely-used strategies of cancer control. Six male Sprague Dawley rats for each treatment group were used. According to the Italian Society of Human Nutrition, a serving of fruit, vegetables and leafy greens corresponds to 150, 250 and 50 g, respectively, in a 70 kg man. Proportionally, rats received one or five servings of lyophilized onion, tomato, peach, black grape or lettuce – for white, red, yellow, violet or green diet, respectively - or five servings of each green (“5 a day” diet) by oral gavage daily for 10 consecutive days. Liver subcellular fractions were tested for various cytochrome P450 (CYP) linked-monooxygenases, phase-II supported XMEs such as glutathione S-transferase (GST) and UDP-glucuronosyl transferase (UDPGT) as well as for some antioxidant enzymes. Hepatic transcriptional and translational effects were evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis, respectively. dROMs test was used to measure plasmatic oxidative stress. Routine haematochemical parameters were also monitored. While the five servings administration didn’t significantly vary XME catalytic activity, the lower dose caused a complex pattern of CYP inactivation with lettuce exerting particularly strong effects (a loss of up to 43% and 45% for CYP content and CYP2B1/2-linked XME, respectively; P<0.01). “5 a day” supplementation produced the most pronounced modulations (a loss of up to 60% for CYP2E1-linked XME and a reduction of CYP content of 54%; P<0.01). Testosterone hydroxylase activity confirmed these results. RT-PCR and Western blot analysis revealed that the “5 a day” diet XMEs inactivations were a result of both a transcriptional and a translational effect while lettuce didn’t exert such effects. All administrations brought out none or fewer modulation of phase-II supported XMEs. Apart from “5 a day” supplementation and the single serving of lettuce, which strongly induced DT- diaphorase (an increase of up to 141 and 171%, respectively; P<0.01), antioxidant enzymes were not significantly changed. RT-PCR analysis confirmed DT-diaphorase induction brought about by the administration of both “5 a day” diet and a single serving of lettuce. Furthermore, it unmasked a similar result for heme-oxygenase. dROMs test provided insight into a condition of high systemic oxidative stress as a consequence of animal diet supplementation with “5 a day” diet and a single serving of lettuce (an increase of up to 600% and 900%, respectively; P<0.01). Haematochemical parameters were mildly affected by such dietary manipulations. According to the classical chemopreventive theory, these results could be of particular relevance. In fact, even if antioxidant enzymes were only mildly affected, the phase-I inactivating ability of these vegetables would be a worthy strategy to cancer control. However, the recorded systemic considerable amount of reactive oxygen species and the complexity of these enzymes and their functions suggest caution in the widespread use of vegan/vegetarian diets as human chemopreventive strategies. In fact, recent literature rather suggests that only diets rich in fruits and vegetables and poor in certain types of fat, together with moderate caloric intake, could be associated with reduced cancer risk.

A reduced cancer risk associated with fruit and vegetable phytochemicals initially dictated chemopreventive approaches focused on specific green variety consumption or even single nutrient supplementations. However, these strategies not only failed to provide any health benefits but gave rise to detrimental effects. In parallel, public-health chemoprevention programmes were developed in the USA and Europe to increase whole vegetable consumption. Among these, the National Cancer Institute (NCI) sponsored plan “5 to 9 a day for a better health” was one of the most popular. This campaign promoted wide food choice through the consumption of at least 5 to 9 servings a day of colourful fruits and vegetables. In this study the effects of the diet suggested by NCI on transcription, translation and catalytic activity of both xenobiotic metabolizing (XME) and antioxidant enzymes were studied in the animal model. In fact, the boost of both antioxidant defences and “good” phase-II together with down-regulation of “bad” phase-I XMEs is still considered one of the most widely-used strategies of cancer control. Six male Sprague Dawley rats for each treatment group were used. According to the Italian Society of Human Nutrition, a serving of fruit, vegetables and leafy greens corresponds to 150, 250 and 50 g, respectively, in a 70 kg man. Proportionally, rats received one or five servings of lyophilized onion, tomato, peach, black grape or lettuce – for white, red, yellow, violet or green diet, respectively - or five servings of each green (“5 a day” diet) by oral gavage daily for 10 consecutive days. Liver subcellular fractions were tested for various cytochrome P450 (CYP) linked-monooxygenases, phase-II supported XMEs such as glutathione S-transferase (GST) and UDP-glucuronosyl transferase (UDPGT) as well as for some antioxidant enzymes. Hepatic transcriptional and translational effects were evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot analysis, respectively. dROMs test was used to measure plasmatic oxidative stress. Routine haematochemical parameters were also monitored. While the five servings administration didn’t significantly vary XME catalytic activity, the lower dose caused a complex pattern of CYP inactivation with lettuce exerting particularly strong effects (a loss of up to 43% and 45% for CYP content and CYP2B1/2-linked XME, respectively; P<0.01). “5 a day” supplementation produced the most pronounced modulations (a loss of up to 60% for CYP2E1-linked XME and a reduction of CYP content of 54%; P<0.01). Testosterone hydroxylase activity confirmed these results. RT-PCR and Western blot analysis revealed that the “5 a day” diet XMEs inactivations were a result of both a transcriptional and a translational effect while lettuce didn’t exert such effects. All administrations brought out none or fewer modulation of phase-II supported XMEs. Apart from “5 a day” supplementation and the single serving of lettuce, which strongly induced DT- diaphorase (an increase of up to 141 and 171%, respectively; P<0.01), antioxidant enzymes were not significantly changed. RT-PCR analysis confirmed DT-diaphorase induction brought about by the administration of both “5 a day” diet and a single serving of lettuce. Furthermore, it unmasked a similar result for heme-oxygenase. dROMs test provided insight into a condition of high systemic oxidative stress as a consequence of animal diet supplementation with “5 a day” diet and a single serving of lettuce (an increase of up to 600% and 900%, respectively; P<0.01). Haematochemical parameters were mildly affected by such dietary manipulations. According to the classical chemopreventive theory, these results could be of particular relevance. In fact, even if antioxidant enzymes were only mildly affected, the phase-I inactivating ability of these vegetables would be a worthy strategy to cancer control. However, the recorded systemic considerable amount of reactive oxygen species and the complexity of these enzymes and their functions suggest caution in the widespread use of vegan/vegetarian diets as human chemopreventive strategies. In fact, recent literature rather suggests that only diets rich in fruits and vegetables and poor in certain types of fat, together with moderate caloric intake, could be associated with reduced cancer risk.

2009 - 2010<br>L’Adenosina (Ado) è una molecola segnale di origine purinica che esplica le sue funzioni metaboliche mediante quattro recettori metabotropici (A1, A2A, A2B, A3). L’Ado è un autacoide ad attività pleiotropica, che regola numerosi processi fisio-patologici, inclusi i processi a carattere infiammatorio/immunitario come il cancro (Ramkumar et al., 1993). L’Ado è prodotta da due enzimi, il CD39 e il CD73, la cui attività aumenta in condizioni ipossiche determinando un accumulo di Ado ad elevate concentrazioni, nel tessuto interessato dall’ipossia, come quello tumorale. In tali condizioni, l’Ado esercita complessivamente potenti effetti immuno-soppressivi, mediati dal recettore A2A, che favoriscono la crescita tumorale. Tuttavia, in ragione della sua signaling pathway il recettore A3 può presentare effetti opposti a quelli dell’A2A. Studi clinici hanno evidenziato che il recettore A3 dell’Ado, la cui espressione aumenta significativamente nei tessuti cancerosi rispetto a quelli “normali”, potrebbe essere considerato un importante marker tumorale. Inoltre, agonisti selettivi del recettore A3 dimostrano potenziali effetti antitumorali sia in vitro che in vivo. Recenti studi hanno dimostrato che la riduzione dei livelli di Ado generata dal CD73 nel tumore può rappresentare un’altra importante strategia terapeutica per limitare la crescita tumorale. Alla luce di ciò, lo scopo del presente progetto di ricerca, è stato quello di studiare il ruolo di potenziali targets molecolari ad attività anti-tumorale del sistema adenosinico, individuati nelle vie di trasduzione del segnale come il recettore A3, o nei processi metabolici di sintesi e di degradazione dell’Ado, come il CD73. I risultati ottenuti durante i quattro anni di dottorato sono stati ripartiti, nei seguenti obiettivi: 1. nella prima parte del progetto è stata valutata l’attività anti-tumorale di un agonista selettivo del recettore A3, il 2-chloro-N6-(3-iodobenzyl)adenosine-5’-N-methylcarboxamide (Cl-IB-MECA), in un modello in vitro di carcinoma tiroideo, utilizzando una linea cellulare di carcinoma papillare differenziato (NPA), in quanto, statisticamente, è la forma più comune di carcinoma della tiroide. Dai nostri esperimenti è emerso che il ClIB-MECA è in grado di ridurre significativamente la proliferazione delle NPA attraverso un blocco del ciclo cellulare nelle fasi G0/G1. 2. alla luce dei dati ottenuti in vitro dai precedenti esperimenti, è stato studiato l’effetto del Cl-IB-MECA in associazione con il TRAIL, attualmente in clinical trial per il trattamento del carcinoma tiroideo, ampiamente studiato anche in ragione della sua elevata selettività farmacologica. Gli esperimenti sono stati effettuati su linee cellulari di carcinoma tiroideo follicolare (FRO) e anaplastico (ARO), considerati i due isotipi più aggressivi nell’uomo, che difatti, come già riportato in letteratura, evidenziano una diversa resistenza al trattamento con TRAIL. Sebbene il Cl-IB-MECA non influenzi la proliferazione di nessuna delle due linee cellulari di carcinoma tiroideo, somministrato in associazione con TRAIL è in grado di incrementarne significativamente gli effetti apoptotici osservati nelle FRO rispetto alla somministrazione di solo TRAIL, attraverso un meccanismo NF-Bdipendente. 3. data la stretta correlazione tra infiammazione e tumore, nonché tra rilascio di Ado, espressione di A3R e crescita tumorale, abbiamo valutato l’attività del Cl-IB-MECA su diverse popolazioni cellulari della risposta immunitaria, tra cui macrofagi (MØ), cellule dendritiche (DCs) e linfociti T, la cui presenza a livello della lesione tumorale aumenta significativamente dopo trattamento con Cl-IB-MECA in animali impiantati con cellule di melanoma B16-F10, come dimostrato in uno studio parallelo al presente progetto. Da studi in vitro è emerso che il Cl-IB-MECA è in grado di incrementare significativamente la produzione delle citochine pro-infiammatorie IL-12 e TNF-da parte delle suddette popolazioni cellulari, attraverso un meccanismo d’azione dipendente dalla modulazione delle signaling pathways dell’ cAMP, PI3K/Akt, PKC e NF-B. 4. Infine, l’obiettivo ultimo del presente progetto è stato quello di studiare un secondo target molecolare del sistema adenosinico, attualmente di grande interesse scientifico, il CD73, considerato l’enzima limitante la sintesi dell’Ado. A tal proposito lo studio è stato effettuato in vivo in un modello murino di melanoma B16F10, utilizzando un inibitore selettivo del CD73, l’ α,β-metilene adenosine-5’-diphosphate (APCP). Nel nostro modello sperimentale, l’APCP riduce significativamente la crescita tumorale. L’attività anti-tumorale dell’APCP è associata a un significativo aumento della percentuale di linfociti T CD8+ e linfociti B CD19+ correlato ad un corrispettivo incremento del rilascio di IFN-e IgG2b. Inoltre gli effetti anti-tumorali dell’APCP sono strettamente dipendenti dai livelli di IL-17 rilasciata nel microambiente tumorale. Nel presente progetto di Dottorato, è stato evidenziato il potenziale terapeutico ottenibile mediante la manipolazione del sistema adenosinergico il quale, alla luce dei risultati ottenuti, potrebbe rappresentare un efficace tool farmacologico per la terapia anti-neoplastica. [a cura dell'autore]<br>IX n.s.

Urotensin-II (U-II) is a cyclic peptide, originally isolated from the urophysis of the goby Gillichthys mirabilis. The human form of U-II (hU-II) is a cyclic undecapeptide. Mature hU-II is synthesized from a large precursor molecule, the prepro-U-II, whose mRNA has been found in many tissues. U-II has been identified as the endogenous ligand of a specific high-affinity receptor, recently identified as the orphan receptor GPR14 which has been renamed urotensin receptor (UT). The human UT isoform belongs to the class A superfamily of G-protein-coupled receptors. The principal physiological role of U-II in mammals is in the cardiovascular system, where it exerts a potent systemic vasoconstrictor and hypertensive effect and several lines of evidence suggested that U-II might be involved in the pathophysiology of the cardiovascular system. On endothelial cells (EC) of animal origin U-II has also been shown to exert a clearcut pro-angiogenic effect, but few experimental data are presently available clarifying the effect of U-II in human endothelium. Thus, in the present study in vitro models based on human vascular endothelial cells directly isolated from different normal human vessels, including saphenous vein (HSVEC), jugular vein (HJVEC), umbilical vein (HUVEC) and aorta (HAEC) have been used to characterize different aspects of the pro-angiogenic profile exhibited by U-II. RT-PCR and ICC analyses indicated that UT was expressed by all the human EC considered, while the expression of U-II resulted heterogeneous, in fact the peptide was detectable in HAEC and HUVEC only. When tested in the Matrigel assay all the investigated EC exhibited a strong angiogenic response to the peptide, with the formation of a meshwork of capillary-like structures of increased density and complexity when compared to the unstimulated condition. The effect was comparable to that of FGF-2 and was counteracted by Palosuran, a specific antagonist of UT, indicating that they were triggered by the binding of U-II to its receptor. Interestingly, in EC derived from adult vessels this activity was not associated with a proliferogenic effect. On the contrary, U-II induced a moderate but significant increase of cell proliferation in HUVEC. Experiments performed in the presence of specific inhibitors of various steps of the signaling cascade showed that the U-II induced self organization of the cells in capillary-like structures is PKC dependent and involves the activation of the ERK1/2 transduction pathway. Western blot analyses on the phosphorilated forms of these kinases provided further support to this finding. Interestingly, the pharmacological inhibition of PI3K, hindered the capacity of U-II to induce a pro-angiogenic effect on HUVEC, indicating that the PI3K/Akt pathway is also involved in regulating the process. It has also to be observed that some of the signalling pathways activated as a consequence of the binding of U-II to UT can, in principle, be started in several ways. In fact GPCR can also indirectly activate them by inducing the synthesis and release of growth factors. In this respect, the stimulation of HUVEC with U-II for 24 hours, induced AM, ET-1 and VEGF expression, as mRNA and proteins. All these factors are characterized by well known pro-angiogenic properties. Therefore U-II can also act indirectly by stimulating in HUVEC the expression of other pro-angiogenic factors. Altogether, the results of the present study suggested that U-II, in addition to regulating cardiovascular function, also exerts a direct action on the development and remodelling of the vascular network.<br>Urotensina-II (U-II) è un peptide ciclico, originariamente isolato dall’urofisi del pesce Gillichthys mirabilis, la cui isoforma umana (hU-II) è costituita di 11 aminoacidi. hU-II matura è sintetizzata da un precursore più grande, la prepro-U-II, il cui mRNA è stato individuato in vari tessuti. U-II è stata identificata quale ligando endogeno di uno specifico recettore ad alta affinità, il recettore orfano GPR14 che è stato successivamente rinominato UT. L’isoforma umana di UT appartiene alla classe A della superfamiglia di recettori accoppiati alle proteine G (GPCR). Il principale ruolo fisiologico di U-II nei mammiferi si esplica a livello del sistema cardiovascolare, dove il peptide esercita un notevole effetto ipertensivo e vasocostrittore e proprio per questo molti dati suggeriscono che U-II possa essere coinvolta nella regolazione del sistema cardiovascolare in condizioni sia fisiologiche che patologiche. In cellule endoteliali (EC) di origine animale sembra esercitare un chiaro effetto pro-angiogenico, ma pochi dati sperimentali sono attualmente disponibili per chiarire le azioni del peptide sull’endotelio vascolare umano. In questo lavoro modelli in vitro basati sull’uso di cellule endoteliali vascolari umane isolate direttamente da vasi diversi, quali vena safena (HSVEC), vena giugulare (HJVEC), vena ombelicale (HUVEC) e aorta (HAEC), sono stai utilizzati per caratterizzare vari aspetti del profilo pro-angiogenico di U-II. Analisi di RT-PCR ed immunocitochimica indicano che UT è espresso da tutte le EC umane considerate, mentre l’espressione di U-II risulta eterogenea, infatti il peptide si ritrova solo nelle HUVEC e nelle HAEC. Sottoposte a coltura su Matrigel, tutte le EC analizzate presentano una forte risposta angiogenica al peptide, con conseguente formazione di una rete di strutture capillaro-simili di maggiore densità e complessità rispetto alla situazione di controllo. L’effetto è comparabile a quello indotto da FGF-2 ed è antagonizzato da Palosuran, antagonista specifico di UT, ad indicare che l’attività del peptide è innescata dal legame con il suo recettore funzionale. E’ stato interessante notare che nelle EC derivate da vasi adulti questa azione non è associata ad un effetto proliferativo. Al contrario, U-II induce un moderato ma significativo aumento della proliferazione cellulare nelle HUVEC. Esperimenti condotti in presenza di specifici inibitori di vari step della cascata di segnalazione intracellulare dimostrano che l’auto-organizzazione in strutture capillaro-simili delle EC indotta da U-II è PKC-dipendente e coinvolge l’attivazione del pathway di trasduzione di ERK1/2. Analisi di western blot sulle forme fosforilate di queste chinasi hanno confermato i dati ottenuti con il Matrigel. Inoltre, l’inibizione farmacologica di PI3K, ostacola la capacità di U-II di indurre un effetto pro-angiogenico nelle HUVEC, indicando che anche il pathway PI3K/Akt potrebbe essere coinvolto nella regolazione del processo. E’ da considerare che alcuni pathway attivati come conseguenza del legame di U-II ad UT, potrebbero essere innescati in diversi modi. Infatti, i GPCR potrebbero anche attivarli indirettamente inducendo la sintesi ed il rilascio di fattori di crescita. A questo proposito, si è messo in evidenza come, dopo 24 ore di stimolazione, U-II induca nelle HUVEC l’espressione di AM, ET-1 e VEGF, tutti fattori con proprietà pro-angiogeniche note. A tempi più lunghi, quindi, U-II potrebbe anche agire indirettamente stimolando nelle HUVEC l’espressione di altri fattori pro-angiogenici. I risultati di questo lavoro suggeriscono quindi che U-II, oltre a regolare la funzionalità cardiovascolare, potrebbe anche esercitare un’azione diretta sullo sviluppo e il rimodellamento vascolare.

It is known that food intake is regulated by interactions between neuronal and hormonal signals arising throughout the body and specific areas of the brain, mainly in the hypothalamus. Among the peripheral mediators, ghrelin could have a primary role in the regulation of feeding. Ghrelin is an endogenous 28 amino acid peptide produced and secreted mainly by the stomach, and it is characterized by endocrine and extra-endocrine effects including the ability to stimulate GH secretion and feeding behaviour. In the last several years new synthetic peptidic and non peptidic compounds, named growth hormone secretagogues, have been shown to share with ghrelin many activities. The purpose of this study was the characterization of new peptide-mimetic analogues of ghrelin, synthesized at the Institut des Biomolecules Max Mousseron, University of Montpellier, that might be considered for developing novel therapeutic agents useful in the treatment of cachexia or, at the opposite, of diet-induced obesity. Cachexia is a condition characterized by loss of lean and fat body mass, anorexia, asthenia and increased energy expenditure. On the other hand obesity results in a chronic imbalance between energy intake and energy expenditure. We set up a chinese hamster ovary (CHO) cell line stably expressing the human GHS-R1a. The activity of the novel compounds was studied using an intracellular mobilization calcium assay. Cells stimulated with ghrelin or hexarelin showed a significant and specific increase in intracellular free calcium. Hexarelin, a synthetic hexapeptide, known to be a full agonist of the GHS-R1a, was used as positive control in all the following experiment. This in vitro model allowed to characterize four agonists and four antagonists of the GHS-R1a. Next, the agonists have been tested in vivo in a rat model of cachexia. Rats were treated daily with 1 mg/kg cisplatin from day 1 through day 3, whereas the test compounds were administered twice a day from day 1 through day 11. In all experimental groups cisplatin induced a significant weight loss that reached the maximum at day four, then the weight started to increase again. Rats treated with JMV2894 had a faster body weight gain compared to the other experimental groups. Interestingly, despite the different rate of body weight gain, the total amount of food eaten over the treatment period was not significantly different among the different groups. These data suggest that the recovery of body weight was not correlated to the orexigenic effect of the agonists used. In the obesity model, mice were fed for 9 weeks with a hypercaloric high-fat diet (HFD) or a standard diet until the body weight of HFD group was doubled compared to controls. Thereafter groups of mice were treated with antagonists of the GHS-R1a, namely JMV 2959 and EP 80317. Interestingly, the treatment with EP80317 inhibited body weight gain in HFD mice. In conclusion, the data of this research show that JMV 2894 is capable to counteract the weight loss induced by cisplatin cachexia, whereas EP 80317 is effective in inhibiting body weight gain in a model of diet-induced obesity.

Among the epileptic syndromes, temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form in adults. It is the consequence of a brain damage (viral infection, stroke, trauma, cancer ...), capable of triggering a cascade of events culminating in the appearance of spontaneous seizures that are, in many cases, difficult to control with the usual drug therapy. The period that elapses between the initial insult and the development of spontaneous recurrent seizures (SRSs) is defined "epileptogenesis”. The cellular and tissue changes that occur during this phase mainly interest the hippocampal region and include: neurodegeneration, neurogenesis, neuroinflammation and reactive gliosis, angiogenesis, and reorganization of brain circuits. Recently, it was shown that supplementation of neurotrophic factors (NTFs), such as FGF-2 (fibroblast growth factor-2) and BDNF (brain derived neurotrophic factor), has anti-epileptogenic effects by reducing neuronal death, favoring a correct neurogenesis and restoring a proper balance between excitatory and inhibitory circuits. In the main study reported in this thesis, we examined if this treatment can also affect neuroinflammatory processes. We used the pilocarpine model, in which an episode of status epilepticus (SE) is followed by an epileptogenic lesion. After three days, herpes viral vectors expressing FGF-2 and BDNF were injected in the hippocampus. Four, 11 and 25 days after treatment (DAI), animals were sacrificed and their brains removed to analyze the expression of three markers of inflammation: IL-1β, GFAP (a marker of astrocytosis), Ox42 (marker of microglia). The results show a very marked reduction of IL-1β expression, evident as early as 4 days after inoculation of the viral vector, and delayed, but significant, attenuation of the other two markers. The sprouting of mossy fibers is another characteristic of the epileptic hippocampal tissue, in which the axons of granule cells form excitatory synapses with cells not usually innervated, forming a circuit that may favour hyperexcitability. The results show that treatment with neurotrophic factors reduce aberrant sprouting of nerve fibers, in a way that correlates with the attenuation of cellular damage. Parallel behavioral studies have also highlighted the ability of the treatment to reduce the frequency and severity of SRSs that, in this model, begin to occur about 21 days after status epilepticus. Despite the promising results, clinical applicability of neurotrophic factors is limited by the choice of an appropriate route of administration. In the experiments reported in this thesis, herpes viral vectors have been used. These vectors were replication defective and engineered to express the two NTFs. However, their residual toxicity makes them unsuitable for human application. Stem cells modified to express genes of interest, including mesangioblasts (MABs), have demonstrated, in vitro, the ability to promote differentiation, survival and neuronal function. Last but not least, the ability to localize in the damaged site when systemically administered makes these cells viable alternatives to more invasive treatments. Although further investigations are required, the results collected in this thesis are an important contribution to the understanding of the multiple effects of NTFs. In addition, the characterization of an alternative and more applicable route of administration renders gene therapy with neurotrophic factor more applicable for the treatment of several neurodegenerative diseases.

Nella prima fase di questo lavoro di tesi sono state messe a punto le sintesi di derivati cumarinici recanti un’unità pirazolica o isossazolica sia come sosti-tuente nella posizione 3, sia fusi con gli stessi sistemi eterociclici applicando la metodologia sintetica da noi precedentemente messa a punto per i derivati chinolinonici. Nella seconda fase si è passati alla sintesi di nuovi prodotti chinolinonici e cumarinici fusi con cicli a sette termini di tipo 1,4-diazepinico: tali prodotti sono stati ottenuti dalle reazioni di opportuni derivati acetilici e benzoilici sia della chinolina che della cumarina con 1,4-dinucleofili quali 1,2-diamminoetano e derivati. Preme evidenziare come l’impiego di derivati chirali dell’etanolammina quali l’(R)-(-)-1-amino-2-propanolo, l’(R)-(-)-2-amino-1-propanolo e l’(S)-(+)-2-amino-1-propanolo abbia permesso la sintesi di derivati chinolinonici 1,4-ossazepinici chirali. Su alcuni composti diazepinici e ossazepinici ottenuti sono stati effettuati primi test di citotossicità verso alcune linee cellulari tumorali grazie alla collaborazione con ricercatori dell’Università di Padova. I risultati mostrano come i composti in esame risultino poco attivi su tali linee cellulari, ma non citotossici, se non ad alte concentrazioni, e ciò costituisce un dato interessante che permette di ipotizzare una possibile applicazione farmacologica, con un ridotto rischio tossicologico, verso altri tipi di patologie.

Vengono presentate nuove alternative sintetiche per l’ottenimento di nuove 2-oxoalcossicumarine,variamente sostituite sia sull’anello cumarinico che in catena laterale, allo scopo di un loro successivo impiego, quali intermedi chiave, nella sintesi di analoghi di composti naturali. Sono state così sintetizzati numerosi analoghi della geiparvarina che differiscono dal prodotto naturale per la presenza di metili sul nucleo cumarinico e/o l’assenza del metile in posizione 3’ ecc. In particolare da test farmacologici preliminari sembra che l’assenza del raggruppamento metilico in posizione 3’ renda il nuovo composto più efficace rispetto al prodotto naturale quale inibitore selettivo della isoforma MAO-B. Infine nella seconda fase del dottoratoi è stata messa a punto una nuova metodologia sintetica per l’ottenimento sia dello psoralene che di alcuni suoi metilderivati. Tali composti, a tutt’oggi assai difficilmente sintetizzabili, risultano essere particolarmente ambiti per studi di attività farmacologica.La metodica ha permesso, ad esempio, di ottenere il 2-metilpsoralene con resa complessiva dell’80% a partire dal commerciale umbelliferone, aprendo così la strada alla sintesi di nuovi derivati psoralenici funzionalizzati nella posizione 2 quali possibili e innovativi inibitori della proteina chinasi C responsabile dell’effetto antiproliferativo della terapia PUVA.

La MetS è una condizione clinica che colpisce circa il 25-35% della popolazione e caratterizzata da uno stato infiammatorio diffuso e correlata ad un insieme di fattori di rischio quali obesità, dislipidemia, ipertensione e resistenza all'insulina, in grado di aumentare la possibilità di sviluppare malattie cardiovascolari, ictus e diabete. La forza trainante della sindrome metabolica è sicuramente l’obesità che è caratterizzata da un eccessivo accumulo di grasso corporeo che può essere dovuto sia all’iperplasia che all’ipertrofia degli adipociti. Nel tessuto adiposo di individui obesi è stata evidenziata un'aumentata espressione del TNF‐α, il quale ha un ruolo cruciale nello stato infiammatorio legato all’obesità. Un'infiammazione cronica di basso grado e un'attivazione del sistema immunitario, osservate nell'obesità viscerale, possono giocare un ruolo importante nella patogenesi dei disturbi metabolici correlati all'obesità. Questi disturbi metabolici aumentano il rischio di sviluppo di diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e malattie cardiovascolari. Il T2DM è la patologia metabolica più diffusa al mondo ed è caratterizzata principalmente da resistenza all’insulina che può essere causata da difetti a carico del recettore insulinico (IR) e della via di segnale a valle. Negli ultimi anni è aumentato l’interesse verso diverse molecole bioattive di origine naturale e gli studi si sono concentrati sulla valutazione dei loro potenziali effetti benefici sulla salute umana, in particolare per evidenziare una eventuale attività modulatrice positiva sulla funzione endoteliale e sul metabolismo dei lipidi e del glucosio. Nella presente tesi è stato preso in esame un estratto di antocianine (ACN), Medox® Biolink Group AS, Sandnes, Norvegia, un integratore alimentare disponibile in commercio costituito da 17 antocianine (tutti glicosidi di cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina e malvidina) estratte da mirtilli (Vaccinium myrtillus) e ribes nero (Ribes nigrum). Le antocianine sono polifenoli noti per le proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e antiiperglicemiche, per valutarne l’effetto protettivo in vitro nei confronti dell’infiammazione ed insulino-resistenza indotta da acido palmitico (PA) in adipociti murini 3T3-L1. Successivamente abbiamo concentrato l’attenzione su un estratto metanolico di foglie di Glycyrrhiza glabra L. (GGLME) e del D-pinitolo, un ciclitolo naturale di cui è ricco l’estratto, per valutarne l’attività nei confronti dell’infiammazione e dell’insulino-resistenza indotta da PA in cellule endoteliali e adipociti. In questo caso si è voluto anche tener conto della possibilità di utilizzare le foglie di G. glabra, generalmente scarto della produzione della liquirizia, come fitocomplesso utile per il trattamento di patologie correlate alla MetS. Per quanto riguarda l’estratto ACN, i dati hanno dimostrato un effetto protettivo nei confronti dell’infiammazione e insulino-resistenza negli adipociti, ripristinando i livelli di PI3K e di pAkt alterati da PA; inoltre l’estratto ACN ha dimostrato esercitare effetti positivi sulla via insulinica alterata da PA negli adipociti con un effetto insulino-sensibilizzante. In maniera analoga all’estratto ACN, anche l’estratto metanolico di foglie di G. glabra, ricco in D-pinitolo, ha mostrato un effetto protettivo nei confronti dell’infiammazione e insulino-resistenza negli adipociti. Infatti, i nostri dati dimostrano, per la prima volta, che il pretrattamento con GGLME ha inibito la via proinfiammatoria di NF‐κB, indotta da PA, in modo dose-dipendente. Inoltre i dati ci hanno permesso di osservare che l’effetto ottenuto con GGLME è paragonabile a quello del D-pinitolo lasciando ipotizzare che il contenuto di questo inositolo influenza prevalentemente l’attività antiinfiammatoria e insulino-sensibilizzante osservata. Ancora, dai dati ottenuti, l’estratto GGLME, così come il D-pinitolo, ha dimostrato un effetto insulino-mimetico. I risultati ottenuti sugli adipociti sono stati confermati anche su un altro modello sperimentale che impiega le HUVEC esposte ad alte concentrazioni di PA. I dati ottenuti pretrattando le cellule HUVEC con GGLME dimostrano che l’estratto in esame è stato in grado di ripristinare la sensibilità all’insulina, alterata da PA, aumentando a valle i livelli di pAkt ed eNOS. Anche nelle cellule endoteliali, i dati confermano che l’effetto esercitato dal GGLME è sovrapponibile a quello del D-pinitolo supportando ulteriormente l’importante ruolo del D-pinitolo contenuto nell’estratto. Inoltre, sia l’estratto che il D-pintolo inducono, anche in questo modello sperimentale, un effetto insulino-mimetico, già dimostrato negli adipociti. Essendo GGLME ricco anche di altri metaboliti secondari, in particolare flavonoidi, diidrostilbeni, non è possibile escludere che l'effetto protettivo di GGLME, osservato nei confronti dell’infiammazione e dell’insulino-resistenza indotte da PA, sia parzialmente dovuto ai composti polifenolici in esso contenuti. Quindi un'interazione sinergica tra i componenti bioattivi di questo estratto (D-pinitolo e polifenoli) può contribuire a migliorare, anche in modo significativo, l'efficacia protettiva dell'estratto nella sua interezza. Anche se sono necessari ulteriori studi in vivo (su animali e sull'uomo) per chiarire e confermare l'efficacia dimostrata in vitro, i risultati consentono di ipotizzare una possibile applicazione di questi estratti vegetali nella prevenzione di condizioni patologiche legate alla sindrome metabolica.