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Tesis sobre el tema "ARN interférant"
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Leite, Nascimento Thais. "Lipoplexes recouverts d’acide hyaluronique pour le ciblage d’ARN interférant à des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44". Thesis, Paris 11, 2015. http://www.theses.fr/2015PA114834/document.
Texto completoResumen
Des progrès récents dans l’utilisation préclinique et clinique des petits ARN interférents (siRNA) ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteur de la synthèse protéique dans de nombreuses pathologies comme le cancer. L’administration des siRNA rencontre un certain nombre de problèmes liés à leur dégradation rapide dans les milieux biologiques, ainsi qu’à leur difficulté à pénétrer au sein des cellules cibles en raison de leur hydrophilie et de leur charge négative. Une des clés de l’amélioration de l’efficacité thérapeutique de ces molécules repose sur l’emploi de vecteurs. Au cours de cette thèse, des lipoplexes capables de protéger les siRNA contre la dégradation et de favoriser leur transport jusqu’aux cellules cibles ont été développés et optimisés. Pour ce faire, des lipoplexes recouverts d’HA ont été formulés pour la vectorisation active de siRNA vers des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44. Dans la première partie de cette thèse, la formation des lipoplexes a été étudiée, ainsi que les paramètres influençant leur organisation supramoléculaire. L'insertion de l'HA dans la structure du liposome au moment de la formation des vésicules a entraîné une augmentation de la taille des liposomes en fonction de la concentration d’HA. Leur complexation avec les siRNA a encore augmenté la taille des particules obtenues. L’ajout des acides nucléiques lors de la formation des lipoplexes a provoqué un déplacement d'une partie du conjugué HA-DOPE de la structure des lipoplexes, comme montré par électrophorèse capillaire. La titration calorimétrique isotherme et les études de diffraction des rayons X ont démontré que, sous l’effet des interactions électrostatiques avec les siRNA, un réarrangement des bicouches lipidiques a lieu, conduisant à la formation de vésicules oligolamellaires, confirmé visuellement par cryo-microscopie. Enfin, le positionnement convenable de l’HA sur la surface des lipoplexes et sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs de CD44 ont été démontrés par la technique de résonance plasmonique de surface. Dans la deuxième partie de cette thèse, la capture cellulaire et localisation intracellulaire des lipoplexes-HA ont été évalués par cytométrie en flux et microscopie de fluorescence, et ont montré que les lipoplexes modifies par l’HA sont internalisés plus rapidement que les lipoplexes non modifiés, et une fois dans des cellules, ils sont localisés principalement à l’intérieur des endosomes. La capacité des lipoplexes à transporter des molécules de siRNA intactes au cytoplasme a été confirmée par 81 % d'inhibition d'expression de luciferase in vitro sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549-luc. In vivo, le traitement avec les lipoplexes-HA transportant un siRNA anti-luciferase a mené à une diminution statistiquement significative de l’expression de luciferase, ce qui a été confirmé par la réduction de l'expression d’ARNm de la luciferase dans le poumon des animaux traités avec les lipoplexes-HA. L'analyse de la distribution des lipoplexes dans les poumons a montré que les lipoplexes modifiés par l’HA sont distribués de façon plus importante et plus homogène dans le tissu pulmonaire que les lipoplexes non modifiés. Dans la troisième partie de cette thèse, la diffusion des lipoplexes-HA de siRNA dans le mucus a été étudié, afin d’évaluer la faisabilité de l’administration pulmonaire de ces particules. Les études utilisant la technique de « multiple particle tracking (MPT) » ont montré que la présence d’HA combinée à l'ajout de siRNA ont permis l’obtention de deux formulations de lipoplexes présentant une pénétration efficace dans le mucus, les lipoplexes-HA and les lipoplexes-PEG/HA. En conclusion, un système efficace de lipoplexes utilisant siRNA pour l'inhibition de l'expression génique ciblant les récepteurs CD44 a été développé. Les résultats obtenus confirment que les HA-lipoplexes sont capables de libérer efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules in vitro et in vivoRecent progresses in the preclinical and clinical use of small interfering RNA (siRNA) have shown their potential as an inhibitor of protein synthesis in many diseases such as cancer. The administration of siRNA encounters a number of problems related to their rapid degradation in biological media, and their difficulty in penetrating targeted cells due to their hydrophilicity and negative charge. A key to improving the therapeutic efficacy of these molecules is based on the use of vectors. In this thesis, lipoplexes that can protect siRNA against degradation and facilitate their transport into target cells were developed and optimized. To do this, lipoplexes covered with HA were formulated for active vectorization of siRNA to tumor cells overexpressing the receptor CD44.In the first part of this thesis, the formation of lipoplexes was studied, and the parameters influencing their supramolecular organization. Insertion of HA within the liposome structure during vesicle formation resulted in the increase in liposome size as a function of HA concentration. Their complexation with siRNA has further increased the size of the particles obtained. The addition of siRNAs when forming lipoplexes caused a displacement of a portion of the HA-DOPE conjugate from the lipoplexes structure, as shown by capillary electrophoresis. The isothermal titration calorimetry and X-ray diffraction studies showed that a rearrangement of the lipid bilayers occur under the effect of electrostatic interactions with siRNAs, leading to the formation of oligolamellar vesicles, which was visually confirmed by cryo-microscopy. Finally, the proper positioning of the HA on the surface of the lipoplexes and its ability to specifically bind to the CD44 receptors has been demonstrated by the surface plasmon resonance technique.In the second part of this thesis, cellular uptake and intracellular localization of HA-lipoplexes were assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy, and showed that lipoplexes modified by HA are internalized more rapidly than unmodified lipoplexes, and once in the cells, they are mainly localized within the endosomes. The ability of lipoplexes to transport intact siRNA molecules to the cytoplasm was confirmed by 81% of luciferase in vitro expression inhibition on the lung cancer cell line A549-luc. In vivo, treatment with HA-lipoplexes carrying anti-luciferase siRNA led to a statistically significant decrease in expression of luciferase, which was confirmed by reducing the mRNA expression of luciferase in lungs of animals treated with HA-lipoplexes. The analysis of the distribution of lipoplexes in the lungs showed that lipoplexes modified with HA are distributed more evenly in the lung tissue than unmodified lipoplexes.In the third part of this thesis, the movement of siRNA HA-lipoplexes in the mucus was studied to assess the feasibility of administering these particles directly to the lungs. Studies using the technique of "multiple particle tracking (MPT)" showed that the presence of HA combined with the addition of siRNA allowed the preparation of two lipoplexes formulations with efficient mucus-penetration, HA-lipoplexes and PEG/HA-lipoplexes.In conclusion, an efficient siRNA lipoplex system for inhibiting gene expression targeted TO the CD44 receptorS has been developed. The results confirm that the HA-lipoplexes are able to effectively release in vitro and in vivo the siRNA molecules in the cytoplasm of cells
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Martins, Aline. "flam and co : mise en place d'une répression programmée des éléments transposables par la voie des piARNs dans le soma gonadique au cours du développement chez Drosophila melanogaster". Electronic Thesis or Diss., Université Clermont Auvergne (2021-...), 2024. http://theses.bu.uca.fr/nondiff/2024UCFA0081_MARTINS.pdf.
Texto completoResumen
Seuls 2 % du génome humain est codant ; le reste est majoritairement constitué de séquences répétées parmi lesquelles se trouvent les éléments transposables (ÉTs). Présent dans le génome de tous les organismes séquencés - et représentant près de 45 % de l'ADN humain -, les ÉTs sont des séquences nucléotidiques capables de se mouvoir dans le génome ; ce phénomène de transposition en fait de forts agents mutagènes internes, raison pour laquelle les organismes ont mis au point différents stratégies afin de réguler leur mobilisation.La voie des piARNs est un mécanisme conservé dans le tissu reproducteur des métazoaires afin de réguler l'expression des ÉTs. Les clusters de piARNs sont des loci dédiés à la production des piARNs, acteurs clefs de la voie pour protéger le génome de la lignée germinale contre l'invasion de ces ÉTs, potentielles sources de mutations et de pathologues transmissibles.Chez la drosophile, la voie des piARNs est aussi présente dans les cellules somatiques bordant les cellules germinales et supportant leur développement. Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du rôle des petits ARN dans la formation de l'hétérochromatine et la répression des ÉTs, les mécanismes par lesquels ces processus sont mises en place au cours du développement et maintenus à travers les divisions cellulaires, en particulier dans les cellules somatiques, restent sous-explorés. Notre étude a pu démontrer que, contrairement aux clusters de piARNs germinaux, dont l'identité est acquise par un dépôt maternel de petits ARNs aux premiers stades embryonnaires, l'expression du cluster somatique majoritaire, flamenco, a lieu plus tardivement, dès lors que les cellules somatiques de la gonade embryonnaire rencontrent la lignée germinale et se différencient. L'accumulation des transcrits de flamenco est non seulement nécessaire pour la mise en place de la voie des piARNs somatique, mais aussi pour son maintien tout au long de la vie de la drosophile ; la moindre perturbation de flamenco conduit en effet à une dérépression des ÉTs corrélée à une stérilité des femelles. L'étude a également été réalisée chez le mâle avec la mise en évidence d'un rôle moins drastique de flamenco dans la répression des ÉTs au sein du testiculeOnly 2% of the human genome is coding; most of the rest is made up of repeated sequences, including transposable elements (TEs). Present in the genome of all sequenced organisms - and representing almost 45% of human DNA - TEs are nucleotide sequences capable of moving around the genome. This transposition phenomenon makes them strong internal mutagens, which is why organisms have developed different strategies to regulate their mobilisation.The piRNA pathway is a conserved mechanism in the reproductive tissue of metazoans for regulating the expression of TEs. PiRNA clusters are loci dedicated to the production of piRNAs, key players in the pathway to protect the germline genome from invasion by these TEs, potential sources of mutations and transmissible pathologies.In Drosophila, the piRNA pathway is also present in somatic cells bordering germ cells and supporting their development. Despite significant progress in understanding the role of small RNAs in heterochromatin formation and repression of TEs, the mechanisms by which these processes are set up during development and maintained through cell divisions, particularly in somatic cells, remain underexplored. Our study has shown that, unlike the germline piRNA clusters, whose identity is acquired by maternal deposition of small RNAs in the early embryonic stages, expression of the majority somatic cluster, flamenco, occurs later, when the somatic cells of the embryonic gonad meet the germline and differentiate. The accumulation of flamenco transcripts is not only necessary for the establishment of the somatic piRNA pathway, but also for its maintenance throughout the life of Drosophila; the slightest disruption of flamenco leads to a derepression of TEs correlated with female sterility. The study was also carried out in males, showing that flamenco plays a less drastic role in the repression of TEs in the testis
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Angelova, Margarita. "CG7009 and CG5220 - novel tRNA methyltransferases linking tRNA biogenesis to the regulation of the sncRNA pathways". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS224.
Texto completoResumen
La répression par les petits ARN non-codant (ARNnc) est un mécanisme répandu de régulation génétique. Chez l’homme, ses dérégulations sont liées à des phénotypes et des pathologies sévères. Parmi ses voies les mieux caractérisées sont les voies des siRNA (petits ARN interférent), miRNA (microARN) et piRNA (ARN interagissant avec piwi).Ce manuscrit de thèse décrit les fonctions moléculaires de deux 2'-O-ARN-méthylases de Drosophila melanogaster conservées de la levure (Trm7) à l'homme (FTSJ1). Des mutations dans Trm7 sont liées à un défaut de croissance sévère et dans FTSJ1 à une déficience intellectuelle non syndromique liée au chromosome X. Les mouches mutantes ont une réduction de la taille des ovaires, une résistance réduite à l'infection virale par le DCV et des niveaux d'expression différentiels des éléments transposables. CG7009 est impliqué à la fois dans les voies des miRNA Ago-2-dépendante et siRNA dans la lignée cellulaire de Drosophile S2 et dans les mouches adultes. CG5220, un paralogue de CG7009, est impliqué dans la voie des miRNA Ago-2-dépendante chez les mouches, de manière similaire au CG7009. De plus, CG7009 et CG5220 ont un rôle dans la voie somatique des piRNA.L'absence de 2'-O méthylation (Nm) sur l’ARNt Phe chez les mutants CG7009 est associée à une accumulation de fragments d'ARNt (tRF). Les tRF sont des ARN stables issus du clivage des ARNt matures. Ils sont détectés dans une multitude d’organismes et ont des diverses fonctions. Des recherches récentes indiquent que les tRF sont une nouvelle classe d'ARNnc. Nos résultats établissent un lien entre la perte de Nm, l'accumulation de tRF et la régulation des voies des petits ARNnc « classiques »Small non-coding RNA-mediated silencing is a widespread mechanism of genetic repression. Its deregulations have been linked to severe phenotypes and pathologies. The best-characterized small RNA silencing pathways are the small interfering RNA (siRNA), the microRNA (miRNA) and the piwi-interacting RNA (piRNA) pathways.In this PhD manuscript are characterized the molecular functions of CG7009 and CG5220: two 2’-O tRNA methyltransferases of Drosophila melanogaster which are conserved from yeast (Trm7) to human (FTSJ1). Mutations in their yeast ortholog Trm7 are linked to a severe growth defect phenotype and in their human ortholog, FTSJ1, to non-syndromic X-linked intellectual disability (NSXLID). Mutant flies have an ovarian size reduction phenotype, decreased resistance to DCV viral infection, and differential transposable element expression levels in somatic and germinal tissues. CG7009 is involved in both the miRNA Ago-2-dependent and in the siRNA pathways in the Drosophila melanogaster S2 cell line and in developing flies. CG5220, a paralog of CG7009, is involved in the miRNA Ago-2-dependent pathway in flies, similarly to CG7009. Furthermore, CG7009 and CG5220 have a role in the somatic piRNA pathway. Lack of 2’-O methylation (Nm) on tRNAPhe in CG7009 mutants triggers differential tRNA fragmentation profiles and tRNA fragments (tRFs) accumulation. tRFs are stable RNAs derived from the cleavage of mature tRNAs, that have been detected in bacteria, plants, yeast, flies and humans and linked to various functions. Recent research point to tRFs as a novel class of sncRNAs. Our results link the loss of Nm with tRFs accumulation and the regulation of the sncRNA pathways
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Chèvre, Raphaël. "Étude du mécanisme d'action des copolymères à blocs amphiphiles pour le transfert de gène in vivo". Nantes, 2009. https://archive.bu.univ-nantes.fr/pollux/show/show?id=53397cdd-f222-4eb5-8820-49663ddd216f.
Texto completoResumen
Les copolymères à blocs amphiphiles comptent aujourd'hui parmi les vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène in vivo dans de nombreux tissus tels que le muscle squelettique, le cœur ou les poumons. Le mécanisme d'action de ces vecteurs demeure peu connu, et l'étude de ce mécanisme représente un enjeu majeur pour leur futur développement clinique. Au cours de cette thèse, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au Lutrol®, polymère efficace in vivo et déjà admis par les pharmacopées internationales. L'incapacité de ces molécules à transfecter des cellules en culture suggère que l'environnement cellulaire détermine leur mécanisme d'action. Afin d'étudier le mécanisme de ces vecteurs au niveau cellulaire, nous avons conçu un modèle permettant d'observer le mécanisme du Lutrol® sur les différentes étapes du trajet des acides nucléiques, depuis l'internalisation du transgène jusqu'à son expression. En utilisant plusieurs stratégies in vitro faisant intervenir le Lutrol® en association directe ou indirecte avec les vecteurs cationiques, nous avons déterminé son niveau d'implication dans la transfection, son rôle au niveau de la cellule et des acides nucléiques, mais également les raisons de son inaptitude à transfecter des cellules en culture en identifiant les barrières limitant son utilisation in vitro. Les résultats obtenus suggèrent fortement que le Lutrol® améliore l'efficacité de transfection par un mécanisme physico-chimique inerte et passif, aboutissant in vivo à une internalisation cellulaire du plasmide par un mécanisme de délivrance directe dans le cytoplasme, indépendant de l'endocytose, et donc en rupture avec celui des lipides cationiquesAmphiphilic block copolymers have been developed recently for their efficient in vivo transfection activities in various tissues including skeletal muscle, heart and lung. However their mechanism of action remains unknown and better understanding of this mechanism represents a major goal for the future development of this new class of vectors. In this study, we particularly focused on Lutrol®, an FDA approved polymer, because of its high in vivo efficiency and remarkably low toxicity. As block copolymers does not allow the transfection of cultured cells in vitro, we suggested that the cell environment was strongly involved in their mechanism of action. In order to evaluate the mechanism of these polymers at the cellular level, we designed a model allowing us to observe the impact of Lutrol® on the different steps involved in the nucleic acids trafficking, from the transgene internalisation to its expression. Using several in vitro transfection strategies involving direct or indirect assemblies of Lutrol® / nucleic acids / cationic vectors, we attempted to elucidate which steps were influenced by lutrol, its role on nucleic acids and cells, but also the reasons of its in vitro transfection inability. Results presented in this report strongly suggest that Lutrol® improves transfection efficiency by a passive and inert physico-chemical mechanism, leading to the enhancement of cellular uptake through a direct delivery mechanism into the cell cytoplasm, and not via an endosomal pathway, strongly contrasting with cationic lipids internalisation pathway
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Noy, Kodie. "ARN viraux et senseurs intracellulaires participant à la réponse immunitaire innée lors des infections par les arénavirus Mopeia et Lassa". Electronic Thesis or Diss., Lyon, École normale supérieure, 2024. http://www.theses.fr/2024ENSL0047.
Texto completoResumen
Les arénavirus Mopeia (MOPV) et Lassa (LASV) bloquent l'induction de la réponse interféron (IFN) de type I grâce à leur nucléoprotéine (NP) qui dégrade spécifiquement TARN double brin (ARNdb) via leur domaine exonucléasique (ExoN). Cependant, l'identité des ARNdb produits par les arénavirus et des senseurs intracellulaires capables d'induire la réponse IFN reste inconnue. J'ai émis l'hypothèse que des virus recombinants MOPV-ExoN et LASV-ExoN mutés dans leur domaine ExoN produiraient des ARNdb et que la reconnaissance de ces ARNdb par les senseurs intracellulaires pourraient activer la réponse antivirale, permettant ainsi d'identifier les ARNdb et les senseurs impliqués. J'ai pu démontré que les virus ExoN sont en effet atténués par rapport aux virus sauvages, induisant une forte réponse IFN de type I. J'ai aussi démontré que RIG-I et MAVS étaient responsables de l'induction de la réponse antivirale. En purifiant RIG-I dans les cellules infectées par les virus MOPV et LASV, j'ai pu isoler les ARN fixés à RIG-I lors de l'infection. J'ai mis en évidence une plus forte immunogénicité des ARN de MOPV liés à RIG-I que ceux de LASV et j'ai pu identifier par séquençage à haut débit les séquences virales responsables de l'activation de la réponse IFN. J'en ai confirmé l'immunogénicité par transfection d'ARN synthétiques. J'ai ensuite émis l'hypothèse que l'IFN induirait l'expression de protéines antivirales ciblant l'ARN viral qui pourraient participer au contrôle de la réplication virale. J'ai donc étudié le rôle de plusieurs protéines antivirales dans le contrôle de l'infection virale. J'ai pu mettre en évidence un rôle antiviral de deux de ces protéines sur la réplication des arénavirus. Ainsi, mon projet de thèse a permis d'améliorer les connaissances de la biologie des arénavirus et d'éclairer des différences notables entre les virus MOPV et LASV qui pourraient en partie expliquer leur différence de pathogénicitéThe genus Mammarenavirus is comprised of several highly pathogenic viruses of global health concern. Lassa virus (LASV) in particular is responsible for thousands of cases annually in Western Africa. Ail Mammarenavirus possess an exoribonuclease (ExoN) domain in their nucleoproteins (NP). This domain dégradés double-stranded RNA (dsRNA) with high affinity and therefore has been proposed to prevent the récognition of viral dsRNA produced during the viral réplication, therefore preventing the activation of the interferon (IFN) response. While the importance of this ExoN activity in arénavirus virulence is well established, nothing is known about the dsRNA molécules that are targeted by NP for dégradation and the dsRNA sensors activated by these dsRNA molécules are yet to be described. In addition, important différences may exist in the control of the IFN response by pathogenic arenaviruses such as LASV or closely related but non-pathogenic viruses such as Mopeia virus (MOPV). I addressed these questions using reverse genetics Systems developed in our laboratory. We generated recombinant LASV and MOPV with abrogated ExoN domains that are no longer able to control the IFN response. I hypothesized that these LASVExoN and MOPVExoN viruses would no longer be capable of degrading dsRNA produced during viral réplication and therefore would be recognized by the host innate immune response. I présent here novel data in A549 cells using these MOPVExoN and LASVExoN mutants, demonstrating that the MAVS signaling pathway and particularly RIG-I is responsible for LASV and MOPV sensing, viral atténuation and IFN production. I was also able to purify RNA bound to RIG-I during the réplication of these viruses, which I showed were immunostimulatory even outside of an infectious context via transfection of synthetic RNA. I also demonstrated that blocking expression of antiviral proteins allowed these ExoN viruses to replicate in A549 cells and I identified two key antiviral proteins in our infection model in A549 cells. I présent these results in the hope that it will enrich our understanding of Mammarenavirus biology, and to bring to light notable différences that we can use to explain the différence in Mammarenavirus pathogenicity and immunogenicity
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Stierlé, Vérène. "Reversion du phénotype de résistance multiple aux antitumoraux par les petits ARNs interférents". Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066612.
Texto completo
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Lavergne, Thomas. "Nouvelle méthode de synthèse d'ARN et préparation de prodrogues de siARN modifiés par des groupements acyloxyméthyle en position 2' des ribonucléosides". Montpellier 2, 2009. http://www.theses.fr/2009MON20112.
Texto completoResumen
L'explosion des technologies basées sur l'ARN a relancé la recherche de méthodes plus efficaces pour sa synthèse chimique. De plus, l'utilisation des ARN en tant que médicament est fortement limitée par des problèmes de distribution et de stabilité dans l'organisme. Ces travaux se sont donc inscrits dans ces deux enjeux majeurs : améliorer la synthèse d'ARN naturels pour faire face à la forte demande de telles molécules et développer des ARN modifiés afin d'augmenter leur efficacité in vivo. Ce manuscrit rapporte une nouvelle méthode de synthèse chimique d'ARN basée sur l'utilisation de groupements acétalester pour la protection des hydroxyles en position 2' du ribose. Cette méthode a permis de simplifier l'accès à des séquences hétéropolymères d'ARN et est actuellement évaluée pour une application commerciale. Une deuxième partie présente la synthèse d'ARN modifiés portant, après élongation et déprotection, des groupements acétalester enzymolabiles en positions 2' du ribose. Les conditions d'obtention de ces ARN, désignés par pro-ARN en vue d'une application comme prodrogues de siARN dans le mécanisme de l'ARN interférence, ainsi que leurs propriétés sont décritesExpansion of RNA based technology has revived research for more powerful methodology for chemical RNA synthesis. Moreover, use of unmodified RNA as drug is restricted by poor cell permeation and low enzymatic stability in vivo. This work was related to these two challenges : find a new efficient strategy for chemical RNA synthesis and develop modified RNA in order to improve in vivo efficiency. Here, an original methodology for chemical RNA synthesis based on the protection of ribonucleosides 2'-hydroxyl by acetalester groups is presented. Thus, natural RNA heterosequences could be obtained with high purity and efficacy. This technology is currently under evaluation for commercial application. In a second part, we describe the synthesis of modified RNA bearing biolabile acetalester groups on nucleoside 2'-hydroxyl after full deprotection of other RNA functions. Synthesis and properties of this modified RNA, named pro-RNA in relation to their potential activity as siRNA prodrugs in RNA interference mechanism, are reported
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Bégin-Lavallée, Valérie. "Inhibition fonctionnelle du récepteur CCR2 par une nouvelle approche d'interférence de l'ARN : application au domaine de la douleur". Mémoire, Université de Sherbrooke, 2012. http://hdl.handle.net/11143/6266.
Texto completoResumen
La chimiokine monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1 ou CCL2) est un neuromodulateur de l'influx nociceptif au sein du système nerveux. Son activité biologique est attribuée à l'activation du récepteur couplé aux protéines G, CCR2. Le couple CCL2/CCR2 joue un rôle important dans la genèse et le maintien de la transmission nociceptive en contidition de douleur chronique. L'ARN interférent est un outil de recherche grandement utilisé dans la découverte de nouvelle cible thérapeutique touchant les désordres du système nerveux. Son potentiel thérapeutique a aussi été investigué dans diverses études cliniques et demeure controversé. Les Dicer-substrate siRNA (DsiRNA) sont des molécules synthétiques d'ARNi qui ont été développées afin d'améliorer les paramètres pharmacologiques des siRNA. Ils ont une meilleure efficacité in vitro et in vivo à faible dose ce qui limite les effets indésirables. Ces performances s'expliquent par la longueur des DsiRNA; un duplex linéaire asymétrique de 27 nucléotides de long plutôt que de 21 mers pour les siRNA classiques. Ce mémoire présente les résultats de recherche du développement des DsiRNA sélectifs pour la cible de l'ARN messager du récepteur rCCR2 et de leur application dans la prévention de la douleur aiguë. Pour cette étude, dix DsiRNA ayant des séquences différentes ont été synthétisées puis validées in vitro. Basés sur leur performance à taire l'expression du récepteur CCR2, deux duplex ont été retenus (933 & 1049). Leur propriété a été optimisée par l'ajout de deux motifs de méthylation (2'OMe) distincts nommés M7 et Evader le long de leur séquence. Les DsiRNA anti-CCR2 ont ensuite été testés in vivo dans un modèle de douleur aiguë induit par l'injection spinale de CCL2 exogène (1µg). Pour cette étude, deux injections de DsiRNA (5µg, i.t.) couplé à l'agent de transfection peptidique Transductin ont été administrées à 24h d'intervalle à des rats sains. Au troisième jour, le modèle allodynique aiguë a été induit. Les résultats du von fry dynamique ont montré que les DsiRNA anti-CCR2 testés ont prévenu 100 % de l'allodynie mécanique induit par le modèle. Aussi, les résultats de qPCR ont montré que 72 h suivant la première administration des DsiRNA, l'effet d'interférence de l'ARNm était toujours observable dans les structures des ganglions de la racine dorsale. Les niveaux d'expression de rCCR2 étaient 50 % plus bas chez les animaux traités au DsiRNA (933 et 1049) que chez les animaux en douleur aigu non traités. Les niveaux de CCL2 étaient également abaissés, suggérant ainsi que l'effet anti-allodynique des DsiRNA passe par le blocage de la boucle d'autorégulation du couple CCL2/CCR2 en condition douloureuse.
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Drouet, Valérie. "Utilisation de petits ARN interférents pour le traitement de la maladie de Huntington". Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066407.
Texto completoResumen
La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative autosomale dominante fatale causée par une expansion de triplets CAG dans le gène codant la huntingtine (htt). Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif pour cette pathologie. Des études récentes montrent que la technique d’ARN interférence (ARNi) est prometteuse pour traiter des maladies autosomales dominantes dont la MH. Dans ce projet, nous avons développé les outils permettant d’étudier la faisabilité et l’efficacité de deux approches : l’inactivation non allèle-spécifique des 2 allèles de la htt ou une inactivation allèle-spécifique de la forme mutée, chez des modèles rongeurs de la MH. La stratégie non allèle-spécifique s’est montrée très efficace à long terme, même lorsque le traitement est initié après l’apparition des symptômes. La dégradation de la forme sauvage provoque des modifications transcriptomiques dans des voies de signalisation associées à des fonctions connues de la htt. Ces changements d’expression n’altèrent pas l’efficacité du traitement et ne sont pas associés à des effets délétères. Les effets à long terme d’une dégradation partielle de la htt sauvage restent cependant à déterminer. En parallèle, nous avons développé une approche ciblant la htt mutée tout en préservant l’expression de la forme sauvage, en tirant parti de la présence de SNP (polymorphisme nucléotidique simple) sur le gène de la htt. Cette approche a conduit à l’inactivation efficace et sélective de la htt mutée, prévenant ainsi l’apparition de la neuropathologie MH pour la majorité des SNP ciblés. L’ensemble de ces résultats confirme la faisabilité et l’efficacité de la stratégie ARNi pour traiter la MH.
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Bruniaux, Jonathan. "Développement de nanoparticules lipidiques pour la délivrance de courtes séquences d'ARN interférents". Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENV025/document.
Texto completoResumen
L'ARN interférence est un mécanisme d'inhibition post-transcriptionnel, capable de réguler l'expression des gènes. Ce mécanisme endogène, activé par l'intermédiaire de microARN, peut être détourné après transfection de cours fragments d'ARN synthétiques, notamment les siARN. Cette technique autorise ainsi le ciblage spécifique de l'ensemble des gènes composant le génome, dont l'extinction transitoire permet d'étudier à la fois leurs fonctions, mais aussi de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouveaux biomarqueurs. Ce très fort potentiel pour la recherche in vitro se retrouve également in vivo, où l'ARN interférence peut être directement utilisé comme agent thérapeutique pour des situations pathologiques telles que les cancers, les infections ou les maladies systémiques. Cependant, la délivrance intra-cytoplasmique des ARN interférents exogènes est nécessaire pour déclencher ce mécanisme de régulation. À l'heure actuelle, en dépit de nombreuses méthodes de transfection développées dans la littérature, cette étape de délivrance reste une limite importante selon les applications envisagées.En ce sens, ces travaux de thèse ont permis de développer un nouveau vecteur à base de nanoparticules lipidiques cationiques, les cLNP, dédié à la transfection cellulaire de siARN. Cette formulation de cLNP a été adaptée, à l'aide d'un plan d'expérience, d'une formulation neutre de LNP permettant l'encapsulation de molécules lipophiles pour des applications en imagerie de fluorescence et/ou de délivrance de médicaments liposolubles. Les caractérisations physico-chimiques des particules cLNP ont démontré une très forte stabilité colloïdale, à la fois pour dans les tampons aqueux et dans les milieux de culture cellulaire complémentés par du sérum. En outre, ces nano-vecteurs se sont avérés extrêmement efficaces pour établir et conserver des liaisons électrostatiques avec des siARN, permettant ainsi d'obtenir rapidement des complexes démontrant une stabilité élevée dans le temps. Les efficacités d'inhibition fonctionnelle de ces nanoparticules ont été testées avec succès sur 3 lignées cellulaires différentes (PC3, HeLa et U2OS). L'ensemble des résultats obtenus confirme le fort potentiel de ce nouveau nano-vecteur, en termes d'inhibition fonctionnelle et d'absence de cytotoxicité, et le positionne parmi les meilleurs agents de transfection commerciaux testés. Ces caractéristiques sont complétées par des capacités de multi-modalité, dont la possibilité d'encapsuler dans le cœur des particules des drogues ou des fluorophores lipophiles. Enfin, des tests préliminaires réalisés sur des cellules considérées comme difficile à transfecter (cellules primaires, cellules non-adhérentes, neurones), ou sur des structures cellulaires tridimensionnelles plus complexes, ouvrent de nouvelles perspectives extrêmement prometteusesL'auteur n'a pas fourni de résumé en anglais
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Boisvert, Marie-Ève. "Les courts ARN chez C. elegans : spécificité et fonction des protéines argonautes". Thesis, Université Laval, 2007. http://www.theses.ulaval.ca/2007/24611/24611.pdf.
Texto completoResumen
Chez C. elegans, les caractéristiques moléculaires des différentes voies des courts ARN divergent. Dans la voie du RNAi, une molécule d’ARN double-brin linéaire mène à la production de siARN, initiant la dégradation de l’ARNm. Quant aux microARN, le précurseur du microARN présente une structure « épingle à cheveux » et le microARN mature induit un blocage de la traduction de cet ARNm. Ces deux voies requièrent leurs protéines Argonautes spécifiques. Nous avons conçu une molécule d’ARNdb linéaire contenant à la fois une séquence d’un microARN et une séquence d’un siARN, et suggérons que la spécificité des Argonautes n’est pas déterminée par la molécule de départ. Nous tentons aussi de comprendre le rôle des Argonautes ALG-1 et ALG-2. Une immunoprécipitation et une analyse des facteurs protéiques et ribonucléiques associés ont été effectués. Cette expérience pourrait aussi s’avérer un outil simple permettant l’identification de nouvelles cibles potentielles des microARN.The molecular characteristics of the RNAi and microRNA pathways are different. In the RNAi pathway, fully base-paired dsRNA molecules trigger the production of small interfering RNAs (siRNAs), which lead to the degradation of the complementary targeted mRNA. On the other hand, the stem-looped miRNA precursor is processed in mature miRNA, which then imperfectly interacts with the mRNA target, leading to the blocking of its translation. In the worm C. elegans, each of the RNAi and miRNA pathways needs its specific Argonautes proteins. RNAi requires RDE-1, while ALG-1 and ALG-2 act in the miRNA pathway. The restriction of siRNAs and miRNAs to specific Argonaute proteins might reflect the recognition of the trigger by specific factors targeting it to the correct Argonaute protein. To better understand the importance of the trigger in the selection of the adequate Argonaute and pathway, we designed a dsRNA trigger containing both miRNA and siRNA sequences. This chimeric molecule can rescue successfully the loss of function of the miRNA let-7, and can also initiate the gfp gene silencing by RNAi. We demonstrated that RDE-1 and the dsRNA-binding protein RDE-4 are essential for RNAi induced with our trigger, but are not involved in the let-7 function of the chimera molecule. On the other hand, we showed that ALG-2 is strictly required for the miRNA function, but not for the RNAi function. Interestingly, we also found that the let-7 miRNA processed from our molecule has a limited lifetime, while the RNAi response, initiated from the same dsRNA, is maintained for a longer period. We suggest that the specificity of the Argonautes and thus the choice of the small RNA pathway is not determined by the type of RNA trigger, but rather by their respective molecular response. Furthermore, we also tried to understand the roles of ALG-1 and ALG-2. An immunoprecipitation of these proteins and an analysis of the protein and RNA interactors were carried out.
Inscrite au Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures
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St-Pierre, Patrick. "Caractérisation des intéractions entre le viroïde PLMVd et le mécanisme d'interférence à l'ARN du pêcher". Mémoire, Université de Sherbrooke, 2009. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/3984.
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Les viroïdes sont les pathogènes les plus simples connus à ce jour. Ils possèdent un génome d'ARN simple brin, circulaire, qui n'encode aucune protéine et qui n'est pas encapsidé. Malgré tout, ils sont capables d'infecter des plantes supérieures et de causer des symptômes suffisamment sévères pour amener d'importantes pertes économiques dans les domaines agro-alimentaire et horticole. Depuis quelques années, plusieurs études ont été réalisées pour mieux comprendre ces pathogènes obligatoires mais, jusqu'à maintenant, peu de données sont disponibles sur les petits ARN interférents (siARN) produits par les plantes à la suite d'une infection par un viroïde. Le but de ce travail est de recueillir le plus d'informations possible sur les siARN produits par le pêcher à la suite d'une infection par le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Les petits ARN non-codants de 18 à 26 nucléotides de plants de pêcher sains et infectés par PLMVd ont été clonés et séquencés.Les observations faites à partir de ces séquences montrent que seul le plant infecté produit des petits ARN homologues à PLMVd. Aussi, certaines régions du génome du viroïde semblent être plus enclines à produire des siARN. De plus, les deux polarités du génome de PLMVd semblent être susceptibles à l'interférence à l'ARN. Ensuite, certaines observations montrent que les molécules circulaires de PLMVd ainsi qu'un duplex d'ARN formé des deux polarités du génome de PLMVd sont des cibles potentielles de l'interférence à l'ARN. Enfin, à la suite de l'analyse des résultats, on peut supposer que les siARN homologues à PLMVd peuvent modifier l'expression de certains gènes végétaux. À la suite de ces observations et aux questions qu'elles ont soulevées, nous avons préparé une expérience de séquençage à haut débit des petits ARN d'un plant de pêcher sain et d'un plant infecté par PLMVd.Les résultats préliminaires montrent que le niveau d'expression de PLMVd et des petits ARN homologues à PLMVd varient selon les plants étudiés et selon le mois dans lequel les feuilles de pêcher ont été cueillies. L'ARN extrait des feuilles qui semblaient contenir la plus forte concentration de siARN a été utilisé pour les expériences suivantes.Les premiers tests pour la préparation des petits ARN pour le séquençage par la technologie Solexa d'Illumina montrent que le kit de préparation des petits ARN est efficace. En conclusion, ces résultats ouvrent la voie à un séquençage à haut débit des siARN de pécher, plus particulièrement ceux qui sont associés à l'infection par PLMVd. Ils permettent aussi d'énoncer certaines hypothèses qu'il sera intéressant de vérifier dans le futur.
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Ripoll, Manon. "Synthèse de nano-vecteurs dérivés des polydiacétylènes pour la co-délivrance d’un ARN interférent et d’un anticancéreux". Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAF076/document.
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En nanomédecine, une nouvelle approche consiste à développer des vecteurs synthétiques pour co-délivrer au sein d’une cellule tumorale, un anticancéreux ainsi qu’un siARN, capable de supprimer l’expression d’une protéine impliquée dans les mécanismes de résistance. Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été consacrés à la synthèse de nano-vecteurs micellaires pour la délivrance simultanée de ces deux agents thérapeutiques. Une première partie décrit la synthèse et la formulation de micelles nanométriques diacétyléniques photopolymérisables conçues pour délivrer efficacement un siARN. Les propriétés d’encapsulation et de délivrance de ces micelles ont ensuite été étudiées in vitro et in vivo pour une application en thérapie combinatoire. Enfin, une dernière partie présente la fonctionnalisation par interaction électrostatique de ces vecteurs cationiques avec des anticorps préalablement modifiés par des oligonucléotides anioniques pour réaliser un ciblage actif des cellules tumoralesIn the nanomedecine field, a new approach consists in developing synthetic vectors able to co-deliver into a cancer cell, an antitumoral drug and siRNAs that target protein(s) involved in MDR. The work described in this manuscript was dedicated to the development of micellar nanovectors for the intracellular co-delivery of these two therapeutic agents. The first part details the synthesis and the formulation of nanometric photopolymerized diacetylenic micelles adapted for the delivery and intracellular release of the siRNA. Then, the encapsulation and delivery properties of these micelles, bearing histidine polar heads have been investigated in vitro and in vivo for the application of combination therapy. Finally, the last part presents the functionalization by electrostatic interaction of these cationic vectors with antibodies, priorly modified by anionic oligonucleotides. This original and versatile system allowed achieving an active targeting of tumoral cells
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Toub, Nedjma. "Étude du devenir in vitro et in vivo des oligonucléotides et sirna vectorises par des nanocapsules à coeur aqueux". Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA114810.
Texto completoResumen
Cette thèse a démontré la capacité des nanocapsules à cœur aqueux à délivrer des oligonucléotides antisens et des siRNAs in vitro et in vivo. Dans un première partie de ce travail, la technique de fractionnement cellulaire a été utilisée pour étudier le trafic intracellulaire des nanocapsules chargées d'oligonucléotides (ODNs) doublement marqués. Les résultats ont montrés que ces nanocapsules sont capables non seulement d'augmenter considérablement la pénétration cellulaire des oligonucléotides, mais aussi de délivrer leur contenu dans les compartiments subcellulaires ciblés (cytoplasme, noyau). Ces résultats ont été confirmés par la microscopie confocale. De plus, les nanocapsules à cœur aqueux chargés d'ODNs anti-EWS-Fli1 se sont révélées efficace pour induire une réversion phénotypique des cellules NIH/3T3 EWS-Fli1 exprimant l'oncogène EWS-Fli1 en phénotype NIH/3T3. Cet effet est du à une inhibition spécifique et significative de l'expression de l'oncogène EWS-Fli1 détectée par la technique RT-PCR. Enfin, l'application récente de ces nanocapsules aux siRNAs, révèle pour la première fois, une inhibition significative d'une tumeur apparentée au sarcome d'Ewing, et ce en utilisant des doses très faibles en siRNAs non modifiés chimiquement. L'inhibition spécifique de l'oncogène ciblé a pu être, à nouveau, mise en évidence par la méthode RT-PCR. Des études complémentaires de microscopie confocale ont démontré la localisation cytoplasmique des siRNAsThe dream of modern drug research is to discover a biologically active molecule or a class of biologically active molecules, totally specific, able to act efficiently only on the function responsible of the disease. If this dream became a reality, treatment of fatal illness (AIDS, cancer, etc. . . ) would be possible without the severe side effect and toxicities that are the main limitations of these treatments. Many drugs work by interfering with critical proteins, which have been identified as responsible for dysfunction of cells or tissues. However, conventional therapeutics agents now on the market, which tend to act on proteins in the body also often bind to non-target proteins, or exert an effect through unknown interactions. Fortunately, progress in genetics and genomics has enabled definitive studies on some of the fundamental molecular mechanisms that regulate the expression of genes, as well as the dysfunction of these mechanisms. From this mass of knowledge, the idea has emerged of drugs that may turn off genes by targeting the RNA that codes for the protein instead of the protein product. This strategy displays several advantages: (1) an active oligonucleotides (ODNs) or siRNA can be identified in a shirt time. (2) The cellular location of the proteins is not important. First results do not show any antigenicity of these nucleic acids. However, despite exciting potential for selectively modulating the expression of an individual gene, nucleic acids are still far from becoming drugs. Nucleic acids drugs are anionic macromolecules and cannot transit biological cell membranes. Additionally, they are rapidly degraded by nucleases. To overcome these limitations, various chemical modifications of nucleic acids (phosphorothioate ODNs) were synthesized. These modifications possess disadvantages, like a decreased mRNA hybridisation, higher cytotoxicity and increased unspecific effects. Therefore, a strong need for the development of unmodified acid nucleic drug delivery systems exists. The therapeutic performance of nucleic acid based drug significantly depends on the capability of carrier systems because of their fragility, impermeability to the cellular membrane and undesirable biodistribution. These delivery systems might be no viral, biocompatible and biodegradable. Carrier systems (liposomes, nanoparticles) protect these nucleic acids based drug in the harsh environment of the extracellular fluids, while inside the cells they should release incorporated drugs at a reasonable rate to remain intracellular concentration sufficient to form a complex with a target molecules such as mRNA. Actually, many academic and industrial laboratories are working on drug delivery based on nanotechnology (liposomes, nanoparticles). Our interest is based on development (unfurl) of polymeric nanocapsules with an aqueous core for nucleic acids delivery. Polyisobutylcyanoacrylate (PIBCA) nanocapsules specially designed for delivery of fragile and anionic molecules (ODNs). These nanocapsules containing in their aqueous core an active ODN induced 60% of inhibition of Ewing's sarcoma tumour after 8 I. T injections in nude mice, but the mechanism by which acts these nanocapsules remain unknown. As described in this report, our gaol was firstly focused on subcellular studies of the fate of ODNs when vectorized by nanocapsules using cellular fractionation and confocal microscopy methods (publication N°2), results showed that nanocapsules permitted enhancement of cellular penetration of oligonucleotides with a specific delivery in the targeted compartments (cytoplasm and nucleus). After fundamental mechanism investigation of delivery of oligonucleotides by nanocapsules following endocytosis way, we tested then their specific effect at cellular level in sarcoma Ewing model. Nanocapsules loaded ODNs have been proven to be highly effective tools for the specific inhibition of sarcoma Ewing's oncogene with a perfect correlation both in vitro and in vivo results in the same model (publication N°3). Recently, the discovery of RNA interference (siRNA), acting into a natural mechanism based on endogenous regulatory system that employs to silence gene expression has generated enthusiasm for cancer treatment, this new therapeutics approach more effective at low doses than other types of nucleic acid-based therapy such like oligonucleotide. But despite advantages of siRNA, obstacles to effective siRNA-based drugs remain without drug delivery systems. Finally, treatment of grafted tumor Ewing's sarcoma in nude mice using unmodified siRNA vectorized by nanocapsules leads to 80% of specific inhibition of tumor growthing after 5 I. T injection using a very low dose of siRNA (publication N°4). Nanocapsules thus appears to be an interesting system for administration of nucleic acid therapy. Further developments are now in progress in order to design such nanocapsules with specific ligands capable to recognize targets after intravenous administration
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Boissonneault, Vincent. "Régulation de la protéine mBACE1 par les miARN miR-298 et miR-328". Thesis, Université Laval, 2006. http://www.theses.ulaval.ca/2006/24104/24104.pdf.
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Kühbacher, Andreas. "Identification of new molecular effectors involved in the internalization of the bacterial pathogen Listeria monocytogenes in host cells using high-throughput RNAi screening and targeted approaches". Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077193.
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La bactérie pathogène Listeria monocytogenes infecte les cellules non-phagocytaires, s'échappe de la vacuole et se réplique dans le cytoplasme de la cellule-hôte. L'internalisation implique l'interaction de récepteurs de la cellule avec des protéines de surface de la bactérie de la famille des internalines. Notamment, InlA interagit avec E-cadherin et In1B interagit avec le récepteur de facteur de croissance hépatocytaire Met, ce qui provoque l'activation de la cascade de signalisation, qui déclenche l'internalisation de la bactérie, dépendant de l'actine et de la clathrine. Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui régulent l'invasion par L. Monocytogenes, nous avons établi une procédure de screening à haut débit avec des ARNs d'interférence et des inhibiteurs. Ce projet a été accompli dans le cadre du consortium suisse InfectX. En combinant ces screens avec des approches de microbiologie, biochimie et biologie cellulaire, nous avons mis en évidence de nouveaux aspects de l'infection par L. Monocytogenes. Des nouveaux facteurs cellulaires impliqués directement ou indirectement ont pu être identifiés. Nous avons caractérisé en détail l'implication d'un de ces facteurs, Lmodl, De plus, l'utilisation de nouvelles approches de protéomique, en collaboration avec l'équipe de Bernd Wollscheid à l'ETH de Zurich, ont permis d'identifier de nouveaux facteurs interagissant avec InIB, ainsi que le rôle des compartiments de l'endocytose tardive pendant l'entrée de L. Monocytogenes et son échappement de la vacuole. Enfin, nous avons pu montrer via des approches ciblées que le réseau d'actine au site d'entrée de L. Monocytogenes est modulé par la lipide phosphatase OCRLThe gram-positive bacterium Listeria monocytogenes is able to enter non-phagocytic cells, to disrupt the phagocytic vacuole and to replicate in the host cell cytoplasm. Invasion of epithelial cells requires the interaction of L. Monocytogene surface proteins internalin (InIA) or In1B with cellular receptors which are the adherens junctions molecule E-cadherin or the hepatocyte growth factor receptor Met respectively. These ligand/receptor-interactions lead to the activation of signaling cascades which result in actin- and clathrin-dependent uptake of the bacterium. In order to obtain a better understanding of the cellular fonctions regulating the L. Monocytogenes invasion process, a high-content screening procedure was established and applied to siRNA, miRNA mimic, miRNA inhibitor and drug libraries. This project was performed in the framework of the Swiss consortium InfectX (www. Infectx. Ch). In combination with standard microbiology, biochemistry and cell biology approaches, we shed light on several new aspects of L. Monocytogenes invasion. New host factors that are directly or indirectly involved in the invasion process could be identified. One of these factors, Lmodl, has been further characterized. In addition, novel proteomics approaches were applied in collaboration with the group of Bernd Wollscheid at ETH Zurich leading to the identification of novel interactors of the bacterial In1B and to the description of a rote of late endocytic compartments during L. Monocytogenes entry and vacuolar escape. Finally, by targeted approaches we could show that the lipid phosphatase OCRL modulates actin dynamics at the L. Monocytogenes entry site
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Song, Ok-Ryul. "Criblage phénotypique d'une banque d'ARN interférents par microscopie haut-débit haut-contenu d'informations appliqué à l'identification de facteurs cellulaires impliqués dans la colonisation du pneumocyte par Mycobacterium tuberculosis". Angers, 2012. http://www.theses.fr/2012ANGE0012.
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La psychopathologie de la tuberculose associée à l'épidémie de SIDA et l'apparition de bacilles multi - résistants et extrêmement - résistants conduisent à des situations d’échecs thérapeutiques. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le processus de colonisation de l'organisme hôte par Mycobacteriun tuberculosis est nécessaire pour permettre des progrès radicaux en matière de lutte contre la tuberculose. M. Tuberculosis a la capacité de coloniser différents types de cellules pulmonaires constituant ainsi des véritables réservoirs du bacille. Si la contribution du bacille intramacrophagique dans la pathogenèse est bien établie, en revanche, le processus de colonisation des cellules épithéliales par M. Tuberculosis par microscopie haut débit haut contenu et l'avons appliqué au calibrage de 20 000 ARN interférents. Nous avons ainsi identifié 88 gènes candidats impliqués dans la réplication du bac. ARFGAP1 est un régulateur négatif de l'activation d'ARF1 qui est impliqué dans les système de trafic vésiculaire COPI et les voies de signalisation par la phospholipase D. L'ensemble de nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives de recherche dans la signalisation intercellulaire de M. Tuberculosis. The current TB lengthy antibiotic therapy fails to be effective against multidrug and extremly resistant strains. To this end, improved understanding of the fundamental biology of this complex disease is needed to come up with radical advances in TB control. Pathology is intimately linked to the interplay between the host immune response and the persistence of the mycobacterium. In the lungs -the major affected organ- M. Tuberculosis has a preferential tropism for alveolar macrophages, dendritic cells and type II alveolar pneumocytes. Whereas the colonization of macrophages by M. Tuberculosis has been comprehensively studied, much less is knowm abaout that of lungs epithelial cells in which the bacillus penetrates but hardly replicates. To uncover key cellular genes involved in the invasion of M. Tuberculosis in pneumocytes, we undertook a genome wide RNAi screening on the M. Tuberculosis infected type II pneumocyte cell model A549. To do this we established a method relying on high content high troughput microscopy enabling the screening of a library of 20 000 RNAi and the selection and confirmation of the 88 RNAi hits. Among them, we carried out a more thorough study on ARFGAP1 for which silencing led to extensive bacterial internalization inside the epithelial cells followed by strong replication. We showed that in the context of out in vitro M. Tuberculosis model of infection, ARFGAP1 negatively regulates ARF1, which impacts on vesicular trafficking, signaling through phospholipase D and actin remodeling. Altogether, our results reveal novel host pathways that are involved in the succesful intracellular colonization of the tubercle becillus. S.
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Devavry, Severine. "Récepteurs de la mélatonine : pharmacologie du récepteur ovin MT2, identification de leur activité constitutive et développement d'une approche par ARN interférent". Thesis, Tours, 2011. http://www.theses.fr/2011TOUR4036/document.
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La mélatonine est une hormone synthétisée et sécrétée uniquement la nuit par la glande pinéale. Son rôle principal est son implication dans la synchronisation de la saison de reproduction. La mélatonine se lie aux récepteurs, MT1 et MT,, membres de la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG).Le clonage récent du récepteur ovin MT2a remis en cause toutes les données connues. La pharmacologie et les voies de signalisation du récepteur oMT2ont été étudiées et sont communes à celles des récepteurs des autres espèces. En revanche, oMT2possède une originalité de séquence avec la présence du motif DRY, fortement impliqué dans l’établissement de l’activité constitutive des RCPG. D’une part, nous avons montré que l’ensemble des récepteurs MT possèdent une activité constitutive. D’autre part, nous avons identifié deux agonistes inverses pour les récepteurs hMT2, initialement décrits comme antagonistes. Dans l’optique de discriminer les rôles respectifs des récepteurs MT in vivo, le développement d’une approche par ARN interférents a été validée dans un modèle cellulaire, la lignée CHO-KI exprimant les récepteurs ovins et de ratMelatonin is a hormone synthesized and secreted only during night by pineal gland. A main role of melatoninconcerns its implication in the synchronization of reproductive seasonality. Binding sites of melatonin are MT1and MT2 receptors which belong to the superfamily of seven-transmembrane-spanning G protein-coupledreceptors (GPCRs).Recent cloning of ovine MT2 receptor has challenged the knowledge about melatonin receptors. Wedemonstrated that its pharmacology and signalling pathways were similar to subtype 2 receptor of othersspecies (human and rat). Nevertheless, oMT2 receptor possesses a particularity of sequence, with the presenceof DRY motif which is known to be involved in the establishment of constitutive activity of GPCRs. In ourstudy, we demonstrated the existence of constitutive activity for ail the melatonin receptors. In addition, weidentified two inverse agonists for human MT2 receptors, previously described as antagonists. To describe therespective roles of each subtype of melatonin receptors in vivo, siRNA approach was developed in cell line,CI-10-K Iexpressing ovine and rat melatonin receptors
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Khoury, Maroun. "Vecteurs optimisés pour une interférence à ARN anti-inflammatoire innovante dans l'arthrite". Montpellier 1, 2007. http://www.theses.fr/2007MON1T007.
Texto completoResumen
La polyarthrite rhumatoïde (PR) étant le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques, elle reste un problème de santé publique majeur. Malgré les avancées majeures réalisées ces dix dernières années dans le cadre du traitement de cette pathologie, les outils de diagnostic et de traitement nécessitent encore des améliorations. Bien que l'analyse du rapport bénéfice-risque soit en faveur de l'utilisation des biothérapies anti-TNF, celles-ci ne sont pas dépourvues d'effets secondaires indésirables, conduisant à l'arrêt du traitement. La thérapie génique offre une alternative thérapeutique possible pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Bien que les premiers essais cliniques de thérapie génique dans la PR soient encourageants, de nombreux obstacles restent à surmonter. Le projet de cette thèse vise à développer de nouveaux vecteurs viraux et non viraux pour une immunothérapie anti-inflammatoire dans la PR par thérapie génique. Différents vecteurs ont été développés pour une administration systémique ou locale du gène thérapeutique, et leur efficacité respective comparée. Le sérotype 5 de l'AAV (adeno-associated virus) s'est révélé être le plus efficace pour transduire la synoviale rhumatoïde. Afin de finement réguler l'expression du gène thérapeutique en fonction des poussées inflammatoires, celle-ci a été mise sous contrôle d'un promoteur chimérique inductible par l'inflammation. Cette approche a été validée dans le modèle expérimental de l'arthrite au collagène chez la souris exprimant un récepteur chimérique soluble du TNF. Une deuxième approche visant une régulation post-transcriptionnelle du TNF en utilisant l'interférence à l'ARN a été développée. Le défi de cette nouvelle technologie est la livraison in vivo des petits ARN interférents (siRNA). Cet obstacle a été surmonté en complexant ces molécules avec une formulation de lipides cationiques et d'ADN. L'injection hebdomadaire du siRNA lipocomplexé dans le modèle expérimental d'arthrite a pour effet de diminuer l'incidence de l'arthrite et la progression de la maladie, mise en évidence par une évaluation clinique et biologique des groupes soumis au traitement. L'aboutissement de ces deux stratégies décrites était la conception d'un vecteur AAV5 exprimant un siRNA en épingle à cheveux dirigés contre l'ARN messager du TNF montrant ainsi un effet thérapeutique significatif en essai pré-clinique. Ce travail a permis la mise en place de différents outils pour une thérapie génique anti-inflammatoire ciblée dans la PR et le dépôt d'un brevet.
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Guilhem, Ducléon Frédéric. "Caractérisation d'un nouveau système d'expression de petits ARN interférents et son application à l'analyse du facteur de transcription Bdp1 dans la transcription par l'ARN polymérase III ex vivo". Bordeaux 2, 2007. http://www.theses.fr/2007BOR21504.
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Tissot, Catherine. "Clonage et caractérisation de nouveaux gènes modulables par les interférons Alpha et Bêta". Montpellier 2, 1996. http://www.theses.fr/1996MON20041.
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Les interferons (ifns) constituent une famille de proteines secretees responsables de nombreux effets biologiques. Ils possedent une activite antivirale et antitumorale, et affectent le fonctionnement du systeme immunitaire ainsi que la differenciation et la proliferation cellulaire. Il est bien etabli que les ifns exercent cette multiplicite d'activites par la modulation de l'expression de nombreux genes. Par le criblage differentiel d'une banque d'adn complementaires de cellules daudi nous avons isole et caracterise de nouveaux genes dont l'expression est modulee par les ifns alpha et beta. Parmi ces genes, certains codent pour des proteines connues telles que la molecule d'adhesion cd48 mais non identifiees comme modulables par les ifns. D'autres adnc que nous avons appeles staf-50 (pour stimulated trans acting factor of 50 kda) et isg-20 (pour interferon stimulated gene of 20 kda) sont de sequences non repertoriees dans les banques de donnees et codent pour des proteines de fonction inconnue. Nous avons demontre que staf-50 est un nouveau membre de la famille des proteines de type ring-finger qui inhibe l'expression initiee a partir du ltr du virus hiv et dont l'expression est reprimee lors de l'activation lymphocytaire. L'adnc d'isg-20 est de 684 paires de bases avec une phase de lecture codant pour une proteine qui possede de fortes homologies avec la proteine de xenope xpmc-2 impliquee dans la regulation negative du cycle cellulaire. Nous avons demontre que l'expression d'isg-20 dans des cellules eucaryotes ccl39 alterait leur repartition dans le cycle cellulaire et entraine l'apparition de cellules polynuclees. Le travail presente ici concerne le clonage et la caracterisation de ces adnc, de meme que l'etude de leur regulation et de leur fonction
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Garcia-Cattaneo, Alejandra. "Régulation du transport, de la maturation et de la signalisation du TLR3". Paris 7, 2001. http://www.theses.fr/2011PA077075.
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TLR3 est un récepteur Toll-like (TLR) endosomal qui active les réponses immunes contre diverses infections virales en se liant à des ARN double brin, produits lors du cycle de réplication de la plupart des virus. TLR3 est abondamment exprimé et peut à la fois activer l' immunité innée et adaptative. Or, le trafic intracellulaire et la maturation du TLR3 sont peu connus. Cette thèse montre que le TLR3 endogène existe sous deux formes à l'état basal: la forme longue (130 kDa) et la courte (70 kDa). L'expression du TLR3 est induite par son ligand: les molécules néosynthétisées transitent par l'appareil de Colgi vers les endosomes où elles sont vite clivées par des cathepsines. Un criblage des cathepsines humaines par ARN d'interférence a montré que les Cathepsines B et H sont responsables de la maturation du TLR3. Le clivage se produit entre les acides aminés 252 et 346. La suppression de 345 acides aminés du N-Terminal produit la forme courte du TLR3 qui est fonctionnel pour la signalisation. Ces données indiquent que la maturation protéolytique du TLR3 est essentielle pour sa fonction, et suggèrent un nouveau mécanisme de régulation de la signalisation des TLRTLR3 is an endosomal Toll-like receptor (TLR) that mediates immune responses against viral infections upon activation by its ligand double stranded RNA, a replication intermediate of most viruses. TLR3 is expressed widely in the body and activates both the innate and adaptive immune Systems. However, little is known about how TLR3 intracellular trafficking and maturation are regulated. Here we show that newly synthesized endogenous TLR3 is transported through the ER and Colgi apparatus to endosomes, where it is rapidly cleaved. TLR3 protein expression is up-regulated by its own ligand leading to the accumulation of its cleaved form. Furthermore, TLR3 signaling and cleavage are sensitive to a cathepsin inhibitor. Screening of the human cathepsin family by RNA interference identified cathepsins B and H as key mediators of TLR3 processing. Cleavage occurs between aa 252 and 346, and results in a functional receptor that signals upon activation. A truncated form of TLR3 lacking the N-terminal 345 amino acids does also signal from acidic compartments in response to ligand activation. Taken together our data indicate that TLR3 proteolytic processing is essential for its function and suggests a mechanism of tight control of TLR3 signaling and thus inflammation
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Ferlotte-Picard, Guillaume. "La modulation de l'expression du gène PARG par l'interférence à l'ARN sensibilise les cellules de gliomes humains aux rayons ionisant". Thesis, Université Laval, 2011. http://www.theses.ulaval.ca/2011/27661/27661.pdf.
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Metral, Sylvain. "Etude des fonctions de la spectrine α non érythroide". Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077027.
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Le squelette dépendant de la spectrine, localisé sous la bicouche lipidique, est un échafaudage essentiel de toutes les cellules animales. La Spectrine (Sp), structure géante, robuste mais flexible d'hétéro tétramères (αβ)2, constitue les filaments de ce réseau, dont chaque nœud interagit avec des filaments d'actine. Les fonctions du squelette de Sp, qui sont bien définies dans le globule rouge (rôle dans sa forme, dans sa résistance aux forces de cisaillement et dans sa déformabilité) sont moins bien connues dans les cellules non-érythroïdes. La Sp non-érythroïde pourrait participer à l'établissement et/ou au maintient de sous-domaines membranaires spécialisés dans l'accumulation de protéines de membrane (telles que les canaux ioniques, les pompes ioniques, les récepteurs et les molécules d'adhérence) comme nous le fait penser les invalidations de la Sp-β non-érythroïde. Cependant le rôle de la Sp-a non-érythroïde est moins bien établi. Chez les mammifères, la Sp-α est codée par deux gènes: un pour Sp-αl, principalement exprimée dans l'érythrocyte mature, le second pour Sp-αI qui est exprimée dans toutes les cellules nucléées. Pour étudier les fonctions de la Sp-αll, nous avons utilisé une approche de SiRNA sur des cellules de mélanome humain. Nos données montrent que la diminution de Sp-αll est associée à I) un arrêt en G1 du cycle cellulaire II) une perte d'adhérence des cellules malgré l'augmentation de quelques intégrines III) des modifications dans l'organisation du réseau d'actineThe spectrin-based skeleton is an essential scaffold underlying different lipid bilayers in ail animal cells. Spectrins (Sp), as giant extended flexible heterotetramers (aβ)2, constitute the filaments of this network, the nodes of which are cross-linked by actin filaments. The functions of the Sp-based skeleton, which are well defined in red blood cells (required for shape, résistance to shear stress and deformability) are less well understood in non-erythroid cells. The non-erythroid Sp might participate in the establishment and/or the maintenance of specialized membrane subdomains by accumulating integral membrane proteins (such as ionic channels, ionic pumps, receptors and cell adhesion molecules) as revealed by loss of the main non-erythroid β-Sp. However the effect of non-erythroid α-Sp are less well established. In mammals, α-Sp are encoded by two genes: one for al-Sp mainly expressed in mature erythrocyte, the second one for αll-Sp which is expressed in ail nucleated cells. Ln the pursuit of all-Sp functions, we have checked the effect of αll-Sp knock down by siRNA melanoma human cell line. Our data revealed that spectrin depletion is associated with i) an arrest of cell cycle at G1 state ii) a loss of cell adhesion in spite of increase in some integrins iii) some modifications of actin organisation
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Holz, Correia Carine Lidiane. "Dynamique de l’émergence in vitro des mutants d’échappement du virus de la peste des petits ruminants (PPRV) face à l’activité ARN interférente ciblant le gène de la nucléoprotéine : implications pour les stratégies thérapeutiques". Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20126.
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Les membres du genre Morbillivirus, famille Paramyxoviridae sont responsables de graves maladies chez l'homme et les animaux, comme la rougeole, la peste bovine (RP) et la peste des petits ruminants (PPR). Malgré l'existence de vaccins efficaces contre ces maladies, des traitements spécifiques sont souhaitables. L'inhibition de la réplication de ces virus peut-être acquise par interférence ARN (ARNi), un mécanisme d'inhibition post-transcriptionnel déclenché par des séquences courtes d'ARN double-brin (siARN). Le CIRAD a précédemment identifié 3 siARNs ciblant des régions conservées du gène de la nucléoprotéine virale capables d'inhiber au moins 80% de la réplication in vitro des virus de la rougeole, de la RP et de la PPR. Cependant, un problème majeur dans la stratégie d'ARNi est le risque d'apparition de virus résistants. Dans cette étude, nous avons évalué le risque d'apparition de mutants d'échappement du virus de la PPR sous pression de sélection de 3 siARNs appliqués seul ou en association après plusieurs transfections successives in vitro. Excepté pour la combinaison des 3 siARNs, le virus a échappé à l'ARNi après 3 à 20 passages consécutifs, avec des mutations simples ou multiples (synonymes ou pas) ou une délétion de 6 nucléotides dans la zone cible des siARN. Ces résultats mettent en évidence une plasticité génomique inattendue des morbillivirus surtout illustrée par cette délétion non-délétère d'une partie significative d'un gène viral essentiel, qui devrait être considérée comme un obstacle à l'utilisation de l'ARNi comme thérapie antivirale. Cependant, l'utilisation combinée de 3 siARNs peut être proposée pour diminuer le risque d'échappement aux siARNsViruses in the genus Morbillivirus, within the family Paramyxoviridae are responsible for severe humans and animal diseases, including measles, rinderpest (RP) and peste des petits ruminants (PPR). In spite of the existence of efficient vaccines against these diseases, specific treatments to be applied when the infection is already present are desirable. Inhibition of morbillivirus replication can be achieved by RNA interference (RNAi), a mechanism of post-transcriptional gene silencing triggered by small double-stranded RNA (siRNA). The CIRAD previously identified three siRNAs that target conserved regions of the essential gene encoding the viral nucleoprotein and are able to prevent in vitro at least 80% of the replication of measles, RP and PPR viruses . However, a major problem in RNAi is the important risk of emergence of escape mutants. In this study, we investigated the ability of PPR virus to escape the inhibition conferred by single or multiple siRNAs after several consecutive transfections in vitro. Except with the combination of the three different siRNAs, the virus systematically escaped RNAi after 3 to 20 consecutive passages. The mutations were characterized by either single or multiple punctual nucleotide mutations (synonymous or not) or a deletion of a stretch of 6 nucleotides into the siRNA target. These results demonstrate that the genomic plasticity of morbilliviruses, illustrated maily by this significant and no-deleterious deletion in an essential viral gene, should be considered as an obstacle to the use of RNAi in antiviral therapy. However, the combined use of three siRNAs can be proposed to prevent treatment failure with siRNAs
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Flusin, Olivier. "Stratégies de lutte contre des virus du risque infectieux : perspectives thérapeutiques contre les nairovirus et les orthopoxvirus". Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077054.
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Les infections au virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV) et au virus de la variole (VARV), pour lesquelles aucun traitement n'est officiellement approuvé, constituent un risque réel pour les armées françaises en raison de la spécificité de leurs missions. Les travaux réalisés au cours de cette thèse décrivent l'utilisation de deux stratégies permettant l'identification de molécules inhibant des protéines et complexes moléculaires impliqués dans la réplication du génome du nairovirus Hazara (HAZV) et de l'orthopoxvirus de la vaccine (VACV), modèles substitutifs respectifs du CCHFV et du VARV. Dans une première étude, l'activité de plusieurs petits ARN interférents (siRNAs) ciblant les ARN messagers du HAZV a été évaluée en culture cellulaire. Nous avons montré que deux siRNAs dirigés contre les transcrits codant la nucléoprotéine permettent de réduire de plus de 90% la production des particules virales infectieuses. L'association de la ribavirine avec chacun des deux siRNAs induit un effet synergique ou additif sur l'inhibition de la réplication du HAZV. Dans une seconde étude, nous avons adapté la technique du double hybride en levure afin de réaliser un criblage haut débit permettant la sélection de modulateurs d'interactions protéine-protéine au sein du complexe de réplication du VACV. Nous avons identifié deux molécules dont l'activité antivirale in vitro est spécifique des OPV. Leur action est associée également à une inhibition de la synthèse du génome viral. Nos travaux suggèrent que les deux stratégies mises en place peuvent contribuer au développement de futurs traitements contre les infections à nairovirus et à OPVCrimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV) and smallpox virus (VARV) infections, for which there are no licensed antiviral therapeutics, represent a significant threat to the strategic and operational missions of the French armed forces. Here, we reported two strategies used to identity novel antiviral compounds that are specifically effective in inhibiting proteins and molecular complexes involved in genome replication of Hazara nairovirus (HAZV) and vaccinia orthopoxvirus (VACV), respective surrogate models of CCHFV and VARV. In a first study, the activity of small interfering RNA (siRNAs) targeting the HAZV mRNA was evaluated in cell culture. We were able to identify two siRNAs directed against the transcripts encoding the nucleoprotein that reduced the production of infectious HAZV particles by over 90%. The combination of ribavirin with siRNAs induced an additive, or synergistic, effect on HAZV replication inhibition. In a second study, we adapted the yeast two-hybrid technique in order to perform a high throughput screening for the selection of protein-protein interaction modulators within the VACV replication complex. We identified two molecules that specifically inhibit orthopoxvirus (OPV) replication in vitro. Furthermore, we showed that both compounds interfere with the VACV genome synthesis. The initial results of this work indicate the potential of these two strategies to be applied for the development of future treatments against nairovirus and OPV infections
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Gattacceca, Florence. "Étude de l'effet antitumoral de l'IFNγ produit par transfert de gène et de son mécanisme d'action sur les cellules de mésothéliome humain". Paris 12, 2004. https://athena.u-pec.fr/primo-explore/search?query=any,exact,990002533560204611&vid=upec.
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Le mésothéliome est une tumeur gravissime de la plèvre dont l'incidence ne cesse d'augmenter. Les thérapies conventionnelles sont inefficaces. Cette situation justifie le développement de thérapies innovantes. Ainsi, nous avons construit un adénovirus recombinant portant le gène de l'IFNy (Ad-IFNy). J'ai d'abord montré que le transfert de gène par l'Ad-IFNy était efficace dans les lignées cellulaires de mésothéliome humain (LCMH), in vitro et in vivo, et que l'IFNy était produit de manière prolongée. L'Ad-IFNy exerçait un effet antiprolifératif sur les LCMH in vitro et antitumoral sur des xénogreffes chez la souris nude. Dans un second temps, les mécanismes d'action de l'IFN-y recombinant humain et de l'Ad-IFNy sur les LCMH ont été abordés par la technique des puces à ADNc. Les gènes régulés variaient selon la LCMH et le traitement. Au vu des gènes régulés, l'Ad-IFNy pourrait exercer un effet antitumoral même si les cellules sont résistantes à l'effet antiprolifératif de l'IFNyMesothelioma is a fatal pleural tumor, with an increasing incidence. Conventionnai therapies are unefficient, justifying the development of innovative therapies. Thus, we have constructed a recombinant adenovirus carrying the IFNy gene (Ad-IFNy). I first showed that Ad-IFNy could efficiently transfer the IFNy gene to human mesothelioma cdl lines (HMCL), in vitro et in vivo, and that IFNy production was prolonged. Ad-IFNy exerted an antiproliferative effect on HMCL in vitro and an antiturnoral action in xenogenic tumors in nude mice. Secondly, the mechanisms involved in the action ofrecombinant human i and Ad-IFNy on HMCL were assessed by cDNA array. Differentiaily regulated genes varied depending on the HMCL and on the treatment, Regarding genes regulated, Ad-IFN could exert an antitumoral effect in mesothelioma, even though mesothelioma cells were resistant to the antiproliferative action of IFNy
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Biscans, Annabelle. "Synthèse et évaluation d’oligoribonucléotides 2’-O-modifiés par des groupements biolabiles acétalesters ou alkyldithiométhyles dans une approche de prodrogues d’ARN interférents". Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTS020.
Texto completoResumen
Les ARN interférents sont de puissants outils thérapeutiques et biologiques pour la mise en silence de l'expression des gènes. Afin d'améliorer leur stabilité enzymatique, leur biodistribution et leur pénétration cellulaire, nous proposons de développer une approche prodrogue d'ARN interférent. Ce manuscrit rapporte la synthèse et l'évaluation de pro-ARN masqués temporairement par des groupements biolabiles susceptibles d'être hydrolysés dans les cellules afin de libérer l'ARN naturel actif. Deux types de modifications sont présentés : des groupes acétalesters enlevés par des carboxyestérases et des groupes alkyldithiométhyles sensibles à un environnement réducteur. Dans une première partie, une nouvelle méthode de synthèse de pro-ARN partiellement modifiés en position 2' par des groupements acétalesters est décrite. Plusieurs groupements variant par leur caractère lipophile ou cationique sont évalués. Des résultats prometteurs d'études physico-chimiques, de stabilité enzymatique, de pénétration cellulaire et d'inhibition de gènes mettent en valeur l'intérêt d'utiliser certains pro-ARN modifiés en tant qu'outils thérapeutiques. Une deuxième partie présente une voie de synthèse originale de pro-ARN modifiés en position 2' par des groupements alkyldithiométyles. Les propriétés physico-chimiques, la stabilité enzymatique et le démasquage de ces pro-ARN sont décrits. Parallèlement, l'étude d'une réaction d'échange thiol-disulfure permettant l'incorporation de liens disulfures intrabrin au sein de duplex d'ARN et de constructions tige-boucles est détaillée dans ce manuscritSiRNA are powerful therapeutic and biological tools for gene silencing. In the aim of improving their stability, their biodistribution and their cellular delivery, we propose to develop a siRNA prodrug-like approach.This manuscript reports the synthesis and the study of pro-RNA temporarily masked by biolabile groups which could be hydrolyzed inside cells in order to release the active unmodified RNA. Two types of modifications are presented: acetalester groups removed by carboxyesterases and alkyldithiomethyl groups cleaved in a reducing environment within cells.In a first part, a new synthesis strategy of partially modified 2'-O-acetalester pro-RNA is described. Several acetalester groups varying in their lipophilicity and their charge are evaluated. Promising results obtained in physical-chemical studies, enzymatic stability and gene inhibition highlight the use of these modified pro-RNA as therapeutic drugs. A second part introduces an original approach for the synthesis of 2'-O-alkyldithiomethyl pro-RNA. The physical-chemical properties, the enzymatic stability and the unmasking of this pro-RNA are described.Moreover, the study of a thiol-disulfide exchange reaction allowing the incorporation of intrastrand disulfide bond into secondary structure duplex and hairpin is reported in this manuscript
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Sütterlin-Diradourian, Claire. "Implication de la protéine ZIP/p62 dans la régulation, par la p38-MAPK, de l'activité transcriptionnelle du récepteur nucléaire PPARalpha". Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077060.
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Le récepteur activé par les proliférateurs de péroxysomes alpha (PPARa) appartient à la famille des récepteurs nucléaires et joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme des lipides, de l'homéostasie glucidique et des processus inflammatoires. En plus de son activation par un ligand, PPARa est également contrôlé par des processus post-traductionnels comme la phosphorylation. Dans le foie, PPARa est phosphorylé par des kinases comme les MAPKs, la PKA et la PKC. Le but de ce travail était d'étudier l'effet de la p38-MAPK sur l'activité transcriptionnelle de PPARa. Nous avons tout d'abord montré que, dans des cellules COS-7, un activateur de la p38-MAPK, l'anisomycine, phosphorylait PPARa de manière dose dépendante et inhibait de 50% son activité transcriptionnelle. Deuxièmement, dans des hépatomes, la phosphorylation de la p38-MAPK induite par l'anisomycine entraîne une diminution de l'expression endogène de la L-CPT I (liver-carnitine palmitoyltransferase), un gène cible de PPARa. Troisièmement, nous avons démontré que l'interaction PPARa/p38-MAPK nécessite un adaptateur, la protéine ZIP (zêta PKC-interacting protein). En effet, des expériences de co-immunoprécipitation nous ont permis de mettre en évidence une interaction trimèrique entre PPARa, la p38-MAPK et ZIP. Enfin, en diminuant l'expression de ZIP à l'aide d'un siRNA, nous avons observé une réduction de l'effet inhibiteur de l'anisomycine sur l'expression du gène codant la L-CPT I. En conclusion, nous avons montré que l'activation de la p38-MAPK induisait une phosphorylation de PPARa et une inhibition de son activité transcriptionnelle secondairement à la formation d'un trimère PPARa/ZIP/p38-MAPKThe peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa) belongs to the nuclear receptor family and plays a central role in the regulation of lipid metabolism, glucose homeostasis an inflammatory processes. In addition to its ligand-induced transcriptional activity, PPARa is also regulated by phosphorylation. In the liver, PPARa is phosphorylated by kinases such as ERK mitogen-activated protein kinases (MAPK), cAMP-dependent protein kinase (PKA) and calcium dependent protein kinase (PKC). The aim of this work was to examine the effect of p38-MAPK on PPARa transcriptional activity. Firstly, we showed that in COS-7 cells, the p38-MAPK activator anisomycin, phosphorylated PPARa in a dose dépendent manner and inhibited by 50% its transcriptional activity. Secondly, in H4IIE hepatoma cells, anisomycin-induced p38-MAPK phosphorylation decreased the endogenous mRNA and protein expression levels of liver carnitine palmitoyltransferase I (L-CPTI), a PPARa target gene. Thirdly, we demonstrated that PPARa/p38 MAPK interaction required a molecular adapter, the zeta PKC-interacting protein (ZIP). Indeed using co-immunoprecipitation assays, we found a trimeric interaction between PPARa, p38-MAPJ and ZIP. Finally, reducing ZIP expression by siRNA, impaired L-CPTI gene expression in response to anisomycin. In conclusion, we showed that p38-MAPK activation induced PPARa phosphorylatio and inhibition of its transcriptional activity through a trimeric interaction between thé p38-MAPK, ZlP and PPARa
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Foca, Adrien. "Identification of PLK1 as a proviral factor for the hepatitis B virus replication : A possible target for antiviral and anticancerous drug development". Thesis, Lyon, 2018. http://www.theses.fr/2018LYSE1310/document.
Texto completoResumen
Dans les régions de fortes endémicités, 70-80% des carcinomes hépatocellulaires sont induits par le VHB. Bien qu’un vaccin prophylactique très efficace existe, il n’est d’aucune utilité pour les 250 millions de personnes chroniquement infectées. Les traitements actuels pour contrôler l'infection chronique par le VHB montrent des limites et le besoin de nouvelles thérapies se fait ressentir. La Polo-like kinase-1 (PLK1), qui joue un rôle essentiel dans la mitose et est surexprimée dans de nombreux cancers, représente une cible prometteuse. Outre son rôle lors de la division cellulaire, PLK1 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes en interphase. Il a été montré que la protéine X du VHB (HBx) active PLK1 dans des modèles de cellules murines. Cependant, il restait à déterminer si PLK1 jouait un rôle au niveau de la réplication du VHB dans des hépatocytes quiescents. Des études récentes ont mis en évidence un lien positif entre l'activation de PLK1 et la réplication du VHB. Le but de ce projet de thèse a été d'étudier le(s) mécanisme(s) par le(s)quel(s) PLK1 jouait un rôle positif sur la réplication virale, avec pour objectif futur d'explorer l’inhibition de PLK1 comme cible antivirale. L'interaction entre PLK1 et la réplication du VHB a d'abord été décrite à l'aide du modèle HepAD38. Dans ce contexte, l'ADN viral est intégré dans le génome hôte, sous le contrôle d'un système d'expression Tet-off. La transcription de l'ARN prégénomique (pgRNA), à la base de la réplication virale, est initiée par la suppression de tétracycline. Dans ce contexte, l'augmentation de l'expression de PLK1 est corrélée avec la régulation négative de deux protéines; SUZ12 et ZNF198, faisant partie de complexes de remodelage de la chromatine. L'inhibition de PLK1 bloque la réplication du VHB, en agissant au niveau de la transcription virale. D'autre part, dans les modèles de réplication du VHB qui miment au mieux une infection, comprenant les hépatocytes primaires humains (PHH) et les cellules non transformées/différenciées HepaRG (dHepaRG), où le VHB se réplique dans des cellules quiescentes, nous avons mis en évidence que: 1) L'inhibition pharmacologique de PLK1 bloque la réplication virale, semblablement en perturbant l’encapsidation du pgRNA via une interaction avec la protéine core du VHB (HBc). 2) Un knocking-down de PLK1 en utilisant des ARN interférents délivrés par nanoparticules lipidiques résulte en une forte baisse de la production de pgRNA et dans la sécrétion des antigènes HBeAg/HBsAg, sans impact sur la viabilité cellulaire. Ce projet a donc permis la preuve de concept que PLK1 pouvait être une cible thérapeutique afin de controler la réplication du VHB. De plus, grâce à la technologie de délivrance par nanoparticules lipidiques d’ARN interférents, nous avons pu cibler spécifiquement les hépatocytes, augmentant de ce fait la spécificité et l’efficacité de nos traitements. Un travail sur la compréhension précise des méchanismes cellulaires impliqués permettra de mieux cerner cette interaction hôte/virus afin de poursuivre le développement de stratégies antivirales innovantes portant sur l’inhibition de PLK1. De manière significative, l'inhibition de PLK1 est non toxique pour les cellules quiescentes par rapport à des cellules cancéreuses à fort taux réplicatif, ce qui fait de PLK1 une cible thérapeutique attrayante. Des inhibiteurs spécifiques sont déjà en essais cliniques pour certains cancers (e.g., Volasertib pour le traitement de la leucémie myéloïde aiguë) et pourraient servir de thérapie bimodale dans le cadre de patients infectés par le VHB, en inhibant la réplication virale, ainsi qu’en prévenant l'émergence de cellules néoplasiques. L'inhibition de la PLK1 est une approche antivirale innovante, qui, en combinaison avec les thérapies actuelles de type IFN-α ou analogues nucléotidiques offre de grandes promesses pour endiguer l'infection chronique par le VHB mais également prévenir les événements carcinogéniquesIn highly HBV endemic regions, 70-80% of hepatocellular carcinoma cases are attributable to this virus. Despite the existence of an HBV vaccine, the World Health Organization estimates 240 million individuals are chronically infected with HBV worldwide. Current antiviral treatments to control chronic HBV infections, and consequently reduce the incidence of liver cancer, are ineffective. New and effective therapies are needed not only for fighting the virus but also to prevent HCC emergence or progression. The polo-like-kinase 1 (PLK1), which plays pivotal roles in mitosis and is over-expressed in many human cancers, represents a promising druggable target in oncology. Beside its role during cell division, PLK1 is also thought to be involved in gene expression regulation during interphase. It was shown that the X protein (HBx) could activate PLK1 in murine cell transformation models. Yet it remained to be determined whether PLK1 could also play a role for HBV replication in non-dividing hepatocytes. Our, and collaborators, recent studies have identified a positive link between PLK1 activation and HBV replication. The goal of this thesis project was to investigate the mechanism(s) by which PLK1 exerts a positive effect on HBV replication, with the future goal of exploring PLK1 as an antiviral target. The interplay between PLK1 and HBV replication was firstly described using the HepAD38 cellular model of HBV replication. In this context, the HBV DNA is stably integrated into the host genome, under control of a Tet-off expression system. Transcription of HBV pregenomic RNA (pgRNA), the template of viral replication, is initiated by tetracycline removal. It has been shown that in HBV-replicating HepAD38 cells, increased PLK1 expression correlates with down-regulation of two proteins that are components of chromatin modifying complexes; SUZ12 protein of the PRC2 complex, and ZNF198 of the LSD1-CoREST-HDAC1 complex. PLK1 inhibition was described to inhibit HBV replication by reducing viral transcription. How PLK1 regulates HBV transcription remains unknown. On the other hand, in HBV replication models that resemble physiologic HBV infection, comprised of Primary Human Hepatocytes (PHH) and non-transformed/differentiated HepaRG cells (dHepaRG), where HBV replicates in non-transformed and non-dividing cells, thus enabling the study of the inter-phasic role of PLK1, irrespective of its well-established cell division implication, we have demonstrated that: 1) A pharmacological inhibition of PLK1 suppressed HBV replication by a different mechanism, likely targeting the packaging of pgRNA by the HBV core antigen (HBc). 2) Knocking-down PLK1 using siRNA delivered by lipid nanoparticles (LNP siPLK1) results in a strong drop of HBV DNAs, RNAs and HBe/HBsAg secretion without affecting the cell viability. This thesis project brought the proof of concept that PLK1 could be a drug target in HBV infection. Furthermore, the use of LNP allowed us to improve the delivery of siPLK1 to hepatocytes. Significantly, PLK1 inhibition is not toxic to quiescent cells in comparison to fast growing cancer cells, rendering PLK1 an attractive therapy target. High level of viremia in chronic HBV patients is a risk factor for progression to liver cancer. PLK1 specific inhibitors are already in clinical trials for other types of cancer (e.g., acute myeloid leukaemia) and could serve as bimodal therapy in HBV infected patients, by inhibiting virus replication as well as preventing emergence and spreading of neoplastic cells. This project was part of a full-working group of experts and thus, has beneficiated of a strong support. The proximity of the oncology-specialized hospital, the Centre Léon Bérard provided us with fresh hepatic biopsy [etc...]
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Durfort, Tiphanie. "Induction d'une réponse antitumorale et immunitaire suite à l'inhibition du récepteur de l'IGF-1 et de son ligand par ARN interférence". Paris 5, 2010. http://www.theses.fr/2010PA05P614.
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Le facteur de croissance IGF-1 et son récepteteur IGF-1R participent à la tumorigénèse de nombreux cancers. L'inhibition de ces protéines avec des approches ARN ou oligonucléotides antisens ont entraîné l'activation d'une réponse immunitaire antitumorale spécifique in vivo. Durant ma thèse, mon objectif a été de développer une stratégie alternative plus éfficace pour inhiber l'axe IGF et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui permettent cette augmentation spécifique de l'immunogénicité. Pour cela, nous avons dessiné plusieurs molécules siRNAs ciblant IGF-1R et IGF-1. Un criblage des séquences a été effectué dans des modèles de cancer du sein (EMT6, C4HD) et du foie murin (mhAT2) syngéniques. Les molécules les plus efficaces ont été modifiées avec un 2'O méthyle sur les motifs uridine du brin passager afin de ne pas stimuler de réponse immunitaire innée cytotoxique dans les cellules. La transfection d'un siRNA 2'O méthyle dirigé contre IGF-1R diminue la prolifération cellulaire et la phosphorylation des voies de signalisation AKT et ERK 1/2, provoquant un blocage du cycle cellulaire en phase G0/G1 dans les cellules. Des cytokines pro-inflammatoires sont sécrétées par les cellules cancéreuses du sein inhibées pour IGF-1R. Les cellules C4HD transfectées avec les siRNAs 2'O méthyle dirigés contre IGF-1R et IGF-1 perdent leur tumorigénicité in vivo. Les analyses hispathologiques de ces tumeurs révèlent la présence d'index mitotique faible ainsi qu'une infiltration par les lymphocytes et les polymorphonucléaires neutrophiles. L'existance d'une réponse immunitaire cellulaire active a été confirmée chez la souris vaccinées avec les cellules C4HD transfectées avec le siRNA 2'O méthyle dirigé contre IGF-1R grâce à l'utilisation de différents tests (test d'hypersensibilité retardée, prolifération et cytotoxicité des splénocytes). Nos résultats montrent que nos molécules possèdent un intérêt thérapeutique dans le traitement des cancers exprimant IGF-1R ou IGF-1 et fournissent plusieurs éléments de réponse concernant le lien entre le système IGF et la réponse immunitaireThe role of insulin-like growth factor I (IGF-I) and its type I receptor (IGF-IR) in tumorigenesis has been well documented. Strategies like RNA or oligonucleotide antisense-based down-regulation of IGF-I or IGF-IR have been shown to trigger antitumoral immune response in addition to in vivo tumor growth inhibition. Here, IGF-I and IGF-IR blockade through 2'Omethyl modified short interfering RNA and their potential immunological stimulation are addressed in syngenic models. Some sequences were selected that were able to efficiently and specifically downregulate IGF-I and IGF-IR in murine hepatocarcinoma (mhAT2) and breast cancer cells (EMT6, CAHD). Transfection of IGF-IR siRNAs caused decreased cell proliferation in vitro. Moreover, IGF-IR silencing diminished phosphorylation of downstream signaling pathway proteins AKT and ERK1/2, and induced a G0/G1 cell cycle block. Proinflammatory cytokines were also produced by breast tumor cells downregulated for IGF-IR. When transfected with anti IGF-I or anti IGF-IR siRNA, C4HD mammary tumor cells significantly lost their tumorigenicity in syngenic BALB/c mice. Histological analyses of developing tumors in mice grafted with IGF-IR or IGF-I siRNA treated C4HD cells revealed a low mitotic index and infiltration of lymphocytes and polymorphonuclear neutrophils, suggesting the involvement of antitumoral immunological response. IGF-IR down-regulated C4HD cells were then tried as an immunogen. Induction of an immune response was clearly evidenced by presence of stimulated splenocytes and an increase in delayed-type hypersensitivity in mice immunized with IGF-IR silenced C4HD cells against parental tumor cells. Our findings suggest that RNA interference technology may offer a new clinical approach for treatment of tumors expressing IGF-IR -or IGF-I- provided the use of modified short interfering RNA with a better understanding of IGF axis and immunological network relationship
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Samson, Mélanie. "Établissement de nouvelles voies de biosynthèse des androgènes et estrogènes actifs dans les cellules du cancer de la prostate (DU-145), les sébocytes transformés (SZ-95) et les choriocarcinomes (JEG-3) en utilisant l'ARN interférence et des inhibiteurs de synthèses". Thesis, Université Laval, 2009. http://www.theses.ulaval.ca/2009/26416/26416.pdf.
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Le, Roy Florence. "Clonage et caractérisation de protéines associées à la RNase L. Identification d'ARNm cellulaires régulés par la RNase L". Montpellier 2, 2000. http://www.theses.fr/2000MON20054.
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Les interferons (ifns) induisent de nombreux genes impliques dans le controle de la proliferation et de la differenciation cellulaires, ainsi que dans la modulation des reponses immunitaires et dans la defense contre l'infection virale. Le systeme 2-5a/rnase l est un des systemes induit par les ifns. L'ifn induit l'expression des genes 2-5a synthetases qui, activees par des arns double-brin (viraux ou cellulaires), polymerisent l'atp en une serie d'oligoadenylates relies par des liaisons phosphodiesters 2'-5' (2-5a). Le 2-5a active une endoribonuclease latente, la rnase l, qui degrade les arns simple brin, entrainant une inhibition de la synthese proteique. L'activite de la rnase l est regulee par le 2-5a et par son inhibiteur proteique, rli (rnase l inhibitor). Afin d'elucider le mecanisme d'action de la rnase l, nous avons clone des partenaires de la rnase l. Nous avons identifie, par purification biochimique suivie d'un microsequencage, une proteine associee a la rnase l impliquee dans la terminaison de la traduction. Parallelement, par la technique du double-hybride, nous avons clone un autre partenaire de la rnase l, implique dans l'initiation de la traduction mitochondriale : if2-mt. L'etude des partenaires de la rnase l nous a amene a etudier le role de la rnase l dans la metabolisme des arnm mitochondriaux. Notre etude montre que la rnase l et son inhibiteur sont presents dans les mitochondries et que la rnase l est impliquee dans l'effet antiproliferatif de l'ifn via la degradation des arnm mitochondriaux.
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Abdel-Lateif, Khalid. "Flavonoids and actinorhizal symbiosis : Impact of RNA interference-mediated silencing of chalcone synthase gene on symbiosis between Casuarina glauca and Frankia". Thesis, Montpellier 2, 2012. http://www.theses.fr/2012MON20244/document.
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Les deux systèmes nodulaires symbiotiques les plus importants au niveau agronomique et environnemental sont, d'une part, les symbioses Rhizobium-légumineuses qui concernent environ 14 000 espèces, et d'autre part, les symbioses entre les plantes actinorhiziennes (environ 200 espèces) et l'actinomycète du sol Frankia. La plupart des plantes actinorhiziennes sont capables de fixer des quantités d'azote comparable à celles des Légumineuses ; ce sont généralement des plantes pionnières capables de coloniser des environnements pauvres en éléments minéraux. Elles représentent donc un atout écologique important. Si la symbiose Rhizobium-légumineuse est très étudiée, les mécanismes moléculaires à l'origine de la formation des nodules actinorhiziens restent actuellement peu connus. Ainsi, chez les Légumineuses, les flavonoïdes sont des molécules-clefs du processus de nodulation, alors que chez les plantes actinorhiziennes, l'implication des flavonoïdes dans la nodulation reste imprécise. L'objectif de cette thèse était de comprendre l'implication des flavonoïdes au cours de l'interaction symbiotique entre l'arbre actinorhizien tropical Casuarina glauca et son symbiote Frankia. L'analyse d'une base de données d'unigènes couplée à celle de données d'expression de puces à ADN a permis l'identification de huit genes de C. glauca impliqués dans la voie de biosynthèse des flavonoïdes. L'étude de leur expression dans les racines par PCR quantitative au cours d'une cinétique d'infection de C. glauca par Frankia a montré que les transcrits de la chalcone isomerase et de l'isoflavone reductase s'accumulaient très tôt après l'inoculation, suggérant ainsi une implication des isoflavonoïdes dans la symbiose actinorhizienne. Nous avons alors utilisé une stratégie d'ARN interférent pour réduire l'expression du gène de la chalcone synthase, la première enzyme de la voie de biosynthèse des flavonoïdes. La réduction de l'expression du gène de la chalcone synthase a provoqué une réduction significative du taux de flavonoïdes dans les racines ainsi qu'une très forte diminution du taux de nodulation chez les plantes transformées. Une restauration du taux de nodulation a pu être obtenu en présence de naringenin, une molécule centrale de la voie de biosynthèse des flavonoïdes.Nos résultats apportent donc, pour la première fois, une évidence directe de l'implication forte des flavonoïdes au cours de la nodulation des plantes actinorhiziennesNitrogen-fixing root nodulation, confined to four plant orders, encompasses more than 14,000 Leguminosae species, and approximately 200 actinorhizal species forming symbioses with rhizobia and Frankia bacterial species, respectively. Most actinorhizal plants are capable of high rates of nitrogen fixation comparable to the nitrogen fixing symbiosis between legumes and Rhizobium. As a consequence, these plants are able to grow in poor and disturbed soils and are important elements in plant community worldwide. The basic knowledge of the symbiotic interaction between Frankia and actinorhizal plants is still poorly understood, although it offers striking differences with the Rhizobium-legume symbiosis. In the symbiosis between legumes and Rhizobium, flavonoids are key molecules for nodulation. In actinorhizal plants, the involvement of flavonoids in symbiosis is poorly understood, but because of the similarities of the infection process between some actinorhizal plants and legumes, flavonoids were proposed to act as plant signals for the bacteria Frankia. The objective of this thesis was to investigate the involvement of flavonoids during the actinorhizal nodulation process resulting from the interaction between the tropical tree Casuarina glauca and the actinomycete Frankia.Eight C. glauca genes involved in flavonoid biosynthesis were identified from a unigene database and their expression patterns were monitored by quantitative real-time PCR during the nodulation time course. Our results showed that chalcone isomerase and isoflavone reductase transcripts accumulated preferentially early after inoculation with Frankia, suggesting thus for the first time that isoflavonoids are implicated in actinorhizal nodulation. To go deeper in the understanding of the role of these molecules in actinorhizal symbiosis, we used RNA interference strategy to silence chalcone synthase, the enzyme that catalyzes the first committed step of the flavonoid pathway. Knockdown of chalcone synthase expression led to a strong reduction of specific flavonoids levels and resulted in a severely impaired nodulation. Nodule formation could be rescued by supplementation of plants with naringenin, which is an upstream intermediate in flavonoid biosynthesis. Our results provide, for the first time, direct evidence of a strong implication of flavonoids during actinorhizal nodulation
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Laroui, Nabila. "Ingénierie et auto-assemblage de nano-vecteurs pour la délivrance ciblée de siRNA". Thesis, Montpellier, 2020. http://www.theses.fr/2020MONTT058.
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Le développement de thérapies géniques ciblées représente un défi majeur en cancérologie qui se heurte souvent à des problèmes de délivrance. Les systèmes de délivrance actuels génèrent de nombreux effets indésirables, dont beaucoup sont dus à des interactions non spécifiques. Ainsi, l’utilisation de nano-vecteurs pour la délivrance ciblée de siRNA devrait permettre de répondre à ces besoins cliniques. L’objectif général de cette thèse porte sur la conception et l’étude de nano-vecteurs de siRNA pour cibler et traiter des pathologies cancéreuses. Le premier axe de recherche est consacré à l’étude de peptides modifiés pour la délivrance du siRNA. Ce travail de thèse visait à améliorer la vectorisation et l’internalisation du siRNA dans les cellules cibles. Pour cela, deux types de peptides ont été développés : i) des CPP (Cell Penetrating Peptides) fonctionnalisés par une séquence de ciblage dérivée de la laminine ̶ ciblant les cellules du cancer du sein̶ et ii) des peptides agrafés qui contraignent une structure secondaire en hélice α permettant d’augmenter la résistance à la protéolyse et favoriser l'internalisation cellulaire. Le deuxième axe s’est orienté vers le développement d’une nouvelle génération de vecteurs obtenus par auto-assemblage. Deux stratégies ont été explorées: i) une approche d’assemblage dynamique covalent pour développer des polymères dynamiques covalents (PDC) obtenus par un processus d’adaptation à la cible siRNA et ii) une approche d’assemblage supramoléculaire de porphyrines cationiques induits par le siRNA. La première stratégie a permis, via la fonctionnalisation des PDC par du D-mannose, de démontrer une vectorisation ciblée de cellules du cancer colorectal et la seconde stratégie a conduit au premier exemple de thérapie duale combinant siRNA et thérapie photo-dynamique basé sur des petites moléculesThe development of targeted gene therapies represents a major challenge in oncology that is hampered by delivery issues. Current delivery systems generate many side effects, many of which are due to off-target interactions, and the use of nano-vectors for targeted delivery of siRNA is a promising approach to tackle this challenge. The general objective of this thesis was to design and study original nano-vectors of siRNA for targeting and treating cancer. The first line of research was dedicated to the study of modified peptides for the siRNA delivery. This work aimed to improve the internalization of siRNA in target cells. For this, two types of peptides have been developed: i) CPPs (Cell Penetrating Peptides) functionalized with a targeting sequence derived from laminin ̶ targeting breast cancer cells, and ii) stapled peptides enforcing an α helical secondary structure which endow enhanced stability towards proteolysis and improved cell uptake. The second axis focused on the development of a new generation of nano-vectors obtained by self-assembly. Two strategies have been described: i) a dynamic covalent self-assembly approach to develop Dynamic Covalent Polymers (DCPs) through a siRNA-templated process, and ii) ii) a supramolecular self-assembly approach of cationic porphyrins directed by the templating siRNA. The first strategy led, via functionalization of the DCPs with D-mannose, to the targeted delivery of colorectal cancer cells and the second strategy led to the first example of dual therapy combining siRNA and photodynamic therapy achieved using small molecules
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Mege-Bronesky, Delphine. "Des ARN non-codants au cœur du métabolisme des sucres : nouveaux mécanismes et impact sur l'adaptation et la virulence". Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ053/document.
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Staphylococcus aureus un pathogène opportuniste de l’homme responsable de nombreuses maladies. Son pouvoir pathogène est dû à l’expression de nombreux facteurs de virulence, aussi qu’à sa capacité de s’adapter à son environnement. En pénétrant dans nos tissus S. aureus doit, pour survivre, faire face aux changements environnementaux et à la disponibilité des nutriments. L’expression des gènes impliqués dans ces réponses adaptatives, est soumise à une régulation fine, apportée par les systèmes à deux composants, les facteurs de transcription et les sARN (small ARN). Dans cette étude, j’ai identifié les fonctions d’un sARN, appelé RsaI, qui est réprimé en présence de glucose extérieur. RsaI, réprime la traduction, de plusieurs ARNm impliqués dans le métabolisme carboné et également de IcaR, impliqué dans la synthèse de biofilms. RsaI participe à l’inhibition de plusieurs enzymes de la voie de synthèse des pentoses phosphates et interagit également avec d’autre sARN. Cet ARN multifonctionnel est un véritable senseur du taux de glucose extérieur engendrant ainsi un switch métabolique, nécessaire à la réponse adaptative de S. aureus en conditions infectieusesStaphylococcus aureus is a human opportunist pathogenic bacterium capable to colonize different host tissues and organs and therefore generates multiple infectious conditions. Its pathogenic power is due to the expression of multiple virulence factors, and by it’s ability to adapt to the environment. Once entered in human tissues, S. aureus must face environmental changes, as the availability of nutriments to survive. Gene expressions implicated in these adaptive responses are submitted to a fine regulation, carried by two component systems, transcriptional factors, and sRNA (small RNA). In this study, I have identified the functions of a sRNA, called RsaI, which is repressed when the external concentration of glucose is at high levels. RsaI represses the translation of multiple mRNA implicated in the carbon metabolism, including a major glucose transporter, and IcaR, implicated in the biofilms synthesis. Furthermore, RsaI interacts with other sRNA. This multifunctional RNA is a real sensor of the external glucose levels, generating a metabolic switch that is necessary to ensure S. aureus adaptive response in infectious conditions
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Moreira, Da Silva Sara. "Caractérisation de NEF-sp : une exoribonucléase 3'→ 5' spécifique du testicule". Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017GREAV042/document.
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Caractérisation de NEF-sp: une exoribonucléase 3'→ 5' spécifique du testicule. Les études biochimiques et génétiques ont révélé que de nombreuses protéines jouent un rôle important dans la voie des ARNpi (ARN interagissant avec Piwi). Néanmoins, certaines caractéristiques mécanistes ne sont pas encore complètement comprises. D’autre part, certaines protéines impliquées dans la voie des ARNpi pourraient ne pas encore être caractérisées. Lorsque ce projet a commencé, le traitement 3’ des ARNpi n'avait pas été complètement identifié. Par contre la directionnalité 3’ à 5’ avait été observée avec une dépendance au Mg2+. Toutefois, la protéine responsable du raccourcissement des ARNpi à leur longueur mature n'était toujours pas connue.NEF-sp devrait être une exo nucléase d'ARN avec une directionnalité de 3' à 5'. Sa prédiction de domaine a révélé que cela se compose d'un domaine de nucléase N-terminal et de deux motifs de reconnaissance d'ARN (RRM). NEF-sp est également prévue comme une nucléase spécifique aux testicules, mais son rôle biologique n'a pas été caractérisé auparavant. Ce projet s'est concentré sur une hypothèse initiale selon laquelle NEF-sp pourrait potentiellement agir comme une nucléase impliquée dans la voie des ARNpi.Globalement, nous avons démontré que NEF-sp humaine est une exoribonucléase avec une directionnalité 3'→ 5'qui est active sur les substrats de l'ARN simple brin. Cette protéine est exprimée exclusivement dans les testicules des souris. En plus, NEF-sp pourrait fonctionner dans le compartiment nucléaire. Notre analyse de la souris Nef-sp mutante n'a révélé aucun phénotype évident. Nous avons observé que les homozygotes des deux sexes sont viables et présentent une fertilité normale. De plus, NEF-sp ne semble pas jouer un rôle dans la voie des ARNpi. Il est possible que le recadrage du/des substrat(s) inconnu(s) ne soit pas important pour la viabilité et fertilité en raison de la compensation potentielle par d'autres nucléases. Néanmoins, notre étude fournit une caractérisation biochimique et génétique de l'exoribonucléase NEF-sp des mammifèresGenetic and biochemical studies have identified more than twenty different proteins involved in the piRNA pathway. However, some mechanistic features are still not fully understood. When this project started, piRNAs 3' end trimming was not completely characterized. Trimming was observed before in BmN4 cells and an Mg2+-dependent 3′ to 5′ exonuclease was implicated in this process. However, the protein responsible for shortening piRNAs to their mature length was still not known.NEF-sp is predicted to be an RNA exonuclease with 3′ to 5′ directionality. This protein is composed by three domains: a nuclease domain at N-terminal and two RNA binding motifs at C-terminal. NEF-sp is also predicted to be a testis-specific nuclease, however its biological role was not previously characterized. This project was based on the hypothesis that NEF-sp could potentially act as a nuclease involved in the piRNA maturation.We examined the biochemical properties of the uncharacterized mammalian nuclease family member NEF-sp. We show that Nef-sp transcripts are detected exclusively in mouse testes. We demonstrate that hNEF-sp is a 3ʹ→5ʹ exoribonuclease that is active on ssRNA substrates and likely functions in the nucleolar compartment. Our own analysis of the Nef-sp mouse knock-out mutant revealed no obvious phenotype. We observed that homozygous animals of both sexes are viability and display normal fertility. NEF-sp does not seem to play a role in piRNA pathway. It is possible that precise trimming of the unknown substrate(s) may not be important for viability/fertility due to potential complementation by other nucleases. Nevertheless, our study provides a biochemical and genetic characterization of the mammalian NEF-sp exoribonuclease
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Autaa, Julie. "The role of the histone demethylase Kdm3 complex in defining the boundaries of piRNA clusters". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2024. https://accesdistant.sorbonne-universite.fr/login?url=https://theses-intra.sorbonne-universite.fr/2024SORUS234.pdf.
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Pour préserver l'intégrité du génome de la lignée germinale animale, l'activité des éléments transposables (TE) est régulée par de petits ARN non codants appelés ARN piwi-interacting (piRNAs). Dans les ovaires de Drosophila melanogaster, les piRNAs proviennent de régions hétérochromatiques appelées piRNA clusters. Ces régions présentent un enrichissement en séquences incomplètes de TE et des marques de di- ou tri-méthylation de la lysine 9 sur l'histone 3 (H3K9me2/3), caractéristiques de l'hétérochromatine. Malgré une chromatine condensée, la transcription se produit dans ces régions, facilitée par Rhino, un membre de la famille de protéines HP1a. Rhino se lie spécifiquement aux régions riches en H3K9me2/3 au piRNA clusters, recrutant la machinerie transcriptionnelle via des partenaires spécifiques. Cependant, la spécificité de sa liaison reste floue. En utilisant des outils génétiques et des analyses informatiques, j'ai montré que la dérégulation de Kdm3, codant une histone déméthylase ciblant les H3K9 méthylés (H3K9me1/2), dans la lignée germinale double presque les niveaux de H3K9me2 dans les ovaires de Drosophila melanogaster. Cela permet à certaines régions contenant des gènes de recruter Rhino, produisant des piRNAs "auto-immuns". Nos résultats soulignent l'importance de l'état de la chromatine dans la détermination des clusters de piRNA. Par la suite, un allèle Kdm3-GFP a été créé en utilisant CRISPR/Cas9, permettant l'identification de deux partenaires protéiques de fonctions inconnues via l'immunoprécipitation suivie de la spectrométrie de masse. Ces protéines sont paralogues, avec des fonctions apparemment redondantes. L'un de ces partenaires a été caractérisé comme l'un des dix principaux partenaires de HP1a. Par conséquent, nous émettons l'hypothèse que ces protéines paralogues établissent des ponts entre Kdm3 et HP1a/Rhino, des protéines aux fonctions antagonistes, aidant ainsi à définir les frontières entre l'euchromatine et l'hétérochromatine et à empêcher l'extension des piRNA clustersTo safeguard the genome integrity of animal germline, the activity of transposable elements (TEs) is regulated by small non-coding RNAs known as PIWI-interacting RNAs (piRNAs). Within Drosophila melanogaster ovaries, piRNAs arise from heterochromatic region called piRNA clusters. These regions exhibit enrichment for incomplete TE sequences and di- or tri-methylation of lysine 9 on histone 3 (H3K9me2/3) marks, characteristic of heterochromatin. Despite condensed chromatin, transcription occurs in these regions facilitated by Rhino, an HP1a protein family member. Rhino selectively binds H3K9me2/3-rich regions, recruiting transcriptional machinery via specific partners. However, its binding specificity remains unclear. Using genetic tools and computational analyses, I have shown that the germline knock-down of Kdm3, a histone demethylase targeting methylated H3K9, nearly doubles H3K9me2 levels across Drosophila ovaries. This enables certain gene-containing regions to recruit Rhino, producing “auto-immune” piRNAs. Our results highlight the importance of the chromatin state in piRNA cluster determination. Subsequently, a Kdm3-GFP allele was created using CRISPR/Cas9 allowing identification of two previously unknown protein partners via immunoprecipitation followed by mass spectrometry. These proteins are paralogous, with seemingly redundant functions. One of these partners has been characterized as one of the top ten interactors of HP1a. Consequently, we hypothesize that these paralogous proteins build bridges between antagonistic Kdm3 and HP1a/Rhino, thus helping to define borders between euchromatin and heterochromatin as well as preventing extension of piRNA clusters loci
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Silhol, Michelle. "La Microinjection dans les cellules somatiques effet d'agents antiviraux /". Grenoble 2 : ANRT, 1987. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb37609920n.
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Sehki, Hayat. "Rôle d’un suppresseur endogène de RNAi dans le développement de la plante et ses interactions avec les pathogènes". Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASB034.
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Le Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) est un mécanisme dirigé contre les acides nucléiques invasifs endogènes (transposons) et exogènes (pathogènes, transgènes). Dans le cas des virus, le PTGS peut s’attaquer aux ARNs double-brin (dsRNAs) intermédiaires de la réplication virale et aux ARNs simple-brin viraux, mais il est souvent inhibé par des protéines virales appelées Viral Suppressor of RNAi (VSR). Chez la plante modèle Arabidopsis thaliana, une enzyme appelée RNase THREE-LIKE 1 (RTL1) est induite en réponse à l'infection virale et détruit les dsRNAs de manière non sélective. Cette enzyme devrait assurer à la plante une seconde ligne de défense en clivant les dsRNAs viraux, mais les VSR qui inhibent le PTGS inhibent généralement RTL1, indiquant que les virus ont mis en place des outils capables de combattre simultanément ces deux mécanismes de défense. Toutefois, un virus, le Turnip yellow mosaic virus (TYMV), est incapable d’inhiber RTL1 et semble même tirer profit de RTL1 pour réussir à infecter A. thaliana (Shamandi et al., 2015).Au cours de cette thèse, nous avons approfondi l’étude de l’interaction Arabidopsis-TYMV. Nous avons montré que le TYMV est incapable d’inhiber l’exécution du PTGS, mais est toutefois capable d’inhiber l’étape d’amplification du PTGS. Cette action est due à la protéine virale P69, et nous avons montré que P69 est retrouvée dans des corpuscules cytoplasmiques appelés siRNA-bodies qui sont le siège de l’amplification du PTGS. Par ailleurs, nous avons généré des mutants rtl1 et montré que l’absence de RTL1 retarde l’infection par le TYMV et augmente la quantité de siRNAs dirigés contre le virus, tandis que la surexpression de RTL1 favorise l’infection et inhibe la production des siRNAs anti-viraux. Nous avons observé que RTL1 était retrouvée dans les siRNA-bodies, et nous avons montré que RTL1 était capable de détruire non seulement les dsRNAs mais également les siRNAs. Ces résultats indiquent donc que le TYMV réussit à infecter A. thaliana en : i) se répliquant dans des invaginations de la membrane chloroplastique (Prod’homme et al., 2003) qui mettent vraisemblablement les dsRNAs intermédiaires de la réplication à l’abri du PTGS et de RTL1, ii) en induisant l’expression de RTL1 qui s’attaque aux dsRNAs et siRNAs induits par le PTGS dans les siRNA-bodies en réponse à l’infection, et iii) en exprimant la protéine P69 qui complète l’action de RTL1 en inhibant l’amplification du PTGS résiduel.Malgré un effet neutre ou négatif pour la plante vis-à-vis des virus, RTL1 est conservé dans toutes les accessions d’Arabidopsis, et l’étude du ratio des mutations synonymes et non synonymes dans les gènes RTL1 de 42 Eucotylédones suggère que RTL1 subit une pression de sélection de conservation, suggérant un rôle essentiel. Chez A. thaliana, RTL1 est exprimé faiblement dans la racine, les tissus en sénescence, et au cours du développement de la graine. Le phénotypage des plantes sauvages et des mutants rtl1 n’a pas révélé de différences morphologiques notables, mais nous avons observé que le poids des graines était supérieur chez les mutants rtl1. Par ailleurs, nous avons observé une senescence accrue chez le mutant rtl1, en particulier dans l’accession Ler. Cette différence entre Ler et Col nous a poussé à examiner si RTL1 pouvait contribuer à la variabilité naturelle du PTGS des transgènes entre les accessions Ler (PTGS peu efficace) et Col (PTGS très efficace). Nous avons observé que la mutation rtl1 n’affectait pas sensiblement l’efficacité du PTGS chez Col mais augmentait celle de Ler au niveau de Col, ce qui pourrait s’expliquer par une plus forte expression de RTL1 chez Ler que chez Col. L’effet de l’absence de RTL1 devra donc être précisé en condition normale et en condition d’infection en privilégiant Ler plutôt que ColPost-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids of endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins. During virus infection, PTGS theoretically targets double-stranded (ds)RNA intermediates of viral replication and viral single-stranded RNAs; however, most viruses encode proteins, referred to as viral suppressor of RNAi (VSR), which inhibit PTGS. In the model plant Arabidopsis thaliana, an enzyme referred to as RNase THREE-LIKE 1 (RTL1) is induced in response to viral infection and cleaves dsRNAs in a non-specific manner. This enzyme should provide a second line of defense by cleaving viral dsRNAs, but VSR that inhibit PTGS generally inhibit RTL1, indicating that viruses had put in place tools that simultaneously counteract these two defense mechanisms. Nevertheless, at least one virus, Turnip yellow mosaic virus (TYMV), is not able to inhibit RTL1 and in fact seems to take advantage of RTL1 to successfully infect A. thaliana (Shamandi et al., 2015).In this thesis, we deepened the study of Arabidopsis-TYMV interaction. We show that TYMV is not able to inhibit PTGS execution but is able to inhibit PTGS amplification. This effect is due to the viral protein P69, and we show that P69 localizes in cytoplasmic foci called siRNA-bodies, where PTGS amplification takes place. Furthermore, using in house-generated rtl1 mutants, we show that the lack of RTL1 delays TYMV infection and promotes the production of siRNAs directed against the virus, whereas RTL1 overexpression enhances viral symptoms and suppresses the production of anti-viral siRNAs. We show that RTL1 is found in siRNA-bodies, and we show that RTL1 attacks not only dsRNAs but also siRNAs. These results indicate that, TYMV successfully infect A. thaliana by : i) replicating in chloroplast membrane invaginations (Prod’homme et al., 2003), which likely shelter dsRNAs intermediates of replication from PTGS and RTL1, ii) inducing RTL1 expression, which promotes the destruction of dsRNAs and siRNAs produced by PTGS in siRNA-bodies in response to TYMV infection, and iii) expressing the P69 protein to inhibit residual PTGS amplification.Despite a neutral or detrimental effect on plant anti-viral PTGS, RTL1 is conserved in all Arabidopsis accessions, and the study of synonymous and non-synonymous substitutions ratios in RTL1 genes from 42 dicotyledonous plant reveals that RTL1 is under the control of a conservative selection, suggesting an essential role. In A. thaliana, RTL1 is weakly expressed in roots, in senescent tissues and during seed development. Phenotyping wild-type plants and rtl1 mutants did not revealed any significant morphological differences, but we observed that seeds weight is enhanced in rtl1 mutants. Moreover, we observed an increased senescence in rtl1 mutants, in particular in the Ler accession. This difference between Ler and Col prompted us to determine if RTL1 could participate in the natural variability of transgene PTGS efficiency between Ler (weak PTGS) and Col (strong PTGS). We observed that rtl1 mutations have no significant effect on PTGS efficiency in Col, but enhances PTGS efficiency in Ler, up to the level of Col, which could be explained by a strongest RTL1 expression in Ler compared to Col. These results indicate that the effect of RTL1 impairment should be further examined in normal and infectious contexts by focusing on Ler rather than Col
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Casier, Karine. "Mécanismes d’activation d’un piRNA cluster par des facteurs environnementaux et génétiques chez Drosophila melanogaster". Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. http://www.theses.fr/2020SORUS282.
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Les éléments transposables (ET) sont des séquences d’ADN mobiles dont l’activité peut être délétère pour l’intégrité du génome. Dans la lignée germinale, l’activité des ET est régulée par les PIWI-Interacting RNA (piRNA), des petits ARN non-codants produits par des séquences spécifiques appelées piRNA clusters. Pour étudier la biologie de ces piRNA clusters, nous utilisons une construction transgénique capable de mimer un piRNA cluster : le cluster BX2. Le laboratoire a montré que BX2 pouvait être activé à chaque génération pour la production de piRNA grâce à l’héritage de piRNA maternels homologues, décrivant ainsi le premier cas de paramutation stable chez un animal. Ce résultat pose la question de l’initiation de l’activation d’un piRNA cluster en absence d’héritage maternel de piRNA. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de deux facteurs indépendants que nous avons identifiés comme étant capables d’activer BX2 en l’absence d’héritage de piRNA maternels : l’augmentation de la température au cours du développement (29°C au lieu de 25°C) et la perte de fonction de la déméthylase d’histone JHDM2. J’ai montré que l’augmentation de la température entrainait la conversion de BX2 dans 2% des cas et nécessite la présence d’une séquence homologue transcrite dans le génome, suggérant un mécanisme d’activation ARN-dépendant. J’ai également montré que la perte de fonction de JHDM2, en plus d’entrainer l’activation de BX2, est responsable de la conversion d’autres régions génomiques pour la production de piRNA. La transcription de ces régions dépend de la machinerie de transcription des piRNA clusters suggérant que JHDM2 est impliqué dans la détermination des piRNA clustersTransposable elements (TE) are mobile DNA sequences that can be deleterious for genome integrity. In germ cells, TE activity is regulated by PIWI-Interacting RNAs (piRNAs), small non-coding RNA which are produced from specific sequences called piRNA clusters. To study piRNA cluster biology, we use a transgenic construct that mimics a piRNA cluster: the BX2 cluster. In the lab, we have previously demonstrated that BX2 can be activated at each generation for piRNA production by maternal piRNA inheritance, describing the first stable paramutation case in animal. Hence, is it possible to activate BX2 without maternal piRNA inheritance? During my PhD, I focused on the role of two independent factors that we identified to be capable to activate BX2 without maternal piRNA inheritance: the increase of developmental temperature (29°C instead of 25°C) and the loss-of-function of the histone demethylase JHDM2. I have shown that the temperature increase induces BX2 conversion in 2% of the cases and that this conversion requires the presence of transcribed homologous sequences in the genome, suggesting an RNA-dependent mechanism. I have also discovered that JHDM2 loss-of-function, besides BX2 conversion, drives piRNA production from other genomic regions. The transcription of these regions depending on piRNA cluster transcription machinery, suggesting that JHDM2 is implicated in piRNA cluster determination
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Smith, Nikaïa. "Étude moléculaire du TNF-Related Apoptosis Induced Ligand (TRAIL) et de l’activation du Toll-Like Receptor 7 (TLR7) dans les cellules dendritiques plasmacytoïdes lors de la réponse antivirale". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2015. http://www.theses.fr/2015USPCB145/document.
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Les pDC représentent la première ligne de défense de l’organisme contre les pathogènes et établissent le lien essentiel entre l’immunité innée et adaptative. Les pDC endocytent et détruisent les particules virales et ainsi détectent leur matériel génétique grâce à des senseurs antiviraux de la famille des Toll-Like Receptors (TLR). L’activation des TLR7/9 induit la production massive d’interféron de type I (IFN-I), un antiviral puissant indispensable au contrôle de la propagation virale lors des phases aigues de l’infection. Cependant, l’IFN-I peut s’avérer avoir des effets délétères dans un grand nombre d’infections chroniques et de maladies auto-immunes. Ainsi, il semble indispensable de découvrir les mécanismes régulateurs des pDC ainsi que des modulateurs de l’activation des pDC. Nous avons ainsi montré que les monoamines (histamine, dopamine, sérotonine) et les polyamines (spermine et spermidine) inhibent l’activation complète des pDC stimulées par divers virus. Par la suite, nous avons identifié CXCR4 comme étant le récepteur des amines sur les pDC. Ainsi nous avons pu montrer que les amines pouvaient réguler les pDC en passant par CXCR4 et que ce récepteur était un interrupteur d’activation potentiel des pDC lors des infections virales. Afin de comprendre le mécanisme des amines, nous avons développé une nouvelle technologie : la transfection de siRNA dans les pDC primaires humaines. D’autre part, nous avons détecté des cellules géantes multinucléées en forme de roue de bicyclette lorsque les pDC sont cultivées in vitro avec de grandes quantités de virus VIH. Ainsi, comme les monocytes et les macrophages, les pDC peuvent former in vitro des cellules géantes multinucléées exprimant de hauts niveaux de protéines virales p24 de VIH-1. Cependant, les pDC ne sont que très peu infectées (moins de 5%). Nous nous sommes alors demandé si le corécepteur CXCR4 du virus VIH était aussi important que le récepteur CD4 pour la reconnaissance de ce dernier lors de l’activation des pDCPDC are the first line of defense of our organism against pathogens and establish the essential link between the innate and adaptive immunity. pDC endocyte and destroy the viral particles and thus, detect the genetic material with their antiviral sensors from the Toll-Like Family (TLR). The activation of TLR7/9 induces massive production of type I interferon (IFN-I), a powerful antiviral molecule, essential to control viral propagation during the acute phases of the infection. However, type I IFN can have deleterious effects in a large number of chronic infections and autoimmune diseases. Thus, it seems essential to discover the regulatory mechanism of pDC as well as pDC activation modulators. We showed that monoamines (histamine, dopamine and serotonin) and polyamines (spermine and spermidine) inhibit completely the activation of virus-stimulated pDC. Thus, we showed that amines regulated pDC activation through CXCR4 engagement and that this receptor was a potential switch "on-off" for pDC during viral infections. To better understand the mechanism of action by which amines inhibit pDC activation, we developed a new technology: siRNA transfection in human primary pDC. Furthermore, we detected multinuclear giant cells bearing the shape of a bicycle wheel when pDC are cultured in vitro with high quantities of HIV virus. Thus, on top of monocytes and macrophages, pDC can form in vitro multinuclear giant cells with high levels of p24 viral protein of HIV-1. However, pDC barely get infected (less than 5%). We then wondered if the receptors and co-receptors of the virus were important for the viral recognition during HIV-activation of pDC
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Delas, Tim. "Formulation et stabilisation de complexes colloïdaux de polyélectrolytes à base de chitosane et de siRNA". Thesis, Bordeaux, 2021. http://www.theses.fr/2021BORD0071.
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La présence de fortes interactions électrostatiques entre les acides nucléiques tel que l’ADN, l’ARN et des polycations permet l’élaboration de particules colloïdales appelées complexes de polyélectrolytes (PECs). Cette approche permettant la formation de vecteurs non-viraux pour la délivrance de matériel génétique a fait l’objet de nombreuses études basées sur l’utilisation de chitosane comme polycation. Dans le cadre de cette thèse, ce dernier a été étudié pour ses propriétés de complexation avec des petits ARN interférents (small interfering RNA, siRNA). Dans un premier temps, des oligosaccharides de chitosane (COS) ont fait l’objet d’une étude quant à leurs propriétés en solution et de complexation avec des siRNA. L’effet de longueur de chaîne sur la solubilité du chitosane et leur comportement complexant a pu être étudié. Par la suite, la stabilité colloïdale en conditions physiologiques des PECs formés à partir de chitosane et de siRNA a été abordée. La déprotonation du chitosane étant un élément rédhibitoire quant à la stabilité des complexes, l’introduction d’ions zinc lors de la formulation des complexes a permis une amélioration de la stabilité à pH physiologique. De plus, l’augmentation du degré d’acétylation du chitosane a également permis une nette amélioration de la stabilité des complexes à des concentrations physiologiques en sel. Avec l’introduction de zinc, une étude portant sur les interactions entre des ions métalliques et le siRNA a également été menée. Finalement, une nouvelle synthèse menant à la formation d’un nouveau copolymère à base de chitosane a été réalisée, permettant d’obtenir des structures encore inexplorées à base de chitosane telles que des micelles ou des structures de type conjuguésThe presence of strong electrostatic interactions between nucleic acids such as DNA, RNA and polycations leads to the formation of colloidal particles called polyelectrolyte complexes (PECs). This approach, which allows the formation of non-viral vectors for genetic material delivery, has been the subject of numerous studies based on the use of chitosan as polycation. In the framework of this thesis, the latter was studied for its complexing properties towards small interfering RNA (siRNA). First, chitosan oligosaccharides (COS) were studied for their solution properties and complexation properties with siRNA. The effect of chain length on the solubility of chitosan and their complexing behaviour was demonstrated. Subsequently, the colloidal stability of PECs formed between chitosan and siRNA under physiological conditions was addressed. As the deprotonation of chitosan is redhibitory for the stability of the complexes, it was shown that the introduction of zinc ions in the formulation of complexes allowed to improve their stability at physiological pH. Moreover, the increase in the degree of acetylation of chitosan also allowed a clear improvement in the stability of the complexes at physiological salt conditions. With the introduction of zinc, a study of the interactions between metal ions and siRNA was also carried out and was able to highlight the strong interactions involved between metal ions and siRNA. Finally, a new synthesis leading to the formation of a new chitosan-based copolymer was carried out, making it possible to obtain as yet unexplored chitosan-based structures such as micelles or conjugate-type structures
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Sanceau, Josiane. "Etude de l’expression du gène de l'interféron γ humain dans les lymphocytes activés et dans les cellules murines transformées". Paris 7, 1985. http://www.theses.fr/1985PA077146.
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Nous savons que les lymphocytes stimulés par différents mi¬togènes subissent une série de modifications biochimiques qui participent à l'induction de protéines possédant des activités immunorégulatrices non spécifiques de l'antigène : facteurs sup¬presseurs et amplificateurs de la réponse anticorps, activités "killer" et diverses autres lymphokines dont l'IFN- 1 Dans un lymphocyte au repos, les ARN messagers sont présents mais peu exprimés. Au cours de la stimulation, principalement pendant les premières 24 heures, les lymphocytes subissent des modifica¬tions dans la population de messagers qui soit modulent le niveau d'expression des messagers déjà présents dans la cellule au re¬pos, soit conduisent à la synthèse de nouveaux messagers parmi lesquels certains messagers codant pour les nouvelles fonctions des lymphocytes. L'analyse des modifications des messagers au cours de l'ac¬tivation des lymphocytes nous a permis de procéder à la caracté¬risation de certains messagers de lymphokines et s'est avéré un très bon modèle pour étudier l'un des aspects de la différencia¬tion cellulaire : le passage du lymphocyte au repos au lymphocyte stimulé. De nombreuses questions se posent au niveau de l'évolution des messagers et particulièrement ceux des lymphokines au cours de la stimulation, entre autres :les messagers sont-ils présents dans les cellules au repos ?, l'activation des lymphocytes stimule-t'elle la transcrip¬tion des messagers lymphokines comme la transcription des autres messagers ?, Ont-ils les mêmes cinétiques d'accumulation au cours du temps ?. . .
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Martinez, Palacios Paulina. "Réponse des agents non codants du génome – éléments transposables et petits ARN – à un événement d'allopolyploïdie : le génome du colza (Brassica napus) comme modèle d'étude". Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112055/document.
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Le succès évolutif de la polyploïdie, notamment de l’allopolyploïdie (où la duplication de génome complet est associée à une hybridation entre génomes différenciés) est en partie lié au fait que cet événement s’accompagne de nombreux changements dans l'organisation du génome et la régulation de l'expression des gènes. On parle du « choc génomique » de l’hybridation interspécifique et de l’allopolyploïdie. Ces sources de diversité génétique, à la fois structurale et fonctionnelle, apparaissent utiles et nécessaires à l'adaptation et l’évolution des espèces. Alors que de nombreuses études portant sur la compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine du succès des allopolyploïdes ont concerné les modifications de l’expression des gènes, mes travaux de thèse ont porté sur les agents non codants du génome que sont les éléments transposables et les petits ARN non codants. Le modèle d'étude est le colza (Brassica napus, AACC), espèce allotétraploïde issue de l'hybridation entre les espèces diploïdes navette (B. rapa, AA) et chou (B. oleracea, CC). Nous disposions de colzas néo-synthétisés, étudiés à différentes générations d’autofécondation, permettant de caractériser les changements génomiques accompagnant la formation puis l’évolution du génome néo-allopolyploïde. Une étude a tout d’abord été menée sur un élément transposable (ET) spécifique du génome C, Bot1, en vue d’identifier de nouvelles transpositions survenant chez les colzas néo-synthétisés par rapport aux parents diploïdes, par une approche SSAP. Quelques rares événements de transposition ont été identifiés. Ces résultats, confrontés à ceux obtenus sur deux autres ET, ont permis de mettre en évidence un impact modéré de l’allopolyploïdie sur la transposition de ces différents ET. Par contre, il est apparu que des changements de méthylation auraient accompagné cette allopolyploïdisation, sans doute à l’origine de la réactivation et la transposition de quelques copies de Bot1. Les petits ARN non codants ont été suggérés comme impliqués dans les différents événements génomiques accompagnant la formation d’un génome allopolyploïde. Pour étudier la dynamique d’expression des petits ARN chez des colzas néo-synthétisés pris à deux générations d’autofécondation (S1, S5) en comparaison de leurs parents diploïdes, j’ai exploité des données de séquençage haut débit obtenues pour 11 banques construites à partir des tiges de ces différents génotypes. J’ai ainsi démontré, qu’à une échelle globale, les petits ARN présentaient une réponse immédiate mais transitoire à l’événement d’allopolyploïdie. Les fractions particulièrement affectées par l’allopolyploïdie se sont révélées correspondre (1) à des petits ARN interférents dérivés d’éléments transposables avec une baisse de leur abondance en génération précoce S1, et (2) à des populations de petits ARN de 21 nucléotides exprimées uniquement de manière très précoce, de l’hybride F1 à la génération S1. Nous avons notamment identifié des transcrits de type viral correspondant à ces petits ARN de 21-nt, et présentant les mêmes profils d’expression (de l’hybride F1 à la génération S1), suggérant une réactivation d’éléments viraux endogènes (EVE) en réponse à l’hybridation et l’allopolyploïdie. L’ensemble de mon étude a démontré la mise en place d’une succession des voies de régulation par petits ARN où ET et EVE, réactivés au niveau transcriptionnel, sont immédiatement soumis à une répression post-transcriptionnelle (PTGS), renforcée ensuite par une répression de leur transcription (TGS). L’hypothèse d’une absence de cette régulation par petits ARN lors des phénomènes de nécrose et létalité hybride, amène à envisager ces populations de petits ARN comme les clés de la réussite de la formation d’un génome hybride, où la répression immédiate et efficace des ET et autres endovirus, réactivés suite au choc génomique, se révèle être une nécessitéThe evolutionary success of polyploid species is partly due to the dynamic changes in genome organization and gene expression patterns that occur at the onset of the polyploid formation. These changes are promoted by the merging of divergent genomes into a single nucleus (i.e. allopolyploidy) that causes a “genomic shock”; they are thought to provide a rich source of new genetic material upon which selection can act to promote adaptation and evolution. Many studies have thus aimed to uncover molecular mechanisms that are responsible for the evolutionary success of allopolyploid species, most of them focusing on gene expression changes. In the present PhD thesis, my interest has been concentrated on the non-coding components of the genome: transposable elements and small non-coding RNAs. My study involves oilseed rape (Brassica napus, AACC), a relatively young allopolyploid species that originated from hybridizations between B. rapa (AA) and B. oleracea (CC). Specifically, I have used resynthesized B. napus polyploids advanced by self-pollination of single plants for several generations; I have analyzed these plants at different generations for genomic changes accompanying polyploid formation and subsequent evolution. In a first part, sequence-specific amplification polymorphism (SSAP) targeting the C genome-specific transposable element Bot1, was used to evaluate transposition rate of Bot1 in resynthesized B. napus in comparison with the diploid parents. Only a few transposition events were identified. When combined with the results obtained for two other TEs, this work suggests that allopolyploidy has only a moderate impact on TE transposition and restructuring. The changes observed in SSAP profiles led us to hypothesize that some of them resulted from changes in DNA methylation, resulting in rare but highly specific TE activation and transposition. In a second part, I have concentrated on small non-coding RNAs (sRNAs), which are thought to mediate different aspects of the response to the “genomic shock” induced by allopolyploid formation. Comprehensive analyses of sRNA expression in resynthesized B. napus allopolyploids have been carried out by deep sequencing sRNAs from 11 libraries prepared from stems of three allotetraploids (surveyed at the two generations S1 and S5) and the two diploid parents. Characterization of sRNA distributions in these plants indicates that sRNAs show an immediate but transient response to allopolyploidy. The sRNAs derived from transposable elements (down-regulated in the S1) or targeting unknown sequences (no Blast hit against any available public database) were particularly affected. The use of B. napus mRNAseq data revealed that these latest unknown candidates, which are 21-nt long and over-expressed in the earliest generations (F1, S0, S1) were derived from endogenous viral elements (EVE). We confirmed that these EVEs showed the same expression patterns as the 21-nt long sRNAs that specifically target them (over-expression in the F1, S0 and S1). These results suggest that (at least) some EVEs might be reactivated as a response to the merging of divergent genomes (in interspecific hybrids and newly formed allopolyploids). Altogether, our results have demonstrated a succession of sRNA pathways that counteract the reactivation of some specific TEs and/or EVEs at the onset of polyploid formation; reactivated TEs and/or EVEs being immediately repressed at the post-transcriptional level (PTGS), and then fully repressed by transcriptional gene silencing (TGS) in the subsequent generations. Such data lead to hypothesize that sRNAs are essential to overcome interspecific hybrid incompatibilities due to the uncontrolled and deleterious reactivation of TEs / EVEs. Therefore, sRNAs should be considered as the guardians of genome integrity even in newly-formed allopolyploids
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Louis, Thierry. "Rôle des récepteurs nicotiniques dans l'apprentissage et la mémoire olfactive chez l'abeille domestique, apis mellifera : étude des sous-unités amelaα7 et amelα8 par interférence d'ARN". Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/1768/.
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L'acétylcholine est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central (SNC) des insectes, particulièrement abondant au sein des structures impliquées dans l'olfaction et la mémoire. Le rôle des récepteurs nicotiniques dans l'apprentissage olfactif chez l'abeille a fait l'objet de nombreux travaux basés sur le conditionnement du réflexe d'extension du proboscis (REP). L'injection intracérébral d'antagonistes nicotiniques couplée au conditionnement a montré que 2 types de récepteurs nicotiniques coexistent au sein du cerveau et qu'ils sous-tendent deux fonctions différentes : les récepteurs sensibles à la mécamylamine sont nécessaires pour le rappel d'une information alors que les récepteurs sensibles à l'a-bungarotoxine (a-bgt) sont requis pour la formation de la mémoire à long terme. Dans le génome de l'abeille, on trouve 11 gènes codant pour des sous-unités nicotiniques, 9 de type alpha et 2 de type beta. Nous avons donc étudié le rôle des récepteurs contenant la sous-unité Amela7 ou Amela8 dans le conditionnement olfactif du REP en réprimant l'expression de ces sous-unités par l'interférence d'ARN. Nous avons tout d'abord démontré l'efficacité de l'injection intracérébrale de siRNA pour réduire l'expression des sous-unités ciblées. Les résultats montrent que la sous-unité Amela8, présente au sein de récepteurs nicotiniques localisés dans les lobes verticaux, est impliquée dans les processus de rappel. Les récepteurs comportant Amela7 participent au processus d'acquisition d'un conditionnement discriminatif et à la formation d'une mémoire à long terme spécifique induite par un conditionnement absolu. Le rôle possible de cette sous-unité dans la perception olfactive est discuté. La comparaison de ce travail avec les études pharmacologiques suggère que les récepteurs sensibles à la mécamylamine comportent la sous-unité Amela8. L'hypothèse que les récepteurs sensibles à l'a-bgt contiennent la sous-unité Amela7 ne peut être retenueAcetylcholine is the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of insects and particularly in structures involved in olfaction and memory processes. The role of the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in learning and memory in the honeybee has been studied using the olfactory conditioning of the proboscis extension reflex (PER), coupled to nicotinic antagonists injected into the brain. The results showed that two different types of nAChRs supporting different functions exist in the brain: the mecamylamine-sensitive nAChRs are necessary to retrieval processes and the a-bungarotoxin-sensitive nAChRS are needed to long-term memory formation. The sequencing of the honeybee génome pointed out 11 genes coding for nicotinic subunits (9 a and 2 ß) that could potentially form a great number of different nAChR types. The aim of this PhD work is to better characterize the two types of nAChRs by studying the role of Amela7 and Amela8 subunits in learning and memory processes using RNA interference. We first show the efficiency of siRNA to decrease the expression of the targeted subunits. The effect of protein deletion on olfactory conditioning indicates the involvement of nAChRs containing Amela8, and specially those in the vertical lobes, in retrieval processes. Amela7 subunit-knockdown blocks acquisition during discriminative PER conditioning and impairs the formation of a specific memory after absolute PER conditioning. The role of Amela7 in olfactory perception is discussed. Together with pharmacological data, our results indicate that Amela8 could form mecamylamine-sensitive nAChRs. The hypothesis that a-bgt-sensitive nAChRs could be form by Amelα7 cannot be retained
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Evenou, Pierre. "Assemblages supramoléculaires hiérarchiques de cyclodextrines fonctionnalisées et de siRNA, application à la thérapie antisens". Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066440/document.
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L’utilisation de siRNA est une nouvelle approche thérapeutique très prometteuse. Néanmoins leur transfection à visée thérapeutique est un réel défi. Les obstacles à franchir pour élaborer des agents de transfection sûrs et fiables sont nombreux. Afin de les contourner nous nous sommes attachés à la construction d’un système dynamique qui, à l’image des virus, est constitué de briques moléculaires, s’emboitant et interagissant avec des acides nucléiques selon des interactions supramoléculaires. Ainsi, nous avons élaboré des polymères supramoléculaires polycationiques à base de monomères de cyclodextrines pontées, fonctionnalisées par un groupement adamantyle. Ce type de conjugué pallie un problème manifeste dans la littérature concernant les assemblages de β-CD souvent insolubles ou bien auto-inclus. L’ajout éventuel d’une autre fonction cationique pour améliorer l’interaction avec les siRNA a aussi été réalisé. Ainsi, la capacité à s’auto-assembler de quatre composés a été étudiée par RMN-1H, RMN-ROESY, ITC, RMN-DOSY, et SANS. Par ailleurs, ces composés ont montré une certaine capacité à complexer et à protéger les siRNA. L’un de ces composés a de plus montré une bonne aptitude à transfecter des siRNA in vitro, sans induire de toxicité. Les assemblages CD-siRNA ont finalement été observés par cryo-TEM et ont montré la formation de fibres, organisées de manière hiérarchique et hautement coopérative. Nous avons ainsi créé des assemblages supramoléculaires uniques à base d’acides nucléiques, rappelant la structure, la taille et la fonction d’un virusSiRNA based therapeutics are very promising. A key challenge for their development is the design of sophisticated, safe and effective delivery methods. To address all the biological obstacles for the conception of such therapeutics, we focused on the construction of a virus-like dynamic system, built with molecular bricks, able to self assemble and to interact with nucleic acid through supramolecular interactions. Bridged cyclodextrin based supramolecular polymers were developed to form host-guest interactions. To do so, cyclodextrins were conjugated with cationic and hydrophobic moiety in a spatially controlled way. These conjugates solved problems well known in the literature about the self-inclusion and the solubility in water of such molecules. The ability to self-assemble of 4 compounds were studied by RMN-1H, RMN-ROESY, ITC, RMN-DOSY and SANS. All these compounds showed a good capability to complex and protect siRNA. Moreover, one of these compounds is able to transfect siRNA in vitro without any toxicity, and therefore, to induce gene silencing. Assembly of CD and siRNA were finally observed by cryo-microscopy, which showed long fibres organised in a hierarchical and cooperative manner. This unique system is therefore strongly reminiscent of the structure, size and function of a virus
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Vigneau, Soline. "Contribution au clonage positionnel du locus Tmevp3 : un locus de prédisposition à la persistance du virus de Theiler chez la souris". Paris 7, 2002. http://www.theses.fr/2002PA077194.
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Machado, Anthony Kévin. "Étude de l’implication des importines-ß dans l’infection et l’import nucléaire du VIH-1". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC182.
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Le VIH-1 fait partie d’une famille de virus, les Lentivirus, capables d’infecter des cellules quiescentes ou en fin de différenciation, telles les macrophages, les cellules dendritiques ou les lymphocytes T CD4+. Les Lentivirus ont développé des mécanismes de transport actif de leur génome à travers le pore nucléaire afin d’accéder au noyau indépendamment du cycle cellulaire. La translocation nucléocytoplasmique des macromolécules se fait physiologiquement par l’intermédiaire de karyophérines, notamment les importines-ß, qui reconnaissent un signal de localisation nucléaire et permettent ainsi le passage vers le noyau des macromolécules. De nombreux déterminants viraux ont été proposés comme la capside, l’intégrase ou encore la nucléocapside sans toutefois être démontrés catégoriquement. De l’autre côté, quelques importines ß ont été étudiées comme KPNB1, IPO7 et TNPO3 mais bien que celles-ci semblent avoir un rôle important ou favorisant le cycle viral, leur participation à l’import nucléaire stricto sensu n’a pas été prouvée. Nous avons donc décidé d’étudier l’implication des cinq importines ß cellulaires principales dans l’import nucléaire et l’infection du VIH-1, afin d’identifier si une de ces importines ß est responsable de l’entrée de l’ADN du VIH-1 dans le noyau de la cellule en cours d’infection. Notre étude a permis d’identifier pour la première fois le rôle de TNPO1 dans l’infection par le VIH-1 et plus précisément dans l’import nucléaire du VIH-1, en cellule HeLa. Nos expériences montrent un rôle de KPNB1 dans les étapes nucléaires de l’infection par le VIH-1 après le transfert de brin qui a lieu lors de l’intégration. Nos résultats suggèrent d’autre part qu’IPO5 interagit avec le VIH-1 et aurait un rôle restrictif sur son cycle réplicatif, possiblement en défavorisant son intégration au niveau de sites activement transcrits de la chromatine. Lors de nos expériences, nous n’avons jamais observé de modification des étapes précoces de l’infection virale lorsque l’expression d’IPO7 est réduite, suggérant que cette importine n’est pas utilisée par le VIH-1 afin d’infecter la cellule cible. Enfin, nos résultats ont confirmé la réduction des cercles à 2-LTR lorsque l’expression de TNPO3 est réduite, suggérant son implication dans l’import nucléaire du VIH-1As all lentiviruses, HIV-1 has the capacity to infect quiescent or non-dividing cells such as macrophages, dendritic cells and CD4+ T cells. Lentiviruses evolved cell cycle independent mechanisms to import actively their genomes into the nuclear compartment to reach the cellular chromatin. Physiologically, translocation of macromolecules from the cytoplasm to the nucleus is mediated by specialized karyopherins called ß-importins which recognize nuclear localization signals born by the macromolecule to import. Many viral determinants have been involved like capsid, integrase or nucleocapsid but their role in HIV-1 nuclear import is still under investigation. Besides, few ß-importins have been studied in HIV-1 infection such as KPNB1, IPO7 and TNPO3. Although the literature suggest they have a role in HIV-1 infection, their involvement in HIV-1 translocation through the nuclear pore remains unclear. We decided to investigate the role of the main five ß-importins in HIV-1 infection, nuclear import and integration in order to identify whether or not one of them if responsible for HIV-1 PIC nuclear import. Our experiments show for the first time the involvement of TNPO1 in HIV-1 infection and more precisely during the nuclear import process in HeLa cells. We also demonstrate the role of KPNB1 in post-strand transfer steps of infection. Interestingly, our data suggest that IPO5 interacts with HIV-1 and would restrict HIV-1 infection possibly by unfavoring integration into actively transcribed sites of cellular chromatin. Our experiment were unable to show IPO7 involvement in HIV-1 infection using shRNA targeting this importin, suggesting that this protein has no role in early steps of HIV-1 infection. Finally, we confirm 2-LTR circles reduction, already observed in the literature, when TNPO3 expression is reduced and suggesting its role in HIV-1 nuclear import
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Butel, Nicolas. "Caractérisation d'un complexe chromatinien impliqué dans l'inactivation post-transcriptionnelle des ARNs". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS302/document.
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Le PTGS (post-transcriptional gene silencing) est un mécanisme de défense qui cible les acides nucléiques invasifs d’origines endogènes (transposons) ou exogènes (pathogènes, transgènes). Des mutations dans les gènes JMJ14 et NAC52 ont été isolées lors d’un crible génétique visant à identifier des mutants déficients en PTGS. JMJ14 code une histone déméthylase ciblant la lysine 4 bi- ou tri-méthylée de l’histone H3, tandis que NAC52 code un facteur de transcription. Ces deux protéines forment un complexe qui régule la transcription de centaines de gènes endogènes. Toutefois, le rôle de ce complexe chromatinien dans l’expression des transgènes et surtout dans le PTGS reste incompris. JMJ14 interagit avec NAC52 mais aussi avec une protéine de type guanine exchange factor de la famille RCC1. Des mutations dans l’un ou l’autre des membres du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 réduisent la transcription des transgènes. JMJ14 se fixe au promoteur de façon indépendante de NAC52, tandis que NAC52 a besoin de JMJ14 pour se fixer à la région transcrite. Toutefois, JMJ14 et NAC52 ne semblent pas requis pour la transcription proprement dite. En effet, un niveau normal de transcription est restauré chez le double mutant jmj14 drm2, indiquant que le rôle du complexe RCC1-JMJ14-NAC52 semble être d’empêcher la méthylation de novo du promoteur par DRM2.L’effet des mutations jmj14 et nac52 sur la transcription des transgènes ne peut expliquer leur effet sur certaines formes de PTGS. En effet, les mutations jmj14 et nac52 n’affectent pas le PTGS induit constitutivement. Par contre, elles empêchent la systémie du PTGS induit localement. Des mutations dans le gène SPCL45 codant une Serine Carboxy Peptidase-Like qui interagit avec NAC52, mais pas JMJ14, ont le même effet. En revanche, la mutation rcc1 n’affecte pas la systémie du PTGS, suggérant que c’est au sein d’un complexe JMJ14-NAC2-SPCL45 que JMJ14 et NAC52 contrôlent le PTGS systémique. Ce complexe pourrait agir directement sur la chromatine du transgène pour permettre d’enclencher le PTGS en réponse à la perception du signal systémique, ou indirectement en contrôlant l’expression d’un gène endogène codant une protéine régulant la systémie du PTGS. Afin de mieux comprendre le rôle de JMJ14 dans la systémie du PTGS, un crible génétique visant à isoler des suppresseurs de la mutation jmj14 a été réalisé. Seize mutants correspondants à sept gènes codant des protéines ayant un rapport avec la chromatine et une action antagoniste à JMJ14 ont été caractérisés. Les mutations dans ces sept gènes pourraient supprimer l’effet de jmj14 en augmentant la transcription du transgène cible et donc la quantité du signal systémique de PTGS. Un 17ème mutant pourrait quant à lui affecter qualitativement le signal systémique de PTGS ou la perception du signal dans les cellules qui le reçoivent. Le gène correspondant reste à identifierPost-transcriptional gene silencing (PTGS) is a defense mechanism that targets invading nucleic acids from endogenous (transposons) or exogenous (pathogens, transgenes) origins. Mutations in JMJ14 and NAC52 have been retrieved from a genetic screen aiming to identify PTGS deficient mutants. JMJ14 encodes an histone demethylase targeting the bi- or tri-methylated lysine 4 of histone H3, while NAC52 encodes a transcription factor. Both act in a complex that regulates the transcription of hundreds endogenous genes. However, the function of this chromatin complex in transgene expression and in PTGS is not known. JMJ14 interacts with NAC52 but also with a guanine exchange factor of the RCC1 family. Mutations in any member of the RCC1-JMJ14-NAC52 complex reduce transgene transcription. JMJ14 binds to the transgene promoter independently of NAC52, whereas NAC52 requires JMJ14 to bind on the transcribed region. However, JMJ14 and NAC52 do not seem to be required for transcription itself. Indeed, a wild-type level of transcription is restored in the jmj14 drm2 double mutant, suggesting that the complex RCC1-JMJ14-NAC52 prevents de novo DNA methylation of the promoter by DRM2. The effects of jmj14 and nac52 mutations on transgene transcription cannot explain their specific effect on some forms of PTGS. Indeed, jmj14 and nac52 do not affect constitutively-induced PTGS, but prevent the systemic spreading of locally-induced PTGS. Mutations in SCPL45, encoding a Serine-Carboxy Peptidase-Like that interacts with NAC52, but not JMJ14, have the same effect. In contrast, rcc1 does not affect the systemic PTGS, suggesting that a JMJ14-NAC52-SCPL45 complex is involved in the control of systemic PTGS. This complex could act directly on transgene chromatin to trigger PTGS in response to the PTGS signal, or indirectly by controlling the expression of an endogenous gene encoding a protein regulating systemic PTGS. To better understand the function of JMJ14 in systemic PTGS, a genetic screen aiming to identify suppressors of jmj14 have been performed. Sixteen mutants corresponding to seven genes encoding proteins related to chromatin and having an antagonist function to JMJ14, have been characterized. Mutations in theses seven genes could suppress jmj14 by increasing transgene transcription and consequently the quantity of the PTGS systemic signal. A seventeenth mutant could have a qualitative effect on the PTGS systemic signal or could affect the perception of this signal in recipient cells. The corresponding gene remains to identify