Tesis sobre el tema "Anomalies génétiques en mosaïque"

L’avènement des nouvelles techniques de séquençage a permis d’augmenter de façon considérable le taux diagnostique des troubles du développement intellectuel (TDI) et plus de 2000 gènes impliqués sont aujourd’hui connus. Malgré ces progrès considérables, l’interprétation des variants identifiés par les techniques de séquençage reste parfois difficile et l’histoire naturelle des TDI nouvellement décrits est souvent méconnue. Notre travail a consisté à étudier quatre formes de TDI rares de modes de transmissionvariés sur les plans clinique et génétique afin de mieux comprendre ces affections et les mécanismes qui les sous-tendent. Nous avons d’une part précisé les tableaux cliniques associés aux variations de BRAT1, CNOT3 et MTOR et avons recherché l’existence d’éventuelles corrélations phénotype-génotype pour les variations de ces gènes. D’autre part, nous avons participé à la mise en place d’un test fonctionnel permettant de reclasser les variants de signification incertaine de PQBP1
The advent of new sequencing techniques has dramatically increased the diagnostic rate of intellectual disability (ID), and more than 2,000 genes are currently known to be involved. Despite these considerable progresses, interpreting the variants identified by sequencing methods remains challenging, and the natural history of newly described ID is often poorly understood. To better understand these disorders and their underlying mechanisms, we have studied four rare forms of ID with various inheritance patterns from both clinical and genetic perspectives. On one hand, we defined the clinical pictures associated with variations in BRAT1, CNOT3 and MTOR, and we investigated the existence of any phenotype-genotype correlations. On the other hand, we contributed to the design of a functional test to reclassify PQBP1 variants of uncertain significance

Introduction : Les dyschromies cutanées en mosaïque ont fait suspecter de longue date l’implication d’un mosaïcisme génétique sous-jacent. Ces évènements post-zygotiques sont cependant difficilement détectables par les techniques conventionnelles. Ainsi, les bases génétiques des dyschromies en mosaïque étaient restées mal connues. Matériel et méthodes : la cohorte M.U.S.T.A.R.D rassemble des échantillons d’ADN de biopsies cutanées de patients porteurs d’un mosaïcisme pigmentaire. Après une analyse phénotypique spécialisée, ces échantillons sont étudiés en séquençage à forte profondeur, d’exome (ES) en trio, ou ciblé. Les données sont analysées à l’aide d’un pipeline dédié, permettant la détection de variations ponctuelles en mosaïque (mSNV) mais également de diverses anomalies chromosomiques en mosaïque. Résultats : De 2013 à 2019, 101 patients ont été inclus. Un ES a été réalisé pour 56 patients, identifiant un mSNV chez 12 patients, dans 7 gènes dont 4 nouveaux (RHOA, DOCK1, GNA13, TFE3), et une anomalie chromosomique chez 17 patients. Une étude ciblée de ces gènes chez 40 autres patients était positive pour 17, soit un rendement diagnostique global à 55% (46/84). Conclusion : Ce travail illustre l’importance d’une approche bioinformatique polyvalente, combinée à une expertise clinique, pour la détermination des causes génétiques des dyschromies cutanées en mosaïque. Il a également mis en évidence le rôle de la voie de signalisation dépendant des Rho GTPases, faisant progresser notre compréhension de la physiopathologie des dyschromies en mosaïque, une étape nécessaire à l’amélioration de la prise en charge de ces patients porteurs de maladies rares et complexes
Introduction: Mosaic cutaneous dyschromia is strongly evocative of an underlying genetic mosaicism. These post-zygotic events are challenging for conventional diagnostic tools. Thus, genetic basis of mosaic cutaneous dyschromia still remained poorly understood. Materials and Methods: The M.U.S.T.A.R.D. cohort gathers DNA from skin biopsies of patients with mosaic cutaneous dyschromia. After a specialised phenotype analysis, they are referred to either trio exome sequencing (ES) at 200X, or targeted ultra-deep sequencing (60,000X) of candidate genes. Data are analysed with a tailored pipeline, allowing detection of both low-rate nucleotidic variations or chromosomal events. Results: From 2013 to 2019, 101 patients were included. ES was performed for 56, with identification of mosaic SNV in 12 patients in 7 new genes, including 4 new genes (RHOA, DOCK1, GNA13, TFE3), and mosaic chromosomal anomalies in 17 patients. A targeted sequencing of these genes was performed for 40 more patients, with a confirmed mosaic SNV in 17, and a global diagnostic yield of 55% (46/84). Conclusion: This work highlights the importance of a versatile bioinformatic approach combined to a clinical expertise, to decipher the chromosomal and molecular aetiologies of developmental anomalies with mosaic cutaneous dyschromia. It also pinpoints the role of the Rho GTPase pathway, which will help enhancing our understanding of mosaic cutaneous dyschromia, and may ultimately result in better patients’ care

The current study deals with four different approaches to analyse a hereditary disease affecting bovine breeds: 1. Comparative pathology combined with comparative mapping is used when pedigrees are not sufficiently informative, 2. The production of a genome scan with genetic markers in informative pedigrees, which permits to define a reliable localization interval,3. Fine mapping to investigate candidate genes,functional genomics to obtain the expression profile of a given genomic region. These methods were used for four bovine hereditary diseases: progressive ataxia and arthrogryposis-palatoschisis for Charolais cattle, generalized caprine-like hypoplasia syndrome (SHGC) in the Montbeliarde breed, and syndactyly for Holstein cattle. They offer new perspectives for breeders (with the design of genetic tests), and raise new questions concerning the limb development in mammals. Finally, our work will renew approaches for the study of genetic traits in domestic species, especially in cattle
La présente étude traite de quatre approches moléculaires pour l'étude des anomalies génétiques présentes en race bovine: la pathologie comparée combinée à la cartographie comparée, lorsque les pedigrees à disposition ne sont pas assez informatifs, le balayage du génome à l'aide de marqueurs génétiques afin d'obtenir une primolocalisation de l'anomalie, la cartographie fine d'un intervalle déjà identifié, 4. La génomique fonctionnelle, afin de réaliser le profil d'expression d'une région génomique donnée. L'utilisation de ces méthodes sur quatre anomalies génétiques bovines (l'ataxie progressive et le Syndrome Arthrogrypose-Palais fendu en race Charolaise, le Syndrome d'Hypoplasie Généralisée Capréoliforme en race Montbéliarde et la syndactylie en race Holstein) ouvre de nouvelles perspectives, tant pour la filière bovine, avec la mise au point de tests de dépistage que pour l'étude du développement des membres des mammifères. Enfin, les nouvelles approches de génomique fonctionnelle permettent d'envisager à "avenir un renouveau dans l'étude des caractères génétiques des animaux domestiques, et en particulier des bovins

L’infertilité masculine parait augmenter depuis plusieurs décennies. Ses étiologies sont multiples, mais les causes génétiques et épigénétiques paraissent importantes. Nous avons dans cette thèse étudié différentes causes génétiques et épigénétiques d’infertilité en mettant en évidence les anomalies portées par les spermatozoïdes et parfois transmissibles au conceptus. Ce travail comporte trois parties, à savoir, tout d'abord, les infertilités associées à des anomalies du caryotype constitutionel en étudiant les conséquences pour le risque chromosomique porté par les spermatozoïdes avec le risque évalué sur tous les spermatozoïdes puis, les infertilités, à caryotype constitutionel normal, dont l’origine génique a parfois été démontrée et où la morphologie spermatique est altérée avec les spermatozoïdes macrocéphales, les spermatozoïdes globozoocéphales et les spermatozoïdes à larges ou petites vacuoles et enfin, les anomalies de la méthylation de l’ADN dans les différentes étiologies d’azoospermie. Ces approches ont un triple intérêt car elles permettent d'évaluer les risques pour le conceptus, de guider la prise en charge des patients et le choix des spermatozoïdes à injecter dans l’ovocyte. A plus long terme grâce à une compréhension des mécanismes en jeu, prévenir des infertilités et proposer de véritables solutions thérapeutiques
The male infertility seems to increase for several decades. Infertility etiologies are multiple, but the genetic and epigenetic causes are important. Here, we tried to study, the abnormalities carried by spermatozoa and sometimes transmissible in the conceptus. This work contains three parts, in a first time, the infertility linked with abnomalities of constitutionel karyotype by studying the consequences for the chromosomal risk with the risk estimated on all spermatozoa, in a second time, the infertility, with normal constitutionel karyotype, where the genetic origin was sometimes demonstrated and sperm morphology altered with macrocephalic sperm, Globozoospermia and spermatozoa with large or small vacuoles and in fine, DNA methylation abnormalities in various azoospermic aetiologies. These approaches have a triple interest because, it estimate the risks for conceptus and advice patients care, guide the choice of spermatozoa to be injected in the oocyte

Il y a presque 20 ans, la mise en évidence de mutations bi-alléliques inactivatrices du gène SMARCB1 dans les tumeurs rhabdoïdes établissait la première démonstration d’altérations du complexe SWI/SNF de remodelage de la chromatine en oncologie. Depuis, l’avènement des techniques d’analyse moléculaire à haut débit appliquées à la cancérologie a permis de montrer que des altérations dans d’autres gènes du complexe SWI/SNF était présentes dans un très grand nombre de cancers. A travers la présentation de plusieurs types de tumeurs SWI/SNF déficientes et de nos modèles d’étude des tumeurs rhabdoïdes, nous montrons que la perte de SMARCB1 est associée à une augmentation de la biosynthèse de la sérine et des voies métaboliques en aval importantes pour l’oncogenèse. Ces résultats pourraient aboutir à une option thérapeutique pour les tumeurs rhabdoïdes voire, plus généralement, pour d’autres modèles de tumeurs SWI/SNF-déficientes. Enfin, la mise en perspective de ces changements métaboliques avec les altérations épigénétiques observées dans les tumeurs SWI/SNF déficientes pourrait se révéler pertinente pour continuer d’approfondir nos connaissances sur ces tumeurs
Nearly 20 years ago, the demonstration of truncated bi-allelic mutations in the SMARCB1 gene in rhabdoid tumors established the first demonstration of alterations in the SWI/SNF chromatin remodeling complex in oncology. Since then, the advent of high-throughput molecular analysis techniques applied to oncology has shown that alterations in other genes of the SWI/SNF complex are present in a wide variety of cancers. Through the presentation of several types of SWI/SNF deficient tumors and our models of rhabdoid tumors, we show that the loss of SMARCB1 is associated with an increase of the serine biosynthesis pathway and the downstream metabolic pathways important for oncogenesis.These results could lead to a therapeutic option for rhabdoid tumors or, more generally, for other models of SWI/SNF-deficient tumors. Finally, the prospect of these metabolic changes with the epigenetic alterations observed in SWI / SNF deficient tumors may be relevant to continue to deepen our knowledge of these tumors

Des anomalies génétiques ont été observées dans les descendances issues de croisements entre variétés d'origine chinoise et française de millet setaria italica: des stérilités partielles, des anomalies héréditaires et des distorsions de ségrégation pour des marqueurs enzymatiques. Des analyses cytogénétiques et des observations de ségrégation d'hybrides intra spécifiques ont été réalisées

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont caractérisées par la prolifération maligneincontrôlée de précurseurs lymphoïdes T bloqués dans la différenciation. Les stades d’arrêt dematuration observés dans les LAL-T reproduisent fidèlement les différentes étapes de la maturationthymique humaine. Ainsi nous avons montré que le facteur de transcription myéloïde CEBPA, expriméuniquement dans les précurseurs thymiques les plus immatures (ETP), est réprimé par un mécanismed’hyperméthylation dans les LAL-T à l’exception des formes les plus immatures. Il est aujourd’huicommunément admis que les LAL-T constituent une pathologie dite « multi-hits » où les oncogènesde type A affectent la différenciation tandis les oncogènes de type B sont impliqués dans la régulationdu cycle cellulaire, l’auto-renouvellement et/ou l’engagement dans la lignée T. La voie de signalisationde NOTCH, cruciale pour le développement lymphoïde T, est constitutivement activée par la survenuede mutations des gènes NOTCH1 et/ou FBXW7 (N/F) dans environ 60% des LAL-T. La valeurpronostique de ces mutations est controversée. Dans notre travail, nous avons montré que lesmutations de N/F sont plus fréquentes dans les LAL-T arrêtées à un stade de maturation cortical etconfèrent un bon pronostic qui semble toutefois dépendre de la chimiothérapie administrée. Grâce àl’étude de cette large cohorte de LAL-T nous avons pu également établir la fréquence de l’anomalieoncogénique CALM-AF10. Cette dernière est très fréquente dans les LAL-T qui se développent àpartir des ETP dites de mauvais pronostic. Nous avons montré que c’est la présence de l’anomalieCALM-AF10 qui confère le pronostic défavorable à ce sous-type de LAL-T. Contrairement à lalittérature nous n’avons pas retrouvé de valeur pronostique liée à la surexpression des gènes ERG etBAALC. L’étude des anomalies génétiques des LAL-T permet de mieux comprendre l’oncogénèse etd’identifier les anomalies avec une valeur pronostique. L’intérêt de ces travaux est d’apporter une aideaux cliniciens pour une stratification thérapeutique adaptée afin de donner les meilleures chances desurvie aux patients
T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) are lymphoid neoplasms characterized by theproliferation of malignant T lymphoblasts arrested at early stages of maturation. Maturation arrest in TALLmirrors normal lymphopoiesis. Thus we have shown that the myeloid transcription factor CEBPA,expressed only in the most immature thymic precursors (ETP), is commonly repressed byhypermethylation in T-ALL with the exception of the most immature subset. It is now widely acceptedthat T-ALL is a “multi-hits” disease where the type A oncogenes affect the differentiation while type Boncogenes are involved in cell cycle regulation, self-renewal and T-cell commitment. The Notchsignaling pathway, crucial for T cell development, is constitutively activated by the occurrence ofmutations in NOTCH1 and /or FBXW7 (N / F) genes in approximately 60% of T-ALL. The prognosticvalue of these mutations is controversial. In our study, we showed that N/F mutations are morefrequently observed in T-ALL arrested at a cortical stage of maturation and confer a good prognosiswhich seems to be influenced by the therapeutic regimen. In this large cohort of T-ALL we could alsodetermine the frequency of the CALM-AF10 oncogenic abnormality. The latter is very common in TALLdeveloped from ETP wich are of very poor prognosis. We have shown that this is the presence ofCALM-AF10 which confers the poor prognosis in this subtype of T-ALL. Contrary to the litterature wedid not find any prognostic value associated with the overexpression of ERG and BAALC genes. Thestudy of genetic abnormalities in T-ALL provides a better understanding of oncogenesis and identifyabnormalities with prognostic value. The interest of this work is to assist clinicians for an efficienttherapeutic stratification to overcome the poor outcome of T-ALL patients

La sous-unité catalytique p110 de la phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) est exprimée spécifiquement dans les leucocytes, et possède un rôle central dans la biologie des lymphocytes. Des mutations germinales dominantes gain-de-fonction de PI3KCD (codant p110 ) ont été identifiées récemment chez des patients présentant une immunodéficience combinée caractérisée par une présentation clinique hétérogène incluant des infections récurrentes des voies respiratoires et des lymphoproliférations associées à une virémie EBV et/ou CMV élevée, connue sous le nom de syndromes APDS. L’hétérogénéité des présentations cliniques suggère l’existence de facteurs secondaires, génétiques ou environnementaux. Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai rapporté le cas de deux nouveaux patients présentant des anomalies génétiques affectant la voie PI3K. Le premier patient, né dans une famille consanguine, présentait une mutation gain- de-fonction de PIK3CD déjà décrite. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une seconde mutation homozygote non-sens de SEC14L2, un régulateur connu de la voie PI3K. Nous avons analysé le phénotype et la fonctionnalité des lymphocytes du patient, et avons mis en évidence in vitro certains mécanismes de régulation de l’activation lymphocytaire par SEC14L2. Enfin, nous avons réalisé une étude de transcriptome afin d’identifier les voies de régulation dérégulées chez notre patient. Dans l’ensemble, ces résultats ont permis d’identifier le premier co-facteur génétique associé au syndrome APDS. Le second patient est également né dans une famille consanguine et présentait des infections sévères des voies respiratoires et un syndrome d’infection chronique à l’EBV (CAEBV) fatal. Par séquençage de l’exome du patient, nous avons identifié une mutation homozygote rare dans PIK3CD. Une modélisation de la structure de la protéine a montré que l’acide aminé muté se situe dans le domaine catalytique de p110 , dans une boucle phylogénétiquement conservée interagissant avec la sous-unité régulatrice p85↵ de la PI3K, et que la mutation conduisait à la perte de cette interaction. In vitro, la mutation de p110 cause la perte de l’activité PI3K, et les lymphocytes T du patient présentaient une diminution de phosphorylation d’AKT et de p70 S6K, deux cibles de la PI3K. Les lymphocytes T du patient présentaient également une production diminuée d’IFN- et de TNF↵, et un excès de prolifération et de flux calcium suite à la stimulation du TCR. Des lignées cellulaires Jurkat déficientes pour PIK3CD générées par CRISPR/Cas9 ont également présenté un défaut de phosphorylation d’ATK et un excès de prolifération et de flux calcium. L’expression de la version sauvage de p110 dans ces cellules, mais pas de la version mutée, a permis une restauration des réponses normales, prouvant l’implication de la mutation dans les phénotypes cellulaires identifiés. De manière intéressante, nous avons mis en évidence l’existence d’un équilibre entre l’activité PI3K et PLC- 1 lors de l’activation T, qui pourrait être expliqué par une compétition pour l’accès à leur substrat commun, le PIP2. Enfin, nous avons identifié chez notre patient une seconde mutation homozygote délétère dans le gène TNFRSF9. Cette mutation est également retrouvée chez la sœur saine du patient, qui présentait une réplication persistante de l’EBV dans le sang, suggérant que cette mutation pourrait agir comme facteur génétique secondaire. Dans l’ensemble, cette étude à permis l’identification de la première immunodéficience associée à des mutations perte-de-fonction de PIK3CD
The pathway p110 catalytic subunit of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PI3K) is selectively expressed in leukocytes and has a central role in lymphocytes biology. Gain-of-function dominant germline mutations of PIK3CD (encoding p110 ) have been recently described in patients presenting a heterogeneous combined immunodeficiency associated with respiratory tract infections, lymphadenopathy and high EBV and/or CMV viremia. The heterogeneous clinical presentation suggests the existence of genetic or environmental modifying factors. In my thesis I report two new patients with different genetic defects causing CID. The first patient, born from a consanguineous family, presented a known gain-of- function mutation of PIK3CD. His clinical presentation was partially compatible with the already described patients. By whole exome sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in SEC14L2, a known regulator of PI3K pathway. We further analyzed the phenotype and functions of patient’s lymphocytes, and performed a transcriptome analysis to better characterize the implication of SEC14L2 mutation in the pathology. The second patient was born from consanguineous family and presented recurrent severe respiratory tract infections and a fatal Chronic Active EBV disease (CAEBV). By Whole Exome Sequencing, we identified a homozygous rare missense mutation in PIK3CD. 3D structure modelization showed that the mutated amino acid is located in p110 catalytic domain, in an evolutionarily conserved loop that interacts with alpha-helix of PI3K regulatory subunit p85a, which interaction is lost in mutated p110 . Phenotyping of patient’s circulating lymphocytes showed increased CD8+ T cells and reduced NK and CD4+ T cells. The mutation in PI3KCD resulted in impaired PI3K activity in vitro and in vivo. Moreover, patient’s T cells exhibited reduced activation-induced phosphorylation of AKT and p70-S6K, two indirect targets of p110 , that we restored by expressing wild type p110 . Patient’s T cells also showed a decreased induction of IFN- and TNF-↵ and an increased proliferation and calcium flux after TCR stimulation. By CRISPR CAS9 technology, we generated Jurkat T- cell lines expressing wild type or mutated PI3K. Jurkat cells expressing mutant PI3K showed decreased AKT phosphorylation and increased calcium flux and proliferation after TCR stimulation, confirming the implication of PIK3CD mutation in patient’s cells phenotype. Interestingly, we highlighted the existence of a balance between PI3K and PLC- 1 activity during T cell activation, that may be due to a competition for access to their shared substrate, the PIP2. Finally, we identified in our patient a second deleterious mutation in TNFRSF9 that is shared by his healthy sister, who also presented persistent EBV replication in blood, suggesting that this additional mutation may act as a modifying genetic factor. Taken together, the results presented in this thesis identified the first loss-of-function mutation in PIK3CD causing CID

Dans les cancers bronchiques, les deletions constitutionnelles au niveau des chromosomes 3, 13 et 17 sont des evenements tres frequents et observes dans tous les types histologiques. Au niveau du chromosome 13, le gene du retinoblastome semble etre la cible de ces deletions. Le but de ce travail consistait en l'etude du mecanisme d'inactivation du gene rb dans une large serie de carcinomes bronchiques primaires ainsi que son eventuel role pronostic. De maniere generale bien que peu d'anomalies de structure et d'expression de l'arn messager du gene rb soient detectables, il semble que l'inactivation du gene rb resultant en une perte de son expression proteique soit un phenomene frequent dans les carcinomes bronchiques primaires. Toutefois le gene rb est inactive de facon differentielle suivant le type histologique des tumeurs. En effet, dans les tumeurs ne a l'exclusion des carcinoides, l'inactivation du gene rb est un phenomene systematique impliquant la perte d'un allele (89%) et la mutation de l'autre allele aboutissant a la perte d'expression de la proteine rb (87%). Il semble de plus que cette mutation entraine majoritairement des anomalies post-transcriptionnelles. Par contre dans les tumeurs non ne, l'inactivation du gene rb est un phenomene moins frequent et qui semble aleatoire, probablement du a l'instabilite genetique au cours de la progression et de la selection tumorale. L'etude de l'importance relative des inactivations cumulees ou non des genes suppresseurs rb et p53 dans les carcinomes bronchiques a montre que l'association de ces deux anomalies est significativement plus frequente dans les carcinomes ne que dans les carcinomes non ne. Dans ces derniers, l'inactivation d'un seul gene semble suffisante pour l'acquisition du phenotype tumoral

L’anomalie de développement du corps calleux (AnCC) est la malformation cérébrale congénitale la plus fréquente. Le spectre clinique lié à l’AnCC est large, d’un développement normal à un trouble du développement intellectuel (TDI) de gravité variable. Les causes connues sont majoritairement génétiques avec une grande hétérogénéité, majoritairement associées à un TDI. Les causes d’AnCC de bon pronostic (i.e. sans TDI) sont rares car peu étudiées. Actuellement l’AnCC est découverte le plus souvent en cours de grossesse, à l’échographie de dépistage du 2ème trimestre. Le principal enjeu est alors celui du pronostic fœtal, dépendant de l’étiologie sous-jacente. Une meilleure connaissance des facteurs génétiques en jeu dans l’AnCC joue un rôle important dans le diagnostic, le conseil génétique et l’information prénatale. Actuellement, la mise en lumière des facteurs diagnostiques et pronostiques est un défi majeur dans le domaine de la médecine fœtale. Les objectifs principaux de ma thèse étaient d’une part d’identifier de nouveaux gènes responsables d’AnCC, mais aussi d’établir des corrélations génotype-phénotype pour les gènes identifiés afin d’améliorer l’information pronostique en particulier en prénatal. Pour répondre à ces objectifs, le travail de thèse s’est axé sur trois axes complémentaires, menés en parallèle. Le premier axe portait sur la description d’un nouveau gène d’AnCC, issu de l’analyse des résultats du séquençage d’exome dans une cohorte de plus de 500 patients avec AnCC, recrutés sur plus de 10 ans dans les services de génétique de l’hôpital de La Pitié Salpêtrière et de neuropédiatrie de l’hôpital Armand Trousseau. Nous avons identifié un nouveau gène responsable d’AnCC, associé à un bon pronostic neurodéveloppemental, ZEB1, gène impliqué jusque-là dans la dystrophie cornéenne. Grâce à une collaboration, nous avons rapporté les données cliniques, génétiques et radiologiques de 14 patients porteurs d’un variant pathogène dans le gène ZEB1. La seconde partie du travail consistait en l’établissement de corrélations génotype-phénotype de syndromes génétiques déjà connus dans l’AnCC, avec un premier focus sur l’inversion duplication délétion du bras court du chromosome 8 (invdupdel8p), anomalie chromosomique la plus fréquente dans la cohorte de patients avec AnCC et TDI. Ce travail a permis de relimiter la région minimale critique dupliquée en 8p23 responsable d’AnCC. Nous avons également analysé les données d’une cohorte de patientes avec variant dans le gène ARX, localisé sur le chromosome X, bien connu dans l’AnCC avec TDI chez le garçon mais dont le phénotype féminin était moins établi. Grâce à une revue de la littérature et la description de 10 nouvelles patientes, nous avons montré que 40% des femmes porteuses d’un variant ARX présentaient un TDI ou une encéphalopathie épileptique et développementale. Parmi les femmes porteuses ayant eu une imagerie cérébrale, 66 % présentaient une AnCC, sans que celle-ci soit prédictive du phénotype neurodéveloppemental sous-jacent. Enfin, la troisième partie portait sur l’application de ces données dans le contexte du diagnostic prénatal avec une étude de faisabilité du séquençage d’exome en prénatal en cas d’AnCC fœtale. Menée dès 2018, cette étude a montré un rendement diagnostique de 25% avec un rendu médian en 21 jours. Ensuite, avec l’équipe de radiologie de l’hôpital Armand Trousseau, nous avons mené un travail de corrélation radio-génétique sur l’imagerie prénatale, en fonction des sous-catégories d’AnCC, montrant que l’identification d’un variant pathogène était plus fréquente dans dysplasies calleuses, et lorsque l’AnCC n’était pas isolée. Ce travail collectif et personnel a ainsi permis d’améliorer les connaissances dans les causes génétiques d’AnCC, augmentant l’efficacité diagnostique, l’information pronostique et a considérablement modifié la prise en charge des couples en prénatal
The Developmental Anomaly of the Corpus Callosum (DACC) is the most common congenital brain malformation. The clinical spectrum associated with DACC is broad, ranging from normal development to varying degrees of intellectual developmental disorder (IDD). The known causes are predominantly genetic with significant heterogeneity, mostly associated with IDD. Causes of DACC with a favorable prognosis (i.e., without IDD) are rare and less studied. Currently, DACC is most often discovered during pregnancy, through second-trimester screening ultrasound. The primary concern at this point is fetal prognosis, which depends on the underlying etiology. A better understanding of the genetic factors involved in DACC plays a crucial role in diagnosis, genetic counseling, and prenatal information. Currently, highlighting diagnostic and prognostic factors is a major challenge in the field of fetal medicine. The main objectives of my thesis were, on the one hand, to identify new genes responsible for DACC, and on the other hand, to establish genotype-phenotype correlations for the identified genes to improve prognostic information, particularly in prenatal care. To address these objectives, the thesis work focused on three complementary axes, conducted in parallel. The first axis involved the description of a new DACC gene, identified through exome sequencing analysis in a cohort of over 500 patients with DACC, recruited over more than 10 years from the genetics departments of La Pitié Salpêtrière Hospital and the neuropediatrics department of Armand Trousseau Hospital. We identified a new gene responsible for DACC, associated with a favorable neurodevelopmental prognosis, ZEB1, a gene previously known to be involved in corneal dystrophy. Through collaboration, we reported clinical, genetic, and radiological data for 14 patients carrying a pathogenic variant in the ZEB1 gene. The second part of the work involved establishing genotype-phenotype correlations of already known genetic syndromes in DCCA, with a primary focus on the inversion duplication deletion of the short arm of chromosome 8 (invdupdel8p), the most common chromosomal anomaly in the cohort of patients with DACC and IDD. This work helped to refine the critical duplicated region in 8p23 responsible for DACC. We also analyzed data from a cohort of patients with a variant in the ARX gene, located on the X chromosome, well known in DCCA with IDD in boys but with less established phenotypes in females. Through a literature review and the description of 10 new female patients, we showed that 40% of women carrying an ARX variant had IDD or a developmental and epileptic encephalopathy. Among the female carriers who had brain imaging, 66% had DACC, although it was not predictive of the underlying neurodevelopmental phenotype. Finally, the third part focused on the application of this data in the context of prenatal diagnosis, with a feasibility study of exome sequencing in prenatal cases of fetal DACC. Conducted since 2018, this study showed a diagnostic yield of 25% with a median turnaround time of 21 days. Then, with the radiology team at Armand Trousseau Hospital, we conducted a radio-genetic correlation study on prenatal imaging, based on subcategories of DACC, showing that the identification of a pathogenic variant was more common in callosal dysplasia and when DACC was not isolated. This collective and personal work has thus improved knowledge about the genetic causes of DACC, increasing diagnostic efficiency, prognostic information, and significantly altering the management of couples in prenatal care

Human gliomas represent the most common primary brain tumours in adults. According to World Health Organization classification, gliomas are divided into astrocytomas with four grades (I, II, III, and IV), oligodendrogliomas with two grades (II and III), and oligoastrocytomas with two grades (II and III) based on the tumor cell phenotype. Pathological classification remains controversial due to the lack of specific immunohistochemical biomarker to recognize gliomas. Also, due to their natural propriety to infiltrate the normal parenchyma and to migrate far from the first location, total surgical resection remains often impossible then adjuvant treatment is needed. The established therapies for gliomas include surgery, radiotherapy and chemotherapy. Despite this arsenal of therapies, median survival of the most malignant grade glioblastoma is approximately 15 months. This is why the attempts to better understand the molecular biology of gliomas in the aim to define new molecular targets is a holy grail. Using conventional and molecular cytogenetic approaches and molecular genetic methods, we have investigated patients bearing gliomas and followed at CHUS. Our results display that the codeletion 1p/19q (1p-/19-) is not only a prognostic and predictive biomarker of oligodendrogliomas but also a diagnostic tool of this tumor. Our study has allowed us to build a glioma-bank containing around 150 samples of patients, which we continued to populate. We have also defined the cut-off positivity of FISH on touch preparation slides, which is 20%. In addition, we have developed a new, fast and reliable method to retrieve the 1p-/19q- in all samples 24 hours after sampling. This method was transferred to the clinical lab. Furthermore, we have successfully cultured the brain tumor samples and analyzed their caryotypes. This has permitted us to discover a new alternative translocation, which is responsable of 1p deletion in one oligoastrocytoma case. Since glioblastoma is characterized by genomic instability, and telomere disruption is a main cause of genomic instability, we investigated the nuclear telomere architecture in this type of tumour. We found that nuclear telomeric architecture could be a biomarker of glioblastoma since it can subdivide glioblastoma patients in three categories with significantly different outcomes and time to progression. We used high-throughput methods (one manual and one semi-automatic) to characterize the nuclear telomeric architecture in glioblastoma. The semi-automatic method can be transfer to the clinical lab since it can deliver the results nine hours after sampling. Then, this approach is usable to monitor this tumor and to evaluate the impact of different treatment options. We need to search the putative tumor suppressor genes on chromosomes 1 and 19. Furthermore, trying to understand the molecular basis of nuclear telomeric architecture will bring up new molecular target therapies.

ABCA3 (ATP-binding cassette subfamily A, member 3) est un transporteur transmembranaire exprimé à la surface des corps lamellaires dans les pneumocytes II, et joue un rôle important dans le stockage et la régulation du surfactant pulmonaire. Des mutations du gène ABCA3 ont été décrites en association avec une détresse respiratoire néonatale (DRNN) sévère ou une pathologie alvéolo-interstitielle (PAI) de l’enfant. L’objectif de ces travaux était de rechercher des mutations d’ABCA3 chez 50 patients présentant une DRNN et/ou une PAI. Le séquençage d’ABCA3 a été réalisé chez 50 patients et chez 23 témoins indemnes de pathologie respiratoire : 13 enfants ont été identifiés comme porteurs de mutations d’ABCA3; 4 à l’état homozygote et 9 à l’état hétérozygote. Parmi ces patients porteurs de mutations d’ABCA3, 7 sont décédés en période néonatale and 6 ont développé une PAI. L’expression des protéines spécifiques du surfactant SP-B et SP-C analysée par Western blot chez ces patients porteurs de mutations d’ABCA3 a révélé des profils d’expression variables. Les études fonctionnelles réalisées pour les mutations homozygotes p. D253H et p. T1173R ont révélé des mécanismes d’action différents: la mutation p. D253H entraîne la formation de corps lamellaires anormaux, alors que la mutation p. T1173R est plutôt associée à une sécrétion accrue d’IL-8 in vitro. Nous avons donc identifié 13 nouvelles mutations d’ABCA3 chez des patients ayant présenté une DRNN sévère inexpliquée et/ou une PAI non étiquetée. Les études fonctionnelles réalisées semblent mettre en évidence des mécanismes physiopathologiques différents malgré un phénotype clinique identique chez les enfants atteints

L’effectif génétique réduit des races bovines entraîne une augmentation de consanguinité de l’ordre de 1% par génération et une forte dérive génétique. Cette évolution favorise l’émergence régulière d’anomalies génétiques récessives dans les populations, qu’elles soient de races laitières ou allaitantes. En France, l’Observatoire National des Anomalies Bovines (ONAB) a été créé dans le but de détecter et contrôler ces anomalies émergentes. Cependant, la détection par les observatoires sous-entend d’une part une diffusion large de l’allèle défavorable dans la population et d’autre part que l’anomalie présente un phénotype avec un tableau clinique spécifique permettant une déclaration du phénotype à l’ONAB. L’impact des anomalies génétiques est donc encore largement sous-estimé. Toutefois, le développement des technologies de génotypage et de séquençage de génomes, associés à l’ensemble des informations disponibles permet une détection efficace des mutations causales. Ainsi, l’objectif de cette thèse a été d’utiliser l’ensemble des données disponibles (phénotypes, génotypes, séquences, annotations fonctionnelles…) pour identifier et valider des mutations délétères ségrégant dans races bovines laitières et allaitantes françaises. Nous avons exploré différentes stratégies classiques - cartographies par homozygotie, haplotypes en déficit en homozygotes - qui gagnent en efficacité grâce aux données de séquence de génome complet (WGS). Nous avons également mis en place des approches alternatives de génétique inverse, basées sur l’exploitation des données WGS française et du consortium 1000 bull genomes.Les travaux réalisé ont permis d’identifier les mutations causales associées à deux syndromes récessifs rapportés à l’ONAB : l’épidermolyse bulleuse jonctionnelle en race Charolaise (ITGB4, g.chr19: g.56488278_56493087del) et d’épilepsie idiopathique (MTCL1, g.chr24:41661691 G>A) récemment émergée dans la race Parthenaise. Nous avons également démontré la forte association entre l’haplotype MH1 et un polymorphisme affectant le gène PFAS (Chr19:g.28511199C>T ; p.R1205C). Par les stratégies de génétique inverse, nous avons également identifié une mutation probablement responsable de mortalité embryonnaire en race Normande affectant le gène CAD (Chr11:g72399397, p.Y452C) ainsi qu’une mutation affectant le gène RP1 (Chr14:g.23995411_23995412insA, p. R791KfsX13) responsable d’une dégénérescence progressive de la rétine et qui ségrége à forte fréquence en race Normande mais aussi dans d’autres races bovines européennes. Ces études encore en cours, fournissent également un inventaire des variants génétiques potentiellement délétères dont la caractérisation de l’effet sur le phénotype pourra être explorée. Enfin, l’identification de ces anomalies et des mutations délétères responsables ont abouti à la mise à disposition de tests de diagnostic efficaces pour permettre une contre-sélection raisonnée de ces variants délétères dans les populations bovines
The reduced genetic size of cattle breeds leads to an increase in inbreeding of nearly 1% per generation and a strong genetic drift. This evolution favors regular emergence of recessive genetic abnormalities in dairy and beef cattle breeds. In France, the National Observatory of Bovine Anomalies (ONAB) was created with the aim to detect and control these new emergences. However, detection by the observatories implies a broad diffusion of the deleterious allele in the population and a phenotype with specific clinical features, allowing reporting to ONAB. Therefore the impact of genetic abnormalities is still largely underestimated. However, development of genotyping and genome sequencing technologies, coupled with all available information, makes possible effective detection of causal mutations. Thus, the aim of this thesis was to use all the available data (phenotypes, genotypes, sequences and functional annotations) to identify and validate deleterious mutations segregating in French dairy and beef cattle breeds. We used homozygosity mapping, and study of haplotypes with deficit in homozygous, two strategies boosted by using whole genome sequence (WGS) data. We also explored alternative reverse genetics strategies, based on data mining of French and 1000 bull genomes consortium WGS data.In these different studies, we identified the causal mutations associated with two described recessive syndromes: epidermolysis bullosa junctional in Charolais race (ITGB4, chr19: g.56488278_56493087del) and idiopathic epilepsy (MTCL1, chr24:g.41661691G>A) recently emerged in the Parthenaise breed. We also demonstrated a strong association between the embryonic lethal mutation MH1 and a polymorphism affecting the PFAS gene (chr19: g.28511199C> T ; p.R1205C) in Montbeliarde cattle. With reverse genetic strategies, we identified another mutation, which affects the CAD gene (chr11: g72399397, p.Y452C), likely responsible for embryonic mortality in Normande cattle, and a frameshift mutation in RP1 (chr14:g.23995411_23995412insA, p. R791KfsX13) responsible for progressive retinal degeneration segregating with a high frequency in the Normande breed but also in other European cattle breeds. These studies, still in progress, provide an inventory of potentially deleterious genetic variants, whose characterization could be explored in the future. At last, identification of mutations responsible for these genetic abnormalities provided or will provide diagnostic tests and allow efficient counter selection of these variants in French beef and dairy cattle populations

La cardiomyopathie hypertrophique familiale (CMH) est caractérisée par une hypertrophie du ventricule gauche et est transmise selon un mode autosomique dominant. Les analyses génétiques ont montré que 9 gènes codant tous des protéines du sarcomère cardiaque sont impliqués dans cette maladie. Parmi ceux ci,nous avons choisi d'étudier le gène MYL2 codant la chaîne légère régulatrice ventriculaire de la myosine et le gène MYBPC3 codant la protéine C cardiaque (cMyBPC) afin de savoir : 1) si des anomalies du gène MYL2 associées jusqu'alors à un phénotype rare pouvaient aussi être responsables de formes classiques de CMH, 2) quels sont les mécanismes moléculaires de la CMH associés aux mutations du gène MYBPC3? Dans la première partie, nous avons analysé les 7 exons du gène MYL2 et identifié 2 nouvelles mutations dans des familles présentant des formes classiques de CMH. Dans la deuxième partie, nous avons analysé ex vivo les conséquences des mutations du gène MYBPC3. Cette analyse a apporté les résultats suivants : (1) Dans les cardiomyocytes de rats foetaux, quatre cMyBP-Cs tronquées humaines ayant perdu les sites majeurs d'interaction avec la myosine et/ou avec la titine sont moins stables et s'incorporent moins bien le sarcomère que la cMyBP-C normale ou mutée. Leur expression est associée à une altération de la striation endogène dans 30 à 50 pour cent des cas. (2) Dans les cellules COS, une cMyBP-C tronquée, ne possédant plus les sites COOH-terminaux de liaison à la titine et à la myosine modifie l'organisation des filaments de α-myosine de rat. (3) Par analyse protéique fine, un troisième site putatif de liaison à la myosine (MyHC) a été identifié dans le domaine NH2-terminal de la cMyBP-C humaine. En conclusion, dans le contexte de la CMH, ce travail a montré qu'il n'existe pas de phénotype particulier pour un gène donné et que les mutations du gène MYBPC3 décalant le cadre de lecture semblent aussi agir par un effet dominant-négatif sur la structure et/ou l'assemblage du sarcomère. Une meilleure connaissance des partenaires sarcomériques de la cMyBP-C ainsi qu'une évaluation ex vivo ou in vivo des effets des cMyBP-Cs anormales sur la fonction du cardiomyocyte permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les mutations MYBPC3 conduisent au développement de la CMH

L’avènement du séquençage haut débit d’exome (SHD-E) en diagnostic et en recherche ces dernières années a conduit à l’identification des bases génétiques de nombreuses pathologies mendéliennes, permettant de résoudre de nombreuses situations d’errance diagnostique. Néanmoins, l’analyse des données de SHD-E permet uniquement d’identifier des variations pathogènes ou probablement pathogènes dans 30 à 45 % des situations sans diagnostic. En effet, certaines limites existent, tant au niveau clinique, moléculaire et bioinformatique. L’évolution constante des connaissances cliniques, du nombre de nouveaux gènes impliqués en pathologie humaine, et des corrélations clinico-biologique a un impact important sur l’analyse des données, entraînant une amélioration progressive de la recherche diagnostique. Des limites techniques inhérentes à la technologie, avec en particulier des régions non couvertes, existent, mais se sont également significativement réduites ces dernières années. Enfin, au-delà de l’analyse de SNV et de CNV, d’autres anomalies génétiques peuvent être responsables de maladies rares, nécessitant un développement bioinformatique pour optimiser les résultats. Bien que le séquençage à haut débit du génome permette de résoudre des observations, en particulier en cas de variations dans les régions non codantes ou les variants de structure, il existe encore de nombreuses informations à extraire et à exploiter à partir des données de SHD-E.L’objectif de cette thèse a donc été de participer à l’amélioration des approches bioinformatiques d’analyse de données de SHD-E pour l’identification de nouveaux gènes ou mécanismes moléculaires impliqués dans des maladies génétiques rares afin de réduire l’errance diagnostique des patients.Plusieurs stratégies ont ainsi été mises en place. La première stratégie a consisté en une réanalyse recherche de données de 80 patients ayant bénéficié d’un SHD-E au laboratoire CERBA (thèse CIFRE) dont la lecture diagnostique était négative. Elle a conduit à la mise en évidence deux nouveaux gènes candidats dans la déficience intellectuelle syndromique, dont le gène OTUD7A (article 1). La deuxième stratégie a consisté en la mise au point d’un pipeline bioinformatique pour extraire les données du génome mitochondrial à partir des données de SHD-E. L’ADN mitochondrial n’est pas ciblé par les kits de capture d’exome mais peut être extrait des données capturées indirectement rendant son analyse possible à partir de données de SHD-E préexistantes. A partir de la collection GAD d’exomes de patients sans diagnostic, deux variations causales ont été identifiées chez deux individus atteints de troubles neuro-développementaux sur 928 personnes étudiées, et ainsi résoudre une errance diagnostique dans 0,2 % des patients sans diagnostic (article 2). La troisième stratégie a consisté en la mise en place d’un pipeline bioinformatique d’identification des éléments mobiles au sein des données d’exome, étant attendu qu’environ 0,3 % des variations pathogènes du génome humain ont pour origine l’insertion de novo d’un élément mobile. A partir de la collection GAD d’exomes de 3322 patients sans diagnostic, cette étape a permis d’identifier deux cas en lien avec l’insertion d’un élément Alu au sein d’un exon du gène FERMT1 et du gène GRIN2B (article 3 en cours d’écriture).Cette thèse a permis de repousser certaines limites de la technologie d’exome. D’autres perspectives existent, et sont explorées par l’équipe, en lien avec le projet Européen Solve-RD
In the last years, the advent of exome sequencing (ES) in diagnosis and in research led to the identification of the genetic bases of many Mendelian disorders, allowing many diagnostic wavering cases to be solved. Nevertheless, ES data analysis only leads to the identification of pathogenic or likely pathogenic variants in 30 to 45 % of the undiagnosed cases. Indeed, some limits exist, both at clinical, molecular and bioinformatic levels. The constant evolution of the clinical knowledge, of the number of genes involved in human diseases, and of the clinical-biological correlations, has a significant impact on data analysis, leading to a progressive improvement in diagnostic research. Limits of the current technologies, especially not covered regions, exist, but have been significantly reduced in the recent years. Although genome sequencing will solve some undiagnosed cases, especially in case of non-coding or structural variants, there is still a lot of information to be extracted and analyzed from ES data. Finally, beyond SNV and CNV analyzes, other genetic events can be involved in rare disorders, requiring a bioinformatic development to optimize results.The aim of the project was therefore to improve bioinformatic approaches of ES data analysis in order to identify new molecular mechanisms involved in rare genetic disorders and reduce diagnostic wavering.Several strategies were established. The first one consisted in reanalysing ES data from 80 undiagnosed patients, who were sequenced by the Laboratoire CERBA (CIFRE thesis). It led to the identification of 2 new candidate genes involved in ID, especially OTUD7A gene (article 1). The second strategy was the development of a bioinformatic pipeline in order to extract mitochondrial DNA data from ES data. The mitochondrial genome is not targeted by exome capture kits but can be extracted from off-target data, giving the opportunity to analyze it from preexisting ES data. From the GAD exomes cohort of undiagnosed patients, 2 causal variations were identified in 2 individuals out of 928, affected with neuro-developmental disorder. It thus solved the diagnostic wavering in 0.2 % of patients without diagnosis (article 2). The third strategy consisted in the development of a bioinformatic pipeline to identify mobile elements insertion within ES data, with the expectation that about 0.03 % of the pathogenic variants originate from de novo mobile element insertion. From the GAD exomes cohort of 3322 undiagnosed patients, this step led to the identification of two Alu element insertions in FERMT1 and GRIN2B gene exons (article 3, in process).This PhD permitted to push out some ES limits. Other perspectives exist, and are explored by the GAD team, in connection with the European Solve-RD project

Les méthodes d'analyse de liaison génétique consistent à mettre en évidence une cotransmission familiale entre le phénotype étudié et un marqueur génétique, afin de localiser dans une région chromosomique un gène influençant le phénotype. La méthode d'analyse de liaison modèle-indépendante (" Wightcd Pairwise Correlation"), introduite par Commenges en 1994, peut s'appliquer à tous les types de phénotypes sans hypothèse distributionnelle, et est particulièrement adaptée à l'analyse de familles étendues. Nous avons développé la méthode WPC afin de prendre en compte plusieurs marqueurs non liés (analyse multi-locus), d'utiliser l'information héritée par descendance (IBD) lors du calcul de la ressemblance au niveau d'un marqueur génétique (analyse deux points) ou d'une région chromosomique (analyse multipoint). Des études de simulation ont montré que les tests deux-locus étaient plus puissants que les tests un-locus, et ont confirmé que l'utilisation de la méthode WPC-IBD conduisait à d'importants gains de puissance, tout particulièrement dans le cas de marqueurs peu polymorphes. La prise en compte de l'information multipoint dans la réanalyse de données de cancer du sein réunies par le consortium BCLC ("Breast Cancer Linkage Con sortium") a notablement augmenté la puissance de l'analyse. L'utilisation des méthodes WPC-IBD deux points et multipoint pour l'analyse des familles de l'étude COGA ("Collaborative Study on the Genetic of Alcoholism") a permis de confirmer le rôle de la région chromosomique 4q21 contenant les gènes Alcool Déshydrogénase (ADH) dans la prédisposition à l'alcoolisme. L'analyse de données brésiliennes concernant les niveaux d'infection par Schistosoma mansoni dans la bilharziose par les méthodes WPC-IBD deux points et multipoint un-locus et deux-locus a permis de mettre en évidence trois régions d'intérêt (1p21-q23, 7q35-q36 et 6p21-q21 ), en plus de la région 5q31-33) où avait été précédemment localisé le gène SMI
Linkage analysis methods search for a familial cotransmission between a phenotype and a genetic marker, in order to loccalize on a chromosornal region a gene influenc!ng the phenotype. The WPC ("Weighted Pairwise Correlation") model-free linkage analysis method, introduced par Commenges in 1994, can be applied to all kind of phenotypes, without any distributional assumption, and is especially suitable for the analysis of large pedigrees. We developed the WPC method to take into account several unlinked marker loci (multi-loci analysis) and to incorporate the ldentical By Descent (IBD) information in the calculation oftlie resemblance at a marker locus (two-point analysis) or in a chromosomal region (multipoint analysis). Simulation studies conducted under various genetic models showed that two-locus tests were more powerful than one-locus tests, and confirmed that the use of the WPC-IBD method leads to a large increase of power, especially in the situation of poorly informative markers. Use of multipoint information in the re-analysis of breast cancer data from the BCLC ("Breast Cancer Linkage Consortium") led to a substantial gain in power as compared to two-point analysis. The use of two-point and multipoint WPC-lBD methods for the analysis of COGA (''Collaborative Study on the Genetic of Alcoholism'') data confinned the involvement of chromosome 4q2l containing Alcohol Dehydrogcnase (ADH) genes in predisposition to alcoholism. Analysis of infection levels by Schistosoma mansoni in schistosomiasis in Brazilian data using WPC-IBD two-point and multipoint one-locus and two-locus methods showed linkage to three chromosomal regions (1p21-q23, 7q135-q36 and 6p21-q21 ), in addition to 5q31-33 where was mapped the SMI gene

La capacité des animaux à se reproduire est un point-clé de la gestion des troupeaux qui permet l'induction de la lactation et la naissance de veaux destinés à la vente ou au renouvellement. Du fait d'une sélection longtemps axée sur les caractères de production ces 80 dernières années, la fertilité des bovins a nettement diminué. L'objectif de ma thèse était d'exploiter les grandes bases de données françaises - constituées par l'enregistrement de 7 millions de naissances annuelles, des informations de suivi et de performances de ces animaux, complétées par 2 millions de génotypes sur puce à SNP et par les séquences de génomes complets de 5000 taureaux - pour identifier des loci influençant différentes facettes de la fertilité des mâles, des femelles et des durées de gestation. Ainsi après avoir développé une méthode de cartographie basée sur l'étude du déséquilibre de liaison entre marqueurs de chromosomes différents dans de grandes familles, 12 réarrangements interchromosomiques ont été identifiés. Ils affectent à la fois la fertilité des taureaux porteurs, celle de leurs filles et divers traits de santé. Une vingtaine de loci récessifs ont aussi été révélés en conduisant des approches cas/contrôles sur des groupes d'animaux aux phénotypes contrastés, impactant fortement la fertilité des mâles ou des femelles. Les centaines de milliers d'accouplements entre animaux génotypés ont permis d'étudier les interactions des génomes parentaux sur les résultats des inséminations et d'initier des travaux sur la compatibilité entre animaux. Enfin, des travaux sur la durée de gestation dans 16 races françaises ont complété les connaissances sur l'héritabilité et la variabilité de ce caractère et de décrire les risques associés à une sélection pour des gestations plus courtes. L'ensemble de ces résultats montrent que le bovin peut être utilisé comme modèle pour la recherche en génétique grâce aux données générées en routine en élevage. Ils doivent pouvoir être utilisés en sélection génétique pour l'amélioration de la fertilité des animaux, qui participe à la durabilité de l'élevage bovin
Abstract: The ability of animals to reproduce is a key factor in herd management, leading to the induction of lactation and the birth of calves for the market or for replacement. Over the past 80 years, cattle fertility has declined sharply as a result of selection that has long focused on production traits. The aim of my thesis was to exploit the large French databases - consisting of 7 million births per year, traceability, and performance information on these animals, supplemented by 2 million genotypes on SNP arrays and the sequences of complete genome of 5,000 bulls - to identify loci influencing different aspects of male and female fertility and gestation length. By developing a mapping method based on the study of linkage disequilibrium between markers from different chromosomes in large families, 12 interchromosomal rearrangements were identified. They affect the fertility of carrier sires, their daughters and various fitness traits. Some twenty recessive loci have also been revealed by conducting case/control approaches on groups of animals with contrasting phenotypes, strongly impacting male or female fertility. Hundreds of thousands of matings between genotyped animals have made it possible to study the interactions of parental genomes on insemination outcomes, and to initiate studies on compatibility between animals. Finally, works on gestation length in 16 French breeds has added to our knowledge on the heritability and variability of this trait, and described the risks associated with selection for shorter gestations. All these results show that cattle can be used as a model for genetic research, thanks to the data routinely generated on the farm. They should also be used in genetic selection to improve animal fertility, a key factor in the sustainability of cattle farming

L’infertilité représente un problème majeur de santé publique en concernant 10 à 15% des couples en âge de procréer. Un facteur masculin est responsable de l’infertilité du couple dans près de la moitié des cas. Pour environ 30% d'entre eux, l'étiologie reste inexpliquée. Le premier axe du travail a concerné l’étude moléculaire d’une cohorte de patients infertiles (azoospermie non-obstructive/cryptozoospermie ou désordre du développement sexuel ou DSD) pour lesquels les analyses du caryotype standard et/ou des microdélétions des régions AZF par PCR n’ont pas permis d’expliquer le phénotype. L'impact des variations de nombre de copies de l'ADN (CNV) détectées par l'hybridation génomique comparative sur puce à ADN est peu documenté. Un design personnalisé de puce à ADN de format 400K, pangénomique et enrichi sur un large panel de 445 gènes liés à l'infertilité et à un DSD a été développé. Cette puce a permis l’identification de 171 CNV d’intérêt. Ces résultats soulignent l’intérêt de ce design comme outil diagnostic dans le cadre du bilan de l’infertilité masculine. Le second axe du travail a été de modéliser l’infertilité masculine in vitro dans un contexte d’anomalie génétique. Des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) ont été générées à partir d’érythroblastes de deux patients infertiles porteurs d’un remaniement chromosomique complexe ou d’un caryotype 46,XX-SRY négatif avec mutation du gène de l’AMH. Dans un deuxième temps, la fonctionnalité des lignées de cellules hiPS générées a été testée par différenciation in vitro en cellules germinales primordiales (CGP). Elles expriment les marqueurs clés du stade CGP dont SOX17, le déterminant germinal le plus précoce des CGP. Les perspectives de ce travail seront de poursuivre la différenciation germinale vers des stades plus matures et ainsi de pouvoir étudier le processus méiotique dans un contexte d’anomalie génétique
Infertility represents a major public health problem and concerns 10 to 15% of couples in the general population. A male factor is responsible for the infertility of the couple in about half of all cases. In approximately 30% of them, the etiology remains unexplained.The first working axis concerned the molecular study of a cohort of infertile patients (nonobstructiveazoospermia/ cryptozoospermia and disorder of the sex development or DSD) for whom analyses of standard karyotype and/or microdeletions of AZF regions were not able to explain the phenotype. The impact of copy number variations of DNA (CNVs) detected by comparative genomic hybridization (CGH-array) is poorly documented. A custom design 400K micoarray, genome-wide and enriched on a wide panel of 445 genes linked with infertility and DSD has been achieved. This array allowed the identification of 171 CNVs of interest.These results underline the potential of this design for diagnosis of male infertility. The second objective of this work was the in vitro modelisation of male infertility in a context of genetic abnormality. For that purpose, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were generated from erythroblasts by means of not integrative Sendaï virus, in two patients carrying genetic abnormalities (complex chromosomal rearrangement and 46,XX-SRY negative karyotype associated with AMH gene mutation). Secondly, functionality of hiPSCs generated was tested by germ cells in vitro differentiation. Primordial germ cell (PGC) stage was successfully obtained. Cells expressed key PGC markers such as SOX17. The perspectives of this work will be to continuethe germinal differentiation towards more mature stages and so to be able studying the meiotic process in a context of genetic abnormality

Depuis les 20 dernières années, l'amniocentèse est devenue un acte médical très répandu. Les données relatives aux 508 amniocentèses génétiques, réalisées à l'Hôpital de Chicoutimi du 14 février 1984 au 1er mars 1990, ont été analysées. L'âge maternel avancé est le motif d'amniocentèse qui compte le plus grand nombre de patientes (soit 62%), suivi des anomalies du tube neural (13,6%), des anomalies chromosomiques (9,4%) et des maladies héréditaires (9%). Un résultat anormal a été trouvé dans 1,3% des amniocentèses réalisées pour âge maternel avancé, 4% pour des anomalies chromosomiques, 4,3% pour des maladies héréditaires et 9% pour les anomalies du tube neural. Les amniocentèses réalisées suite à une anomalie détectée à l'échographie se sont révélées anormales dans 44% des cas. A l'exception des translocations chromosomiques équilibrées, toutes les autres grossesses dont l'amniocentèse avait donné un résultat anormal ont été interrompues ou se sont terminées spontanément.

Le neuroblastome (NB) représente 8% de tous les cancers pédiatriques et est caractérisé par sa grande hétérogénéité clinique. Afin d’évaluer son pronostic, plusieurs facteurs génétiques sont utilisés : amplification de MYCN, délétion 1p, gain 11q et gain 17q. Les buts de notre travail étaient d’abord de vérifier si l’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permet une analyse complète de ces anomalies et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome telle le polymorphisme nucléotidique simple (SNP), de vérifier la concordance avec les résultats de la FISH et le pronostic potentiel des anomalies du 14q, en particulier du gène AKT. Nous avons donc établi un panel de sondes pour la FISH qui a été appliqué sur 16 tumeurs non-fixées. Après isolation de l’ADN de 36 tumeurs, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 » contenant 945,826 sondes non polymorphiques et 906,000 sondes polymorphiques. Nos résultats ont démontré que la FISH permet l’évaluation complète des anomalies génétiques importantes du NB et que les anomalies déséquilibrées sont détectées très précisément par SNP. Les anomalies du 14q tendent à être associées avec des facteurs cliniques comme le grade et l’évolution, contrairement aux anomalies d’AKT. L’analyse du 14q a révélé trois gènes d’intérêt, MAX, BCL11B et GPHN, qui devraient être analysés sur un plus grand échantillon. Ainsi, l’étude par FISH semble adaptée pour détecter les anomalies génétiques classiques du NB, alors que celles retrouvées en 14q représentent de potentielles cibles thérapeutiques pour cette tumeur.
Neuroblastoma (NB) accounts for 8% of all childhood cancers and is characterized by its clinical heterogeneity. To evaluate its prognostic, many genetic markers are used: MYCN amplification, 1p deletion, 11q gain and 17q gain. Our goals were first to verify if fluorescence in situ hybridization (FISH) allows a complete analysis of these abnormalities and, second, using a global genomic analysis as single nucleotide polymorphism (SNP), to verify the concordance with FISH results and the prognostic potential of 14q abnormalities, especially these of AKT gene. We then established a FISH panel that has been applied on 16 unfixed tumors. After DNA isolation of 36 tumors, we made a genotypic analysis by SNP using « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 » containing 945,826 nonpolymorphic probes and 906,000 polymorphic probes. Our results have demonstrated that FISH allows a complete evaluation of the NB’s important genetic abnormalities and that unbalanced abnormalities are detected very precisely by SNP. 14q abnormalities seem to be associated with clinical factors such as tumor grading and evolution, unlike AKT abnormalities. Analysis of 14q abnormalities revealed three genes of interest, MAX, BCL11B and GPHN, which should be analyzed on a larger sample. Thereby, FISH study seems appropriate to detect the NB’s classic genetic abnormalities, while those found in 14q represent potential therapeutic targets for this tumor.

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.
Neural tube defects (NTDs), including anencephaly and spina bifida, represent a group of very common birth defects in humans. These anomalies are caused by a partial or complete failure of neural tube closure during embryogenesis. NTDs have a multifactorial etiology involving environmental and genetic factors. The non-canonical signaling pathway Frizzled (Fz) / Dishevelled (Dvl) controls the planar cell polarity (PCP) and the morphogenetic process called convergent extension (CE) which is essential for gastrulation and neural tube closure. Importantly, mutations in genes of this pathway were strongly associated with NTDs in mice and humans. Scribble is a PCP gene that causes a severe NTD mouse Circletail. Scribble binds to another PCP protein, Stbm / Vang, and they cooperate together for the stability of the PCP pathway. Our study aims at investigating the role of SCRIBBLE1 in human NTDs by sequence analyses of its open reading frame and exon-intron junctions. The cohort included in this study consisted of 396 patients recruited at the Spina Bifida Centre of Gaslini Hospital in Genoa, Italy, and 83 patients recruited at the Spina Bifida Center of the Sainte Justine Hospital, Montreal, Canada. Patients were affected by several forms of NTDs. We identified nine non-synonymous and rare mutations in 10 patients: p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) and p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Five of those mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, were absent in all controls analyzed and were predicted to be pathogenic using bioinformatics. Our study demonstrates that rare mutations in SCRIB1 could predispose to NTDs in a fraction of patients. The identification of genes that predispose to ATN will help us better understand the pathogenic mechanisms involved in these diseases.

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales parmi les plus fréquentes chez l’humain en touchant 1-2 nouveau-nés par 1000 naissances. Elles résultent d’un défaut de fermeture du tube neural pendant l’embryogenèse. Les formes les plus courantes d'ATN chez l'homme sont l'anencéphalie et le spina-bifida. Leur étiologie est complexe impliquant à la fois des facteurs environnementaux et des facteurs génétiques. Un dérèglement dans la signalisation Wnt, incluant la signalisation canonique Wnt/β-caténine et non-canonique de la polarité planaire cellulaire (PCP), peut causer respectivement le cancer ou les anomalies du tube neural (ATN). Les deux voies semblent s’antagoniser mutuellement. Dans cette étude, nous investiguons les rôles de Lrp6 et deANKRD6, entant qu’interrupteurs moléculaires entre les deux voies de signalisation Wnt, et CELSR1, en tant que membre de la PCP, chez la souris mutante Skax26m1Jus, générée par l’agent mutagène N-Ethyl-N-Nitrosuera, et dans une cohorte de patients humains ATN. Pour Lrp6, nous avons démontré que Skax26m1Jus représente un allèle hypermorphe de Lrp6 avec une augmentation de l’activité de la signalisation Wnt/canonique et une diminution de l’activité JNK induite par la voie PCP. Nous avons également montré que Lrp6Skax26m1Jus interagit génétiquement avec un mutant PCP (Vangl2Lp) où les doubles hétérozygotes ont montré une fréquence élevée d’ATN et des défauts dans la polarité des cellules ciliées de la cochlée. Particulièrement, notre étude démontre l'association des nouvelles et rares mutations faux-sens dans LRP6 avec les ATN humaines. Nous montrons que trois mutations de LRP6 causent une activité canonique réduite et non-canonique élevée. Pour ANKRD6, nous avons identifié quatre nouvelles et rares mutations faux-sens chez 0,8% des patients ATN et deux chez 1,3% des contrôles. Notamment, seulement deux, des six mutations validées (p.Pro548Leu et p.Arg632His) ont démontré un effet significatif sur l’activité de ANKRD6 selon un mode hypomorphique. Pour CELSR1, nous avons identifié une mutation non-sens dans l'exon 1 qui supprime la majeure partie de la protéine et une délétionde 12 pb. Cette perte de nucléotides ne change pas le cadre de lecture et élimine un motif putatif de phosphorylation par la PKC " SSR ". Nous avons également détecté un total de 13 nouveaux et rares variants faux-sens qui avaient été prédits comme étant pathogènes in silico. Nos données confirment le rôle inhibiteur de Lrp6 dans la signalisation PCP pendant la neurulation et indiquent aussi que les mutations faux-sens identifiées chez LRP6 et ANKRD6 pourraient affecter un équilibre réciproque et un antagonisme très sensible à un dosage précis entre les deux voies Wnt. Ces variants peuvent aussi agir comme facteurs prédisposants aux ATN. En outre, nos résultats impliquent aussi CELSR1 comme un facteur de risque pour les anomalies du tube neural ou l’agénésie caudale. Nos résultats fournissent des preuves supplémentaires que la voie de signalisation PCP a un rôle pathogène dans ces malformations congénitales et un outil important pour mieux comprendre leurs mécanismes moléculaires.
Neural tube defects (NTDs) are among the most common congenital malformations in humans affecting 1–2 infants per 1000 births. NTDs are caused by failure of the neural tube to close during embryogenesis. The most common forms of NTDs in humans are anencephaly and spina bifida. Their etiology is complex implicating environmental and genetic factors. Wnt signaling has been classified as canonical Wnt/ β-catenin dependent or non-canonical planar cell polarity (PCP) pathway. Misregulation of either pathway is linked mainly to cancer or neural tube defects (NTDs) respectively. Both pathwaysseem to antagonize each other. In this study, we investigate the role of Lrp6andANKRD6 as molecular switches between both Wnt pathways as well as CELSR1 as PCP member, in a novel ENU mouse mutant of Lrp6 (Skax26m1Jus) and in human NTDs. For Lrp6, we demonstrate that Skax26m1Jus represents a hypermorphic allele of Lrp6 with increased Wnt canonical and abolished PCP-induced JNK activities. We also show that Lrp6Skax26m1Jusgenetically interacts with a PCP mutant (Vangl2Lp) where double heterozygotes showed an increased frequency of NTDs and defects in cochlear hair cells’ polarity. Importantly, our study also demonstrates the association of rare and novel missense mutations in LRP6 that is an inhibitor rather than an activator of the PCP pathway with human NTDs. We show that three LRP6 mutations in NTDs led to a reduced Wnt canonical activity and enhanced PCP signaling. For ANKRD6: We identified four rare missense mutations in 0.8% of the NTD patients and 2 rare missense mutations in 1.3% of the controls. Notably, when all 6 mutations were validated, only two mutations identified in NTD patients, p.Pro548Leu, p.Arg632His, significantly altered DIVERSIN activity in Wnt signaling assays in a hypomorphic fashion. For CELSR1: We identified one nonsense mutation in exon 1 of CELSR1 that truncates the majority of the protein in one NTD patient and one in-frame 12 bp deletion that removes a putative PKC phosphorylation“SSR” motif in one caudal agenesis patient. We also detected a total of 13 novel missense variants in 12 patients (11 NTDs and 1 caudal agenesis) that were predicted to be pathogenic in silico. Our data confirm an inhibitory role of Lrp6 in PCP signaling in neurulation and indicate that rare missense mutations in LRP6 and ANKRD6 could affect a balanced reciprocal and a highly dosage sensitive antagonism between both Wnt pathways in neurulation and act as predisposing factors to NTDs in a subset of patients. Also, our findings implicate CELSR1 as a risk factor for NTDs or caudal agenesis. Our findings provide additional evidence for a pathogenic role of PCP signaling in thesemalformations and an important tool for better understanding their molecular mechanisms.

L’analyse des anomalies génomiques récurrentes est importante pour établir le diagnostic, le pronostic et pour orienter la thérapie des leucémies aiguës pédiatriques. L’objectif de notre étude est d’élaborer une stratégie optimale pour détecter les anomalies chromosomiques dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) et myéloïdes (LAM) des enfants. Pour ce faire, nous avons caractérisé au caryotype, avec des panels d’hybridation in situ en fluorescence (FISH), par RT-PCR et par l’index d’ADN 253 leucémies de novo reçues au CHU Sainte-Justine entre 2005 et 2011 (186 LAL-B, 27 LAL-T et 40 LAM). Nous avons réussi à optimiser la détection des anomalies chromosomiques dans les trois types de leucémies, avec des fréquences de 93,5% dans les LAL-B (174/186), 66,7% dans les LAL-T (18/27) et 90% dans les LAM (36/40). Nos résultats suggèrent d’utiliser plusieurs tests génétiques concomitants afin d’optimiser la détection des anomalies génomiques dans les LAL et les LAM de novo pédiatriques.
Analysis of recurrent genomic abnormalities is important for the diagnosis, prognosis and therapeutic choices in paediatric acute leukemia. The aim of our study is to establish a strategy optimizing the detection of cytogenetic abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML). To do so, we have characterized childhood AML and ALL cases received in cytogenetic laboratory of CHU Sainte-Justine (Montreal, Canada) between 2005 and 2011. Overall, 253 de novo cases have been analyzed (186 B-ALL, 27 T-ALL and 40 AML) by karyotyping, fluorescence in situ hybridization (FISH) panels, RT-PCR and DNA index. Chromosomal abnormalities detection rates achieved 93,5% in B-ALL (174/186), 66,7% in T-ALL (18/27) and 90% in AML (36/40). Our results suggest the analysis of both molecular and cytogenetic tests to optimize the detection of genomic abnormalities in new cases of childhood AML and ALL.