Tesis sobre el tema "Annexin A5"

La macroautofagia y la endocitosis son dos procesos catabólicos conservados evolutivamente en los que, mediante un tráfico vesicular, se degrada el material secuestrado, cuyo origen es intra- y extracelular, respectivamente. Ambos procesos comienzan de manera diferente: mediante la formación de un nuevo orgánulo, el autofagosoma, que secuestra material citoplásmico (macroautofagia), o mediante la internalización de material extracelular y de algunos componentes de la membrana plasmática a través de vesículas endocíticas (endocitosis). Sin embargo, los dos terminan en el mismo compartimiento: el lisosoma. En un análisis proteómico de membranas lisosomales, purificadas a partir de fibroblastos de ratón, identificamos tres proteínas, que se unen a fosfolípidos de una manera dependiente de calcio, y cuyos niveles en la membrana lisosomal aumentaban en ausencia de aminoácidos, una condición que activa la macroautofagia. Basándonos en esos resultados iniciales, y teniendo en cuenta que el calcio es un segundo mensajero muy importante, decidimos: en primer lugar, abordar el papel del calcio en la activación de la autofagia producida por el ayuno de aminoácidos, y, en segundo lugar, investigar el papel de esas tres proteínas en el mecanismo autofágico. Como resultado de estos estudios, describimos en primer lugar una nueva vía de señalización dependiente de calcio que activa la formación de autofagosomas por los aminoácidos. Concretamente, hemos encontrado que el ayuno de aminoácidos esenciales produce un aumento en el calcio citosólico, procedente tanto del medio extracelular como de almacenes intracelulares. Como consecuencia de esto, la calmodulina quinasa quinasa- ß activa a AMPK y a mTORC1. En la última etapa de esta vía, ULK1, una quinasa responsable de la iniciación de la autofagia, se activa para contribuir a la formación de los autofagosomas. Las tres proteínas identificadas en el estudio proteómico y cuyos niveles en las membranas lisosomales aumentan en ausencia de aminoácidos son la anexina A1, la anexina A5 y la copina 1. Empleando métodos bioquímicos y de inmunofluorescencia observamos que el ayuno de aminoácidos causa la translocación de la anexina A5 desde el complejo de Golgi hasta las membranas lisosomales, donde también se acumulan la anexina A1 y la copina 1. Asimismo, demostramos por sobre-expresión y silenciamiento de esas tres proteínas, que las tres inducen la fusión de autofagosomas con lisosomas y que la copina 1, y en menor medida la anexina A1, aumentan el efecto individual de la anexina A5. Finalmente, la anexina A5 inhibe la endocitosis mientras que copina 1 la induce. En resumen, nuestros resultados ponen de manifiesto que la activación de la formación de autofagosomas por el ayuno de aminoácidos es debida, al menos en parte, a una vía de señalización dependiente de Ca2+ y que esta condición también conlleva la aceleración de la maduración de los autofagosomas a autolisosomas a través de proteínas que unen el Ca2+ como las anexinas A1 y A5 y la copina 1.
Ghislat Cherfaoui, G. (2013). Regulation of Lysosomal Degradation by CA2+And CA2+-Binding Proteins [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/29690
TESIS

La membrane plasmique est un assemblage supramoléculaire qui délimite la cellule. C’est une structure fine, complexe et dynamique assurant des fonctions multiples et vitales pour la cellule. Sa rupture est un évènement physiologique pour les cellules soumises à des stress mécaniques fréquents et/ou importants, comme les cellules épithéliales, les cellules endothéliales ou les cellules musculaires. Dans des conditions physiopathologiques, la membrane plasmique peut également être endommagée par l’insertion de toxines bactériennes formant des pores (PFTs, pour « pore forming toxins »). Le processus de réparation membranaire et la machinerie protéique associée sont encore mal connus. Connaître les partenaires protéiques et comprendre les mécanismes mis en jeu durant le processus de réparation de la membrane plasmique sont deux enjeux fondamentaux majeurs. En effet, il a été établi qu’une défaillance du processus de réparation membranaire pour les fibres musculaires est la cause principale de certaines dystrophies musculaires. La machinerie protéique de réparation comprend des protéines comme la dysferline, la cavéoline-3 et certaines Annexines (Anx). Les Anx appartiennent à une superfamille de protéines répandue chez la plupart des eucaryotes, qui ont la propriété commune de se lier aux membranes biologiques en présence de calcium (Ca2+). Certaines Anx, comme l’AnxA5, une fois liées aux membranes biologiques s’auto-assemblent spontanément en réseau-2D. Lors de ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de l’AnxA5 dans la réparation membranaire des trophoblastes placentaires et des cellules du muscle squelettique humain. Pour les deux types cellulaires, nous avons montré que l’AnxA5 est un acteur indispensable du processus de réparation membranaire dans le cas de ruptures mécaniques. En associant des approches de microscopie de fluorescence et de microscopie électronique à transmission (MET), nous avons mis en évidence que dans ces cellules, le mécanisme de réparation est principalement basé sur la formation d’un « patch » lipidique. Dans les cellules musculaires, les expériences de MET ont mis en évidence qu’un pool d’AnxA5 endogène se lie aux bords du site de rupture quelques secondes après la lésion du sarcolemme. Ceci suggère qu’après rupture de la membrane plasmique, l’augmentation locale de la concentration calcique intracellulaire provoque la liaison de l’AnxA5 spécifiquement aux bords de la région membranaire lésée où elle forme un réseau-2D. Le réseau-2D stabiliserait localement la membrane et préviendrait sa déchirure, induite par les forces de tensions exercées par le cytosquelette cortical. Nous avons également montré que l’AnxA5 ne semble pas impliquée dans la réparation de la membrane plasmique après insertion de PFTs. Ceci suggère que différents mécanismes de réparation existent et que leur mise en place dépend probablement du type ou de l’importance des dommages. Finalement nous avons étendu notre étude à des lignées cellulaires établies à partir de patients diagnostiqués comme souffrant de dystrophies des ceintures de type 2B (déficience en dysferline) et 1C (déficience en cavéoline-3), respectivement. Nous avons montré, pour ces lignées, que la déficience en dysferline ou cavéoline-3 provoque un défaut de réparation dans le cas des ruptures mécaniques de la membrane plasmique. Dans ces cellules musculaires pathologiques intactes ou endommagées, l’AnxA5 a le même comportement, ce qui suggère que l’action de l’AnxA5 est indépendante de ces protéines. A la différence des cellules déficientes en dysferline, nous avons observé que les cellules déficientes en cavéoline-3 sont capables de réparer efficacement des lésions créées par l’insertion de PFTs dans le sarcolemme. Ce résultat supporte l’hypothèse de l’existence de plusieurs mécanismes de réparation. En conclusion, ce travail montre que l’AnxA5 est un composant clé de la machinerie de réparation dans le cas des ruptures mécaniques
Plasma membrane is the supramolecular assembly that delimits the cell. It is a thin, dynamic and complex structure, ensuring multiple and vital cell functions. Its disruption is a physiological event occurring in cells submitted to frequent mechanical stresses, such as endothelial cells, epithelial cells and muscle cells. It is also a physiological event for cells exposed to pore forming bacterial toxins (PFTs). Membrane repair mechanisms and associated protein machinery are still poorly understood. This knowledge is, however, essential for obvious physiopathological issues. Indeed, a defect of membrane repair in muscle cells leads to some muscular dystrophies. Membrane repair machinery includes proteins such as dysferlin, MG-53, caveolin-3 and some Annexins (Anx). Anx belong to a superfamily of proteins widely spread in most of eukaryotes, which share the property of binding to biological membranes in the presence of calcium (Ca2+). Here, we investigated the role of AnxA5 in cell membrane repair of human trophoblastic and skeletal muscle cells. We showed that AnxA5 is required for membrane repair of mechanical damages in the two cell types. By combining fluorescence and transmission electron microscopy approaches, we evidenced that membrane repair mechanism in these cells is based on the formation of a lipid “patch”. In human muscle cells, TEM experiments revealed that a pool of endogenous AnxA5 binds to the edges of the torn sarcolemma as soon as a few seconds after membrane disruption. Our results suggest the following mechanism: triggered by the local increase in Ca2+ concentration, AnxA5 molecules bind to PS exposed at the edges of the torn membrane, where they self-assemble into 2D arrays. The formation of 2D arrays strengthens the damaged sarcolemma, counteracts the tensions exerted by the cortical cytoskeleton and thus prevents the expansion of the tear. We showed also that a pool of endogenous AnxA5 binds to intracellular vesicles that obstruct the wounding site. It is likely these vesicles, once associated one to each other, ensure membrane resealing. Our results suggest that sarcolemma repair of damages caused by PFTs is independent of AnxA5. Therefore, different membrane repair mechanisms may exist, their occurrence probably depending on the type and/or the size of damages. Finally, we performed studies on muscle cells established from patients diagnosed with limb girdle muscular dystrophies type 2B (dysferlin-deficient) and 1C (caveolin-3-deficient), respectively. We found that dysferlin or caveolin-3 deficiency leads to a defect of membrane repair, in the case of mechanical damages. AnxA5 behaved similarly in these damaged cells and wild-type cells, suggesting that its function is independent of dysferlin or caveolin-3. Unlike dysferlin-deficient cells, damages created by PFTs are efficiently repaired in caveolin- 3-deficient cells. This result supports the hypothesis that different mechanisms occur in muscle cells, depending on the type of damage. In conclusion, this work indicates that AnxA5 is a key component of the membrane repair machinery, in the case of mechanical disruptions. Our results enable to propose a detailed mode of action for AnxA5

L’Annexine A5 (AnxA5) est une protéine soluble se liant aux membranes contenant de la phosphatidylsérine (PS) en présence de calcium (Ca2+). Le rôle central joué par l’AnxA5 dans les processus de réparation membranaire a été récemment mis en évidence. L’AnxA5 possède une très forte affinité pour les membranes biologiques contenant de la PS, cependant son mode de liaison aux membranes n’est pas encore élucidé.La première partie de mon travail de thèse a concerné le développement d’une approche originale d’étude de la liaison de l’AnxA5 à des microsphères de silice fonctionnalisées par une bicouche lipidique (µPSiO2@SLB pour supported lipid bilayer), par cytométrie en flux (FCM). Cette approche m’a permis d’étudier la liaison à l’équilibre et en cinétique à très faible concentration en AnxA5, de l’ordre du picomolaire. Cette approche représente une des méthodes les plus sensibles d’étude de liaison à l’équilibre et la première permettant d’accéder aux constantes cinétiques d’interaction pour l’AnxA5. Cette étude m’a également permis de mettre au point une stratégie de dosage indirect de liposomes contenant de la PS avec une sensibilité de l’ordre du nanogramme de lipides par millilitre.La seconde partie de ma thèse a concerné l’étude de microparticules (MP), fragments de membranes cellulaires présents dans les fluides biologiques. Dans le plasma sanguin la majorité des MP sont d’origine plaquettaire et exposent de la PS. Il existe une corrélation entre la concentration en MP plasmatiques exposant de la PS et le développement de pathologies thrombotiques. La FCM est la méthode de référence dans l’étude des MP cependant leur détection est rendue difficile par leur petite taille. J’ai appliqué aux MP plasmatiques le test de dosage développé pour les liposomes. Les résultats obtenus sont prometteurs et permettent d’envisager le développement d’un test de dosage de l’ensemble des MP exposant de la PS
Annexin-A5 (AnxA5) is a soluble membrane binding protein that binds to phosphatidylserine (PS) containing membranes in a calcium dependent manner and plays a central role in cell membrane repair processes. AnxA5 has a remarkably high affinity for PS containing membranes, but its binding mechanism remains unclear.The first part of my PhD work was to develop a new method for studying AnxA5 binding using supported lipid bilayer functionalized silica microspheres (µPSiO2@SLB) and Flow Cytometry (FCM). This approach allowed me to describe in details both equilibrium and kinetics of AnxA5 binding at picomolar concentrations in AnxA5. This study is one of the most sensitive for equilibrium binding studies and the first allowing to measure binding kinetics constants for AnxA5. This study also led to the development of a new strategy for determination of liposome concentration with sensitivity in the range of one nanogram of lipid per milliliter. The second part of my work focused on microparticles (MP) that are cell membrane fragments found in biological fluids. In plasma, the vast majority of MP originates from platelets and expresses PS at their surface. There is a correlation between MP concentration in plasma and thrombotic risk. FCM is the “golden standard” of hæmatologic analysis but the majority of MPs are too small to be detected. I have applied the test developed with liposomes for the quantification of MP. The results are promising and allow foreseeing the development of a test able to give the absolute quantity of PS exposing MPs in plasma samples

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral (LV), pertence ao grupo de endemias consideradas prioritárias no mundo. É uma doença grave e com poucas opções de tratamento e, mesmo quando adequadamente tratada, possui um nível de letalidade de 5 a 7%. Apesar da expansão da doença, o tratamento para leishmaniose visceral não obteve avanços. O tratamento da leishmaniose possui apenas dois grupos de medicamentos utilizados: os antimonoiais e os não-antimoniais. Os compostos nitroheterocíclicos foram utilizados pois acredita-se que a eficácia desta classe de compostos está na habilidade desses compostos inibirem a tripanotiona redutase. Os compostos foram obtidos por via sintética e refinados pelo método QSAR por remodelagem molecular. Foram obtidos séries de compostos nitroheterocíclicos, onde a série BSF (derivados 5-nitro-2-furfurilideno - azometínicos) foi utilizada para avaliar a bioatividade in vitro destes compostos frente à Leishmania. Para avaliação da atividade anti-Leishmania foram usadas formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum. Os métodos utilizados para determinar a atividade anti-Leishmania dos compostos da série BSF foram os métodos colorimétrico 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il] 2,5 brometo de difeniltetrazólio (MTT), apoptose por Anexina V e reação de Griess (dosagem de NO). Ao comparar os resultados com os respectivos controles positivos e com a Anfotericina B, foi observado que a atividade anti-Leishmania em formas promastigotas de L. L. infantum dos compostos foi menos significativa quando comparado com anfotericina B. Porém, ao comparar os resultados de macrófagos infectados e citotoxicidade com a anfotericina B, os compostos mostraram resultados expressivos, ao apresentarem baixa taxa de citotoxicidade e significativa diminuição da proliferação intracelular. A expressiva produção de nitrito pelos macrófagos infectados tratados com os compostos da série BSF sugere-se que estes compostos possuam uma ação indireta de potencialização de produção de NO nas células hospedeiras. Os resultados in vitro utilizando derivados nitroheterocíclicos mostraram atividade destes sobre formas promastigotas e amastigotas intracelulares, e são compostos em potencial para avaliação de efeito in vivo contra leishmaniose visceral
INTRODUCTION: Visceral leishmaniasis (VL) belongs to the group of endemics prioritized worldwide. It is a serious disease with few treatment options, and even when adequately treated, it has a lethality level of 5 to 7%. Despite the expansion of the disease, treatment for visceral leishmaniasis has not made progress. Treatment of leishmaniasis has used only two groups of drugs: antimonial and non-antimonial. Nitro-heterocyclic compounds were used in this study because it is believed that the effectiveness of this class of compounds is the ability to inhibit trypanothione reductase. The compounds were obtained synthetically and refined by QSAR method molecular remodeling. Nitro-heterocyclic series of compounds were obtained, where the BSF series (derived from 5-nitro-2-furfurylidene - azometínicos) was used to evaluate the in vitro bioactivity of these compounds against the Leishmania. To evaluate the anti-Leishmania activity, promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum were used. The methods used to determine the anti-Leishmania activity of the BSF series compounds were colorimetric methods 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), apoptosis by Annexin V, and Griess reaction (IN dosage). By comparing the results with the respective positive controls and with amphotericin B, it was observed that the anti-Leishmania activity of L. L. infantum promastigotes of the compounds was less significant when compared with amphotericin B. However, comparing the results of infected macrophages and cytotoxicity with amphotericin B, compounds showed significant results, presenting low cytotoxicity rate and significant decrease in intracellular proliferation. The significant nitrite production by infected macrophages treated with the BSF series compounds suggested that these compounds have an indirect potentiation action in the NO production in the host cells. In vitro results using nitro-heterocyclic derivatives showed their activity on these promastigotes and intracellular amastigotes, and presented them as potential compounds for in vivo effect evaluation against visceral leishmaniasis

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des vésicules membranaires de taille majoritairement submicrométrique présentes dans les fluides biologiques et émises par les cellules en réponse à divers stimuli. Les VEs sont impliquées dans de nombreux phénomènes physiologiques mais également dans des pathologies telles que cancers ou maladies cardiovasculaires. Elles pourraient donc être utilisées comme biomarqueurs de ces pathologies. Bien que les VEs soient aujourd’hui largement étudiées, nos connaissances sur le sujet demeurent limitées. Ceci est principalement dû aux difficultés de caractérisation des VEs et à l’absence de standardisation de leurs méthodes d’étude et d’isolation. La première partie de mon travail de thèse a porté sur le développement d’une méthode de thiolation de protéines. Des anticorps ont été modifiés pour exposer des thiols et ont été conjugués à des nanoparticules d’or fonctionnalisées par des maléimides. Le couplage des anticorps thiolés aux nanoparticules d’or a été étudié de manière quantitative et des conditions de conjugaison optimales ont été déterminées par des approches biochimiques. La seconde partie de ce travail a concerné la caractérisation des VEs du plasma sanguin de sujets sains par microscopie électronique à transmission (MET). La morphologie, la taille et le phénotype des VEs ont été déterminés par cryo- MET combinée au marquage par des nanoparticules d’or conjuguées à des protéines. La quantification objective des VEs du plasma sanguin a été réalisée à l’aide d’une méthode originale de MET basée sur la sédimentation de VEs sur grille de MET. La troisième partie de cette étude a consisté à mettre au point une méthode d’isolation de VEs à l’aide de particules magnétiques conjuguées à de l’AnxA5. Des conditions permettant d’extraire la totalité des VEs exposant la phosphatidylsérine contenues dans un plasma sanguin ont été déterminées par cytométrie en flux (CF). Ce travail a permis d’apporter une caractérisation détaillée des VEs du plasma sanguin du sujet sain et peut servir de référence pour des études ultérieures concernant les VEs contenues dans des plasmas ou autres liquides biologiques pathologiques
Extracellular vesicles (EVs) are submicrometric membrane vesicles found in body fluids and produced by cells in response to various stimuli. EVs are involved in numerous physiological processes but also in pathologies as cancers or cardiovascular diseases. Even if EVs are largely studied, our knowledge about them remains limited. This is mainly caused by the difficulties to characterize EVs and by the lack of standardized methods allowing their characterization. The first part of my PhD work focused on the development and optimization of a protein thiolation method. Antibodies modified to expose few thiols were conjugated to gold nanoparticles functionalized with maleimides. The binding of thiolated antibodies to gold nanoparticles was quantitatively studied and optimal conjugation conditions were determined using biochemical methods. The second part of my PhD work concerned the characterization of blood plasma EVs from healthy subjects using transmission electron microscopy (TEM). EVs morphology, size and phenotype were determined by cryo-TEM combined with labelling with protein-conjugated gold nanoparticles. The near-absolute quantification of blood plasma EVs was achieved using an original TEM method based on the direct sedimentation of EVs onto TEM grids. The third part of this study consisted in developing an EV isolation method using AnxA5-conjugated magnetic particles. Conditions allowing total extraction of blood plasma phosphatidylserine-exposing EVs were determined using flow cytometry (FC). This study presents a detailed characterization of blood plasma EVs from healthy subjects and can serve as a reference for future studies on EVs contained in pathological plasmas or other body fluids

Zweck der molekularen Bildgebung ist es, biologische Prozesse auf zellulärer und molekularer Ebene zu messen und zu charakterisieren, um so die Ursachen von Krankheiten und Veränderungen im Organismus zu diagnostizieren. Sie basiert auf dem Einsatz molekularer Bildgebungssonden, welche einen spezifischen biologischen Vorgang darstellen oder sich spezifisch in dem zu untersuchenden Gewebe anreichern oder aktiviert werden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Analyse neuer Bildgebungssonden für die spezifische in-vivo-Bildgebung der Apoptose und von Enzymaktivitäten mittels Magnetresonanztomographie (MRT) auf der Grundlage sehr kleiner Eisenoxidnanopartikel (very small iron oxide particles, VSOP). VSOP sind superparamagnetisch und durch ihre negativ geladene Citrathülle elektrostatisch stabilisiert. Für die Apoptose-Bildgebung sollte durch Bindung des Proteins Annexin A5 (AnxA5) an die Citrathülle der VSOP eine zielgerichtete Sonde hergestellt werden (AnxA5-VSOP). Für die Bildgebung von Enzymaktivitäten sollte eine durch die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) aktivierbare Sonde hergestellt werden (Protease-spezifische Eisenoxidpartikel, PSOP).
The goal of molecular imaging is to characterize and measure biological processes at cellular and molecular levels for the purpose of diagnosing the cause of diseases and molecular abnormalities. Molecular imaging is based on the use of probes with a high affinity to the target tissue and / or which are specifically activated. The aim of this study was to develop and analyze new molecular imaging probes for the in vivo imaging of apoptosis and enzyme activity using magnetic resonance imaging (MRI), based on very small iron oxide particles (VSOP). VSOP are superparamagnetic and electrostatically stabilized due to their negatively charged citrate surface. For the imaging of apoptosis the protein annexin A5 (AnxA5) was coupled to the citrate surface (AnxA5-VSOP). For the imaging of enzyme activities an activatable imaging probe with a cleavage site for the matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) was synthesized (protease-specific iron oxide particles, PSOP).

L'Annexine A5 (Anx5) est une protéine de la famille des annexines qui présente la propriété de s'organiser à la surface des bicouches lipidiques en trimères et en assemblages bidimensionnels (2D) de trimères. Ce travail de thèse concerne le développement d'applications biotechnologiques des assemblages 2D d'Anx5 ainsi qu'une étude des propriétés fonctionnelles de ces assemblages. Ces travaux ont été réalisés principalement à l'aide des méthodes de la microbalance à cristal de quartz avec mesure de dissipation (QCM-D) et de la microscopie à force atomique (AFM). La première partie de cette thèse concerne le développement de plates-formes d'ancrage basées sur des assemblages 2D de protéines dérivées de l'Anx5. Des complexes covalents entre l'Anx5 et des peptides d'adhésion cellulaire pour la réalisation de plates-formes d'ancrage de cellules. Des protéines de fusion entre l'Anx5 et un fragment de la protéine A ont d'autre part servi au développement de plates-formes 2D pour l'immobilisation contrôlée d'anticorps et de protéines. La seconde partie de cette thèse concerne l'étude des propriétés fonctionnelles des assemblages 2D d'Anx5. L'étude de l'interaction d'un anticorps anti-phospholipide avec les assemblages 2D d'Anx5 montre que cet anticorps ne perturbe pas l'organisation 2D de l'Anx5. La seconde étude concernant l'influence des assemblages 2D de l'Anx5 sur la dynamique des bicouches lipidiques établie une corrélation entre la formation de trimères et le ralentissement de la dynamique des membranes. Ces travaux contribuent à notre compréhension des propriétés des assemblages 2D d'Anx5 et permettent d'envisager le développement de biocapteurs pour cellules ou molécules.

Le cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) est un canal chlorure cAMPdependant dont la fonction peut-être régulée par des interactions protéine-protéines. Cependant, on connaît encore mal l’étendue et l’importance de ces intéractions. Sachant que I’ annexine A5 (anxA5) est surexprimée dans la mucoviscidose et que l’anxA5 et le CFTR partagent certaines propriétés, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle ces deux protéines interagissent physiquement et/ou fonctionnellement. Dans la première partie de cette thèse, nous montrons pour la première fois que l’anxA5 se lie au domaine NBD1 (nucleotide-binding domain 1) du CFTR et que cette interaction est renforcée en présence de Ca2+ et d’ATP. Nous montrons également que la diminution de l’expression de l’anxA5 est corrélée avec une diminution de la fonction du canal CFTR. Nous concluons donc que l’anxA5 est nécessaire au fonctionnement normal du CFTR. Dans une seconde partie, nos résultats indiquent que la surexpression de l’anxA5 permet de corriger partiellement le défaut d’expression du canal CFTR dans la membrane plasmique induit par la mutation ΔF508, la mutation la plus fréquente. De plus, nous montrons que l’augmentation de la concentration intracytosolique en Ca2+, induite par la thapsigargine, permet de potentialiser l’effet de I ‘anxA5. L’ensemble de ces résultats suggère que l’anxA5 peut être envisagée comme une cible thérapeutique potentielle
The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) functions as a cAMP-activated chloride channel which is regulated by protein-protein interactions. The extent to which CFTR is regulated by these interactions remains unknown. Annexin A5 (anxA5) is overexpressed in cystic fibrosis (CF) and given the functional properties of anxA5 and CFTR we considered whether they are associated and if so whether this has implications for CFTR function. In the first part of this thesis, we show for the first time that anxA5 is associated with nucleotide-binding domain 1 (NBD1) of CFTR and that this interaction is Ca2+ and ATP-dependent. The decreased anxA5 expression was correlated with a decreased CFTR chloride channel function. We concluded that anxA5 is necessary for normal CFTR chloride channel activity. In the second part of this thesis, our results indicated that the overexpression of anxA5 permitted to partially correct the ceIl surface expression defect of the misfolded ΔF508-CFTR, the most common mutation. Moreover, we show that the increase of intracytosolic Ca2+ concentration, induced by a thapsigargin treatment, allowed to increase the anxA5 effect. All these results suggest that anxA5 may be seen as a potential therapeutic target

Les annexines constituent une famille de protéines solubles, qui lient de façon réversible les membranes chargées négativement en présence de calcium. Les fonctions biologiques précises des annexines restent aujourd'hui encore à déterminer. De nombreuses études structurales ont permis de caractériser la structure modulaire de ces protéines, et notamment les sites multiples de liaison du calcium. En 1995, une étude par cristallographie des rayons X a permis de proposer un modèle d'interaction entre l'annexine A5 de rat, le calcium et la glycérophosphosérine, qui ne rend cependant pas compte de l'ensemble des propriétés biochimiques des annexines. Ce travail a pour objectif de compléter la description des interactions entre annexine A5 humaine et divers phospholipides. La stratégie employée se base sur la mutagenèse dirigée. Cette étude a nécessité la mesure par RMN des faibles affinités des différents sites calcium de la protéine en solution, et de déterminer l'influence des mutations réalisées sur ces affinités. Divers tests de liaison aux phospholipides ont permis de déterminer l'influence des mutations sur l'interaction entre la protéine et différents phospholipides. Ce travail a mis en évidence le rôle des quatre domaines de l'annexine A5 humaine dans le processus de liaison aux liposomes, ainsi que le rôle des trois sites calcium du domaine I dans la liaison et la capacité à mimer les ions calcium par la charge positive d'un résidu lysine. Nous avons proposé un nouveau site phospholipidique présent dans les domaines I ou les domaines II des annexines. Ce site est compatible avec le mode d'interaction décrit dans la littérature, ce qui permet de proposer un mode d'interaction entre un domaine d'annexine et plusieurs phospholipides simultanément. Enfin, nous avons exploré par RMN l'interaction entre le domaine I de l'annexine A5 et différents systèmes phospholipidiques pour établir les conditions favorables à l'étude du complexe annexine-calcium-phospholipides
Annexins are a family of soluble proteins, which bind in a calcium dependant manner negatively charged membranes. Biological functions of annexins still remain unclear. Numerous structural studies characterized the four homologous domains nature of these proteins, each domain harbours several calcium binding sites. In 1995, an X-ray crystallography study described an interaction involving rat annexin A5, calcium and glycerophosphoserine. However, this model lacks to describe the whole biochemical membrane binding properties of annexins. This work aims to go farther in description of the human annexin A5 -calcium - phospholipids interactions. The site directed mutagenesis method has been chosen for this study, a strategy to which has been associated a NMR approach in order to define the intrinsic affinity of calcium binding sites in solution, and to probe the influence of mutations on these affinities. Several phospholipid binding techniques have been used to probe the implication of crucial residues for membrane binding properties of human annexin A5. This work sheds light on the involvement of each domain of this protein in liposome binding, as well the involvement of the three calcium binding sites located in domain I for its membrane binding properties has been studied. The question of mimicking calcium ions needed for binding by positively charged lysine sidechains has also been addressed in this work. A new phospholipid binding site located in the first or in the second domain of annexins is described. This binding site is compatible with the interaction mode previously described and leads to a multisite binding model of the first domain of human annexin A5. Finally, several conditions have been explored to establish favourable conditions to obtain a NMR high resolution structure of the annexin - calcium -phospholipids complex

La présence intra-articulaire des cristaux de phopshate de calcium basique (PCB), qui regroupent des cristaux d'octacalcium de phosphate (OCP), l'apatite carbonatée, l'hydroxyapatite et le tricalcium de phosphate, est associée à des arthroses sévères, des arthroses érosives ou encore des arthropathies destructrices. Les mécanismes précis de destruction articulaire induite par les cristaux de PCB ne sont pas élucidés. Nous montrons, dans la première partie de ce travail, que les cristaux d'OCP induisent la production de la monoxyde d'azote (NO) synthétase inductible et la production du NO par les explants de cartilages articulaires bovins et des cultures primaires de chondrocytes articulaires. La production du NO est secondaire à une synthèse de novo et est indépendante de la voie de l'interleukine-1p. Elle dépend des voies des MAPK (mitogen-activated protein kinase) p38 et JNK (C-Jun N-terminal kinase) et du facteur de transcription AP-1 (Activator protein 1). Dans la deuxième partie, nous montrons que les trois types de cristaux de PCB stimulent l'apoptose des chondrocytes. Cette apoptose induite par les cristaux de PCB est indépendante du NO, nécessite une interaction physique cristal-cellule et est partiellement secondaire à leur endocytose et à une dissolution intra-lysosomale. L'effet apoptotique des cristaux de PCB est majoré par l'hyper-expression de l'annexine 5 (A5). L'expression de I'A5 est augmentée dans le cartilage arthrosique. L'A5 possède des sites de liaisons au calcium et nous montrons qu'elle peut effectivement se lier physiquement aux cristaux de PCB. Ce travail a permis de mettre en évidence, in vitro, de nouveaux mécanismes de destruction cartilagineuse qui pourraient participer à la pathogénie des arthropathies associées aux cristaux de PCB
Basic calcium phosphate (BCP) crystals including octacalcium phosphate (OCP), carbonate-substituted apatite, hydoxyapatite and tricalcium phosphate are associated with severe forms osteoarthritis (OA) and joint destruction. The mechanism of cartilage breakdown in BCP crystal-associated OA remains unclear. We show, in the first part of this work, that OCP crystals induce inducible nitric oxide (NO) synthase and NO production by bovine articular cartilage explants and isolated articular chondrocytes. NO production is independent of interleukin-1p pathway and is secondary to a novo synthesis. NO production involves p38 and JNK (C-Jun N-Terminal kinase) MAPK (mitogen-activated protein kinase) activation and the transcription factorAP-1 (Activator protein). In the second part, we show that the three type of BCP crystals induce articular chondrocyte apoptosis. BCP crystal-induced apoptosis is independent of NO production, requires crystal-cells interaction and is partly secondary to crystal endocytosis and intralysosomal crystal dissolution. The apoptosis effect BCP crystals is enhanced by annexin 5 (A5) over-expression. A5 expression is increased in OA cartilage a A5 possesses calcium binding sites. We show that A5 can actually binds to BCP crystals. These results highlight new pathophysiological mechanisms of cartilage destruction in the arthropathies related to BCP crystal deposition

L'insuffisance cardiaque (IC) se caractérise par une altération de la contraction du cardiomyocyte qui est en partie liée à une modification de l'activité des protéines du cycle calcique et de leurs facteurs régulateurs. Notre hypothèse est que l'annexine A5, qui forme des complexes membranaires en présence de Ca2+, qui est dans le sarcolemme des cardiomyocytes et qui est en partie relocalisée dans l'espace interstitiel au cours de l'IC, pourrait être un nouveau facteur régulateur de l'homéostasie calcique. Les objectifs de ma thèse étaient : 1) d'identifier les complexes engageant l'annexine A5 et de définir leurs évolutions au cours de l'IC humaine, et 2) de déterminer, in vitro, les effets de la surexpression adénovirale de l'annexine A5 sur la transitoire calcique de myocyte de lapin. Dans le cœur humain, l'annexine A5, l'échangeur Na+/Ca2+ (NCX qui assure l'efflux de Ca2+ et favorise la relaxation), et la cavéoline-3 forment un complexe membranaire dont la quantité est augmentée au cours de l'IC (co-immunoprécipitation). Cette association annexine A5/ NCX est dépendante de la présence de Ca2+ et a probablement lieu avec la boucle de régulation cytoplasmique du NCX (BIAcore). In vitro, la surexpression de l'annexine A5 entraine une augmentation de l'amplitude de contraction associée à une augmentation de l'amplitude du cycle calcique des myocytes. Elle augmente également l'activité du NCX (lonOptix). En conclusion, ces travaux montrent que l'annexine A5 est un facteur régulateur du cycle calcique qui augmente l'activité NCX et suggèrent qu'au cours de l'IC, le renforcement du complexe trimoléculaire pourrait participer à l'altération de l'homéostasie calcique.
Ca2+ handling proteins and their regulatory factors have been reported to be involved in impaired Ça cycling occurring during heart failure (HF). Our hypothesis was that annexin A5, a Ca2+-dependant membrane binding protein located in the cardiomyocyte sarcolemma and partly translocated to the interstitial space during HF, could be such a factor. The goals of my thesis were (i) to identify the Ca2+ handling proteins associated with annexin A5 and to define the regulations of these complexes in Human HF, and (ii) to détermine, in vitro, the physiological impact of annexin A5 overexpression in rabbit cardiomyocytes using adenoviral transfection. In control hearts, immunoprecipitation assays showed that annexin A5, NaVCa2+ exchanger (NCX, which extrudes the cytosolic Ca2+ to facilitate relaxation) and caveolin-3 (a constituent of caveolae) formed a trimolecular complex. In HF, the trimolecular complex was significantly increased. Surface plasmon resonance experiments (BIAcore) showed that the annexin A5/ NCX association was Ca2+-dependant and likely occurred with the cytoplasmic regulatory loop of NCX. Finally, in vitro overexpression of annexin A5 in rabbit cardiomyocytes induced an increase in cell shortening and Ca2+ transient amplitudes. Moreover, using caffeine assays, we observed an increase in NCX activity in the annexin A5 transfected cells. In conclusion, our results showed that annexin A5: 1) is a new regulatory factor for Ca2+ handling proteins and 2) increase NCX activity and suggested that, in HF, the increase in the trimolecular complex could participate in the alteration of Ca2+ homeostasis

L'Annexine A5 (Anx5) est une protéine de la famille des annexines qui présente la propriété de s'organiser à la surface des bicouches lipidiques en trimères et en assemblages bidimensionnels (2D) de trimères. Ce travail de thèse concerne le développement d'applications biotechnologiques des assemblages 2D d'Anx5 ainsi qu'une étude des propriétés fonctionnelles de ces assemblages. Ces travaux ont été réalisés principalement à l'aide des méthodes de la microbalance à cristal de quartz avec mesure de dissipation (QCM-D) et de la microscopie à force atomique (AFM).
La première partie de cette thèse concerne le développement de plates-formes d'ancrage basées sur des assemblages 2D de protéines dérivées de l'Anx5. Des complexes covalents entre l'Anx5 et des peptides d'adhésion cellulaire pour la réalisation de plates-formes d'ancrage de cellules. Des protéines de fusion entre l'Anx5 et un fragment de la protéine A ont d'autre part servi au développement de plates-formes 2D pour l'immobilisation contrôlée d'anticorps et de protéines.
La seconde partie de cette thèse concerne l'étude des propriétés fonctionnelles des assemblages 2D d'Anx5. L'étude de l'interaction d'un anticorps anti-phospholipide avec les assemblages 2D d'Anx5 montre que cet anticorps ne perturbe pas l'organisation 2D de l'Anx5. La seconde étude concernant l'influence des assemblages 2D de l'Anx5 sur la dynamique des bicouches lipidiques établie une corrélation entre la formation de trimères et le ralentissement de la dynamique des membranes.
Ces travaux contribuent à notre compréhension des propriétés des assemblages 2D d'Anx5 et permettent d'envisager le développement de biocapteurs pour cellules ou molécules.

L'annexine A5, protéine endogène de 35kDa, présente une forte affinité pour la phosphatidysérine (PS) exprimée par la surface des cellules apoptotiques et des plaquettes activées. L'annexine A5 radiomarquée au Tc-99m (99mTc-ANX5) a été développée par Strauss (Stanford, USA) comme traceur d'apoptose : apoptose tumorale induite par chimio-radiothérapie, lésions d'ischémie/reperfusion chez l'animal et chez l'homme, rejet de greffons. Par ailleurs, de nombreuses données in vitro suggèrent que l'annexine A5 marque également la nécrose (rupture de la membrane plasmique), qui survient à un stade plus ou moins tardif de tout processus de mort cellulaire. Ce travail s'inscrit dans un objectif global d'évaluer les possibilités de développement de l'imagerie scintigraphie à l'annexine A5 radiomarquée comme outil clinique en pathologie cardiovasculaire. Quatre études réalisées dans les modèles (rat) d'infarctus du myocarde par ligature coronaire ou ischémie-reperfusion, de myocardites subaiguë et toxique aiguë à l'isuprel, montrent que l'99mTc-ANX5 présente une grande sensibilité de détection in vivo de la mort myocutaire par apoptose ou nécrose, massive aiguë confluente (infarctus), ou progressive et non confluente (myocardites). Une autre étude rapporte les performances de l'99mTc-ANX5 pour l'imagerie in vivo de l'activité biologique du thrombus dans un modèle d'anévrysme de l'aorte abdominale (rat). Les résultats de ces travaux permettents d'envisager l'utilisation clinique de l'imagerie à l'ANX5 dans les myocardites aiguës et surtout diverses pathologies vasculaires à composante thrombotique
Annexin A5, a 35KDa protein, specifically binds with high affinity to phosphatidylsérine (PS) which is activally redistributed to the external leaflet of plasmic membrane in apoptotic cells and activated platelets. Annexin A5 radiolabelled with Tc-99m (99mTc-ANX5) was developped by Strauss (Stanford, USA) to image apoptosis in vivo : tumour cells apoptosis induced by chemo-radiotherapy, ischemia/reperfusion lesions in animals and patients, graft rejection. Additionally, many in vitro data suggest that annexin A5 also stains necrosis (membrane disruption), which occurs in all types of cell death. This preclinical work aimed to evaluate the potential interest of 99mTc-ANX5 imaging as a clinical tool in cardiovascular diseases. Four studies performed in rat models of myocardial infarction by coronary ligation ans ischemia-reperfusion, and in rat models of subacute and acute (isoproterenol-induced) myocarditis show the ability of 99mTc-ANX5 to detect in vivo cardiomyocytes death by apoptosis and necrosis. Another study demonstrates that 99mTc-ANX5 is highly accurate to evaluate in vivo the biological activity of parietal thrombus in a rat model of elastase-induced abdominal aortic aneurysm. These results suggest that 99mTc-ANX5 imaging could be used in patients for non invasive diagnosis, pronostic evaluation in acute myocarditis and in various thrombotic cardiovascular diseases

Trabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de Medicina
Background: Pregnancy alters the hemostatic system into a physiological state of hypercoagulability, which can predispose to adverse pregnancy outcomes (APO), namely recurrent pregnancy loss (RPL), gestational hypertension (GH), pre-eclampsia (PE), intrauterine growth restriction (IUGR), small-for gestational age and venous thromboembolism. Inherited risk factors for thrombophilia have been largely explored as a cause of these APO. Recently a new hereditary risk factor for APO was identified, a sequence variation in the promoter region of the gene encoding annexin A5 (ANXA5), called the M2 haplotype. Therefore, we intend to evaluate the frequency of the M2 haplotype in a Portuguese women population sample with a previous history of APO and to assess the association between the M2 haplotype and the risk of APO.Materials and Methods: A retrospective case-control study was conducted with a case group of 102 Portuguese women with history of unexplained APO including RPL, early miscarriage, IUFD, IUGR, PE, eclampsia and hemolysis, elevated liver enzymes and low platelets (HELLP) syndrome. This group was compared with a control group of Portuguese women without history of APO (n=84), and two independent control groups, previously recruited in similar studies: the Münster controls (n=500) and the PopGen controls (n=533). The ANXA5 gene promoter region was genotyped by PCR/Sanger sequencing for the presence of the M1 and M2 haplotypes. GraphPad software was used to determine the allelic frequencies, concordance with Hardy-Weinberg equilibrium and the association between the ANXA5 haplotypes and APO through the Fisher's exact test, estimating OR with 95% confidence intervals (95% CI) and p-values. Results: The M2 haplotype was found in 31.4% of women with APO (allele frequency 0.167) and in 15.5% of the Portuguese controls (allele frequency 0.083). Carriers of the M2 haplotype were found to exhibit a relative risk of APO 1.32 higher than non-carriers (OR 2.15, 95% CI 1.13-4.30; p=0.0280), when compared to the Portuguese controls, a 1.74 higher risk when compared to the PopGen controls (OR 2.04, 95% CI 1.32-3.10; p<0.0015) and a 2.36 higher risk in comparison to the Münster controls (OR 3.27, 95% CI 2.06-5.15; p<0.0001). The M1 haplotype was not significantly associated with the risk of APO.Conclusion: The obtained results suggest that the M2 haplotype may be a relevant risk factor for APO in this Portuguese women population sample. Thus, genotyping ANXA5 gene for the M2 haplotype status seems to be a well oriented approach in the prognosis of women with unexplained APO and may guide adequate preventive therapeutic measures.
Introdução: A gravidez induz um estado de hipercoaguabilidade fisiológica que pode predispor a complicações na gravidez, nomeadamente aborto recorrente (AR), hipertensão gestacional, pré-eclâmpsia (PE), restrição de crescimento intrauterino (RCIU), recém-nascido pequeno para a idade gestacional e tromboembolismo venoso. Os fatores de risco hereditários para trombofilia têm sido identificados como possíveis causas e extensamente investigados. Recentemente, foi identificado um novo fator de risco hereditário para estas complicações, uma variação na sequência da região promotora do gene que codifica a Anexina A5 (ANXA5), denominado haplótipo M2. Assim, este estudo pretende avaliar a frequência do haplótipo M2 numa amostra populacional de mulheres portuguesas e averiguar a sua associação com o risco de ocorrência de complicações na gravidez. Metodologia: Realizou-se um estudo retrospetivo caso-controlo com 102 casos de mulheres portuguesas com antecedentes de complicações na gravidez, incluindo AR, aborto precoce, morte fetal in útero, RCIU, PE, eclâmpsia e síndrome HELLP (hemolysis, elevated liver enzymes and low platelets). Este grupo foi comparado com um grupo controlo de mulheres portuguesas sem história de complicações na gravidez (n=84), e com dois grupos controlo independentes, previamente usados em estudos semelhantes: os Münster controls (n=500) e os PopGen controls (n=533). A região promotora do gene da ANXA5 foi genotipada para a presença dos haplótipos M1 e M2 por PCR/sequenciação de Sanger. Foram estimadas as frequências alélicas, avaliada a conformidade com o equilíbrio Hardy-Weinberg e testada a associação entre os haplótipos da ANXA5 e a ocorrência de complicações na gravidez utilizando o teste exato de Fisher, cálculo do OR (odds ratio), intervalos de confiança (IC) de 95% e valores de p, recorrendo ao software Graphpad. Resultados: O haplótipo M2 estava presente em 31,4% das mulheres com complicações na gravidez (frequência alélica 0,167) e em 15.5% dos controlos portugueses (frequência alélica 0,083). As portadoras do haplótipo M2 apresentavam um risco relativo de ocorrência de complicações na gravidez 1,32 vezes superior ao das não portadoras (OR 2,15, 95% CI 1,13-4,30; p=0,0280), quando comparadas com os controlos portugueses, um risco relativo 1.74 vezes superior quando comparadas com os PopGen controls (OR 2,04, 95% CI 1,32-3,10; p<0,0015), e um risco relativo 2,36 vezes superior em comparação com os Münster controls (OR 3,27, 95% CI 2,06-5,15; p<0,0001). O haplótipo M1 não estava significativamente associado ao risco de ter complicações na gravidez.Conclusão: Os resultados obtidos sugerem que o haplótipo M2 pode ser um fator de risco relevante para o desenvolvimento de complicações na gravidez nesta amostra populacional de mulheres portuguesas. Assim, a genotipagem do gene da ANXA5 para a presença do haplótipo M2, parece ser um procedimento prognóstico adequado em mulheres com complicações na gravidez de causa desconhecida, podendo auxiliar a estabelecer medidas terapêuticas preventivas.