Tesis: "ADN Ligase"

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Touzé, Elodie Giegé Richard. "Cristallogenèse et études structurales appliquées aux aminoacyl-ARNt synthétases". Strasbourg : Université Louis Pasteur, 2008. http://eprints-scd-ulp.u-strasbg.fr:8080/911/01/TOUZE_Elodie_2007.pdf.

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Menchon, Grégory. "Criblage virtuel et fonctionnel sur le complexe XRCC4/ADN ligase IV/Cer-XLF de ligature des cassures double-brin de l'ADN : application en radiosensibilisation tumorale". Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30395.

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Resumen

En cancérologie, la radiothérapie est une des armes essentielles pour éradiquer les cellules tumorales. Les cassures des deux brins de l'ADN dites "double-brin" qu'elle induit sont particulièrement toxiques et constituent la principale cause de mort cellulaire. La NHEJ (Jonction d'Extrémités Non-Homologues) est la voie métabolique majeure de réparation de ces cassures double-brin de l'ADN et par ce mécanisme, les cellules humaines adoptent une résistance à la radiothérapie. Ce mécanisme de réparation constitue donc une cible de choix pour un traitement anticancéreux combiné en vue d'augmenter la sensibilité des cellules cancéreuses aux rayons ionisants (radiosensibilisation). Au cours du mécanisme NHEJ, la ligature finale des extrémités d'ADN est assurée par le complexe protéique tripartite: XRCC4/ADN Ligase IV/Cernunnos-XLF. Les interfaces protéiques concernées représentent toutes des cibles potentielles dans une stratégie rationnelle d'isolement de molécules inhibitrices, guidée par les structures tridimensionnelles de chaque protéine. A travers des expériences de criblage virtuel et de validation à la fois biophysique et biochimique, nous avons isolé les premières molécules capable de prévenir in vitro les interactions protéine-protéine pour les complexes XRCC4/Lig4 et XRCC4/Cer-XLF, respectivement. Ces composés sont des points de départ pour l'élaboration d'inhibiteurs potentiels de plus haute affinité grâce à l'apport de la biologie structurale, en vue d'un effet radiosensibilisant cellulaire
Radiotherapy is a major weapon used against cancer. Radio-induced DNA double strand breaks (DSB) are the main lesions responsible for cell death. Non-homologous end-joining (NHEJ) is a predominant DSB repair mechanism which contributes to cancer cells resistance to radiotherapy. NHEJ is thus a good target for strategies which aim at increasing the radio-sensitivity of tumors. Through in silico screening and biophysical and biochemical assays, our objective was to find specific ligands for the XRCC4/Lig4 and XRCC4/Cer-XLF protein-protein interactions involved in NHEJ. Here, we isolated the first compounds able to prevent their interaction in vitro. These early stage inhibitors are promising tools for cancer therapy with the hope to develop more specific compounds for cellular assays through the 3D structure of the protein/inhibitor complexes

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De, Melo Abinadabe Jackson. "Molecular basis for the structural role of human DNA ligase IV". Thesis, Aix-Marseille, 2016. http://www.theses.fr/2016AIXM4040.

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Resumen

Les défauts dans la réparation des cassures double-brin de l'ADN (DSBs) peuvent avoir d'importantes conséquences pouvant entrainer une instabilité génomique et conduire à la mort cellulaire ou au développement de cancers. Dans la plupart des cellules mammifères, le mécanisme de Jonction des Extrémités Non Homologues (NHEJ) est le principal mécanisme de réparation des DSBs. L'ADN Ligase IV (LigIV) est une protéine unique dans sa capacité à promouvoir la NHEJ classique. Elle s'associe avec deux autres protéines structuralement similaires, XRCC4 et XLF (ou Cernunnos). LigIV interagit directement avec XRCC4 pour former un complexe stable, tandis que l'interaction entre XLF et ce complexe est médiée par XRCC4. XLF stimule fortement l'activité de ligation du complexe LigIV/XRCC4 par un mécanisme encore indéterminé. Récemment, un rôle structurel non catalytique a été attribué à LigIV (Cottarel et al., 2013). Dans le travail de thèse présenté ici, nous avons reconstitué l'étape de ligation de la NHEJ en utilisant des protéines recombinantes produites dans des bactéries afin d’une part, d'explorer les bases moléculaires du rôle structural de LigIV, d’autre part de comprendre le mécanisme par lequel XLF stimule le complexe de ligation, et enfin de mieux comprendre comment ces trois protéines coopèrent au cours de la NHEJ. Nos analyses biochimiques suggèrent que XLF via son interaction avec XRCC4 lié à LigIV, pourrait induire un changement conformationnel dans la LigIV. Ce réarrangement de la ligase exposerait son interface de liaison à l'ADN ce qui lui permettrait alors de ponter deux molécules indépendantes d'ADN, une capacité indépendante de l'activité catalytique de LigIV
Failure to repair DNA double-strand breaks (DSBs) may have deleterious consequences inducing genomic instability and even cell death. In most mammalian cells, Non-Homologous End Joining (NHEJ) is a prominent DSB repair pathway. DNA ligase IV (LigIV) is unique in its ability to promote classical NHEJ. It associates with two structurally related proteins called XRCC4 and XLF (aka Cernunnos). LigIV directly interacts with XRCC4 forming a stable complex while the XLF interaction with this complex is mediated by XRCC4. XLF strongly stimulates the ligation activity of the LigIV/XRCC4 complex by an unknown mechanism. Recently, a structural noncatalytic role of LigIV has been uncovered (Cottarel et al., 2013). Here, we have reconstituted the end joining ligation step using recombinant proteins produced in bacteria to explore not only the molecular basis for the structural role of LigIV, but also to understand the mechanism by which XLF stimulates the ligation complex, and how these three proteins work together during NHEJ. Our biochemical analysis suggests that XLF, through interactions with LigIV/XRCC4 complex, could induce a conformational change in LigIV. Rearrangement of the LigIV would expose its DNA binding interface that is able to bridge two independent DNA molecules. This bridging ability is fully independent of LigIV’s catalytic activity. We have mutated this interface in order to attempt to disrupt the newly identified DNA bridging ability. In vitro analysis of this LigIV mutant will be presented as well as a preliminary in vivo analysis

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Wu, Pei-Yu. "Le complexe de ligation dans la réaction de réparation des cassures de l'ADN par recombination non homologué". Toulouse 3, 2008. http://www.theses.fr/2008TOU30064.

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Les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont produites lors d'événements physiologiques ou physiopathologiques comme la recombinaison V(D)J, le blocage de fourches de replication, ou bien induites par des agents physiques ou chimiques à activité clastogène. Les CDB représentent une lésion hautement toxique et sont réparées par recombinaison homologue ou par recombinaison non-homologue (NHEJ). Chez les mammifères, la voie NHEJ représente le processus majoritaire de réparation responsable de la survie cellulaire après endommagement de l'ADN. Suite à la production de CDB, par exemple par des rayonnements ionisants (RI), l'he��térodimère Ku70/80 se lie aux extrémités de la cassure et recrute la sous-unité catalytique DNA-PKcs. Ce Complexe-1 ou DNA-PK (i. E Ku70/Ku80/DNA-PKcs) forme une synapse qui maintient rapprochées les extrémités de la cassure, acquiert une activité sérine-thréonine kinase qui par auto-phosphorylation de la DNA-PKcs induit un changement de conformation favorisant le recrutement du 2ème complexe impliqué dans la ligation des extrémités. Ce Complexe-2 est un hétérotrimère composé de XRCC4, Ligase IV et Cernnunos-XLF. Ce travail a eu pour objectif de mieux comprendre les interactions internes et externes des partenaires du Complexe-2. Nous avons établi le domaine minimal d'interaction fonctionnelle de la Ligase IV (XIR-BRCT2) avec XRCC4 et montré que son expression cellulaire induit une sensibilisation au RI et autres agents clastogènes. Le mécanisme de sensibilisation repose sur un déplacement de la Ligase IV du Complexe-2 suivie de sa dégradation aboutissant à une perte de recrutement stable du complexe sur la chromatine endommagée. .
DNA double-strand breaks (DSBs) are the most lethal threats among all the DNA damages in cells. They can arise not only endogenously from normal physiological processes such as V(D)J recombination or toxic lesions like DNA replication forks collapses, but also exogenously from DNA damaging agents like ionizing radiation (IR) or radiomimetic compounds. In mammals, DSBs are mainly repaired by homologous recombination (HR) during S and G2 phases of the cell cycle when sister chromatids are available, and, more predominantly, in all the phases of cell cycle by the non-homologous end-joining (NHEJ) pathway without any requirement for homology guidance. The NHEJ machinery is also involved in V(D)J recombination to rearrange B-cell immunoglobulin and T-cell receptor genes. Deficiency in NHEJ consequently results in hypersensitivity to IR, immunodeficiency, as well as chromosomal instability. After DSBs induction, Ku70/Ku80 heterodimer binds to free DNA ends, allowing the subsequent recruitment and activation of the DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs). The resulting DNA-PK holoenzyme (i. E. Ku/DNA-PKcs or Complex-1) tethers two DNA termini and form the synaptic complex that may further activates DNA-PKcs by several (auto)phosphorylation events. Upon activation, Complex-1 undergoes conformational changes to accommodate the ligation complex (Complex-2) and accessory factors that make DNA ends compatible with ligation, when necessary. Complex-2 comprises XRCC4, DNA LigIV (LigIV) and the more recently identified factor Cernunnos-XLF (Cer-XLF). The three partners interact with each other and Complex-2 also binds Complex-1 and accessory factors, thus accounting for its highly efficient end-joining activity. In this work we aimed at characterizing the intimate interaction network between Complex-2 factors. .

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Nassar, Joelle. "Caractérisation de la fonction de OBI1, une E3 ubiquitine ligase, dans la réplication de l'ADN". Thesis, Montpellier, 2019. http://www.theses.fr/2019MONTT039.

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Resumen

La division cellulaire est l’un des processus cellulaires les plus complexes. Pour que cette division se déroule correctement, la cellule doit répliquer de manière fiable l’intégralité de son génome. Durant ce processus, la réplication de l’ADN est initiée a des sites prédéfinis du génome, appelés « origines de réplication ». Vu qu’un dysfonctionnement de l'activité des origines est lié à plusieurs pathologies humaines, leur activation doit être hautement régulée. Plusieurs protéines ont été trouvées aux origines de la réplication, mais aucune n’explique comment ces origines sont reconnues et sélectionnées pour l’activation. Notre groupe de recherche vise à comprendre comment les origines de réplication sont régulées dans les cellules de métazoaires. Dans ce but, une approche protéomique a été réalisée pour définir l'interactome des origines de réplication humaine, dans l’objectif d'identifier de nouveaux facteurs qui pourraient être impliqués dans la régulation des origines. À l'aide de cette approche, une nouvelle ubiquitine ligase, nommée OBI1 (ORC-ubiquitine-ligase-1), a été identifiée avant mon arrivée au laboratoire. OBI1 se lie au complexe de reconnaissance des origines (complexe ORC) et mon projet vise à mieux caractériser le rôle de cette nouvelle protéine dans la réplication de l'ADN. Notre stratégie expérimentale est basée sur deux modèles différents: un modèle in vivo de cellules humaines en culture et un système de réplication de l'ADN in vitro dérivé d'œufs de Xénope.Nos analyses sur des cellules humaines ont d’abord révélé qu’OBI1 était crucial pour la prolifération cellulaire. Cette observation a été ensuite attribuée à son rôle dans la réplication de l’ADN et plus précisément dans l’activation des origines de réplication. En effet, la déplétion d’OBI1 a montré une diminution de recrutement à la chromatine de facteurs impliqués dans l’activation des origines. De plus, une analyse fonctionnelle a montré qu'OBI1 multiubiquitine ORC3 et ORC5, deux sous-unités du complexe ORC. Cette ubiquitination a été ensuite liée au rôle d’OBI1 dans l’activation des origines de réplication, après que la surexpression des mutants ORC3 / 5 non-ubiquitinables ait donné des résultats similaires à ceux observés lors de la déplétion d’OBI1. Dans l’ensemble, nos résultats ont démontré qu’OBI1 est une protéine essentielle à l’activation des origines et nous ont permis de mettre en place une hypothèse suggérant qu’en ubiquitinant ORC3/5, OBI1 pourrait jouer un rôle dans la sélection des origines destinées à l’activation, parmi toutes les origines définies antérieurement. Après cette étude, maintenant publiée, nous avons voulu aborder le rôle de la multiubiquitination des ORC dans l’activation des origines. Nos expériences préliminaires suggèrent un rôle de l'histone acétyl-transférase (HAT) GCN5 / KAT2A.Dans la deuxième partie de mon projet, nous avons utilisé le système in vitro, basé sur des extraits d'œufs de xénope, pour étudier le rôle de l'OBI1 et de l'ubiquitination dans l'activation des origines de réplication. Nos analyses ont confirmé la conservation d’OBI1 chez Xenopus Laevis et son recrutement a la chromatine lors de la réplication. Nous avons montré que l'ubiquitination se produit sur la chromatine lors de l'activation de l'origine. De plus, en utilisant des inhibiteurs de E1, nous avons constaté que l’ubiquitination est importante pour l’activation des origines. De façon intéressante, la déplétion de OBI1 dans ce système embryonnaire a suggéré un rôle diffèrent d’OBI1 dans l’activation des origines dans le système embryonnaire comparé aux conditions plus somatiques.Finalement, la découverte de ce nouveau facteur d'initiation a fourni des informations essentielles sur le rôle de l'ubiquitination et d’OBI1 dans l'activation et la sélection des origines de réplication. Une telle sélection pourrait également participer à la régulation du « timing » de la réplication de l'ADN
Cell division is one of the most complex processes a cell undergoes. For this to happen properly, the genetic material stored in a cell must be faithfully copied or replicated. During this process, DNA replication is initiated at pre-defined sites in the genome, called "origins of replication". The activation of these origins is highly regulated, as a dysfunction in origin activity is linked to several human pathologies. Several proteins have been found at replication origins, but none of them explain how to be activated origins are recognized and selected. Our research group aims to understand how DNA replication origins are regulated in metazoan cells, to this aim, a proteomic approach was performed to define the interactome of human replication origins. Our goal was to identify new factors that could be involved in replication origin regulation. Using this methodology, a novel E3 ubiquitin ligase, named OBI1 (for ORC-ubiquitin-ligase-1), was identified prior to my arrival in the laboratory. OBI1 binds the origin recognition complex (ORC complex) and my project aimed at further characterizing the role of this new protein in DNA replication. Our experimental strategy used two different model systems: an in-vivo model based on human cells in culture, and an in-vitro DNA replication system derived from Xenopus eggs.Our analyses in human cells revealed that OBI1 was a crucial gene involved in cellular proliferation, this observation was later attributed to OBI1’s role in DNA replication and more specifically, to replication origin activation. Indeed, OBI1 knockdown resulted in a deficient origin firing and a decrease in the chromatin recruitment of factors involved in origin firing. A further functional analysis showed that OBI1 multiubiquitylates two subunits of the ORC complex, ORC3 and ORC5. This ubiquitylation was directly linked to OBI1’s role in origin firing, after the over-expression of non-ubiquitylable ORC3/5 mutants yielded similar results to OBI1’s knock down. Altogether, our results demonstrated that OBI1 encoded for a protein essential for origin activation, and allowed us to propose its main role: by multiubiquitylating a subset of the ORC complex, OBI1 could select the replication origins to be activated amongst all the potential replication origins set in G1 phase of the cell cycle. After this set of experiments, now published, we wanted to address the mechanistic impact of the multiubiquitylation of ORC on origin activation. Our preliminary experiments suggest a role of the histone acetyl-transferase (HAT) GCN5/KAT2A in the “OBI1 pathway”In the second part of my project, we used the in vitro DNA replication system, based on Xenopus laevis egg extracts, to study the role of OBI1 and ubiquitylation in origin activation. Our in-vitro analyses confirmed the conservation of OBI1 in Xenopus Laevis and its recruitment to the chromatin during DNA replication. We showed that de novo ubiquitylation takes place on chromatin during origin activation. Moreover, using E1 inhibitors, we found that active ubiquitylation is important for efficient origin firing. Interestingly, our loss of function experiments suggested that OBI1’s impact on origin activation could defer in early development when compared to somatic-like conditions.Taken together, the discovery of this new replication initiation factor provided key information on the role of ubiquitylation in general and OBI1 in particular on origin activation and selection. Such selection could participate as well in the regulation of the timing of DNA replication

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Amram, Jérémy. "Etude structurale et fonctionnelle des complexes multi-protéiques de la voie de réparation NHEJ chez l’homme". Thesis, Paris 11, 2015. http://www.theses.fr/2015PA114822/document.

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La voie de réparation NHEJ (Non-Homologous End-Joining) est une voie majeure de réparation des cassures double-brin chez l’homme. Les protéines de cette voie interagissent et forment des complexes dynamiques dont les mécanismes moléculaires sont encore largement méconnus. Nous avons dans un premier temps mis au point des protocoles de production à l’échelle de plusieurs milligrammes des protéines cœur de la voie NHEJ en cellules d’insecte à l’aide du système MultiBac. Nous avons ainsi purifié les complexes Ku70/Ku80 et Ligase4/XRCC4 et les protéines Cernunnos et Artemis à homogénéité. Des essais de cristallisation, des études par SAXS et des analyses par microscopie électronique ont été réalisés sur différents complexes formés par ces protéines cœur du NHEJ. Nous avons également caractérisé par chromatographie d’exclusion de taille et calorimétrie, les interactions effectuées entre les protéines de la voie NHEJ. L’ensemble de ces travaux a permis d’établir des bases biochimiques solides en vue des études structurales et fonctionnelles de la voie NHEJ chez l’homme
Human DNA repair pathway NHEJ (Non-Homologous End-Joining) is a major pathway of double-strand breaks repair. The proteins involved in this pathway interact and form dynamic complexes whose molecular mechanisms are largely unknown. Firstly, we established protocols to be able to purify milligrams of those NHEJ pathway core proteins using MultiBac insect cells system. We then purified Ku70/Ku80 and Ligase4/XRCC4 complexes, Artemis and Cernunnos to homogeneity. Crystallogenesis assays, SAXS experiments and Transmission Electronic Microscopy experiments have been performed on several complexes formed by these core NHEJ proteins. We also characterized the interactions between these proteins by Size Exclusion Chromatography and Isothermal Calorimetry. These experiments have led to biochemical results sufficient to establish a solid basis to initiate the structural and functional study of the Human NHEJ Pathway

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Aoufouchi, Said. "Adn ligases chez les eucaryotes superieurs". Rennes 1, 1992. http://www.theses.fr/1992REN10016.

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L'adn ligase i humaine est une proteine de 130 kda, tres sensible aux phenomenes de proteolyse et genere plusieurs produits de degradation qui conservent une activite adn ligase. Des difficultes d'ordre quantitatifs et qualitatifs, nous ont amene a changer le modele experimental pour purifier cette enzyme. Notre choix s'est porte sur l'uf de l'amphibien xenopus laevis du fait de sa grande disponibilite, et sa richesse en enzymes liees a la replication de l'adn. L'adn ligase i du xenope est une proteine 180 kda egalement sujette aux phenomenes de proteolyses qui generent majoritairement deux polypeptides de 130 et 76 kda. La purification du polypeptide 180 kda nous a permis de preparer des anticorps specifiques. L'adn ligase i du xenope est une enzyme nucleaire, presente des le premier stade de l'ovogenese et qui s'accumule progressivement jusqu'au stade v. Sa quantite demeure constante au moins jusqu'au stade bourgeon caudal. L'adn ligase ii de xenope est une proteine de poids moleculaire apparent de 80 kda. Elle n'est pas reconnue par les anticorps anti-adn ligase i. Elle est presente dans les ovocytes, les ufs vierges et apres la fecondation. Nous avons montre de facon claire que contrairement a ce qui etait decrit dans la litterature l'adn ligase i chez les deux amphibiens axolotl et pleurodele est presente avant la fecondation. Ceci est egalement vrai chez l'oursin

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Castagné, Claire. "Analyse par résonance magnétique nucléaire des interactions ADN-protéine : étude des facteurs de transcription Rev-erb [bêta] et SRY ; détermination de la structure secondaire du domaine C-terminal de la tyrosyl'RNA synthétase". Université Joseph Fourier (Grenoble), 1999. http://www.theses.fr/1999GRE10039.

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Le passage de l'adn aux proteines est une succession de reactions compliquees mais il peut etre decompose de facon simple en deux etapes principales : la transcription, qui copie fidelement l'information codee par l'adn en molecules d'arn messager, et la traduction de ces arns messagers en proteines. Pour activer la transcription d'un gene, des facteurs nommes facteurs de transcription doivent se fixer a leurs promoteurs. Nous avons etudie les interactions adn - proteine de deux d'entre eux : rev-erb et sry. D'une part, l'element de reponse aux hormones de rev-erb , le 15 mere rev-re, a ete modelise en se basant sur les contraintes obtenues par rmn. Sous sa forme libre, cette molecule d'adn adopte une conformation d'adn b quasi canonique. Les premieres etudes sur le complexe rev-erb - rev-re montrent que d'importantes deformations du duplex d'adn apparaissent. D'autre part, les complexes sry-8 mere et sry-14 mere ont ete analyses par rmn du phosphore et pour la premiere fois l'attribution complete de tous les signaux phosphore dans un complexe adn - proteine a ete realisee. Au niveau de l'etape de traduction, chaque codon de l'arn messager est reconnu par l'anticodon equivalent d'un arn de transfert charge avec l'acide amine apparente. Le chargement (ou aminoacylation) specifique d'un acide amine sur son arn de transfert apparente est catalyse par les aminoacyl-trna synthetases (aarss). La structure du domaine c-terminal de la tyrosine trna synthetase (tyrrs) de bacillus stearothermophilus est etudiee par rmn heteronucleaire et l'analyse des spectres tridimensionnelles ( 1 3c- 1 5n- 1h) nous a permis d'identifier les elements de structure secondaire qu'une etude cristallographique n'avait pas pu reveler.

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Touzé, Elodie. "Cristallogenèse et études structurales appliquées aux aminoacyl-ARNt synthétases". Phd thesis, Université Louis Pasteur - Strasbourg I, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00206952.

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La GlnRS de Deinococcus radiodurans se distingue des autres GlnRS par la présence d'un appendice additionnel en C-terminal (C-ter). Celui-ci adopterait le même repliement que la famille de protéines YqeY de fonction inconnue et une région de la sous-unité GatB de l'AdT. Son architecture atypique, trouvée dans 4 organismes, corresponds à la fusion de protéine de la voie directe et indirecte d'aminoacylation des ARNt. La structure cristallographique de la GlnRS-Dr n'a pas permis de résoudre la région C-ter, la maille étant suffisamment large pour l'accommoder. Des analyses en RMN du C-ter isolé ont confirmé la présence d'une région majoritairement structurée. D'autres structures ont été résolues en présence de petits substrats (glutamine, analogues d'adénylate) ainsi que la forme tronquée en C-ter. Dans 2 cas, une conformation verrouillée unique du site actif a été mise en évidence. Des analyses structurales et fonctionnelles et les propriétés de l'empilement cristallin sont exposées.

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Dorison, Hugo. "Sumo-Directed Control of the Resolvase Yen1 in Mitotic Cells Slx5-Slx8 Ubiquitin Ligase Targets Active Pools of the Yen1 Nuclease To Limit Crossover Formation SUMO-Mediated Recruitment Allows Timely Function of the Yen1 Nuclease". Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL003.

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Resumen

La réparation de cassures d’ADN double brins par recombinaison homologue nécessite la formation d’intermédiaires multibrins qui peuvent être le lieu de formation de crossovers après résolution par des nucléases. La modification de protéines par ubiquitine et SUMO est un mode de contrôle répandu parmi les protéines de la réparation de l’ADN. De plus, certaines protéines de la réparation de cassures double brins interagissent entre elles, lorsqu’elles sont sumoylées, par le biais de motifs d’interaction avec SUMO (SIMs). La nucléase Yen1 subit un contrôle rigoureux lors du cycle cellulaire dans le but de limiter la formation de crossover et ainsi de préserver l’intégrité du génome. Dans ce manuscrit, il sera mis en évidence que Yen1 est régulé de surcroit par l’ubiquitination, la sumoylation et enfin l’interaction non covalente avec le modificateur SUMO via ses SIMs désormais découverts. Yen1 est sumoylé par les SUMO ligases Siz1 et Siz2, d’autant plus en conditions de dommages à l’ADN. En plus de quoi, Yen1 est un substrat de l’ubiquitine ligase Slx5-Slx8. En absence de cette dernière, la fraction sumoylée de Yen1 persiste, ce qui mène à la localisation durable de Yen1 en accumulation ponctuelle dans le noyau. L’ubiquitination de Yen1 par Slx5-Slx8 a surtout lieu à la lysine 714. Une mutation de cette lysine augmente la formation de crossovers, et annule également les défauts de ségrégation des chromosomes qui peuvent avoir lieu en l’absence d’autres nucléases. D’autre part, l’action nucléolytique de Yen1 ne s’effectue correctement que lorsque celui-ci peut interagir de façon non covalente avec des partenaires sumoylés. Des mutations dans les SIMs de Yen1 réduisent sa capacité à découper et résoudre les intermédiaires de la recombinaison, ce qui donne lieu à une augmentation de l’instabilité génomique et de la mauvaise ségrégation des chromosomes
The repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) by homologous recombination involves the formation of branched intermediates that can lead to crossovers following nucleolytic resolution. Ubiquitin and SUMO modification is commonplace amongst the DNA damage repair proteins. What is more, a number of DSB repair factors interact with each other when sumoylated, making use of SUMO interaction motifs (SIMs). The nuclease Yen1 is tightly controlled during the cell cycle to limit the extent of crossover formation and preserve genome integrity. In this manuscript we describe further regulation of Yen1 by ubiquitination, sumoylation and non-covalent interaction with SUMO through its newly characterized SIMs. Yen1 is sumoylated by Siz1 and Siz2 SUMO ligases, especially in conditions of DNA damage. Furthermore, Yen1 is a substrate of the Slx5-Slx8 ubiquitin ligase. Loss of Slx5-Slx8 stabilizes the sumoylated fraction of Yen1, and results in persistent localization of Yen1 in nuclear foci. Slx5-Slx8-dependent ubiquitination of Yen1 occurs mainly at K714 and mutation of this lysine increases crossover formation during DSB repair and suppresses chromosome segregation defects when other nucleases are unavailable. In addition, proper and timely nucleolytic processing from Yen1 is dependent on interactions mediated by non-covalent binding to sumoylated partners. Mutations in the motifs that allow SUMO-mediated recruitment of Yen1 leads to its mis-localization, decreasing Yen1’s ability to resolve DNA joint-molecule intermediates and resulting in increased genome instability and chromosome mis-segregation

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Kapusta, Aurélie. "Réarrangements du génome chez Paramecium tetraurelia : ligases ADN et voies de End-Joining". Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112207.

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De façon spectaculaire, à chaque cycle sexuel, le cilié Paramecium remodèle l'intégralité de son génome somatique. Ce processus implique notamment l'excision de dizaines de milliers de courtes séquences (IES), présentant un dinucléotide 5'-TA-3' à chacune de leurs bornes. Les IES interrompant les séquences codantes, leur élimination précise est nécessaire à la survie de la descendance. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double-brin (CDB), dont la géométrie de 4 bases sortantes en 5' centrées sur le TA, permettrait un recollement des extrémités suite à une maturation minimale. Toutefois, les acteurs protéiques impliqués dans l'assemblage final et précis des gènes somatiques restent à établir. En me focalisant sur l'étape finale de réparation, j'ai tout d'abord caractérisé in silico les ligases ADN dépendantes de l'ATP de la paramécie. L'analyse fonctionnelle de la Ligase IV et de son partenaire Xrcc4, impliqués dans une voie cellulaire canonique de réparation des CDB (Non Homologous End-Joining ou NHEJ), a montré qu'ils étaient indispensables à la réparation des CDB introduites lors de l'excision des IES. Mes résultats ont mené à un modèle actualisé d'excision des IES de type « couper & recoller ». J'ai pu y inclure les acteurs protéiques avérés, ou supposés, notamment pour la protection des extrémités cassées et pour l'étape de maturation contrôlée, points déterminants pour une réparation précise hautement reproductible. Ainsi, la paramécie constituerait un excellent organisme modèle pour l'étude de l'implication de la voie NHEJ dans la réparation précise de CDB introduites de façon programmée à l'échelle d'un génome entier
During the sexual cycle of the ciliate Paramecium, the somatic genome is spectacularly and reproducibly rearranged. This process involves two kinds of germline DNA elimination, including the precise excision of tens of thousands of short sequences (Internal Eliminated Sequences or IESs), each one flanked by two 5' - TA- 3' dinucleotides. These developmentally programmed rearrangements are initiated by DNA double-strand breaks (DSBs) that exhibit a characteristic geometry, with 4-base 5' overhangs centered on the conserved TA, and may readily align and undergo ligation with minimal processing. However, the actors involved in the final and precise assembly of somatic genes have remained unknown. My work has been focused on the last step of DNA repair, which first led me to characterize in silico the Paramecium ATP-dependent DNA ligases. Functional analysis of Ligase IV and its partner Xrcc4p, core components of a canonical cellular DSB repair pathway (non-homologous endjoining or NHEJ), showed their requirement both for the repair of IES excision sites and for the circularization of excised IESs. Moreover, my data provide direct evidence for the introduction of initiating double-strand cleavages at both ends of each IES, followed by DSB repair via highly precise end-joining. This led to a "cut-and-close" model, including confirmed or putative actors, mostly involved in the protection of broken ends and their controlled processing, key steps in a highly reproducible and precise repair. Paramecium may therefore be an excellent model organism to study precise DSB repair in genome-wide programmed rearrangements

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Frau, Silvana. "Préparation et activité nucléase d'une molécule conjuguée "métalloporphyrine-Hoechst 33258" comme agent de reconnaissance du petit sillon de l'ADN". Toulouse 3, 1996. http://www.theses.fr/1996TOU30017.

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Ce memoire presente des travaux visant a modeliser la bleomycine, un antibiotique d'origine naturelle, capable de degrader l'adn par un mecanisme d'oxydation de type cytochrome p450. Nous avons prepare une molecule hybride metalloporphyrine-hoechst 33258 associant un agent de reconnaissance du petit sillon de l'adn (h33258) a une porphyrine cationique de manganese, catalyseur biomimetique d'oxydation connue pour son activite nuclease. Le premier chapitre est consacre a des rappels bibliographiques sur la nature des interactions de h33258 avec l'adn, generalement etudiee grace aux methodes physico-chimiques et biologiques courantes (gels d'empreintes, modelisation moleculaire, spectroscopies d'absorption et d'emission, spectroscopie de resonance, cristallographie). Dans un deuxieme chapitre, nous decrivons la synthese du compose metalloporphyrine-hoechst 33258 en plusieurs etapes: fonctionnalisation des deux synthons de depart, couplage pour former la molecule hybride, quaternarisation qui conduit a une structure polycationique a haute affinite pour l'adn, puis metallation de l'hybride. Plusieurs metaux ont ete inseres dans le cycle porphyrinique: le manganese pour ses proprietes redox, le nickel comme controle et le zinc pour d'eventuelles etudes de chimie luminescence. Enfin, dans un troisieme chapitre nous mettons en evidence les proprietes nucleases de la molecule metallee par le manganese, et, a partir des sites de coupures identifies, nous apprehendons et discutons ses differents modes d'interactions avec les acides nucleiques etudies. L'equilibre en solution du complexe ligand-adn est etudie par spectroscopie d'absorption afin d'estimer la constante d'affinite de cette molecule hybride pour des polymeres poly(da. Dt)

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Paradis, Geneviève. "Transport de protéines thérapeutiques à travers diverses barrières biologiques à l'aide d'un ligand peptidique". Sherbrooke : Université de Sherbrooke, 2004.

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Dumont, Marilyn. "Mécanismes impliqués dans la formation des anomalies chromosomiques lors de la meiose en absence de brca2 chez la plante arabidopsis thaliana". Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112086/document.

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En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l’ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l’ADN. Enphase méiotique, les CDB de l’ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes’associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l’ADN effectuée par d’autres mécanismesde réparation de l’ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l’ADN en phase somatique,n’intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l’hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n’avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D’ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n’ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l’ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l’état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l’hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l’utilisation d’unsystème ARNi pour éteindre l’expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l’implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n’a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n’est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l’ADN
In somatic cells, several mechanisms are involved in the repair of DNAdouble strand breaks (DSB). In meiotic cells, programmed DSBs are causedby Spo11 and repaired by homologous recombination (HR), whose main playersare Rad51 and Dmc1 aided by Brca2. In Arabidopsis, in the absence ofBrca2, meiosis is disturbed, chromosomes do not organize into bivalents,they appear stuck and entangled together. Thus, in the absence of Brca2,HR may be no functional and the chromosomal anomalies we observecouldresult from the aberrant repair of the DNA DSBs due to other mechanisms ofDNA repair. We have shown in Arabidopsis that the homologous end joining(NHEJ) and/or Single Strand Annealing (SSA), mechanisms of DNA DSB repairthat are active in the somatic phase, were not involved in the formationof the meiotic anomalies observed in the absence of Brca2 in meioticcells. Still assuming that these figures are the result of meioticcovalent bond, we checked whether DNA ligases could be involved. Thus, wehave shown that 6 Ligase, DNA ligase specific plants, had no role in thechromosomal abnormalities observed in meiosis in the absence of Brca2.Besides the Ligase 6 does not seem to interfere with the meiotic figuresobserved in rad51 and mnd1 mutants. We wanted to identify the Ligase 6role in studying its mutant. Ligase 6 mutant did not show sensitivity togenotoxic stress. The Ligase 6 does not seem to be involved in DNA repair.The lethality of the ligase I mutant was bypassed with a RNAi constructaimed at extinguishing the gene expression of LIGASE I atmeiosis only.However, the involvement of Ligase I in the meiotic anomalies observed inthe absence of Brca2 could not be determined. Finally, we confirmed that,in Arabidopsis, Xrcc4 has a role in NHEJ through its interaction withligase IV and the sensitivity of the xrcc4 mutant to different genotoxicstress. In contrast, Xrcc4-like does not appear to interact with playersin the NHEJ ligation complex and the mutant shows no sensitivity togenotoxic stress. These result indicated that this protein is not involvedin NHEJ and, more generally in the mechanisms of DNA repair

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Pottier, Aurore Hénichart Jean-Pierre. "Conception, synthèse et évaluation pharmacologique de pyrrolo[3,4-b]quinoléines condensées, ligands potentiels de l'ADN". [S.l.] : [s.n.], 2003. http://www.univ-lille1.fr/bustl-grisemine/pdf/extheses/50376-2003-83-84.pdf.

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Alberti, Patrizia. "Étude thermodynamique et cinétique de triplexes et de quadruplexes d'ADN". Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2003. http://www.theses.fr/2003MNHN0008.

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Nous avons étudié la dynamique de structures d'ADN à 3 et à 4 brins. Une étude cinétique par résonance plasmonique de surface nous a permis de proposer un modèle de formation directionnelle des triple-hélices, qui découlerait de la nature droite du duplexe cible. Le polymorphisme structural de l'ADN permet également la réalisation de systèmes capables d'accomplir des mouvements. Nous avons réalisé une machine moléculaire à ADN fondé sur l'interconversion entre un duplexe et un G-quadruplexe. L'équilibre entre des conformations différentes d'ADN peut être modulé par des ligands spécifiques des structures en jeu. En particulier, la stabilisation d'une structure en G-quadruplexe à l'extrémité 3' des télomères constitue une approche potentielle pour inhiber la télomérase, une enzyme active dans la majorité des cellules tumorales. Afin d'identifier des ligands spécifiques des G-quadruplexes nous avons étudié la sélectivité de plusieurs composés vis-à-vis de différentes structures d'ADN
We have studied the dynamics of DNA three- and four-stranded structures. A kinetic study by surface plasmon resonance led us to the elucidation of a directional mechanism for triple-helix formation, probably due to the right-handedness of the target duplex. The DNA structural polymorphism also allows the realisation of systems capable of performing movements. We have realised a DNA system accomplishing an extension-contraction movement based on the interconversion between a double-helix and a G-quadruplex. The equilibrium between different DNA possible conformations may be modulated by small molecules specifically recognising a given DNA structure. In particular, the stabilisation of G-quadruplexes at telomeres represents a potential therapeutic approach to inhibit telomerase, an enzyme active in most of cancer cells. In order to identify G-quadruplexes specific ligands, we have explored the structural selectivity of different DNA binding molecules by a competition dialysis assay

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Bailly, Fabrice. "Le motif de reconnaissance spécifique de l'ADN, SPKK et son utilisation pour l'élaboration d'hybrides peptide-intercalant". Lille 1, 1992. http://www.theses.fr/1992LIL10107.

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L'amsacrine est un médicament antileucémique synthétique puissant qui interagit avec l'ADN par un processus d'intercalation. Le motif peptidique SPKK (Ser-Pro-Lys-Lys) est un fragment de l'histone H1 susceptible de se fixer sélectivement dans le petit sillon de l'ADN à la manière de la nétropsine, antibiotique naturel antitumoral et antiviral. Deux séries hybrides répondant au concept «ligand du petit sillon-intercalant» ont été élaborées en associant à l'amsacrine ou à l'une de ses structures chimiques dérivées un puis deux motifs SPKK. Le mode de liaison à l'ADN de ces molécules hybrides a été clairement défini par la convergence de nombreuses techniques physicochimiques (spectroscopie d'absorption UV; fluorescence; dichroïsmes circulaire et linéaire; viscosimétrie) et biochimiques (footprinting). Par ailleurs leurs propriétés d'oxydation ont été étudiées (spectroscopie d'absorption UV; chimioluminescence). L'activité biologique de ces modèles hybrides a aussi été appréhendée in vitro, comparativement à celle du composé témoin amsacrine

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Plouvier, Bertrand. "Analogues thiazoliques de la nétropsine : interaction avec l'ADN et pouvoir cytotoxique". Lille 1, 1991. http://www.theses.fr/1991LIL10119.

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La nétropsine est un antibiotique d'origine naturelle qui se lie spécifiquement aux bases Adénine et Thymine du petit sillon de l'ADN. Des modèles synthétiques où le motif N-méthylpyrrole de la nétropsine est remplacé par un thiazole différemment substitué ont été élaborés. Le mode de liaison à l'ADN de ces analogues de la nétropsine a été étudié par de nombreuses techniques physicochimiques (spectroscopie d'absorption UV, fluorescence, viscosimétrie, dichroïsme linéaire électrique) et de biologie moléculaire (footprinting) pour l'un d'entre eux. En prenant comme molécules de référence l'amsacrine et la bléomycine, substances antitumorales utilisées en clinique, des hybrides répondant au concept peptide à liaison spécifique-intercalant ont été réalisés: ils comprennent dans leur structure une partie pseudopeptidique thiazolique analogue de la nétropsine et l'élément intercalant constitutif de l'amsacrine ou de la bléomycine. Le mode d'interaction à l'ADN et l'activité biologique de tels hybrides ont été étudiés. Cette étude a permis d'élaborer dans un premier temps un composé (Thia-Nt) se liant dans le petit sillon à une séquence oligonucléotidique spécifique et dans un second temps de composés hybrides hybrides possédant une activité antitumorale en partie due au noyau acridinique intercalant de l'amsacrine qu'on leur a greffé

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Nonglaton, Guillaume. "Applications des films Langmuir-Blodgett à base de phosphonates de zirconium pour la préparation de puces à oligonucléotides : synthèse de ligands hybrides P/N chiraux. Étude de leurs propriétés de coordination". Nantes, 2005. http://www.theses.fr/2005NANT2054.

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Ce mémoire traite d'un procédé de préparation de puces à ADN utilisant un support de verre recouvert d'une couche de phosphonate de zirconium déposée par la technique de Langmuir-Blodgett. Les oligonucléotides sondes modifiés par un phosphate terminal sont déposés sur la surface de zirconium et s'y fixent en formant des liaisons à caractère fortement covalent. Les performances de ce nouveau type de puce à ADN ont été étudiées dans des conditions biologiques. Une augmentation de la fluorescence est observée lors de l'introduction d'un espaceur polyguanine entre la sonde et le phosphate terminal. Puis la synthèse de ligands P/N chiraux est décrite via la désymétrisation du squelette méso et achiral d'une diamine de symétrie C2 par l'introduction sélective d'un groupement diphénylphosphine sur un des deux centres azotés. La coordination du ligand (L) avec des précurseurs métalliques à base de Rh(I) ou de Pd(0) permet l'obtention de complexes potentiellement utilisables en catalyse
This report deals with a new process for preparing DNA microarrays using glass slides covered by a zirconium phosphonate monolayer deposited by Langmuir-Blodgett method. Oligonucleotides probes modified with a terminal phosphate were spotted onto the zirconated surface where they bound by formation of metal-oxygen covalent bonds. Performances of this new type of DNA microarrays were studied in biological conditions. An increase of the fluorescence intensity was observed when using a polyguanine spacer between the probe oligomer and the terminal phosphate. Then the synthesis of novel chiral P,N-ligands by desymmetrization of the achiral meso N,N'-dimethyl-1,2-diphenylethane-1,2-diamine backbone is described. This transformation was achieved by the selective introduction of a diphenylphosphine moiety on one of the two nitrogen centers. The coordination of this ligand (L) with Rh(I) and Pd(0) precursors led to the formation of complexes which can be of potential interest for catalysis

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PROST, SANDRINE. "Etude des mecanismes de resistance aux antitumoraux inhibiteurs des adn-topoisomerases dans une lignee de cancer humain". Paris 6, 1993. http://www.theses.fr/1993PA066625.

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La resistance intrinseque ou acquise aux agents antitumoraux pose un probleme majeur du traitement des cancers. Nous avons selectionne une lignee de cancers bronchiques a petites cellules, resistante a un inhibiteur de topoisomerase ii (topo ii), le mamsa. Cette lignee (n417/amsa) presente une resistance croisee vis a vis de plusieurs drogues, sans toutefois exprimer la glycoproteine pgp170 codee par le gene mdr1 (phenotype mdr atypique). Nous avons observe dans les cellules resistantes une diminution de l'activite de la topo ii et des frequences de cassures de l'adn induites par le mamsa. Parallelement, l'activite de la topo i est augmentee, compensant ainsi la perte de la topo ii. Dans d'autres lignees cellulaires, l'augmentation de la topo i entraine generalement une hypersensibilite a la camptothecine (cpt), un inhibiteur specifique de la topo i. Curieusement, la lignee n417/amsa presente une resistance croisee a la cpt. Cette resistance est associee a une diminution des cassures de l'adn induites par la cpt, la topo i des cellules resistantes etant moins sensible a la cpt que celle des cellules parentales. Enfin, nous avons montre que les drogues antitumorales utilisees sont capables d'induire la mort cellulaire par apoptose des cellules parentales. Cet effet n'a pas pu etre mis en evidence dans les cellules resistantes. Une difference dans l'induction de la mort cellulaire par apoptose pourrait ainsi contribuer au phenotype de resistance

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Praseuth, Danièle. "Photodégradation d’un ADN de plasmide induite par les porphyrines hydrosolubles : relation entre la structure des colorants et leur efficacité photodynamique". Paris 11, 1985. http://www.theses.fr/1985PA112051.

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Les porphyrines cartioniques méso-substituées interagissent efficacement avec l’ADN in vitro. Le mode d’interaction dépend de la structure des groupents en méso et dans le cas des métallo-porphyrines, de la géométrie autour du métal. L’intercalation est possible dans le cas des porphyrines les moins encombrées. Les porphyrines base libre ou celles couplées avec un métal diamagnétique sont de bons photosensibilisateurs et produisent en présence de lumière visible de l’oxygène singulet avec des rendements élevés. Ces molécules sont capables d’induire avec une grande efficacité une photodégradation de l’ADN pBR322 in vitro. Ces propriétés laissent présager leur utilisation possible dans le domaine de la photothérapie du cancer.

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Pentikäinen, Olli. "Modeling of protein-ligand interactions : integrin I-domains and ionotropic glutamate receptors /". Turku : Å̊bo Akademi University, 2003. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb399324293.

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Schechner-Resom, Martina Gabriele. "Ligand binding and molecular flexibility : Studies on DNA gyrase B". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. http://www.theses.fr/2005STR1A001.

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L’ADN gyrase est une enzyme vitale pour la bactérie grâce à sa capacité de manipuler les molécules d’ADN dans la cellule vivante. Cette capacité fait de l’ADN gyrase une cible idéale pour des composés anti-infectieux. Dans ce travail, l’ADN gyrase a été étudié par des méthodes de modélisatoin moléculaire. Une approche de conception de ligands basée sur la structure a été entreprise sur le sous-domaine N-terminal de 24 kDa de l’ADN gyrase B (domaine GHKL). La flexibilité de deux boucles du site actif du domaine GHKL a été étudiée par des simulations de dynamiques moléculaires en présence de différents ligands. Dans une dernière partie, une analyse des modes normaux du dimère du domaine N-terminal de 43 kDa a été entreprise
DNA gyrase is a vital bacterial enzyme necessary for the handling of the large DNA molecules in the living cell. Therefore DNA gyrase is an ideal target enzyme for anti-infectious compounds. In this work DNA gyrase has been studied by molecular modelling methods. A computational structure-based ligand design approach has been carried out on the N-terminal 24 kDa subdomain of DNA gyrase B (GHKL domain). To further examine the flexibility of two active site loops, molecular dynamics simulations have been carried out on the GHKL domain in different ligand binding conditions. In a final part, normal mode analysis has been carried out on the dimer of the 43 kDa domain of DNA gyrase B

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Becker, Jérôme. "Identification de nouveaux ligands peptidiques des récepteurs aux opiacés Mu, Delta, Kappa et ORL-1 et mise en place de la technologie des puces à ADN dans le cadre de la pharmacodépendance". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2001. http://www.theses.fr/2001STR13140.

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Desjobert, Cécile. "L'intégrase du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 : identification de ligands protéiques et peptidiques : étude de ces interactions physiques et fonctionnelles". Bordeaux 2, 2005. http://www.theses.fr/2005BOR21204.

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Le SIDA est un problème de santé publique mondial. L'intégrase catalyse une étape cruciale du cycle infectieux du VIH-1 : l'intégration de l'ADN viral dans le génome cellulaire. L'IN constitue donc une cible intéressante, qui n'est pas encore utilisée dans les thérapies actuelles. De plus, elle interagit avec des facteurs au sein du complexe de préintégration (CPI), qui optimisent ses activités dans le noyau. Ces partenaires ne sont pas tous identifiés et leur effet sur l'IN n'est pas compris. Nous avons étudié les interactions entre l'IN et la RT, car ces deux enzymes virales sont présentes dans le CPI et leurs activités sont mutuellement régulées pendant le cycle viral. Grâce à des essais en ELISA et en pull-down, nous avons démontré l'interaction entre ces deux enzymes. De plus, la RT est capable d'inhiber les activités de l'IN à un ratio de 1 : 13 Pour isoler des partenaires cellulaires de l'IN nous avons employé la méthode du double-hybride. Nous avons ainsi identifié des protéines associées aux microtubules, suggérant un rôle de ce réseau dans le transport de l'IN vers le noyau. Finalement, le phage-display a été utilisé pour cribler des heptapeptides aléatoires, ligands de l'IN. L'un d'entre eux s'est révélé être un inhibiteur efficace de son activité de transfert de brin. Ce peptide pourra être utilisé comme base pour définir de nouveaux agents anti-IN
AIDS is a worldwide health problem. Integrase (IN) catalyzes a crucial step of the HIV-1 infectious cycle : integration of the viral DNA into the cellular genome. So IN is an attractive target which is not yet used in current therapies. Moreover the retroviral IN interacts with other factors in a preintegration complex (PIC) that optimizes its activities in the nucleus. These partners are not all identified and their action on IN is not well understood. We studied the interactions between IN and RT because these two viral enzymes are present in the PIC and their activities are mutually regulated during the viral cycle. Using ELISA and pull-down, we demonstrated the interaction between the two enzymes. Therefore RT is able to inhibit IN activities at a ratio of 1 : 1. To isolate cellular partners of IN we used the yeast-two hybrid system. We identified microtubule-associated proteins, suggesting a role of this network in the transport of IN to the nucleus. Finally, phage-display method was used to screen random heptapeptides ligands of IN. One of them was found to be an efficient inhibitor of its strand transfer reaction. This peptide could be used as a base for developing new anti-integrase compounds

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Corniquel, Béatrice. "Construction de banques d'ADNc de palmier dattier (Phoenix dactylifera L. ). Différenciation de cultivars par RFLP à l'aide des ADNc : isolement et caractérisation d'un ADNc polymorphe. Isolement et caractérisation d'un ADNc codant pour la glutamine synthetase cytosolique". Angers, 1994. http://www.theses.fr/1994ANGE0014.

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La caractérisation des cultivars de palmier dattier a été réalisée par des analyses RFLP et RAPD à partir des feuilles internes des rejets. Des sondes ont été isolées d'une banque d’ADNc construite à partir d'ARNM extraits de cals organogènes du cultivar bou sthammi noire. La sonde ADNc 1 a permis d'obtenir neuf profils d'hybridation distincts pour chacun des neuf cultivars étudiés. Des profils d'amplification distincts pour trois cultivars ont été obtenus par RAPD avec des amorces oligonucléotidiques. Des analyses RFLP ont été aussi réalisées sur du matériel maintenu in vitro ou issu de culture tissulaire afin de déterminer si d'éventuelles variations induites par la culture in vitro affectaient le génome du palmier dattier. L'analyse moléculaire de la sonde ADNc 1 a été abordée. Le transcrit qui comprend 2400 nucléotides est exprimé dans les feuilles et les cals organogènes. Sa séquence partielle a été établie, l'absence d'homologie entre cette séquence de 1456 nucléotides et les séquences enregistrées dans les banques de données suggère que nous avons isole un ADNc codant pour une nouvelle protéine. Un ADNc codant pour la glutamine synthétase a été isolé. L'absence au niveau de la séquence des aminoacides de cet ADNc de l'extension c-terminale qui caractérise la structure primaire des séquences des sous-unités chloroplastiques montre que l’ADNc isole code pour la sous-unité cytosolique de la glutamine synthétase.

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Pommier, Yves. "Les agents intercalants affectent le fonctionnement des adn topoisomerases deux eukaryotes". Paris 6, 1986. http://www.theses.fr/1986PA066570.

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Parmi les medicaments anticancereux les plus actifs, les agents intercalants de l'adn (anthracyclines, acridines) produisent des lesions sur l'adn de type soit cassure du dna, soit pontage adn-proteine. Ces alterations sont analysees par elution alcaline, sedimentation de nucleotide et sedimentation alcaline. Ces lesions sont reversibles apres suppression des intercalants (culture cellulaire, cellules leuconiques(l1210)). Les dna topoisomerase 2 (enzyme de replication, de transcription, d'organisation de chromatine) sont responsables des lesions provoquees par les agents intercalants du dna, car dans ces conditions, elles forment les ponts proteine-dna. L'utilisation des cellules soit sensibles soit resistantes aux inhibiteurs de dna topoisomerase 2 a permis de mettre en evidence leur role dans la formation de ces alterations au dna

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Abu-Halaweh, Marwan y n/a. "Molecular Methods for Campylobacter and Arcobacter Detection". Griffith University. School of Biomolecular and Biomedical Science, 2005. http://www4.gu.edu.au:8080/adt-root/public/adt-QGU20060223.084457.

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Twenty species and six subspecies of the genera Arcobacter and Campylobacter have been described to date. All are Gram-negative, microaerophilic, curved, spiral or S-shaped cells, and are members of the order Campylobacterales, class Epsilonproteobacteria phylum Proteobacteria. Though most members are pathogenic, C. jejuni, C. coli and A. butzleri are the most frequently isolated species from patients suffering from gastrointestinal illness. The current methods for their detection, identification, and differentiation are cumbersome, time consuming and lack specificity. DNA based molecular techniques including real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) and Fingerprinting methods Terminal Restriction Fragments Length Polymorphism (T-RFLP) and Ligase Detection Reaction (LDR) have been used in this project to develop rapid detection and identification methods for Campylobacter and Arcobacter species. Five real-time PCR methods were developed which include: (a) rapid detection and identification of Campylobacter species using real-time PCR adjacent hybridisation probes, (b) rapid identification of C. jejuni using SYBR Green I, (c) rapid detection and differentiation of Arcobacter species using adjacent hybridisation probes, (d) rapid detection and differentiation of Arcobacter species and the Campylobacter group (C. coli, C. jejuni, C. lari, C. hyoilei, C. helviticus, C. hyointestinalis, C. insulaenigrae, C lanienae) using melting temperature (Tm) of adjacent hybridisation probes, and (e) a one tube real-time PCR multiplex for the rapid detection and identification of Campylobacter species, C. coli and C. jejuni using a TaqMan Probe, in an iCycler iQTM (BioRad, USA) and Light CyclerTM (Idaho Technology, USA). [Continued ...]

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Dumont, Marylin. "Mecanismes impliques dans la formation des anomalies chromosomiques lors de la meiose en absence de brca2 chez la plante arabidopsis thaliana". Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00632489.

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En phase somatique, plusieurs mécanismes de réparations de l'ADNinterviennent pour réparer les cassures double brin (CDB) de l'ADN. Enphase méiotique, les CDB de l'ADN engendrées de façon programmées parSpo11 sont réparées par la recombinaison homologue (RH) dont les acteursprincipaux sont Rad51 et Dmc1 aidés de Brca2. Chez Arabidopsis, en absencede Brca2, le déroulement méiotique est perturbé, les chromosomes nes'associent pas en bivalents, ils apparaissent emmêlés. Ainsi, en absencede Brca2, la recombinaison homologue pourrait ne plus être fonctionnelleet les anomalies chromosomiques observées pourraient être le résultat deréparations aberrantes des CDB de l'ADN effectuée par d'autres mécanismesde réparation de l'ADN. Nous avons montrés, chez Arabidopsis, que le Nonhomologous End Joining (NHEJ) et/ou le Single Strand Annealing (SSA),mécanismes de réparation des CDB de l'ADN en phase somatique,n'intervenaient pas en phase méiotique dans la formation des anomaliesobservées en absence de Brca2. Toujours dans l'hypothèse où ces figuresméiotiques soient le résultat de liaisons covalentes, nous avons regardési les ADN-ligases ne pourraient pas être impliquées. Ainsi, nous avons pumontrer que la Ligase 6, ADN-ligase spécifique des plantes, n'avait pas derôle dans les anomalies chromosomiques observées en méiose en absence deBrca2. D'ailleurs la Ligase 6 ne semble pas non plus intervenir dans lesfigures chromosomiques observées chez les mutants rad51 et mnd1. Le rôlede la Ligase 6 n'ayant pas été déterminé lorsque nous avons démarré cetravail, nous avons voulu identifier son le rôle en étudiant le mutantcorrespondant. Le mutant ligase 6 ne présente pas de sensibilité auxstress génotoxiques utilisés ce qui indique que la Ligase 6 ne semble pasintervenir dans la réparation de l'ADN. La mutation dans le gène LIGASE Iest létal à l'état homozygote, de plus nous avons pu observer uneségrégation anormale chez l'hétérozygote mutant pour le gène LIGASE I. Lalétalité du mutant ligase I a été contournée par l'utilisation d'unsystème ARNi pour éteindre l'expression du gène LIGASE I uniquement enméiose. Cependant, l'implication de la Ligase I, dans les anomaliesméiotiques observées en absence de Brca2 n'a pas pu être déterminée.Enfin, nous avons confirmé que, chez Arabidopsis, Xrcc4 avait un rôle dansle NHEJ via son interaction avec la Ligase IV et via la sensibilité dumutant xrcc4 à différents stress génotoxiques. En revanche, Xrcc4-like nesemble pas interagir avec les acteurs du complexe de ligation du NHEJ etle mutant ne présente pas de sensibilité aux stress génotoxique, indiquantque cette protéine n'est pas impliquée dans le NHEJ et plus généralementdans les mécanismes de réparation de l'ADN.

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Yaman-Deveci, Ruken. "Implication des méthyltransférases de l'ADN dans l'établissement des méthylations symétrique (CpG) et asymétrique (non-CpG) dans la lignée germinale mâle chez la souris". Nice, 2006. http://www.theses.fr/2006NICE4005.

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La méthylation de l'ADN est une modification épigénétique majeure chez les mammifères. Elle s'effectue essentiellement sur les dinucléotides CpG. Elle est contrôlée par les méthyltransférases de l'ADN (Dnmt(s)). Les profils de méthylation sont très stables au cours des générations. Cependant, deux périodes voient des remaniements importants de ces profils, la période la plus précoce du développement et la gamétogenèse. Bien que la mise en place de nouveaux profils de méthylation soit primordiale pour la survie de l'espèce, les mécanismes impliqués dans ce processus sont mal connus. Afin d'apporter des éléments de réponse à cette question, j'ai, tout d'abord, analysé le rôle d'une Dnmt de novo, la Dnmt3a, au cours de la spermatogenèse. J'ai montré que la méthylation des éléments répétés et rétrotransposons n'était peu ou pas affectée en absence de cette enzyme mais que le profil de méthylation de gènes soumis à empreinte était complètement altéré. Cette analyse suggère également que l'entrée en méiose des cellules germinales mutantes dépend, en partie de la protéine Dnmt3a puisque l'entrée en méiose est ralentie dans ce contexte génétique. La seconde approche utilisée fût de préciser les mécanismes moléculaires impliqués dans le maintien au cours des générations d'un profil de méthylation très originale affectant les cytosines incluses dans des sites non-CpG. Grâce à l'utilisation d'un système modèle expérimental où cette méthylation s'avère être stable et fidèlement reproduite de génération en génération, nous avons montré que la méthylation non-CpG dépend de la méthylation CpG puisqu'en absence de la protéine Dnmt1, les profils de méthylation non-CpG sont altérés
DNA methylation is a major epigenetic modification in mammals. It is present primarily on CpG dinucleotides and controlled by the DNA methyltransferases (Dnmt(s)). Methylation patterns are very stable through the generations. However, two periods involve significant alterations of these profiles, the earliest period of embryonic development and gametogenesis. Although the establishment of new methylation profiles is of great biological importance, the mechanisms involved in this process are largely unknown. To attempt to answer this question I firstly investigated the role of de novo Dnmt, Dnmt3a, during spermatogenesis. I showed that methylation of repeated elements and retrotransposons was not greatly perturbed by the absence of this enzyme while, in contrast, the pattern of methylation of imprinted genes was completely disrupted. This analysis also suggests that entry into meiosis of the mutant germ cells depends partly on the Dnmt3a protein as this process is slower in a Dnmt3a mutant background. The second question I investigated was the nature of the molecular mechanisms involved in the maintenance through the generations of the methylation patterns of cytosines included in non-CpG sites. By using an experimental model system where such non-CpG methylation events are both stable and accurately transmitted from generation to generation, we have shown that methylation of non-CpG sites depends on CpG methylation, since in absence of the Dnmt1 protein, non-CpG methylation patterns are diminished

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Mo, Min y n/a. "Characterization of an Orf virus RING-H2 protein, B5L : a mimic of cellular anaphase promoting complex subunit 11". University of Otago. Department of Microbiology & Immunology, 2009. http://adt.otago.ac.nz./public/adt-NZDU20090220.085825.

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The anaphase promoting complex (APC/C) is an ubiquitin ligase that is an essential regulator of multiple steps in the cell cycle. The complex consists of at least 12 subunits with a catalytic core formed by a scaffold protein, APC2, and a RING-H2 protein, APC11. The Parapoxvirus, Orf virus (OV), encodes a RING-H2 protein, B5L, with clear sequence similarities to APC11. The disruption of APC/C function leads to pre-mature entry into S phase and a delayed M phase exit and, potentially, apoptosis. This investigation explored the functional significance of the similarity between B5L and APC11 and specifically sought to determine if B5L manipulates cell cycle regulation by targeting APC/C function. Co-immunoprecipitation experiments from lysates of cells expressing a range of constructs revealed an interaction between B5L and APC2 in the same manner as seen with APC11. Furthermore, B5L was found to associate with endogenous APC/C. However, although APC11 promoted the formation of polyubiquitin chains in substrate-independent in vitro assays, B5L was inactive in this assay. Bioinformatics comparisons of APC11 and other known RING ubiquitin ligases with B5L and its poxviral homologues revealed some subtle differences. In particular a domain of APC11 (amino acids 61-74), that is essential for its ubiquitin ligase activity is not conserved in B5L or its homologues. When this APC11 domain was incorporated in place of the corresponding region of B5L (amino acids 59-67), the mutated B5L acquired ubiquitin ligase activity. On the other hand, APC11 protein in which the domain was replaced with that of B5L lost ubiquitin ligase activity. Stable cell lines expressing B5L showed an increased number of cells in G2/M phase (30�4%) compared with cell lines expressing APC11 (11�2%, n=3, p<0.05, ANOVA, Tukey�s), consistent with impaired APC/C function. APC/C substrates such as cyclin A, cyclin B and the thymidine kinase were stablized in B5L-expressing cells compared with control cells. Furthermore, transient hyper-expression of B5L induced apoptosis in 25�2% (n=3, p<0.05) of the cell population compared with only 6�1% apoptotic cells when APC11 was hyper-expressed. Analysis of the DNA content of OV-infected cells revealed enhanced DNA synthesis compared with cells infected with a B5L knockout OV. These observations indicate that B5L is a non-functional mimic of APC11. It associates with APC/C, but lacks ubiquitin ligase activity, and hence disrupts APC/C function. These abilities may enable OV to induce a cellular environment that enhances viral replication.

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Pottier, Aurore. "Conception, synthèse et évaluation pharmacologique de pyrrolo[3,4-b]quinoléines condensées, ligands potentiels de l'ADN". Lille 1, 2003. https://ori-nuxeo.univ-lille1.fr/nuxeo/site/esupversions/55bbdfca-1abf-49be-a9d6-8c805ba42673.

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Le cancer est la deuxième cause de mortalité dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. C'est pourquoi de nombreuses recherches sont entreprises afin d'obtenir des outils thérapeutiques pour combattre cette maladie. Une des cibles biologiques de choix pour le traitement des cancers est la double hélice d'ADN, qui contient les informations nécessaires à la multiplication cellulaire. Nous nous sommes inspirés de la camptothécine, alcaloi͏̈de pentacyclique, connue pour ses propriétés antitumorales, qui est le chef de file des inhibiteurs de topoisomérase I, enzyme essentielle pour la réplication de l'ADN. L'utilisation du squelette polycyclique de la camptothécine afin de concevoir des ligands de l'ADN constitue une approche originale dans cette série. Notre étude décrit la conception, la synthèse et l'évaluation pharmacologique de pyrrolo[3,4-b]quinoléines condensées, ligands de l'ADN. Les différents motifs polycycliques étudiés et les diverses modulations entreprises nous permettent de proposer de nouveaux squelettes liant l'ADN et un ensemble de relations structure-affinité. L'ensemble des tests biologiques ont permis de déterminer le mode d'interaction de ces composés avec l'ADN (intercalant et/ou ligand du petit sillon) et de mettre en évidence des molécules cytotoxiques sur des lignées cancéreuses humaines (MCF7, cancer du sein, et PC3, cancer de la prostate). La préparation de ces quinoléines condensées de structure originale a été réalisée par la réaction de Friedländer (cyclisation d'un o-aminobenzaldéhyde ou d'une o-aminocétone avec une cétone énolisable) dont nous avons optimisé les conditions afin d'améliorer les rendements.

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Gandemer, Virginie. "Utilisation des puces à adn pour l’étude fonctionnelle du génome dans les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B de l’enfant". Rennes 1, 2007. http://www.theses.fr/2007REN1S040.

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Les LAL-B représentent le 1er cancer de l’enfant. Les mécanismes moléculaires mis en jeu dans le processus de leucémogenèse et dans leur pronostic sont peu connus. L’étude des profils d’expression génique nous a permis d’explorer la pathogénie d’un groupe homogène de LAL-B caractérisée par le transcrit TEL/AML1. Nous avons mis en évidence et validé 14 gènes regroupés en 5 processus biologiques caractérisant ces LAL. Parmi eux, RUNX1 s’est avéré plus représentatif de ce groupe que le transcrit TEL/AML1. Pour la première fois, nous avons mis en évidence le processus de mobilité cellulaire et explorons les mécanismes de régulation épigénétique des deux seuls gènes sous-exprimés. Au sein des LAL-B sans anomalie cytogénétique récurrente, notre étude n’a pu retrouver de profils d’expression en rapport avec les groupes pronostiques clinico-biologiques (âge et leucocytose au diagnostic). Ces données conduisent à rechercher de nouveaux marqueurs de caractérisation et de pronostic des LAL-B
B-ALL is a common pediatric malignancy but leucemogenesis and prognostic biological mechanisms still remain uncertain. We explored critical pathways of TEL/AML1 B-ALL with gene expression profile approach. We highlighted 5 enriched Gene Ontology categories characterized by 14 genes, able to discriminate the TEL/AML1 sub-group. Over-expression of RUNX1 was proposed to become a additional surrogate marker of this subgroup. Cell motility was for the first time identified as a representative process of this subgroup and epigenetic regulation of the 2 underexpressed genes is underanalysis. We could not show patterns of expression in pediatric B-ALL lacking common cytogenetic abnormatities that correlated with the NCI risk factors (age and blood cell count). Our results suggest the refinement of existing classification and risk algorithms

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Clastre, Marc. "Purification et caractérisation de la géranyl diphosphate synthétase de cellules de Vitis vinifera L. Cv. Muscat de Frontignan cultivées in vitro". Toulouse, INPT, 1993. http://www.theses.fr/1993INPT013A.

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Les cultures de cellules et tissus vegetaux produisent des quantites negligeables de metabolites secondaires, souvent inferieures a 1% par rapport au taux que l'on trouve dans les plantes entieres. Ll en est ainsi des cellules de vitis vinifera l. Cv. Muscat de frontignan qui se montrent incapables de biosynthetiser les monoterpenes responsables de la flaveur musquee du raisin. Ce phenomene peut s'expliquer par une eventuelle repression de la voie de biosynthese des terpenes, en particulier des etapes qui menent de l'acide mevalonique au geranyl diphosphate, compose considere comme le precurseur universel des monoterpenes. C'est pourquoi, nous nous sommes essentiellement interesse a l'elaboration de cette molecule. L'existence d'une geranyl diphosphate synthetase specifique, assurant la biosynthese du geranyl diphosphate a partir d'isopentenyl diphosphate et de dimethylallyl diphosphate, a d'abord ete mise en evidence. La proteine a ensuite ete purifiee a homogeneite par precipitation au sulfate d'ammonium, chromatographies liquides sur colonnes deae-sephacel, hydroxylapatite, mono q, phenyl superose, superose 12 et electrophorese preparative en conditions non denaturantes. L'enzyme synthetise du geranyl diphosphate. En aucun cas, le neryl diphosphate (l'isomere en cis du geranyl diphosphate) et le farnesyl diphosphate ne sont produits. Sa masse moleculaire native est de 685 kilodaltons. En gel de polyacrylamide, en conditions denaturantes elle migre avec une masse moleculaire de 662 kilodaltons. Les constantes de michaelis pour l'isopentenyl diphosphate et le dimethylallyl diphosphate sont respectivement de 8,5 m et de 56,8 m. L'enzyme requiert la presence des cofacteurs manganese et magnesium et son activite est stimulee par le triton x-100. Un analogue du substrat, le diphosphate d'aminophenetyle ainsi que les produits de la reaction, le pyrophosphate inorganique et le geranyl diphosphate ont des effets inhibiteurs

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Depoix, Christophe. "Régulation de l'activité des récepteurs de l'acide rétinoi͏̈que par la dimérisation". Lille 2, 2002. http://www.theses.fr/2002LIL2MT01.

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Alomari, Arqam. "Biophysical and kinetic analysis of Escherichia coli DNA ligase activity and inhibition". Thesis, University of Portsmouth, 2018. https://researchportal.port.ac.uk/portal/en/theses/biophysical-and-kinetic-analysis-of-escherichia-coli-dna-ligase-activity-and-inhibition(96c7d355-6dbe-4e2a-be0d-5641ec98e54a).html.

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DNA ligases are essential enzymes across all three domains of life. Their role is to bind nicked DNA or DNA ends and re-join broken nucleic acid strands. In bacteria, there are two key pathways that DNA ligases are involved in: DNA replication during cell division and DNA repair for breaks in DNA that occur as a result of damage. In E.coli, there are two genes for DNA ligases: LigA, whose structure has been published and LigB as a second ligase (unknown in structure) that has a different DNA, and therefore protein, sequence. The overall aim of this work was first to clone, express, purify and test the kinetic and binding reactions of LigA and LigB as native proteins (not fusion-tagged versions, which most previous studies have used). This has not been reported before and the characterisation of the kinetics of LigA and LigB are very sparse in the literature. In this study we attempted to cover the lack of kinetic data on native LigA and LigB by studying how its functioning is affected by varying [DNA], [NAD⁺], reaction temperature, [NMN] and [NH₄SO₄]. The aim was to find the Vmax (maximal theoretical rate), K_m (Michaelis equilibrium constant) and kcat (turnover number) for the nick-sealing reaction with each different variable. We found that the Km values for LigA and LigB (how tightly they bound the nicked DNA) for singly-nicked DNA substrate were 12.22±6.42 and 3.50±1.34 nM, respectively. Therefore, native LigA was 6.4-fold tighter than native LigB. The K_m values for varying NAD⁺cofactor concentration were sharply different (1.55±0.33 vs. 0.16±0.03 µM), and show that LigB bound NAD⁺ 9.6 times tighter than LigA. However, the V_max values showed that LigA was 4-fold faster than LigB. Both native enzymes had a similar optimum temperature for activity. For LigA this was ~20ºC, and for LigB approximately ~16ºC. The remaining two parameters, [NMN] and [NH₄SO₄], were only studied for LigA. The interesting result for NMN was that it inhibited the reaction of LigA with an IC50 of 31.34±1.58 µM. This shows that one of the ligation products (NMN) acts as a feedback inhibitor. The K_m for the ammonium sulphate concentration experiment on LigA was 37.64±40.64 µM, and that [NH₄SO₄] stimulated the LigA reaction when present about 1.6 fold. The results from these characterisation studies allowed the development of a three-part molecular screening method (in silico to in vitro to in vivo) to build towards potential future studies that could then explore small molecule compounds that affect these basic kinetic parameters and find new ligase inhibitors. Therefore the second aim of the work was to explore the potential of DNA ligases (LigA in particular) as possible antibiotic targets. These involved the use of a molecular docking programme called Molecular Operating Environment (MOE). This software (in silico) was used to identify eight chemical compounds from a large library of possible small molecular inhibitors. The key question in this work was to see if these compounds could inhibit the E.coli DNA LigA in vitro (by denaturing gel experiments) and in vivo (by Kirby-Bauer bacterial surface-inhibition experiments). We found that four out of the eight compounds (5-Azacytidine, Geneticin (G418), Chlorhexidine and Imidazolidinyl Urea) did inhibit the activity of LigA in vitro with IC50 values of 10.34±4.14, 45.31±13.81, 20.66±6.11 and 7.56±14.48 µM, respectively. Three of the eight compounds: Geneticin (G418), Chlorhexidine and Imidazolidinyl, did inhibit the growth of the bacteria (in vivo) with IC₅₀ values of 0.63± 0.17, 0.17±0.03 and 233.25±143.35 mM, respectively. They had success in all three areas of study (in silico, in vitro and in vivo) and make them suitable candidates for future drug development studies as a promising chemical leads to target bacteria. In conclusion, this thesis provides important kinetic and binding data on LigA and LigB that will help explain how they work in E.coli. This thesis also provides clear evidence for at least three new ligase inhibitors of E.coli.

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Xhemalce, Blerta. "Rôle de SUMO dans l'(in)stabilité génétique chez S. Pombe". Paris 7, 2006. http://www.theses.fr/2006PA077177.

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La sumoylation est un mécanisme conservé de modification post-traductionnelle aboutissant à l'attachement d'une petite protéine reliée à l'ubiquitine et appelée SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) sur les protéines cibles. Ici, nous avons utilisé S. Pombe. Un organisme eucaryote unicellulaire génétiquement puissant, comme modèle d'étude pour élucider le rôle de la sumoylation dans les processus cellulaires responsables de la maintenance de la stabilité du génome. Nous avons montré que Pli 1p est une SUMO E3-ligase de la famille Siz/PIAS impliquée dans trois fonctions clé pour la stabilité génétique: les centromères, les télomères et la réparation des dommages à l'ADN durant la phase de duplication du génome
Sumoylation represents a conserved mechanism of post-translational modification resulting in the covalent attachment of the Small Ubiquitin-like Modifier SUMO protein on target proteins. Here, we have used S. Pombe, a monocellular eukaryotic organism providinq powerfull genetic tools as a model system to elucidate the roles of sumoylation in cellullar processes responsible for the maintenance of the stability of the genome. We showed Pli 1p to be a SUMO E3 Ligase of the Siz/PIAS family implicated in three key nuclear fonctions for genetic stability : the centromeres, the telomères and the repair of DMA damage occurring durina the S phase of genome duplication

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Coppel, Yannick. "Études de la structure de complexes ADN-ligand par résonance magnétique nucléaire et modélisation nucléaire : sondes de chiralite de l'ADN, modèles d'AP-endonuclease". Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015), 1996. http://www.theses.fr/1996GRE10079.

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Les avancees considerables realisees dans le domaine de la synthese de fragments d'adn et des methodes d'analyse de structures, notamment en resonance magnetique nucleaire (rmn) et en modelisation moleculaire, ont permis d'ameliorer nos connaissances des interactions adn-ligand. Notre travail s'inscrit dans cette problematique. Nous avons plus particulierement etudie deux classes de molecules qui ont respectivement des applications potentielles comme (1) sondes de chiralite de l'adn ou comme (2) nucleases artificielles interagissant specifiquement au niveau des lesions abasiques (ap-lyases). A l'aide d'une approche theorique par modelisation moleculaire, nous avons evalue la capacite de reconnaissance chirale de l'adn en conformation b (helice droite) de la base de trger 9,19-methano-9,10,19,20-tetrahydrodiacridino-b,f-1,5-diazocine. Cette molecule composee de deux noyaux aromatiques formant entre eux un angle d'environ 90, existe sous la forme de deux enantiomeres 1r,5r et 1s,5s. Nous avons montre que l'enantiomere 1s,5s etait susceptible de s'associer plus fortement avec l'adn-b que l'enantiomere 1r,5r. D'autre part par la rmn et par la modelisation moleculaire, nous avons determine la structure tridimensionnelle d'un undecamere contenant en son centre un analogue chimiquement stable du site abasique de type tetrahydrofurane (x), et de sequence d(cgcacxcacgc). D(gcgtgtgtgcg). Si pour cette sequence la thymine situee en face du site abasique conserve une position intrahelicoidale, la lesion induit toutefois un coude d'environ 30. L'utilisation conjointe des techniques de rmn et modelisation moleculaire, nous a permis d'etudier egalement la reconnaissance de cette lesion par des systemes de type base-chaine-intercalant doues d'activite de coupure, et de preciser le mode d'interaction de ces ap-lyases de synthese: (1) la base est situee dans la loge abasique et probablement appariee avec la thymine qui lui fait face, selon un mode de type hoogsteen ; (2) la chaine est positionnee dans le petit sillon ; (3) l'intercalant est situe a deux paires de bases et uniquement du cote 5' du site abasique. Nous avons enfin mis en evidence par rmn que le site abasique constituait un site d'intercalation preferentiel pour l'intercalant bromure d'ethidium. L'ensemble de ces resultats constitue une base structurale importante pour la recherche de nouvelles sondes de chiralite de l'adn ou de molecules capables d'interagir specifiquement au niveau des lesions abasiques

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Tran, Phong Lan Thao. "Quadruplexes de guanines : formation, stabilité et interaction". Thesis, Bordeaux 2, 2011. http://www.theses.fr/2011BOR21888/document.

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Les quadruplexes de guanines (G4) sont des structures non canonique d’acides nucléiques à quatre brins formées à partir de séquences ADN ou ARN riches en guanines. Ces structures reposant sur la formation et l’empilement de quartets de guanines sont très polymorphes, leur formation pourrait être envisagé dans de nombreux domaines d’application, aussi bien pour les biotechnologies que les nanotechnologies. L’étude de G4 tétramoléculaires modifiés présentée dans ce manuscrit a participé à la compréhension du mécanisme d’association de ces complexes. En particulier, nous avons montré que l’insertion de 8-méthyle-2’-déoxyguanosine à l’extrémité 5’ de la séquence favorise l’association et la stabilité du G4. Par ailleurs, l’étude de l’ADN en série L (image de l’ADN naturel dans un miroir) a montré la formation d’un G4 tétramoléculaire avec les mêmes propriétés que son énantiomère, à l’exception de sa chiralité, qui est inversée. L’étude a révélé également une auto-exclusion de deux énantiomères (forme D et forme L) démontrant un assemblage contrôlé des brins parallèles. Ce travail de thèse a aussi permis d’introduire un système simple et stable de visualisation de G4 tétramoléculaire antiparallèle, appelé “ADN synaptique”, sur une nanostructure d’ADN origami. In vivo, ces structures pourraient être impliquées de façon transitoire dans de nombreux processus biologiques, en particulier au niveau des télomères. Nous avons réalisé, au cours de cette thèse, une étude comparative de la structure et de la stabilité des séquences télomériques connues de différents organismes. Cette étude a permis d’enrichir les données nécessaires au développement d’un algorithme prédisant la stabilité de G4. Enfin, nous avons développé une méthode facile et peu coûteuse de criblage (G4-FID) sur plaques 96 puits permettant d’identifier l’interaction de ligands avec différentes séquences biologiques pertinentes. La stabilisation du G4 dans certaines régions du génome via des ligands spécifiques pourrait limiter la prolifération de cellules tumorales et est donc intéressante pour les thérapies anticancéreuses
Guanine quadruplexes (G4) are non-canonical four-stranded nucleic acid structures formed by guanine-rich DNA and RNA sequences. Theses polymorphic structures are built from the stacking of several G-quartets and could be involved in many fields, in biotechnology as well as in nanotechnology. The study of modified tetramolecular G4 presented in this manuscript participated to the understanding of tetramolecular G4 formation. Especially, we showed that the insertion of 8-methyl-2’-deoxyguanosine at the 5’-end of the sequence accelerate G4 formation and increase its stability. Besides, we demonstrate here that short guanine rich L-DNA strands (mirror image of natural DNA) form a tetramolecular G4 with the same properties than their enantiomer, but with opposite chirality. The study revealed also self-exclusion between two enantiomers (D- and L- form), showing the controlled parallel self-assembly of different G-rich strands. This work introduced also a simple and stable system to observe tetramolecular antiparallel G4 formation, called “synaptic DNA”, into a DNA origami nanostructure. In vivo, such structures appear to be implicated in genome dynamics, and especially at telomeres. During this thesis, we dedicated a study to the comparison of G4 folding and stability of known telomeric sequences from different organisms. The present study allowed enriching the dataset necessary to build and refine algorithms predicting G4 stability. Last but not least, we developed a G4 ligand screening method onto 96-well plates allowing the comparison of different biological relevant sequences. The G4 stabilisation by specific ligands in some genome regions may prevent cancer cell proliferation, making it an attractive target for anticancer therapy

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Somers, Neil. "Structural chemistry of copper(1) / pnicogen-ligand adducts". University of Western Australia. School of Biomedical and Chemical Sciences, 2004. http://theses.library.uwa.edu.au/adt-WU2005.0057.

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[Formulae and special characters can only be approximated here. Please see the pdf version of the abstract for an accurate reproduction.] Group 15 Lewis base adducts of Group 11 coinage metal salts of the form MX : L (1:n), where M=Cu(I),Ag(I),Au(I); X=(pseudo-)halide (Cl,Br,I,SCN,CN) and oxyanion; L-uni- or bi-dentate pnicogen ligand and n=1-4, may adopt monomeric, dimeric, oligomeric or polymeric structural forms. For the purpose of this study, the pnicogen bases are divided into two groups: the 'harder' nitrogen base ligands and 'softer' phosphine/arsine/stibine ligands. A sizeable body of structural data exits for adducts of silver(I) salts. Those with uni-dentate nitrogen base ligands are usually restricted to readily accessible liquid bases such as pyridine and its derivatives. The extension of such series to encompass ligands with more varied base characteristics may assist in the access of new bonding modes and stereochemistry, leading to control of these and of stoichiometry. Herein a number of complexes of copper(I) salts with uni-dentate nitrogen and bi-dentate phosphine/arsine/stibine adducts with differing degrees of complexity have been characterized, extending the known range of structural forms. Systematic variations in stoichiometry, halide, ligand and solvent of crystallization have provided a range of complexes whose structures have been determined by single crystal X-ray diffraction techniques. The structural relationship between these and other known adducts, often including their silver analogues, are considered, permitting comparisons of various common features and differences. The first section of this thesis (Chapter 3 and Chapter 4) reports a number of complexes of the form CuX : L (1:n) (CuX)Ln, L=uni-dentate nitrogen base ligand with n=1-3, the second section (Chapter 5 through Chapter 10) reports adducts with bi-dentate bis(diphenylpnicogeno)alkane ligands, Ph2E(CH2)xEPh2 (whereE=P,AS,Sb and x=1-6). The structural types and copper(I) coordination environments are influenced by CuX (salt) : ligand stoichiometry, the stereochemistry and basicity of the ligand, the type and size of the counter-ion (where applicable) and crystallization solvent. The structural types found for copper(I) (pseudo-)halide and oxyanion species are similar to those found for their silver(I) analogues, although the transitions between structural types may occur with different pnicogen and halide atoms, consequent on the smaller size of the copper(I) ion and differences in stereochemical preferences.

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Sureau, Camille. "Production du virus de l'hépatite B par une lignée d'hépatoblastique humaine différenciée après transfection par le génome viral récircularise". Tours, 1988. http://www.theses.fr/1988TOUR3801.

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Mirzadeh, Nedaossadat y s3114476@student rmit edu au. "Synthesis, structures and reactions of new cyclometallated dinuclear gold complexes containing the fluorine-substituted ligands". RMIT University. Applied Sciences, 2008. http://adt.lib.rmit.edu.au/adt/public/adt-VIT20081204.114414.

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The dinuclear cyclometallated gold(I) complex [Au2(μ-2-C6F4PPh2)2] was prepared in high yield from the reaction of 2-LiC6F4PPh2 with either [AuBr(AsPh3)] or [AuCl(tht)], and from the reaction of 2-Me3SnC6F4PPh2 with [AuCl(tht)]. The digold(I) complex undergoes oxidative addition reactions with halogens to give the metal-metal bonded dihalodigold(II) complexes [Au2IIX2(μ-2-C6F4PPh2)2] (X = Cl, Br, I), which on warming or exposure to light, isomerise to give the heterovalent gold(I)-gold(III) species [XAu(µ-2-C6F4PPh2)(κ2-2-C6F4PPh2)AuX] containing a four-membered cyclometallated ring on a gold(III) centre. Unlike its protio analogue, [Au2(μ-2-C6F4PPh2)2] did not undergo oxidative addition of methyl iodide or dibenzoyl peroxide. The dihalodigold(II) [Au2IIX2(μ-2-C6F4PPh2)2] and gold(I)-gold(III) compounds [XAu(µ-2-C6F4PPh2)(κ2-2-C6F4PPh2)AuX] (X = Cl, Br) are further oxidised by halogens to give the digold(III) species [Au2X4(μ-2-C6F4PPh2)2] and [X3Au(μ-2-C6F4PPh2)(κ2-2-C6F4PPh2)AuX], respectively. The complexes [Au2X4(μ-2-C6F4PPh2)2] are reduced to the dihalodigold(II) complexes in the presence of one equivalent of zinc powder; further addition of zinc gave the parent digold(I) dimer. Treatment of [Au2IICl2(μ-2-C6F4PPh2)2] and [ClAu(µ-2-C6F4PPh2)(κ2-2-C6F4PPh2)AuCl] with an excess of silver nitrate, benzoate, acetate, trifluoroacetate or triflate gave the corresponding oxyanion complexes. Slow crystallisation of the di(benzoato)digold(II) complex from dichloromethane and methanol gave the parent digold(I) complex derived by reductive elimination. The di(triflato)digold(II) complex behaved similarly, although in this case the novel gold(I) tetramer [Au4(μ-2-C6F4PPh2)4] was formed together with the dimer. Two closely related gold complexes containing the chelating κ2(C,O) phosphine oxide ligand, 2-C6F4P(O)PPh2, were isolated from the reaction of [ClAu(µ-2-C6F4PPh2)(κ2-2-C6F4PPh2)AuCl] with an excess of silver nitrate. The reaction of [Au2IICl2(μ-2-C6F4PPh2)2] with two equivalents of potassium trifluoroethoxide failed to give the corresponding digold(II) bis(alkoxo) complex; instead, reduction took place to form the digold(I) dimer [Au2(μ-2-C6F4PPh2)2]. Treatment of a solution of the di(benzoato)digold(II) complex with C6F5Li gave the pentafluorophenyl complex [Au2(C6F5)2(μ-2-C6F4PPh2)2] which, when heated in toluene, rearranged to the gold(I)-gold(III) complex [(C6F5)Au(µ-2-C6F4PPh2)(κ2-2-C6F4PPh2)Au(C6F5)], analogous to the behaviour of the dihalodigold(II) complexes. The heterovalent, gold(I)-gold(III) dimethyl compound [Au2I,III(CH3)2(μ-2-C6F4PPh2)2] was obtained from the reaction of the di(benzoato)digold(II) complex with dimethylzinc. This compound is structurally similar to its tetraprotio analogue. The cycloaurated dinuclear gold complexes [Au2(μ-C6H3-n-F-2-PPh2)2] (n = 5, 6) were made similarly to the 2-C6F4PPh2 analogue from the appropriate lithium or tin reagents, though in some cases the dimers were formed in admixture with the corresponding gold(I) tetramers. Like their tetrafluoro analogues, the 6-fluoro complexes [Au2X2(μ-C6H3-6-F-2-PPh2)2] (X = Cl, Br, I) rearrange on heating to give the heterovalent gold(I)-gold(III) species [XAu(µ-C6H3-6-F-2-PPh2)(κ2-C6H3-6-F-2-PPh2)AuX]. Thus, the presence of a fluorine atom in place of hydrogen in the 6-position of the bridging aryl group is sufficient to stop the isomerisation of the digold(II) complexes [Au2X2(μ-2-C6H4PPh2)2] at the gold(I)-gold(III) stage and to prevent subsequent C-C coupling of the aryl groups at the gold(III) centre. In contrast, the dihalodigold(II) complexes containing the 5-fluoro substituted ligand undergo reductive elimination and coupling of the metallated aryl groups to give the digold(I) biphenyldiyl complexes [Au2X2(2,2'-Ph2P-5-FC6H3C6H3-5-F-PPh2)] (X = Cl, Br, I). The described complexes were characterised using 1H NMR, 31P NMR, 19F NMR spectroscopy, elemental analysis, mass spectroscopy, IR spectroscopy, X-ray diffraction and 197Au Mössbauer spectroscopy.

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Castaneda, Saucedo Eduardo. "Role of the retinoid X receptor α (RXRα) and its heterodimetric partners during skin carcinogenesis". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2004. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2004/CASTANEDA_SAUCEDO_Eduardo_2004.pdf.

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Sallez, Yves. "Conception d'un système de programmation hors ligne de cellules robotisées intégrant le langage ADA". Valenciennes, 1988. https://ged.uphf.fr/nuxeo/site/esupversions/3941307a-1d5e-4e41-8bd2-65df2a934515.

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Le système incluant les phases de description, programmation et simulation doit respecter les contraintes de modularité, prise en compte du parallélisme des activités au sein de la cellule, communication homme-machine. Un modèle conceptuel, décrivant les aspects fonctionnels, matériels et les caractéristiques de commande de la cellule, sert de base au modèle de description.

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Sallez, Yves. "Conception d'un système de programmation hors ligne de cellules robotisées intégrant le langage ADA". Grenoble 2 : ANRT, 1988. http://catalogue.bnf.fr/ark:/12148/cb37618415n.

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Piccolo, Stefano. "Biophysical characterization of aptamer-ligand interactions by native mass spectrometry". Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0276.

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Les aptamères sont des acides nucléiques capables de se lier sélectivement à un ligand ou à une famille de molécules. Les aptamères sont la partie sensible des riboswitches, qui sont des segments régulateurs de l'ARN messager impliqués dans l'expression génétique. Les aptamères ont aussi des applications prometteuses comme sondes artificielles et capteurs Pour ces technologies, il est crucial de comprendre comment la liaison se produit, de la quantifier, et de comprendre comment les changements conformationnels sont induits par les ligands. Les objectifs de cette thèse sont d'explorer l'applicabilité de la spectrometrie de mobilité ionique (IMS) couplée à la spectrométrie de masse (SM) native aux aptamères d'ADN et d'ARN, d'abord dans la quantification de liaison, ensuite dans la détection du changement conformationnel lors de la liaison du ligand.Dans la première partie, nous avons évalué la détermination des valeurs de constantes d’équilibre de dissociation (KD) par MS, en tenant compte des facteurs de réponse relatifs (Rx) des aptamères libres et liés. Les titrages en SM sont comparés, pour validation, avec la calorimétrie par titrage isotherme (ITC). Deux aptamères d'ARN sont pris comme modèles : l'aptamère du vert de malachite, largement étudié par ITC, et l'aptamère de la riboflavine mononucléotide , un cas réaliste d'ARN Mg2+-dépendant pour la liaison du ligand. Nous avons observé que l'acétate d'ammonium et l'acétate de triméthyl ammonium conviennent à l'étude des aptamères et leurs complexes, et que les valeurs de KD obtenues par ITC et SM native sont comparables. Les aptamères ARN de la néomycine et de la tobramycine ont été choisis pour tester la limite de détection en SM native. Nous concluons que la SM native est adaptée pour déterminer des valeurs de KD comprises entre 50 nM et 30 µM. La correction apportée par Rx est relativement modeste dans tous les cas, en suggerant que la liaison du ligand n'est pas associée à une différence conformationnelle significative lors de l'ionisation. Pour ces aptamères, nous concluons que l'hypothèse de Rx égaux est acceptable.Dans la deuxième partie, nous avons évalué si le mécanisme de "liaison adaptative" des aptamères peut être révélé par IMS. À cette fin, en plus des systèmes énumérés ci-dessus, nous avons étudié l'aptamère ARN de la tétracycline et une série d'aptamères ADN capables de lier la cocaïne, pour lesquels le changement conformationnel par liaison du ligand est largement documenté dans la littérature. Pour tous les aptamères à l'exception de l'aptamère de la tétracycline, nous n'avons pas observé de différences significatives dans la conformation en phase gazeuse des ions liés aux ligands ou Mg2+. Cependant, nous avons observé un changement significatif dans la mobilité des ions de l'aptamère de la tétracycline. Le Mg2+ (100 µM) s’avère essentiel pour la liaison du ligand. Pour la série des aptamères de la cocaïne, même si nous ayons observé dans des conditions douces de pré IMS des ions compacts aussi bien pour les aptamères libres que pour les aptamères liés, une extension conformationnelle est visible à haute activation pre-IMS, bien révélée par l'état de charge 7-, qui suggère des réarrangements de phase gazeuse. Pour mieux étudier ces réarrangements, nous avons modifié les séquences avec des extensions dA, afin de comparer des systèmes ayant un nombre similaire de degrés de liberté sans modifier la structure cœur. Nous proposons également de nouvelles façons de présenter ces données, mieux adaptées quand la dissociation du ligand, la perte d’aduits et le dépliement d’ion arrivent dans les mêmes gammes d’énergie. L'augmentation graduelle de l'activation collisionnelle avant l'IMS, a révélé que l’energie de dépliement est corrélée au contenu en paires de bases, ce qui suggère que les paires de bases sont conservées dans les structures en phase gazeuse. Nous avons également observé que le ligand se perd à des énergies inférieures à celles du dépliage
Aptamers are single-stranded nucleic acids capable to bind selectively to a ligand or to a family of molecules. Aptamers are the sensing part of riboswitches, which are regulatory segments of messenger RNA involved in gene expression. Aptamers are also promising artificial probes, sensors and stimuli-responsive elements. In the development of aptamer-based technology, it is crucial to understand how binding is occurring, to quantify affinities, and ligand-induced conformational changes. The objective of this thesis is to explore the applicability of native IM-MS to DNA and RNA aptamers to quantify binding and to detect conformational change upon binding.In the first part, we evaluated the quantitative determination of equilibrium dissociation constants (KD) by mass spectrometry (MS), and the necessity of including a correction for relative response factors of free and bound aptamers. We compared isothermal titration calorimetry and MS titrations to validate the quantifications. Two RNA aptamers were taken as models: the malachite green aptamer, extensively studied by ITC, and the riboflavin mononucleotide aptamer, a case of Mg2+-dependent ligand binding. We observed that typical volatile electrolytes ammonium acetate and trimethyl ammonium acetate are suitable to study RNA aptamer binding, and that comparable KD values are obtained from ITC and native MS. The neomycin and tobramycin RNA aptamers were chosen to test the limit of detection of native MS. We found that native MS is appropriate to determine KD values in the range from 50 nM to 30 µM. The relative response factor correction was relatively modest in all cases, suggesting that the ligand binding is not associated to a significant conformational difference upon ionization. For these aptamers, we conclude that assuming equal response factors is acceptable.In the second part, we evaluated whether the aptamers’ “adaptive binding” mechanism can be revealed by ion mobility spectrometry (IMS). To this aim, in addition to the systems listed above we studied the tetracycline RNA aptamer and a series of cocaine-binding DNA aptamers, for which the conformational change upon binding is reported in literature. For all aptamers except the tetracycline aptamer, we did not observe a significant difference in the shape of the gas-phase structure upon ligand or Mg2+ binding. However, a significant change was observed in tetracycline RNA aptamer’s ion mobilities, at biologically relevant concentration of Mg2+ (100 µM), and we found that Mg2+ is essential for ligand binding, in agreement with previous solution studies. For the cocaine-binding DNA aptamer series, although we observed similar compactness for the free and bound aptamers in soft pre-IMS conditions, a conformational extension occurs at high pre-IMS activation, best revealed by charge state 7-, suggesting gas-phase rearrangements. To better investigate whether the energetics of these rearrangements depend on pre-folding or on ligand binding, we modified the sequences with dA overhangs, to compare systems with similar numbers of degrees of freedom without altering the core structure. We also propose new ways of presenting the data, adapted to the cases where ligand dissociation, declustering and unfolding occur at similar voltages. The gradual increase of the pre-IMS collisional activation revealed that the unfolding energetics is correlated with the base pairs content, suggesting that base pairs are conserved in the gas-phase structures. We also found that ligand is lost at lower energies than unfolding.In summary, gas-phase compaction occur for both the free aptamers and bound aptamers, and memories of the solution-phase structures can only be revealed in some particular cases. However, the compaction towards similar shapes might constitute an advantage for the quantification, because molecular systems of similar shapes have similar electrospray responses. Consequently, native MS provides reliable estimations of KD values

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Ayel, Elodie. "Reconnaissance spécifique de l'ADN en double-brin par des oligonucléotides : sélection in vitro en présence de ligand". Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066329.

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La reconnaissance spécifique de l’ADN en double-brin par des molécules synthétiques permet de développer de nouvelles approches thérapeutiques ainsi que de nouveaux outils moléculaires pour la compréhension de processus biologiques. Parmi ces ligands synthétiques, les oligonucléotides formant des triple-hélices (OFT) sont très étudiés au laboratoire. Ils ne peuvent se fixer que sur des séquences oligopurines•oligopyrimidines. Leur fixation peut être renforcée par l’utilisation de ligands stabilisant les triple-hélices en s’intercalant entre les triplets de bases. A ce jour, il n’existe pas de règles simples pour déterminer le meilleur OFT pour une cible donnée en présence de ligand. Nous avons développé une approche combinatoire afin de sélectionner des oligonucléotides qui se fixent avec une grande affinité et spécificité sur des cibles d’ADN double-brin en présence de ligands stabilisant les triple-hélices. Nous avons tout d’abord mis au point un protocole de sélection in vitro à pH neutre. Pour cela, nous avons développé des outils permettant de mesurer l’efficacité de ce protocole et de suivre l’enrichissement en séquences spécifiques au cours du processus de sélection. Nous avons ensuite appliqué cette stratégie à l’étude de deux types de cibles d’ADN en double-brin en présence de ligands des triple-hélices, l’une possédant une séquence strictement oligopurine•oligopyrimidine et l’autre une séquence oligopurine•oligopyrimidine alternée. Les oligonucléotides sélectionnés contre la cible oligopurine•oligopyrimidine sont capables de former des triple-hélices avec un motif antiparallèle. Dans le cas de la cible oligopurine•oligopyrimidine alternée, les séquences sélectionnées sont composées de blocs de thymines entrecoupées par des cytosines ou des guanines. Des analyses complémentaires nous ont permis de mettre en évidence que ces oligonucléotides se fixent selon des orientations différentes en formant deux ou trois petites triple-hélices saut de brin. Ces études nous ont permis de mieux caractériser la formation de triple-hélices en présence de ligands spécifiques et de nouveaux motifs structuraux ont été mis en évidence. Ce système expérimental ouvre la voie à l’étude de nouveaux ligands et au ciblage de nouvelles séquences cibles.

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Sidibe, Assitan. "Effet de ligands de G-quadruplexes sur la séquence terminale des télomères". Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2012. http://www.theses.fr/2012MNHN0017.

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Les télomères sont des complexes nucléoprotéiques situés à lʼextrémité des chromosomes. Le rôle des télomères dans la protection du génome, et leur implication dans la sénescence et le cancer en font une cible privilégiée dans la lutte contre le cancer. Une stratégie originale consiste à bloquer lʼaccès de lʼextrémité télomérique aux protéines nécessaires à sa réplication et à sa stabilité comme par exemple la télomérase qui est activée dans 85% des cancers ou les protéines POT1 et TRF2 qui protègent lʼextrémité télomérique. A cause de la répétition en guanines du brin G, lʼextrémité des télomères peut former des structures en quadruplexes de guanines (G- quadruplexes) dont la stabilisation par des ligands spécifiques (Ligands G4) bloque la réplication des télomères et altère son intégrité. Le traitement de cellules tumorales par des ligands G4 provoque une dysfonction télomérique associée à une dissociation des protéines POT1 et TRF2 et conduit à une apoptose ou une sénescence des cellules. Lʼanalyse de la séquence terminale de lʼextrémité télomérique par la méthode STELA (Single Telomere Length Analysis) montre que la séquence terminale du brin C se termine majoritairement par la séquence ATC-5ʼ. La protéine POT1 est responsable de la résection du brin C des télomères en recrutant une exo- nucléase capable de créer le substrat simple-brin pour la télomérase. La déplétion de POT1 par ARN interférence provoque une dérégulation de la terminaison du brin C. Nous avons étudié au cours de notre travail lʼeffet de ligands G4 sur la séquence terminale du brin C télomérique au niveau des télomères du chromosome XpYp et au niveau de lʼensemble des télomères en utilisant une modification de la technique de STELA. Nos résultats montrent quʼune faible concentration des dérivés de la série des pyridines dicarboxamides provoque un effet mineur mais significatif au niveau de la séquence terminale des télomères XpYp et au niveau de lʼensemble des télo- mères dans la lignée HT1080. Au contraire, une concentration plus importante ne modifie pas la séquence terminale du brin C dans les cellules HT1080, A549 et HeLa, mais induit un stress réplicatif. Lʼeffet modeste de ces ligands sʼexplique par une activité de dissociation incomplete de la protéine POT1 des télomères comparativement à sa déplétion par ARN interférence. En effet, nous avons également montré que la déplétion quasi complète de POT1 par shARN induit une randomisation de la séquence terminale du brin C
The role of telomeres in protecting the genome, and their involvement in senescence and cancer make them a prime target in the fight against cancer. An original strategy is to block the access of proteins to the telomeric end necessary for replication and stability, such as telomerase which is activated in 85% of cancers or TRF2 and POT1, proteins that protect the telomeric end. Because of the guanine repetition on the G strand, telomeric ends can form quadruplex structures in guanine (G-quadruplexes) whose stabilization by specific ligands (G4 ligands) blocks the replication of telomeres and alters its integrity. Treatment of tumor cells with G4 ligands causes a dysfunction associated with the dissociation of telomeric proteins POT1 and TRF2 and leads to apoptosis or cell senescence. The analysis of the telomeric end terminal sequence by the STELA method (Single Telomere Length Analysis) shows that the C-terminal sequence of the strand ends mainly by the sequence ATC-5 ʼ. POT1 protein is responsible for the resection of the C strand of telomeres by recruiting an exonuclease capable of creating a single-stranded substrate for telomerase. Depletion of POT1 by RNA interference causes a deregulation of the C strand end. We studied in our work the effect of G4 ligands on the terminal sequence of the telomeric C strand at the telomere of chromosome XpYp and at all telomeres using a modification of the technique of STELA. Our results show that a low concentration of derivatives of the pyridine dicarboxamides series causes a minor but significant effect on the terminal sequence of XpYp telomeres and of all telomeres in HT1080 cell line. On the contrary, a higher concentration does not alter the C strand termination in HT1080, A549 and HeLa cells but induces a replicative stress. The modest effect of these ligands can be explained by an incomplete activity of dissociation of the protein POT1 of telomeres compared to its depletion by RNA interference. Indeed, we also showed that the nearly complete depletion of POT1 by shRNA randomizes the terminal sequence of the C strand

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Papillon, Julie. "Etude structurale et fonctionnelle des complexes de l'ADN gyrase, une ADN topoisomérase bactérienne de type II". Thesis, Strasbourg, 2012. http://www.theses.fr/2012STRAJ127.

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Les ADN topoisomérases (Topos) sont des éléments essentiels de la vie cellulaire eucaryote et procaryote. Ces enzymes interviennent lors de la réplication, de la réparation et également lors de la transcription en modulant la topologie de l'ADN. L'ADN gyrase, une Topoisomérase IIA (TopoIIA) bactérienne particulière, est la seule topoisomérase capable de surenrouler l’ADN négativement en présence d’ATP, une activité indispensable au génome bactérien. Les différentes études structurales et fonctionnelles sur ces enzymes ont permis de proposer un mécanisme catalytique de surenroulement très sophistiqué mais la vision morcelée de ces complexes multi-‐conformationnels laisse aujourd’hui de nombreuses questions mécanistiques en suspens. Ce travail de thèse a combiné une approche structurale et fonctionnelle pour essayer de répondre aux questions fondamentales mécanistiques encore non élucidées à propos des ADN topoisomérases de type II et à la découverte de nouveaux inhibiteurs « anti-‐Topo » face à l’émergence de populations bactériennes résistantes aux traitements
Type II DNA topoisomerases (Topo2A) remodel DNA topology during replication, transcription and chromosome segregation. Most TopoIIA are able to perform ATP-‐dependent DNA relaxation or decatenation but the bacterial DNA gyraseis the sole type II DNA topoisomerase able to introduce negative supercoils. Several biochemical and structural studies haverevealed a highly sophisticated supercoiling catalytic mechanism but despite a wealth of information, the full architectureof Topo2A and the structural basis for DNA supercoiling remain elusive. Due to their physiological roles, topoisomerasesare also important targets for antibiotics targeting the bacterial enzyme but also anti-‐cancer molecules inhibiting the humanprotein. This presented work has combinedboth structural and functional approach to answer the fundamental mechanisticquestions still unveiled and to discover new inhibitors against the emergence of resistant bacterial population

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Fraser, Claire Louise. "Bisubstrate kinetics and processivity measurements on Escherichia coli DNA ligase A". Thesis, University of Portsmouth, 2012. https://researchportal.port.ac.uk/portal/en/theses/bisubstrate-kinetics-and-processivity-measurements-on-escherichia-coli-dna-ligase-a(25bf65df-5bce-44d2-a589-8c937546f296).html.

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Resumen

DNA ligases are essential repair enzymes required for maintaining genomic integrity in cells. The first ligase to be discovered was Escherichia coli DNA ligase; a 670 amino acid, 74 kDa, NAD+ dependent ligase. This work reports a series of studies into the behaviour of His-tagged E.coli ligase. Order-of-addition studies on singly-nicked oligoduplexes under steady state conditions revealed that ligase undergoes an obligatory off-step from the DNA after sealing a break in a phosphodiester strand before readenylation in solution. These results corroborate the findings of Lehman that a sequential model is the normal mode of Ligase operation. Ligase affinity for its substrates NAD+ and DNA were 3.5 μM and 3.5 nM respectively. Length dependency studies on singly-nicked PCR substrates revealed that when two different DNA lengths were in the same solution, the initial association rate was always faster for the longer DNA substrate. For example, 40 bp versus 902 bp gave initial rate values 0.06 nM/min (40 bp) and 0.28 nM/min (902 bp); increasing the length 22 fold increased the initial rate 4 fold. This hints that Ligase uses DNA flanking a nick to locate its specific site. Processivity studies were achieved to determine the one- or three-dimensional pathway of Ligase using doubly-nicked DNA. Nicks were either directly repeated (on the same DNA strand) or inverted (opposite strands). Results revealed Ligase is weakly processive; 32% processive. However, when beta-clamp and gamma-loader were added to the reaction processivity significantly increased.

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Tesis sobre el tema "ADN Ligase"

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