Literatura académica sobre el tema "[4Fe-4S]2+"

Cette these se situe dans le cadre des modelisations chimiques de proteines fer-soufre, plus particulierement les proteines fer-soufre a haut potentiel (hipip). L'objectif est de synthetiser des centres 4fe-4s dans les deux etats d'oxydation physiologiques 4fe-4s#2+ et 4fe-4s#3+ et de les caracteriser d'un point de vue physico-chimique. L'hypothese a partir de laquelle le sujet a ete aborde consiste a supposer qu'il est necessaire d'etablir une zone steriquement encombree et hydrophobe autour de l'agregat afin de proteger le centre 4fe-4s#3+ d'une degradation oxydante. Pratiquement, un tel environnement encombre et hydrophobe a ete realise grace a l'utilisation de ligands thiolates riches en noyaux aromatiques et tres encombres. Pour chaque ligand utilise, le centre 4fe-4s#2+ a ete synthetise et caracterise par les spectroscopies uv-visible, rmn et mossbauer, et l'etude de sa susceptibilite magnetique a aussi ete effectuee. Dans un deuxieme temps, des etudes d'oxydation sont realisees sur ces nouveaux composes modeles 4fe-4s#2+ dans le but d'obtenir des centres 4fe-4s#3+. Des phenythiolates d'une part et des benzylhtiolates d'autre part, tous tres hydrophobes, ont ete utilises comme ligands. Dans chacun des cas, un nouveau modele de hipip a ete obtenu et completement caracterise dans les deux etats redox. Celui avec le ligand de type benzylthiolate est un meilleur modele chimique de ces proteines car il utilise des ligands plus biomimetiques. Par ailleurs, l'influence exercee par l'encombrement sterique a ete etudiee de facon systematique. En utilisant une serie de ligands encombres de facon croissante, il a pu etre montre tres clairement que la presence d'un environnement encombre (et toujours tres hydrophobe) au voisinage immediat de l'agregat assure la protection du centre 4fe-4s#3+ vis-a-vis des degradations ulterieures. L'ensemble des resultats obtenus autorisent a conclure sur la validite de l'hypothese de depart, laquelle preconisait l'emploi de ligands encombres pour l'obtention de tels modeles stables. Ce travail permet alors egalement de confirmer l'hypothese sur les proteines qui consiste a dire que l'hydrophobicite est un critere fondamental pour qu'une proteine a 4fe-4s fonctionne comme une hipip plutot que comme une ferredoxine

Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est un cofacteur clé du métabolisme cellulaire. Synthétisé à partir d'acide quinolinique (QA) chez tous les organismes vivants, la biosynthèse du QA diffère entre les eucaryotes et les procaryotes. Chez les eucaryotes, il est produit à partir de L-tryptophane alors que chez les procaryotes et les plantes, il est synthétisé par l'action concertée de deux enzymes: la L-aspartate oxydase (NadB) qui permet la formation d'iminoaspartate (IA) à partir de L-aspartate et la quinolinate synthase (NadA) qui permet la condensation de deux molécules, la dihydroxyacétone-phosphate (DHAP) et l'iminoaspartate, pour former l'acide quinolinique. En plus de cette voie dite « de novo », la plupart des organismes possèdent une voie de secours qui produit le NAD à partir de niacine provenant de l'alimentation ou de la dégradation du NAD. Chez certains pathogènes tels que Mycobacterium leprae et Helicobacter pylori, cette voie de secours n'existe pas. Ceci fait de NadA une cible particulièrement attractive pour la conception d'antibactériens et ceci d'autant plus qu'elle est absente chez l'homme.NadA est la seule enzyme de la voie de biosynthèse de novo du NAD dont le mécanisme moléculaire et la structure tridimensionnelle sous forme active (avec son centre [4Fe-4S]2+) sont inconnus. Grâce à l'utilisation d'analogues de substrats ou d'intermédiaires réactionnels, nous avons pu non seulement avancer dans l'élucidation du mécanisme moléculaire de NadA et notamment dans la compréhension du rôle du centre [4Fe-4S]2+ dans la catalyse mais en plus, nous avons été en mesure de proposer un 1er inhibiteur in vitro et in vivo de NadA : l'acide 4,5 Dithiohydroxyphtalique (DTHPA). Le DTHPA nous a fourni de bonnes bases pour la conception d'inhibiteurs puissants et spécifiques de NadA grâce à une étude Structure-Activité. Par ailleurs, nous avons résolu la 1ère structure aux rayons X de NadA sous forme holoprotéine dont les données structurales nous ont grandement aidé dans la compréhension du mécanisme de NadA<br>The Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) is a key cofactor essential for cellular metabolism. Synthesized from quinolinic acid (QA) in all living organisms, NAD biosynthesis is different between eucaryotes and procaryotes. Indeed, most of eukaryotes produce QA from L-tryptophan, whereas most of prokaryotes and plants synthesize QA by the concerted action of 2 enzymes: L-aspartate oxydase (NadB), an FAD enzyme, which catalyzes L-Aspartate oxidation to form iminoaspartate (IA) while quinolinate synthetase (NadA) allows condensation between IA and Dihydroxyacetone Phosphate (DHAP) to produce QA. Besides this « de novo » pathway, most eukaryotes and some bacteriae have a salvage pathway which allows NAD synthesis from nutrients and metabolites of NAD degradation in order to maintain a correct pool of NAD in the cell. However, some pathogens like Mycobacterium leprae, Helicobacter pylori do not possess this pathway. As a consequence, NadA represents a very attractive target for designing specific antibacterial agents since it does not exist in Human.NadA is the only metalloenzyme of NAD de novo biosynthesis whose molecular mechanism and tridimensional structure with its [4Fe-4S]2+ cluster are unknown. Using substrate and intermediate analogues, we have been able to understand better NadA mechanism, especially [4Fe-4S]2+ cluster role in catalysis. Moreover, we proposed the first in vitro and in vivo inhibitor of NadA : the 4,5 Dithiohydroxyphtalic Acid (DTHPA) which gave us basis to design powerful and specific NadA inhibitors thanks to a structure-activity relationship study. Besides, we resolved the first X-rays structure of NadA under its holoprotein form. Datas we extracted from it helped us greatly to understand NadA mechanism

Les centres fer-soufre sont des groupements metalliques presents dans une grande variete de proteines ou ils assurent des fonctions tres diverses. Depuis plus d'une vingtaine d'annees, la description de leurs proprietes a suscite une somme considerable de travaux, mais la comprehension de leur structure electronique se heurte a plusieurs difficultes liees a la presence d'etats de valence mixte fe i i et fe i i i et a leur delocalisation sur plusieurs sites fe. Dans ce contexte, nous avons entrepris une etude systematique des proprietes magnetiques des centres 4fe4s 2 + / 3 + presents dans la proteine a haut potentiel de chromatium vinosum et de plusieurs composes modeles. Nous avons choisi d'effectuer des mesures d'aimantation et de spectroscopie optique sur une gamme etendue de temperatures. Ce qui nous a permis d'obtenir des informations structurales tout a fait complementaires de celles obtenues par d'autres techniques spectroscopiques : mosbauer, rmn, rpe. Nous avons pu demontrer que dans les systemes 4fe4s 2 +, la modelisation par paires en symetrie d 2 d et une description des interactions en termes d'interactions d'echange et de double, echange permettent de rendre compte des resultats obtenus. En revanche, dans le cas des systemes 4fe4s 3 +, la description n'a pu etre obtenue que de maniere approximative. Pour ces systemes, nous avons entrepris de raffiner leur description en prenant en compte le phenomene de couplage vibronique, et nous avons obtenu des resultats tres prometteurs.

IspH est la dernière enzyme de la voie du méthylérythritol phosphate qui produit les deux précurseurs nécessaires à la biosynthèse de tous les isoprénoïdes. Cette métalloenzyme est essentielle à la survie de nombreux microorganismes dont des bactéries pathogènes et le parasite responsable du paludisme. Etant absente chez l’humain, IspH est une cible de choix pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens. En utilisant une approche pluridisciplinaire combinant biologie moléculaire, enzymologie, spectroscopies Raman, Mössbauer et cristallographie, l’objectif de cette thèse était d’étudier le mécanisme d’IspH et plus particulièrement les paramètres qui gouvernent la formation des deux produits dans un ratio défini. Plusieurs mutants d’IspH d’E coli ont été produits, étudiés et caractérisés, et les résultats ont mis en évidence des acides aminés importants pour l’activité enzymatique et aussi pour maintenir le ratio des deux produits. Lors des études biophysiques, ces mutants ont révélé des différences au niveau de leur cofacteur, un centre [4Fe4S]2+, et de leur façon de lier le substrat par rapport à l’enzyme de type sauvage. IspH a pour la première fois été étudiée par spectroscopie Raman et une analyse détaillée a été menée<br>IspH is the last enzyme of the methylerythritol phosphate pathway which produces the two precursors needed for the biosynthesis of all isoprenoids. This metalloenzyme is essential for the survival of many microorganisms, among them pathogenic bacteria and the parasite responsible for malaria. Being absent in humans, IspH is a suitable target for the development of novel antimicrobial agents. Using a multidisciplinary approach combining molecular biology, enzymology, Raman and Mössbauer spectroscopy, and crystallography, the objective of this thesis was to understand the mechanism of IspH and especially the formation of the two products in a defined ratio. Several mutants were produced, studied and characterized, and the results shed light on some amino acids which are important for the enzyme activity and for maintaining the ratio of the two products. During biophysical studies, these mutants revealed differences in their cofactor, a [4Fe4S]2+ cluster, and in their way to bind the substrate as compared to the wild type enzyme. IspH has for the first time been studied using Raman spectroscopy and a detailed analysis was conducted

<p>The work performed herein describes three proteins: Uracil DNA glycosylase (UDG) from Archaeoglobus fulgidus, MutY, and Endonuclease III (EndoIII) from Escherichia coli. They are DNA repair glycosylases that contain [4Fe-4S] clusters. While the catalytic mechanisms of many BER enzymes have been studied in detail, questions remain about how these enzymes search the vast amount of cellular DNA to find their substrates, and why some require a [4Fe-4S] cluster. The iron-sulfur cluster is not necessary for catalysis, and it only displays a physiologically relevant midpoint potential when bound to DNA. We have proposed that UDG, MutY, and EndoIII use their [4Fe-4S] clusters to participate in DNA-mediated charge transport (CT), and that these proteins mediate long-range electrochemical signaling in order to detect DNA damage.</p> <p>This scheme for DNA damage detection assumes that CT occurs efficiently between the DNA helix and the [4Fe-4S] cluster of the bound protein. In order for efficient CT to occur, a pathway of amino acids must be present that facilitates CT between the DNA and the iron-sulfur cluster. For each of the enzymes mentioned, this pathway was explored through mutagenesis. In UDG, MutY, and EndoIII, several amino acids thought to be important for CT were mutated and the resulting proteins were characterized biochemically. Their CT capabilities were analyzed by cyclic voltammetry on DNA-modified electrodes. In these experiments, the mutants’ signal intensities were quantified and compared to those of wild-type enzyme. An attenuated signal relative to wild-type protein may indicate that the mutant is deficient in CT and that the targeted amino acid is part of the protein-DNA CT pathway in the native enzyme. Many mutants were also screened by enzymatic assays and circular dichroism spectroscopy to further characterize their DNA-binding properties and structural stability.</p> <p>The A. fulgidus UDG mutants examined, C17H, C85S, and C101S, all contained mutations in the cysteine residues that ligate the [4Fe-4S] cluster. These mutants were designed to determine how the iron-sulfur cluster coordination environment affects protein-DNA CT. The mutants exhibited varying signal strengths relative to WT UDG on DNA-modified electrodes. C85S produced a weaker signal, indicating a CT deficiency. The signal intensity from C101S was within error of that of WT, and the signal from C17H was larger than that of WT, possibly indicating that this mutant is less structurally stable than WT UDG.</p> <p>In E. coli MutY, position Y82 aligns with Y165 in MUTYH, a residue in which mutations have been found in many colorectal cancer patients. To better understand the correlation between protein-DNA CT and colorectal cancer, the MutY mutants Y82C and Y82L were prepared and characterized. Y82C exhibited a CT deficiency relative to WT MutY, whereas Y82L did not. These data indicate that Y82 forms part of the CT pathway in native E. coli MutY, but that other long-chain amino acids, such as leucine, can also mediate CT efficiently at this position.</p> <p>Several different mutants of E. coli EndoIII were examined. First, the Y82 position was targeted, since the aligning MUTYH residue has been found mutated in colorectal cancer patients and because this residue is located near the protein-DNA interface. Five mutations were made at or near the Y82 position, and their cyclic voltammetry signals demonstrated that aromatic amino acids best mediate CT at this position. Other residues towards the interior of the protein, Y75, Y55, and F30 were also mutated to alanines. These mutants exhibited CT deficiencies, implicating the residues as part of a potential CT pathway. Residues W178 and Y185, located near the [4Fe-4S] cluster of EndoIII, were also mutated to alanines. The resulting mutants produced larger signals than that of WT EndoIII. These mutants were later shown by circular dichroism spectroscopy to be less stable structurally than WT EndoIII. All of the mutants mentioned exhibited enzymatic properties similar to those of WT, suggesting that they are able to bind DNA and excise damage nucleobases as well as the native enzyme. Several of these mutants were also used in a mutagenesis-based experiment to assay how EndoIII variants help MutY search for DNA lesions, although data from these experiments showed no significant differences in mutation rate between strains expressing different EndoIII variants.</p> <p>In total, the mutagenesis studies performed here helped determine the characteristics of BER enzymes that enable them to mediate DNA-protein CT. All these enzymes must contain a stable, well-protected metallocluster that charge can access through a series of CT-facilitating amino acids. In discovering several residues important for protein-DNA CT in UDG, MutY, and EndoIII, we have strengthened support for the hypothesis that these enzymes facilitate DNA-mediated CT in vivo. These enzymes may in fact be part of a much larger array of redox-active DNA-binding proteins that communicate electrochemically to help each other detect and repair DNA lesions inside the cell.</p>