Academic literature on the topic 'Zona-pelúcida'

Realizou-se uma análise estereológica comparativa de complexos cumulus-ovócito (COCs) de bovino da raça Holtein-Friesian aspirados de folículos antrais pequenos (com diâmetro de 1-4mm) e médios (com diâmetro de 4-8mm) durante as fases de metaestro, diestro e de proestro. Foram estimados o volume médio dos COCs, dos ovócitos (com e sem zona pelúcida), dos núcleos dos ovócitos e das células foliculares e seus respectivos núcleos. Estimou-se a espessura da zona pelúcida e calculou-se a percentagem relativa da freqüência dos diferentes tipos de células foliculares encontradas no cumulus. Os folículos pequenos apresentaram crescimento acelerado e sem sincronia entre o volume do citoplasma e o do núcleo. No folículo médio ocorreu expansão harmoniosa núcleo-citoplasmática. Identificaram-se três populações de células foliculares (C1, C2 e C3), cuja distribuição na massa do cumulus é independente de sua posição relativamente ao ovócito. Durante o ciclo estral, as células C1 foram progressivamente substituídas por C2 e estas, por C3.

Biotecnologias reprodutivas aplicadas a espécies selvagens, como inseminação artificial, fertilização in vitro e transferência de embriões, são vistas como um potencial caminho para proteção das espécies ameaçadas de extinção. Devido a isso, o objetivo deste estudo foi avaliar a fertilidade do sêmen congelado de onças pintadas (Panthera onca) e o meio de capacitação espermática usando o ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida. Ejaculados de nove animais foram coletados por eletroejaculação e criopreservados. Para determinar a capacitação espermática foi utilizada a técnica swin-up com meio Tyrods Talp PVA a temperatura ambiente. No ensaio de penetração em oócitos de hamster livres de zona pelúcida foram considerados como oócitos penetrados aqueles que apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada. O ensaio foi realizado em um total de 2275 oócitos, dos quais 350 apresentaram em seu interior a cabeça do espermatozóide descondensada, perfazendo um total de 15.4% de penetração. Os resultados deste estudo demonstraram alto índice de anormalidades espermáticas, baixa qualidade do sêmen e baixa porcentagem de penetrações. Entretanto, os resultados de penetração espermática demonstraram que sêmen congelado de onça pintada poderá ser utilizado para inseminação artificial, fertilização in vitro e injeção intracitoplasmática dando suporte para a criação de um banco de sêmen para esta espécie.

La inyección intracitoplasmática del espermatozoide al ovulo (ICSI) es una técnica de fertilización in vitro en la que un espermatozoide es inyectado al ovocito utilizando una micropipeta biselada, para conseguir la fecundación. Esta técnica, ampliamente usada en reproducción asistida, genera una deformación moderada de la membrana del ovocito, llegando a ser, en algunos casos, nocivo para este. Utilizando la técnica Piezo-ICSI, esta deformación se minimiza, ya que el dispositivo Piezo genera vibración submicrónica en la micropipeta de ICSI, y atraviesa la zona pelúcida sin generar resistencia alguna. No existe evidencia que esta técnica haya logrado un embarazo en América Latina, por lo tanto, se presenta el siguiente reporte como el primer caso de embarazo clínico con actividad cardiaca de 16 semanas de gestación proveniente de un embrión fecundado con la técnica de Piezo-ICSI.

Resumo: Estudou-se o tecido germinativo ovariano do peixe Melanotaenia boesemani. Por meio de análises morfológicas das gônadas, realizadas após a confecção de lâminas histológicas elaboradas em parafina e coradas com hematoxilina-eosina, foram descritos os tipos celulares encontrados e realizada a classificação do estádio de maturidade dos peixes. Macroscopicamente, foi identificado que a referida espécie possui ovário único, arredondado e, na fase observada, amarelado, localizado na parte látero-anterior da cavidade celomática. As fêmeas analisadas foram classificadas na escala de desenvolvimento gonadal como maduro/em reprodução. A presença de folículos vazios e marcas de desova nas lamelas ovulígeras mostrou-se evidente. Nos ovócitos vitelogênicos deste peixe, foi constatada a presença de filamentos de adesão ovocitária ancorados à zona pelúcida. Os ovários apresentaram aspecto morfológico geral semelhante ao de outros peixes teleósteos. Seu tipo de desova foi classificado como intermitente e o padrão de desenvolvimento de ovócitos, como assincrônico.

Durante a fecundação, os espermatozoides interagem com a zona pelúcida (ZP) por meio da ligação entre o acrossomo e as proteínas 2 e 3 (ZP2 e ZP3). A membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas é homóloga à ZP3 de mamíferos, possibilitando a ligação espermática de diversas espécies. Este trabalho padronizou e avaliou a eficiência do teste de ligação espermática à membrana perivitelínica da gema de ovo de galinhas como avaliação funcional do sêmen de cães. Para tal, foram utilizadas nove amostras seminais previamente criopreservadas. Cada amostra foi dividida em duas alíquotas: a primeira foi mantida em banho-maria à 37ºC (vivos) e a segunda submetida a choque térmico com o intuito de induzir dano celular (mortos). As duas alíquotas foram misturadas, correspondendo a 0, 25, 50, 75 e 100% de células viáveis. As amostras foram avaliadas quanto ao número de espermatozoides ligados à membrana perivitelínica por meio da análise computadorizada da motilidade (CASA) ou microscopia convencional. Ademais, as amostras foram avaliadas quanto à motilidade espermática, integridade das membranas acrossomal e plasmática e atividade mitocondrial espermática. O teste de ligação espermática à membrana perivitelínica de ovos de galinha foi considerado um teste de análise seminal exequível tanto para avaliar a capacidade fecundante dos espermatozoides como atributos seminais gerais, especialmente quando realizado em microscopia convencional, expandindo sua praticidade para a maioria dos laboratórios de análise de sêmen canino.

<p>La producción de embriones in vitro (PIV) es una biotecnología reproductiva que impacta los sistemas ganaderos favoreciendo el mejoramiento genético y que también se ha utilizado como modelo de investigación del desarrollo embrionario en otras especies. Para el desarrollo de ésta técnica, se colectan oocitos in vivo por medio de laparoscopia y aspiración folicular guiada por ultrasonografía ó a través de ovarios recolectados en plantas de sacrificio. Los oocitos son sometidos a procesos de maduración in vitro, utilizando diversos medios, adición de gonadotropinas y factores de crecimiento. Los espermatozoides son sometidos a tratamientos de capacitación espermática in vitro, donde adquieren capacidad fertilizante y se separan los espermatozoides vivos de los componentes seminales y crio-protectores. Para la fertilización in vitro se realiza un cocultivo de espermatozoides y oocitos en un medio que favorece la actividad espermática y penetración de la zona pelúcida. Posteriormente, los embriones obtenidos son sometidos a cultivo en medios que contengan fuentes de energía, aminoácidos y factores de crecimiento, con el fin de mantener su sobrevivencia y desarrollo. En la actualidad la técnica de PIV en bovinos se ha masificado y se trabaja en los procesos de estandarización en otras especies. A partir de la PIV se dio el desarrollo de nuevas biotecnologías como la clonación y transgénesis. El objetivo de esta revisión es describir las fases de la PIV y su relación con los eventos fisiológicos de la fertilización y desarrollo embrionario temprano.</p>

En este estudio se demuestra el uso de la transferencia nuclear de células somáticas para producir los primeros bovinos clonados en el Perú. Se obtuvieron fibroblastos de piel y células de cúmulos de donantes adultos para ser usados como carioplastos; asimismo, ovocitos obtenidos a partir de ovarios de camal fueron madurados in vitro por 24 h. Los ovocitos madurados se incubaron 2 h en demecolcina (2.5 ìg/ml) para promover la formación del cono con el plato metafásico y para orientar la enucleación manual. Se eliminó la zona pelúcida en pronasa (2 mg/ml) por 3 min. La enucleación fue manual con una microcuchilla dividiendo el óvulo en dos mitades, donde las mitades carentes de núcleo fueron fusionadas por el método «sandwich» (citoplasto–fibroblasto–citoplasto) por electrofusión. Las estructuras reconstruidas se activaron químicamente mediante incubación por 5 min en 7% de etanol absoluto, seguido por 5 h de citocalacina B (5 ìg/ml) y cicloheximida (10 ìg/ml). Las estructuras se cultivaron durante 7 d hasta la fase de incubación/eclosión de blastocisto. Siete blastocistos fueron transferidos a seis vacas receptoras sincronizadas siete días después de la ovulación. Se logró la permanencia de cuatro y tres vesículas embrionarias hasta los días 28 y 60, respectivamente. Dos terneras llegaron a nacer a partir de embriones reconstruidos con células de piel y con células de cúmulos. Mediante el análisis de genotipos, utilizando 15 marcadores (SSR) para bovinos, se confirmó que los terneros clonados fueron derivados de las líneas celulares de las donantes.

Introducción. Los estudios genéticos preimplantacionales son cada vez más utilizados con la esperanza de conseguir mejores tasas de implantación y nacido vivo, así como una disminución en la tasa de abortos; por ello resulta necesario analizar estos procedimientos. Objetivo. Evaluar el desarrollo preimplantacional in vitro con ovodonación y estudio genético Diseño. Cohortes retrospectivas. Lugar. Laboratorio Pranor, 2008-2013. Material. Ciclos de fecundación in vitro con ovodonación (FIV-OD). Intervenciones. Se evaluaron 2 077 ciclos de FIV-OD, los cuales fueron clasificados en tres cohortes: 1) ciclos con biopsia embrionaria en día 3, mediante una incisión en la zona pelúcida (ZP) embrionaria, para exéresis de una blastómera (n=527); 2) ciclos con incisión láser en día 4 del desarrollo embrionario, como parte del procedimiento para la biopsia de trofoblasto (n=131); y, 3) ciclos sin intervención (n=1 419). Principales medidas de resultado. Tasa de fecundación, tasa de blastulación. Resultados. No existió diferencia significativa en la tasa de fecundación de las 3 cohortes (75,0%, 74,6% y 75,9%, respectivamente, p=0,31). La tasa de blastulación en la cohorte 1 fue 42,5%, mientras que en la cohorte 3 fue 47% (RR=1,085; IC=1,051 a 1,120; p<0,0001). Adicionalmente, la cohorte 2 tuvo 51,9%, con una diferencia estadísticamente significativa de prevención del riesgo de no blastular con respecto a la cohorte 3 (RR=0,906; IC=0,851 a -0,965; p=0,0017). Conclusiones. El desarrollo preimplantacional hasta blastocisto puede mejorar cuando se utiliza el láser embrionario en día cuatro. Es necesario realizar más estudios para confirmar nuestros resultados.

Introducción: La zona pelúcida (ZP) es una matriz extracelular transparente que rodea la membrana plasmática de los ovocitos de los mamíferos. Para que se produzca la implantación, es necesaria la completa expansión del blastocisto, acompañado por el afinamiento de la ZP y la eclosión del pre-embrión favorecida por la disolución de la ZP. Sin embargo, este proceso no siempre sucede, y si el blastocisto no puede salir de la ZP no será posible que se produzca la implantación. Durante las dos décadas pasadas, se han utilizado diferentes métodos para la manipulación de la ZP en mujeres de edad avanzada (Balaban et al., 2002). Una revisión sistemática (Das et al., 2009), revela que la Eclosión asistida (EA), puede incrementar las tasas de éxito en mujeres con fallo de implantación y probablemente en edad avanzada, pero se debe analizar con más profundidad los datos obtenidos respecto a las tasas de gestación múltiple. Parece ser que, tanto la edad avanzada como el cultivo in vitro de los pre-embriones pueden causar un endurecimiento de la ZP haciendo necesaria la aplicación de la técnica de EA para facilitar la eclosión de los blastocistos, para aumentar las tasas de gestación e implantación (Magli et al., 1998). Objetivos: Objetivo principal: analizar si la aplicación del afinamiento de la zona pelúcida (AZPL) es una herramienta útil para aumentar la tasa de gestación en pacientes que se sometan a un TRA, en ciclos de FIV/ICSI, según edad de la paciente (38-39 años y ≥ a 40 años) y según grosor de la ZP (< 15µm y ≥ 15µm). Objetivos secundarios: analizar si la aplicación del AZPL es una herramienta útil para aumentar las tasas de implantación y RNV y disminuir la tasa de aborto, RNV en pacientes que se sometan a TRA, en ciclos de FIV/ICSI, (38-39 años y ≥ 40 años) y según grosor de la ZP (< 15µm y ≥ 15µm). Materiales y Métodos: Este estudio retrospectivo se realizó en IVI-Murcia, entre Marzo del 2006 y Diciembre del 2012. Consta de 308 ciclos que fueron distribuidos, de forma aleatoria, en 2 grupos según se realizara o no AZPL: A: 154 ciclos en los que no se realizó el AZPL (No-AZPL) a los pre-embriones. B: 154 ciclos en los que sí se les realizó el AZPL (AZPL) a los pre-embriones. Estos 2 grupos se subdividieron, según edad, en: 38-39 años y ≥ 40 años: -Pacientes con 38-39 años, a cuyos pre-embriones no se les realizó el AZPL: No-AZPL 38-39 años. -Pacientes con 38-39 años, a los que sí que se les realizó AZPL: AZPL 38-39 años. -Pacientes con edad ≥ 40 años sin AZPL: No-AZPL ≥ 40 años. -Pacientes con edad ≥ 40 años con AZPL: AZPL ≥ 40 años. El grosor de la ZP fue analizado y dividido en: A: pre-embriones cuyo grosor medio de la ZP fuera ≥15µm. B: pre-embriones con diámetro medio de la ZP <15µm. A su vez, estos grupos fueron analizados, evaluando el impacto del AZPL, según la edad: 38-39 años y ≥ 40 años. -Pacientes con 38-39 años con pre-embriones con: ZP < 15µm y ZP ≥ 15µm. -Pacientes ≥ 40 años con pre-embriones con: ZP < 15µm ZP ≥ 15µm. A cada pre-embrión a transferir, en D3, se le realizó un AZP utilizando el sistema Octax láser shot (MTG-Octax Alemania), cuando le correspondía el AZPL. El análisis estadístico se realizó con el test de Fisher. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando se obtuvo un valor de P <0.05. Resultados globales de AZPL y No-AZPL en mujeres ≥ 38 años Los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar en el grupo control (No-AZPL) son: 32,1%, 20,8%, 20,0%, 26,7% y 5,7 respectivamente, mientras que los resultados en el grupo de las pacientes 38-39 años con AZPL, en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son:46,9%, 35,0%, 26,7%, 42,7 y 17,7% respectivamente, siendo estadísticamente significativos los resultados de gestación y tasa de RNV respecto al grupo control (p<0,05) En las pacientes con edades de 40 años o más que pertenecen al grupo No-AZPL, los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son 24,4%, 16,4%, 45,4%, 15,5% y 9,1% respectivamente sin haber diferencias estadísticamente significativas en ninguna de las variables. Los resultados en pacientes con edades de 40 o más años, con AZPL, las tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son 22,4%, 14,0%, 46,2%, 13,8% y 7,7% respectivamente, sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas en ninguna dalas variables. Resultados globales de AZPL y No-AZPL con ZP ≥ 15µm Los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar en el grupo de pacientes No-AZPL con 38-39 años y ZP ≥ 15µm son: 30,2%, 21,5%, 21,7%, 26,3% y 13,0% respectivamente sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas. Mientras que en el grupo de pacientes que pertenecían al grupo estudio (AZPL 38-39 años), las tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y tasa de gestación gemelar son 50,8%, 38,8%, 20,0%, 50,8% y 20,0% respectivamente existiendo diferencias estadísticamente significativas en las tasas de gestación, implantación y RNV a favor del grupo estudio (p<0,05). Respecto a las pacientes con 40 años o más en el grupo No-AZPL con ZP ≥ 15µm, los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son: 40,0%, 23,8%, 40,0%, 28,0 y 0% respectivamente sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas. Los resultados de las pacientes con 40 años o más años, en cuanto a tasa de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son: 23,1%, 15,6%, 55,5%, 12,8% y 11,1% respectivamente sin haber diferencias estadísticamente significativos. Conclusiones: En pacientes de 38-39 años: Las tasas de gestación e implantación obtenidas son significativamente superiores (p<0,05) cuando se realiza el AZPL, en ovocitos frescos cuyas ZPs son ≥15µm, al compararlas con pacientes en las que no se ha aplicado el AZPL a sus pre-embriones antes de la transferencia. La tasa de aborto no se ve afectada cuando se aplica el AZPL a los pre-embriones antes de la transferencia. La tasa de RNV obtenida es significativamente superior (p<0,05) cuando se realiza el AZPL, en ovocitos frescos cuyas ZPs son ≥ 15µm al compararlas con pacientes en las que no se ha aplicado el AZPL a sus pre-embriones antes de la transferencia. No hay diferencias estadísticamente significativas en las tasas de gestación gemelar obtenidas en los subgrupos de este grupo de edad.
Introduction: The zona pellucida (ZP) is a transparent extracellular matrix surrounding the oocyte plasma membrane of mammals. In order for implantation to occur, the full expansion of the blastocyst, accompanied by thinning of the ZP and the emergence of pre-embryo favored by the dissolution of the ZP is necessary. However, this process does not always happen, and if the blastocyst can not leave the ZP, it would not be possible for the implantation to occur. Over the last two decades, different methods have been used for handling the ZP in old women (Balaban et al., 2002). A systematic review (Das et al., 2009) reveals that assisted hatching (AH), can increase success rates in women with implantation failure and probably old women, but the data of rates of multiple pregnancy must be analysed more deeply. It seems that the advanced age and the in vitro culture of the pre-embryos can cause hardening of the ZP, so making the application of Assisted hatching (AH) technique to facilitate the hatching of blastocysts necessary, and then to increase pregnancy rates and implantation (Magli et al., 1998). Objectives: Main objective: to analyse whether the application of laser assisted zona thinning (LAZT) is a useful tool to increase the pregnancy rate in patients who undergo in ART, in cycles of IVF/ICSI, according to patient age (38- 39 years and ≥ 40 years) and thickness according to ZP (<15 µm and ≥ 15 µm). Secondary objectives: to analyse whether the application of AZPL is a useful tool to increase implantation rates, LB in patients undergoing ART, and decrease miscarriages rates in cycles of IVF / ICSI (38-39 years and ≥ 40 years) and according ZP thickness (<15 µm and ≥ 15 µm). Materials and Methods: This retrospective study was performed in IVI-Murcia, between March 2006 and December 2012. It consists of studying 308 cycles which were distributed randomly in 2 groups as placed or not LAZT: A: 154 cycles in which the LAZT (Non- LAZT) is not performed on pre-embryos. B: 154 cycles in those that underwent the LAZT on pre-embryos. These two groups were subdivided according to age, in: 38-39 years rank and ≥ 40 years rank: • Patients with 38-39 years, whose pre-embryos underwent the LAZT: No- LAZT 38-39 years. • Patients with 38-39 years, who underwent yes LAZT: LAZT 38-39 years. • Patients with age ≥ 40 years without LAZT: No- LAZT ≥ 40 years. • Patients aged ≥ 40 years with LAZT: LAZT ≥ 40 years. The thickness of the ZP was analysed and divided into: A: pre-embryos whose average thickness was ≥ 15μm ZP. B: pre-embryos ZP average diameter of <15µm. And in turn, these groups were analysed, evaluating the impact of LAZT, according to age: 38-39 years and ≥ 40 years. • Patients with 38-39 years with pre-embryos: ZP <15µm and 15µm ≥ ZP. • Patients ≥ 40 years with pre-embryos: ZP <15µm and ZP ≥ 15µm. To each pre-embryo transfer, in D3, was performed a LAZT OCTAX system using laser shot (MTG-OCTAX Germany), when belonging to LAZT. Statistical analysis was performed using Fisher's test. The results were considered statistically significant when P <0.05 was obtained. Overall results of LAZT and Non- LAZT in women ≥ 38 years Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 32,0%, 20,8%, 20,0%, 26,7% and 5,7% respectively in patients belonging to LAZT in patients with 38-39 years. And in patients belonging to LAZT 38-39 years the results in pregnancy rate, implantation rate, abortion rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 46,9%, 35,0%, 26,7%, 42,7% and 17,7% respectively. There are statistically significant in pregnancy and LB rate (p<0.05). In patients No- LAZT ≥ 40 years, the results are in pregnancy rate, implantation rate, abortion rate, LB rate and Twins Pregnancy rate: 24,4%, 16,4%, 45,4%, 15,5% and 9,1% respectively. In patients LAZT ≥ 40 years, the results are in pregnancy rate, implantation rate, abortion rate, LB rate and Twins Pregnancy rate: 22,4%, 14,0%, 46,2%, 13,8% and 7,7% respectively (p>0,05). Overall results of LAZT and Non- LAZT in women ≥ 38 years with ZP ≥ 15µm Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 30,2%, 21,5%, 21,7%, 26,3% and 13,0% respectively in patients belonging to No-LAZT in patients with 38-39 years and ZP ≥ 15µm. Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 50,8%, 38,8%, 20,0%, 50,8% and 20,0% respectively in patients belonging to LAZT with 38-39 years and ZP ≥ 15µm.There are results statistically significant in pregnancy, implantation and LB rate. Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 40,0%, 23,8%, 40,0%, 28,0% and 0% respectively in patients belonging to No-LAZT with ≥ 40 years and ZP ≥ 15µm. Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 23,1%, 15,6%, 55,5%, 12,8% and 11,1% respectively in patients belonging to LAZT with ≥ 40 years and ZP ≥ 15µm. No statistically significant differences in this group. Conclusions: In patients from 38 to 39 years old: The pregnancy and implantation rates obtained are significantly higher (p <0.05) when the LAZT is done in fresh oocytes which are ≥15μm ZPS, when it is compared with patients that have not been applied LAZT their pre-embryos before transfer. The abortion rate is not affected when the LAZT is applied to pre-embryos before embryo transfer. LB obtained rate is significantly higher (p <0.05) when the LAZT is performed in fresh oocytes which are ZPs ≥ 15 μm as compared to patients where it has not been applied LAZT their pre-embryos prior to transfer. No statistically significant differences in twin pregnancy rates are obtained from subgroups of this age group.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario
Durante la maduración ovocitaria el ovocito experimenta cambios a nivel nuclear, citoplasmático y de sus cubiertas, encontrándose en esta última la zona pelúcida (ZP), cubierta extracelular que cumple importantes funciones en el reconocimiento gamético durante la fecundación. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) los cambios a nivel ultraestructural en la ZP durante la maduración ovocitaria in vitro, comparando la ZP de ovocitos inmaduros y aquellos madurados en cultivo. También se evaluó el estado morfológico de la ZP de ovocitos de perra durante el proceso de maduración in vitro, a través de dos tiempos de cultivo (72 y 96 horas). Paralelamente, se evaluó el diámetro de los ovocitos con su ZP, en estado inmaduro y sometidos a maduración en cultivo. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvo un total de 500 ovocitos a través de cortes finos, en un total de 15 réplicas experimentales. Se seleccionaron los ovocitos, de mayor tamaño (diámetro), con su citoplasma homogéneo y completamente rodeados por al menos tres capas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados en cada réplica fueron divididos en dos grupos: un grupo se incubó para maduración in vitro en medio TCM 199 suplementado y el otro grupo se procesó inmediatamente en estado de ovocitos inmaduros. La fijación de los ovocitos inmaduros y madurados in vitro se realizó posterior a la extracción de las células del cúmulo. Para ello, fueron lavados en buffer Cacodilato 50 mM por 15 minutos y luego fijados en glutaraldehído 2,5% por un mínimo de 24 h. Posteriormente se realizó una postfijación con Tetroxido de Osmio al 2%, luego los ovocitos fueron colocados en cámaras de cobre cerradas para ser deshidratados mediante concentraciones crecientes de acetona (30%, 50%, 70%, 90% y 100%). La deshidratación de los ovocitos se completó mediante secado de punto crítico del CO2. Luego fueron 5 montados en porta-especímen para ser sombreados con oro-paladio. Las muestras se analizaron bajo el MEB marca “LEO” modelo 1420 VP. La medición del trabeculado de la zona pelúcida y del tamaño ovocitario se llevó a cabo mediante el programa “AutoCad 2006” a un total de 93 ovocitos a partir de las fotografías tomadas en el MEB. Del total de ovocitos analizados 30 pertenecían a estado inmaduro, 31 a 72 horas de maduración y 32 a 96 horas de maduración. Los resultados se evaluaron por el análisis de varianza de un factor o clasificación simple y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P≤ 0,05. Se encontraron diferencias significativas (P≤ 0,05) entre ovocitos inmaduros y madurados in vitro, tanto a 72 como a 96 h. En ovocitos antes de la maduración en cultivo se observó que los agujeros de la ZP eran compactos y de poco tamaño, en cambio en los ovocitos ya madurados in vitro, los agujeros de la ZP presentaron un tamaño mayor. Comparando los dos tiempos de maduración in vitro empleados en este trabajo, se observó mayor tamaño de agujeros en el trabeculado de la ZP de ovocitos madurados por 72 h en comparación a aquellos madurados por 96 h. En el tamaño ovocitario no se encontró un aumento significativo entre los ovocitos madurados in vitro respecto a los inmaduros. Tanto en los ovocitos inmaduros como en los madurados en sistema de cultivo se observó en un alto porcentaje, aproximadamente un 81% de un total de 500 ovocitos, cierto grado de daño morfológico en la ZP, encontrando una mayor proporción de daño en los ovocitos que se sometieron a un sistema de maduración in vitro. De los resultados se puede concluir que durante la maduración ovocitaria in vitro hay cambios estructurales a nivel de la ZP en ovocitos caninos, los que podrían influir en la capacidad de unión y penetración del espermatozoide a través de la ZP durante la interacción de los gametos
Proyectos ENL 05/8 DID y FONDECYT 1060602

Orientador: José Gonçalves Franco Júnior
Banca: Anice Maria Vieira Camargo Martins
Banca: Edson Borges
Banca: Jorge Nahas Filho
Banca: Ana Lúcia Kalinin
Resumo: Nas últimas décadas, alguns parâmetros laboratoriais têm sido propostos para identificar o potencial de saúde oocitária em Reprodução Assistida: 1. Maturidade nuclear e citoplasmática (pesquisa); 2. Dismorfismo (anomalias intracitoplasmáticas); 3. Fertilizaçao. Habitualmente, esses parâmetros (exceto a maturação citoplasmática) são avaliados pelo simples emprego de sistemas de microscopia de luz convencional. Nos últimos oito anos, foram relatados diversos estudos em oócitos humanos sobre a birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP), a espessura da ZP, e a visualização do fuso meiótico (FM). Entretanto, ainda é discutível o poder desses novos parâmetros na seleção de óvulos com o pontecial de originar embriões com taxas de implantação elevadas, além disso, seu sistema de visualização e quantificação é complexo e dispendioso. O objetivo deste estudo foi investigar uma possível correlação entre esses parâmetros tradicionais com a BF-ZP, espessura da ZP e o FM. Dessa forma, um total de 73 pacientes que participaram do programa de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) no Centro de Reprodução Humana "Prof Franco Júnior" tiveram seus óvulos avaliados quanto a maturação nuclear (n=83), maturação citoplasmática (n=29), dismorfismo (n=280) e fertilização (n=216) sendo os resultados correlacionados com a imagem do FM (presença ou ausência), a intensidade da BF-ZP (positiva ou negativa) e a espessura da ZP. Os dados finais revelaram uma fraca correlação entre a maturação, o dismorfismo e a fertilização oocitária com a imagem do FM, a intensidade da BF-ZP, e a espessura da ZP. Entretanto, esses parâmetros poderiam ser responsáveis por identificar pontos biológicos diferentes do potencial de qualidade oocitária. Assim sendo, seria uma medida coerente, a utilização desses parâmetros, em forma conjunta, através de um escore de qualidade oocitária.
Abstract: During the last decades, three laboratorial parameters have been proposed to identify the potential of the oocyte quality in ART: 1- Nuclear and cytoplasmic maturation; 2-Dysmorphims (intracytoplasmic abnormalities); 3 - Fertilization. These parameters (except the cytoplasmic maturation) are assessed by a simple system of conventional light microscopy. In the last eight years, numerous studies about zona pellucida birefringence (BF-ZP), zona pellucida thickness and meiotic spindle visualization have been reported. However, it is still controversial the power of these parameters in selecting oocyte with potential to develop into implantation-competent embryos. Furthermore, the microscopy system is complex and expensive. The present study aims to evaluate whether there is any correlation between the classical parameters with BF-ZP, ZP thickness and spindle image. A total of 73 patients who participated in an ICSI program had their oocytes evaluated such nuclear maturation (n=83), cytoplasmic maturation (n=29), dysmorphism (n=280) and fertilization (n=216) being its results correlated to the spindle image (presence or absence), BF-ZP intensity (positive or negative) and ZP thickness. The final results showed a low correlation between maturation, dysmorphism and fertilization compared to spindle image and ZP characteristics (BF-ZP, ZP thickness). However, these factors can be responsible to identify specific biological differ from the oocyte potential. Concluding, the use of these factors in association, as a score (oocyte quality score), could be the correct evaluation.
Doutor

El oocito de mamífero está rodeado por una matriz denominada zona pelúcida (ZP). Esta envoltura participa en procesos tales como la inducción de la reacción acrosómica, la unión de espermatozoides y también puede estar implicada en la especiación. Estudios recientes han demostrado que la matriz de ZP de ovocitos en varias especies se compone de cuatro glicoproteínas, denominadas ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, en lugar de las tres descritas en el ratón, cerdo y vaca. En la gata (Felis catus), esta matriz se compone de al menos tres glicoproteínas denominadas ZP2, ZP3 y ZP4. Sin embargo, la presencia de cuatro proteínas en varios mamíferos, sugiere que necesita una reevaluación de la ZP en la gata. Además, en esta tesis, se realizaron investigaciones para determinar la expresión de una cuarta glicoproteína en la ZP de conejo (Oryctolagus cuniculis). Los objetivos de esta investigación fueron analizar la composición de proteínas de ZP gato por medio de análisis proteómico y en el conejo se amplificó ZP1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). En la ZP aislada de ovarios y ovocitos de gato, se detectaron varios péptidos correspondientes a cuatro proteínas, teniendo una cobertura del 33,17%, 71,50%, 50,23% y 49,64% para ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, respectivamente. Por otra parte, se confirmó por análisis molecular la expresión de los cuatro genes de ZP a partir de ARN total aislado de ovarios de gato, las ZPs de gato fueron parcialmente amplificadas por RT-PCR. En el conejo la ZP1 incluye un marco de lectura abierto de 1825 nucleótidos que codifican un polipéptido de 608 residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos deducida de ZP1 de conejo mostró una alta identidad con otras especies: 70% de identidad con ZP1 humana y caballo y 67% de identidad con la ZP1 de ratón y rata. A nivel proteómico, fueron detectados por espectrometría de masas péptidos correspondientes a las cuatro proteínas ZP. Además, mediante un análisis filogenético molecular de ZP1 mostró que este gen presenta una pseudogenización de por lo menos cuatro veces durante la evolución de los mamíferos. Los datos presentados en esta tesis proporcionan evidencia, por primera vez, que la ZP de conejo y la ZP de gato se compone de cuatro glicoproteínas. 2
The mammalian oocyte is surrounded by a matrix called the zona pellucida (ZP). This envelope participates in processes such as acrosome reaction induction, sperm binding, and may be involved in speciation. Recent studies have shown that the ZP matrix of oocytes in several species is composed of four glycoproteins, designated ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, rather than the three described in mouse, pig and cow. In cat (Felis catus), this matrix is composed of at least three glycoproteins called ZP2, ZP3 and ZP4. However, the presence of a fourth protein in several mammals, meaning that a reevaluation of cat ZP is needed. Additionally, in this thesis, investigations were carried out to unveil a fourth glycoprotein in the rabbit (Oryctolagus cuniculis) ZP. The objectives of this research was to analyse of the protein composition of cat ZP by means of proteomic analysis and rabbit ZP1 was amplified by reverse transcribed polymerase chain reaction (RT-PCR). Using ZP from ovaries and oocytes of cat, several peptides corresponding to four proteins were detected, yielding a coverage of 33.17%, 71.50%, 50.23% and 49.64% for ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4, respectively. Moreover, the expression of four genes was confirmed by molecular analysis. Using total RNA isolated from cat ovaries, the complementary deoxyribonucleic acids (cDNAs) encoding cat ZPs were partially amplified by RT-PCR. In the rabbit the ZP1 cDNA contains an open reading frame of 1825 nucleotides encoding a polypeptide of 608 amino acid residues. The deduced amino acid sequence of rabbit ZP1 showed high identity with other species: 70% identity with human and horse ZP1, and 67% identity with mouse and rat ZP1. At the proteomic level, peptides corresponding to the four proteins were detected by mass spectrometry. In addition, a molecular phylogenetic analysis of ZP1 showed that pseudogenization of this gene has occurred at least four times during the evolution of mammals. The data presented in this thesis provide evidence, for the first time, that the rabbit and cat ZP is composed of four glycoproteins.

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Nas últimas décadas, alguns parâmetros laboratoriais têm sido propostos para identificar o potencial de saúde oocitária em Reprodução Assistida: 1. Maturidade nuclear e citoplasmática (pesquisa); 2. Dismorfismo (anomalias intracitoplasmáticas); 3. Fertilizaçao. Habitualmente, esses parâmetros (exceto a maturação citoplasmática) são avaliados pelo simples emprego de sistemas de microscopia de luz convencional. Nos últimos oito anos, foram relatados diversos estudos em oócitos humanos sobre a birrefringência da zona pelúcida (BF-ZP), a espessura da ZP, e a visualização do fuso meiótico (FM). Entretanto, ainda é discutível o poder desses novos parâmetros na seleção de óvulos com o pontecial de originar embriões com taxas de implantação elevadas, além disso, seu sistema de visualização e quantificação é complexo e dispendioso. O objetivo deste estudo foi investigar uma possível correlação entre esses parâmetros tradicionais com a BF-ZP, espessura da ZP e o FM. Dessa forma, um total de 73 pacientes que participaram do programa de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) no Centro de Reprodução Humana “Prof Franco Júnior” tiveram seus óvulos avaliados quanto a maturação nuclear (n=83), maturação citoplasmática (n=29), dismorfismo (n=280) e fertilização (n=216) sendo os resultados correlacionados com a imagem do FM (presença ou ausência), a intensidade da BF-ZP (positiva ou negativa) e a espessura da ZP. Os dados finais revelaram uma fraca correlação entre a maturação, o dismorfismo e a fertilização oocitária com a imagem do FM, a intensidade da BF-ZP, e a espessura da ZP. Entretanto, esses parâmetros poderiam ser responsáveis por identificar pontos biológicos diferentes do potencial de qualidade oocitária. Assim sendo, seria uma medida coerente, a utilização desses parâmetros, em forma conjunta, através de um escore de qualidade oocitária.
During the last decades, three laboratorial parameters have been proposed to identify the potential of the oocyte quality in ART: 1- Nuclear and cytoplasmic maturation; 2-Dysmorphims (intracytoplasmic abnormalities); 3 - Fertilization. These parameters (except the cytoplasmic maturation) are assessed by a simple system of conventional light microscopy. In the last eight years, numerous studies about zona pellucida birefringence (BF-ZP), zona pellucida thickness and meiotic spindle visualization have been reported. However, it is still controversial the power of these parameters in selecting oocyte with potential to develop into implantation-competent embryos. Furthermore, the microscopy system is complex and expensive. The present study aims to evaluate whether there is any correlation between the classical parameters with BF-ZP, ZP thickness and spindle image. A total of 73 patients who participated in an ICSI program had their oocytes evaluated such nuclear maturation (n=83), cytoplasmic maturation (n=29), dysmorphism (n=280) and fertilization (n=216) being its results correlated to the spindle image (presence or absence), BF-ZP intensity (positive or negative) and ZP thickness. The final results showed a low correlation between maturation, dysmorphism and fertilization compared to spindle image and ZP characteristics (BF-ZP, ZP thickness). However, these factors can be responsible to identify specific biological differ from the oocyte potential. Concluding, the use of these factors in association, as a score (oocyte quality score), could be the correct evaluation.

maviles@um.es
En la presente tesis doctoral se han estudiados diferentes aspectos relacionados con la composición glucídica, estructura, formación y origen de la zona pelúcida y las glicoproteínas que la forman, poniendo especial interés en la especie humana. Para este propósito hemos desarrollado tres líneas principales de investigación, estudio ultraestructural de la zona pelúcida y gránulos corticales de ovocitos humanos y de la síntesis de las glicoproteínas de la ZP humana y de ratón, análisis bioquímico y biofísico de las glicoproteínas de la zona pelúcida de hámster y análisis bioquímico y fisiológico de ZP2 y ZP3 recombinantes humanas expresadas en células CHO
In the present thesis, several aspects of the carbohydrate content, structure, formation and origin of the ZP, with special attention to the human ZP, have been analyzed. Therefore, the methods and techniques used in the present thesis included the ultrasctuctural study of human ZP, cortical granules and biosynthetic pathway of the human and mouse ZP, biochemical and cytochemical characterization of the hamster zona pellucid and characterization of recombinant human ZP2 y ZP3 expressed in CHO cells.

La Zona Pelúcida es la matriz extracelular que rodea a los ovocitos de vertebrados, cumple roles trascendentales en la reproducción, incluyendo el reconocimiento y unión de gametos especie-específico, inducción de la reacción acrosómica (RA) del espermatozoide, el bloqueo de la poliespermia, mantiene la integridad del embrión temprano durante su transición por el oviducto; está constituida por tres glicoproteínas: ZP3 que induce RA; ZP1, estructural, que interconecta a ZP3 y ZP2. ZP2 es la molécula de unión secundaria, interactúa con los receptores espermáticos expuestos después de RA siendo necesaria para mantener la unión del espermatozoide al ovocito, su modificación proteolítica después de la fertilización permite el bloqueo de la poliespermia. ZP2 participa también en la organización, el desarrollo y maduración del ovocito, puesto que mantiene consistente la matriz y la interacción entre las células periféricas y la célula germinal. Se caracterizó y analizó in silico la secuencia codificante parcial de la glicoproteína de Zona Pelúcida tipo 2 (aZP2) en alpacas, se determinó que esta proteína se expresa exclusivamente en los ovarios. Además está secuencia parcial analizada se encuentra conservada, constituyéndose un grupo monofilético entre los Cetarteodactyla. La presente Tesis aporta conocimiento básico sobre la glicoproteína aZP2 en alpacas, proteína implícita en la fecundación, conocerla implícitamente beneficia el mejoramiento de las actuales técnicas biotecnológicas reproductivas tales como la maduración folicular-ovocitaria, criopreservación de gametos y embriones, fertilización in vitro e inyección intracitoplasmática del espermatozoide, técnicas que se intentan aplicar con muchas dificultades en camélidos.
The zona pellucida is a extracellular matriz that surrounds vertebrate oocytes, and plays important roles in the recognition and interaction of gametes specie- specific, induction of Acrosome Reaction (AR) of the spermatozoa, block to polyspermy, keeps th integrity of the early embryo through its transicion by the oviduct; It is composed of three glycoproteins: ZP3 that induces RA; ZP1, structural, crosslink ZP3 and ZP2. ZP2 acts as a secondary sperm receptor that is necessary for the maintenance of sperm binding to the egg, its proteolytical modification after fertilization permits the block to polyspermy ZP2 participates also in the organization, development, maturation of the oocyte beacuse it keeps consistently the matrix and the interaction between peripherical cells with the germ cell. We isolated and analized in silico a partial coding secquence of the glycoprotein of type 2 (aZP2) in alpacas, we determined that this protein is express exclusively in the ovaries. Also this amalized partial secquence is conserved, constituting a monophyletic group between Cetarteodactyla. This thesis work provides basic knowledge on the glycoprotein a ZP2 in alpacas, a protein implicitly involved in fertilization, to know it benefits the improvement of existing reproductive biotechnology techniques such as the follicular-oocyte maturation, cryopreservation of gametes and embryos in vitro fertilization and injection of intracytoplasmic sperm, techniques that are trying to be implemented with many difficulties in camelids.
Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La adecuada interacción de los gametos depende de la capacidad que tengan los espermatozoides de experimentar la capacitación y reacción acrosómica, procesos esenciales para la fecundación del ovocito y que pueden verse afectados por el proceso de refrigeración espermática. En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en espermatozoides refrigerados de perro, a través de la capacidad de unión y penetración a la zona pelúcida de ovocitos de perra madurados in vitro. El semen se obtuvo de la estimulación digital a 5 perros adultos. Un total de 9 eyaculados provenientes de los mismos perros, fueron procesados como muestras frescas o refrigeradas. Posterior a la evaluación seminal, el plasma seminal fue retirado por centrifugación. Los espermatozoides frescos se resuspendieron inmediatamente en Fert Talp y los espermatozoides a refrigerar se resuspendieron en diluyente en base a TRIS - yema de huevo - ácido cítrico - fructuosa y se conservaron a 4ºC por 24 horas, para luego ser mantenidos a 37°C por 10 minutos y posteriormente centrifugados para retirar el diluyente. Luego, los espermatozoides frescos (control) y refrigerados, fueron incubados en Fert Talp para capacitación in vitro, a temperatura ambiente (20°C) durante 0 a 3 horas y, posterior a cada tiempo de incubación, co-incubados con ovocitos madurados in vitro. Posterior a la co-incubación, los ovocitos inseminados fueron lavados y luego procesados separadamente para ser examinados bajo microscopia electrónica de barrido (MEB) y microscopia de epifluorescencia. Para MEB, se evaluaron un total de 318 ovocitos (174 y 134 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente). El análisis de MEB consideró un ovocito con espermatozoides unidos cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides adheridos a la zona pelúcida ovocitaria (ZP), y un ovocito con espermatozoides penetrados cuando se encontraron uno o más espermatozoides atravesando la ZP. Para la microscopia de epifluorescencia se evaluaron un total de 466 ovocitos (219 y 247 ovocitos para espermatozoides frescos y refrigerados, respectivamente), considerando un ovocito con espermatozoides unidos cuando se encontraron uno o más espermatozoides adheridos a la ZP y ovocito con epermatozoides penetrados cuando fueron encontrados uno o más espermatozoides atravesando la ZP, en el espacio perivitelino o dentro del citoplasma ovular. Los resultados se analizaron mediante un procedimiento de Regresión Logística Binomial (Statistical Analysis System, SAS Institute, Cary, NC, USA). Tanto en MEB como en microscopia de epifluorescencia, los resultados de fecundación in vitro con espermatozoides frescos y refrigerados, no mostraron diferencias significativas en la unión ni en la penetración espermática (p≥0,05), a través de los diferentes tiempos de capacitación. Asimismo, al comparar entre ambos tipos de espermatozoides, la unión y penetración en los diferentes tiempos de capacitación, no se evidenciaron diferencias significativas entre ellos (p≥0,05). En conclusión, los espermatozoides frescos y refrigerados caninos, capacitados in vitro durante 0 a 3 horas, no difieren en su capacidad para unirse y penetrar la ZP de ovocitos de perra madurados in vitro
Proyecto Fondecyt 1060602

En la presente Tesis Doctoral se realiza un estudio acerca de la composición y origen de la zona pelúcida de ovocitos de hámster. En este estudio se demuestra la existencia de cuatro glicoproteínas en su composición (ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4) y se describe al ovocito como lugar exclusivo de síntesis de estas glicoproteínas. Además, se inicia un estudio desde el punto de vista evolutivo de la proteína ZP4 en roedores y concretamente en la subfamilia Murinae.
In this doctoral thesis, we analyzed the origin and the composition of hamster ZP. In this study we demonstrated that the hamster zona pellucida is formed by four glycoproteins (ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4). The results of our study suggested that the expression of this glycoproteins is exclusively restricted to the oocyte. Finally, ZP4 was analyzed by means of a phylogenetic approach in the subfamily Murinae.

Até o momento a literatura não determinou qual o melhor estadio de maturação (imaturo ou maduro) para que o oocito mantenha sua competência para o desenvolvimento reprodutivo após a criopreservação. O objetivo deste estudo foi determinar em qual estadio meiótico (imaturo -VG (vesícula germinativa) ou maduro- MII (metáfase II)) o oócito é menos susceptível ao dano na criopreservação, utilizando modelo experimental bovino. Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro, após a aspiração dos folículos, os oócitos imaturos (VG) foram selecionados para a maturação in vitro e vitrificação, e foram divididos em três grupos: 1) oócitos maturados in vitro e não submetidos à vitrificação (CONTROLE); 2) oócitos vitrificados imaturos (VG), descongelados e submetidos à maturação in vitro (CRIO-MIV); 3) oócitos maturados in vitro (MII), vitrificados e descongelados (MIV-CRIO). Os oócitos foram avaliados quanto a: a)maturação nuclear pela técnica de orceína acética; b) integridade da zona pelúcida (ZP) através de microscopia de polarização; c) viabilidade oocitária pela técnica de DEAD-LIVE; d) desenvolvimento embrionário (taxa de clivagem, produção e eclosão de blastocistos) através da fertilização in vitro (FIV) e ativação partenogenética (AT). Não houve diferença na capacidade de maturação nuclear entre os oócitos frescos e descongelados no grupo CRIO-MIV (p=0,23). Em relação à zona pelúcida a totalidade dos oócitos (100%) nos três grupos apresentou leitura de zona pelúcida positiva, não havendo correlação com evolução embrionária posterior. Na análise de viabilidade celular pelo DEAD-LIVE verificou-se que houve redução da viabilidade do grupo MIV-CRIO (27%) quando comparado com controle (84%) (p<0,0001). Na análise do potencial de desenvolvimento embrionário o grupo controle apresentou melhores taxas de clivagem após FIV (80%) e AT (58%), do que os grupos CRIO-MIV (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectivamente) e MIV-CRIO (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectivamente). As taxas de formação de blastocisto e eclosão após FIV nos grupos CRIO-MIV, MIV-CRIO e após AT no grupo MIV-CRIO foram nulas. Houve a produção e eclosão de apenas um blastocisto no grupo CRIO-MIV após AT. No modelo experimental utilizado, o procedimento de vitrificação comprometeu parcialmente a viabilidade dos oócitos medida pela técnica de DEAD- LIVE e completamente o desenvolvimento embrionário subseqüente, independente do estadio de maturação meiótica (VG ou MII) durante a criopreservação. No entanto, oócitos vitrificados em estadio de VG e submetidos à MIV foram meioticamente competentes e progrediram até o estadio de MII, sugerindo que o dano não compromete a capacidade de maturação nuclear do oócito. Este estudo não conseguiu determinar qual o melhor estadio meiótico oocitário para criopreservação, já que os dois estadios meióticos (VG e MII) se mostraram igualmente prejudicados pela criopreservação em relação à capacidade reprodutiva.
Until the present literature has not achieved a consensus regarding the best maturation stage for oocyte to maintain their reproductive capacity after cryopreservation. The aim of this study was to determine, using an experimental bovine model, in which stage of development (VG stage, immature, or MII stage, post-maturation in vitro) the oocyte is less susceptible to damage during cryopreservation. Immature oocytes (VG) from the ovaries of slaughtered cows were selected for in vitro maturation or vitrification and divided into three groups. The first group (CONTROL) consisted of immature oocytes, matured in vitro without vitrification; the second group (CRYO-IVM) consisted of vitrified immature oocytes thawed and submitted to in vitro maturation; and the third group (IVM-CRYO) consisted of matured in vitro oocytes submitted to vitrification and thawing. The oocytes were evaluated for: nuclear maturation by acetic orcein staining; integrity of the zona pellucida using a polarized microscope; cell viability by the Dead-Live technique; and embryo development (cleavage, production and hatching rate) by in vitro fertilization and parthenogenetic activation. There was no difference in capacity of nuclear maturation between fresh and thawed oocytes (p=0.23). Regarding the zona pellucida (ZP), all oocytes (100%) of all three groups (control, CRYO-IVM and IVMCRYO) presented a positive ZP reading, with no correlation with later embryo evolution. DEAD-LIVE analysis of cell viability revealed reduction of viability in the IVM-CRYO group (27%) compared to control (84%) (p<0.0001) and to the CRYO-IVM group (56%) (p=0.017), with no difference between the last two groups (p=0.055). Analysis of the potential for embryo development by means of in vitro fertilization showed that the control group presented better cleavage and blastocyst formation rates than the CRYO-IVM (p<0.0001 and p<0.0001, respectively) and the IVM-CRYO (p<0.0001 and p=0.0004, respectively) groups. Analyzing the potential for embryo development the control group presented better cleavage by means of in vitro fertilization (80%) and parthenogenetic activation (58%) than the CRYOIVM (28%; p<0,0001; 28%; p=0,0002, respectively) and the IVM-CRYO groups (26%; p<0,0001; 22%, p<0,0001,respectively) Analysis of blastocyst formation rates and hatching after FIV and AT in CRYO-IVM and IVM-CRYO groups were null. Vitrification of bovine oocytes causes great impairment of their reproductive capacity regardless of the stage of maturation at the time of freezing. However the vitrified immature oocytes submitted to IVM maintained their capacity of nuclear maturation, as they achieved MII stage. This study was not able to determine which stage was better in reducing crio damage, as both stages (VG and MII) presented equally impaired by the process.