Dissertations / Theses on the topic 'Virus de la stomatite vésiculeuse'

Les structures pré- et post-fusion de G VSV ont été élucidées par radiocristallographie,permettent d'identifier certains résidus qui pourraient jouer le rôle d'interrupteurs moléculaires sensibles au pH depuis la forme post- vers la forme pré-fusion. Ces acides aminés acides ont donc été remplacés par de simples(D268L,N,V;D274N;E276Q;D393N;D395N: et doubles mutants(D274N-D395N,E276-393N). L'expression,repliement,transport à la membrane cellulaire ont été analysés par immunofluorescence et FACS. Des expériences de fusion cellule-cellule ont montré que la plupart de ces mutants sont affectés dans leur propriétés de fusion. En particulier,les mutants en position 268 ont complètement perdu leur activité de fusion. Les mutants D268V/L sont piégés dans leur conformation post-fusion alors que la mutation D268N entraîne la création d'un site de glycosylation,qui rend le mutant incapable de former le trimère post-fusion. Tous ces mutants,sauf E276Q,ont des capacités réduites à pseudotyper un virus dépourvu du gène de la G. De façon inattendue,la stabilisation du trimère post-fusion empêche l'incorporation de G dans les particules virales. Nous avons utilisé la génétique inverse pour produire des particules virales recombinantes. La plupart des mutants on immédiatement réverté vers la séquence de type sauvage révélant l'importance de celle-ci. Ces données démontrent que les résidus identifiés précédemment sont bien des régulateurs du changement de conformation de G et que D268 est k résidu majeur dans cet rôle. Elles suggèrent aussi que la conformation de G régule son incorporation dans les particule naissantes et/ou la libération de la nucléocapside virale dans le cytoplasme après fusion
The structure of the pre- and post-fusion of VSV G states have been elucidated by X-ray crystallography,allowing the identification of some amino acid residues which could play the role of pH-dependent molecular switches,triggering the conformational change from the post- toward the pre-fusion state. To confirm this,these acidic amino acids were mutated,creating single(D268L,N,V;D274N;E276Q;D393N;D395N) and double mutants (D274N-D395N,E276Q-D393N). Their expression,folding and transport to the tell membrane were analyzed by immunofluorescence and FACS. A cell-cell fusion assay showed that most of these mutants are affected in their membrane fusion properties. Particularly,mutants D268L/V/N have completely lost their fusion activity. We demonstrated that D268LN are trapped in their post-fusion state whereas the mutation D268N,which results in the creation of an efficient glycosylation, is unable to form the post fusion trimer. All these mutants, except mutant E276Q, do not or very inefficiently pseudotype a virus lacking the glycoprotein gene. Surprisingly,the stabilization of the post fusion trimer precludes G incorporation into the viral particles. We used a reverse genetic approach to produce recombinant viral particles. Most of the mutants immediately reverted toward the wild type sequence indicating the importance of the wild type sequence in this region. These data demonstrate that the residues identified are indeed regulators of G conformational change and that D268 is the major pH sensitive switch. It also suggests that the conformation of G regulates its incorporation in nascent particles and/or the release of viral nucleocapsid into the cytoplasm alter fusion

Les virus enveloppés pénètrent dans les cellules par la fusion membranaire catalysée par des glycoprotéines virales. Les structures cristallines ont fourni, des images statiques des conformation pré- et post-fusion de ces glycoprotéines mais les états intermédiaires restent inconnus. Les glycoprotéines (G) des vésiculovirus forment des assemblages trimériques dans leurs conformations pré- et post-fusion. Ici nous décrivons un unique cristal contenant simultanément un intermédiaire précoce et tardif durant le changement de conformation de la glycoprotéine (G) du virus Chandipura, un vésiculovirus responsable d'encéphalites mortelles. Les deux intermédiaires de G forment un hétérotétramètre (un dimère d'hétérodimère) plat exposant les boucles de fusion à sa surface. La microscopie électronique et la tomographie montrent deux intermédiaires différents à la surface du virus : une structure plate qui induit l'agrégation des virions et une structure allongée monomérique correspondant à l'intermédiaire tardif. Ces résultats ainsi que des données précédemment obtenues sur des mutants de G de plusieurs rhabdovirus, nous permettent de proposeer que le tétramère ou le dimer sont le complexe qui attaque la membrane cible. Dans ce modèle, la transition structurale depuis la forme pré-fusion de G démarre par une étape de monomérisation et se poursuit par une série d'événements au cours de laquelle les monomères sont en mesure de former d'une part le tétramère, au niveau de la zone de contact avec la membrane cible, et d'autre part un réseau de spicules dans leur état post-fusion en dehors de cette zone de contact. Ce dernier réseau serait impliqué dans l'élargissement des pores de fusion
Enveloped viruses enter cells through a membrane fusion reaction driven by conformational changes of viral fusion glycoproteins. Crystal structures have provided static pictures of pre- and post-fusion conformations for several of these glycoproteins but structures of intermediates are unknown. Vesiculovirus glycoproteins (G) form trimeric assemblies both in their pre- and post- fusion conformation. We report here a single crystal structure containing two different states of G which correspond to an early and a late intermediate during the conformational change of the glycoprotein G of Chandipura virus, a vesiculovirus responsible for deadly encephalopathies. In the crystal, the two intermediates are associated to form a fusion loop-exposing flat tetramer with twofold symmetry. Consistent with these data, electron microscopy and tomography show two different intermediates at the viral surface depending on experimental conditions : a flat assembly leading to viral aggregation and a monomeric elongated structure which resembles the late intermediate. All this information and previous rhabdoviruses mutants with so far unexplained phenotypes, allowed us to propose that G dimer or tetramer have a role during membrane fusion. We propose a model for G structural transition that is depicted as a series of events in which, after dissociation of the trimeric prefusion state, the resulting monomers are able to form, on the one hand, a tetrameric assembly in the contact zone with the target membrane, and on the other, outside this contact zone, a helical network of spikes in their post-fusion state. This helical network would be involved in fusion pore enlargement

Le transfert d'un cargo, contenu dans une vésicule, vers des cellules d'intérêt reste un défi pour les thérapies ciblées. Les glycoprotéines virales, se liant à un récepteur cellulaire et induisant la fusion membranaire, constituent des outils prometteurs pour ce type d'approche. La glycoprotéine G du VSV est la glycoprotéine virale la plus utilisée pour pseudotyper des lentivirus en thérapie génique. Il y a néanmoins des limites à l'utilisation de G : les récepteurs de G (membres de la famille du LDLR) sont ubiquitaires et présents à la surface de cellules non cibles. Les travaux de l'équipe sur la structure du complexe VSVG/LDLR avaient identifié des mutants de G ne liant plus le LDLR mais conservant leur activité de fusion. Ce découplage entre reconnaissance du récepteur et fusion ouvrait la possibilité de recibler spécifiquement la glycoprotéine vers des récepteurs d'intérêt. Nous avons construit une glycoprotéine chimérique en fusion avec un nanobody dirigé contre la mCherry en position aminoterminale de G. L'insertion de ce nanobody dans G est délétère. Par évolution expérimentale, nous avons identifié deux mutations dans G améliorant le repliement de la chimére. Ces mutations favorisent le repliement des G chimériques quel que soit le nanobody inséré en position amino-terminale. Les virus pseudotypés (VSV et lentivirus) avec ces G chimériques ont un titre 10 fois plus élevé lorsque les mutations d'optimisations sont présentes. Nous avons ensuite construit des glycoprotéines chimériques avec plusieurs nanobodies ciblant le récepteur HER2. Dans ces glycoprotéines, nous avons introduit les mutations abolissant la reconnaissance des récepteurs naturels de G. Les virus pseudotypés par ces glycoprotéines n'infectent plus que des cellules exprimant le récepteur HER2. Nous avons donc identifié des mutations de G permettant de conférer un nouveau tropisme à G par insertion aminoterminale de nanobodies. Ceci ouvre la voie à des thérapies ciblées personnalisées
The transfer of vesicles containing cargos toward cells of interest remains a challenge for targeted therapy. Viral fusion glycoproteins having the property of receptor recognition and fusion activity constitute promising tools for this kind of approach. VSV glycoprotein (G) is the most used viral glycoprotein to pseudotype lentiviruses in gene therapy. However, we encounter limits to the use of G: G cellular receptors (from LDLR family) are ubiquitous and expressed at the surface of non-target cells. The work of the team on VSVG/LDLR structure enabled us to identify G mutants that no longer bind the LDLR without affecting its fusion activity. This uncoupling between the recognition of the receptor and the fusion capacity opened up the possibility of retargeting G towards receptors of interest. A chimeric glycoprotein fused with a nanobody directed against the mCherry protein, in N-terminal, of G has been constructed. The insertion of a nanobody in G is deleterious for its activity. Using experimental evolution, we identified two mutations on G enhancing the chimera folding. Remarkably, these mutations improve the folding of chimeric Gs, regardless of the sequence of the nanobody inserted in amino-terminal. Pseudotyped viruses (both VSV and lentiviruses) with these chimeric Gs at their surface show 10 times higher titers with these mutations of optimisation. We then constructed chimeric Gs with several nanobodies targeting the receptor HER2. We introduced the mutations abolishing LDLR recognition in these Gs. Viruses pseudotyped with these glycoproteins only infected cells expressing HER2. We therefore identified G mutations conferring a new tropism of G thanks to the N-terminal insertion of a nanobody. All this work opens the way to personalised targeted therapies

La protéine de matrice (M, 229aa, 26kDa) du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est impliquée dans plusieurs étapes du cycle viral. Elle joue un rôle dans l'inhibition de la réponse antivirale de l'hôte, dans l'assemblage et dans le bourgeonnement des nouvelles particules virales. Pour réaliser ces fonctions, la protéine de matrice interagit avec plusieurs machineries cellulaires, comme celle des corps multivésiculaires ou le pore nucléaire. Pour identifier d'autres partenaires de la M, un crible double hybride a été réalisé et a permis l'identification de deux partenaires potentiels. Le premier est la dynamine. Cette protéine est impliquée dans la séparation des vésicules d'endocytose de la membrane plasmique. Les domaines d'interactions ont été identifié comme étant le domaine N-terminal de la M et le domaine d'homologie à la Pleckstrine de la dynamine. Par une approche de génétique inverse, nous avons mis en évidence que cette interaction était fonctionnelle. Cette interaction joue un rôle crucial dans les étapes d'assemblage juste avant le bourgeonnement. En particulier, nous montrons que la M interagit avec la dynamine afin d'inhiber l'endocytose de la cellule hôte ce qui favorise la formation de plates-formes d'assemblages virales. Le deuxième partenaire est CRM1. Cette protéine est impliquée dans l'export nucléaire. Nous avon: identifié une mutation sur la M abolissant l'interaction avec CRM1. Cette mutation a déjà été identifiée lors d'infections persistantes. L'interaction entre la M et CRM1 ne semble pas jouer de rôk dans la localisation cellulaire de M ni inhiber la fonction d'export de CRM1. La fonction de cette interaction reste donc à déterminer
The vesicular stomatitis virus (VSV) matrix protein (M, 229aa, 26kDa) is involved in many steps during the viral cycle. M plays a key role in the assembly and budding of new viral particles. M inhibits the cell's antiviral response. M interacts and hijacks cellular functions like the nuclear pore complex to inhibit RNA's nuclear export and the multivesicular body machinery for budding. A yeast two hybrid screening was realized in the lab with the M protein as a bait to identify new cellular partners. Among all the positive clones, we found two proteins of interest during the viral cycle : dynamin and CRM1. The first one is dynamin. This protein is involved in the pinching of new endocytosis vesicles from the plasma membrane. The flexible amino-terminal part of M interacts with dynamin PH domains. A single mutation on M abolishes interaction with dynamin and reduce virus yield. Adaptation of mutant virus occurs rapidly allowing the isolation of revertants of which the M protein recovered a significant level of interaction with dynamin. We show that M-dynamin interaction inhibits clathrine dependant endocytosis and favours the accumulation of the viral glycoprotein at the plasma membrane thus allowing the formation of assembly platform. The second cellular partner is CRM1. This protein is involved in the export of protein which have : nuclear export signal. A mutation on M that abolishes interaction between CRM1 and M was discovered. This mutation is known to be involved in persistent infections. The M-CRM1 interaction seems to have no effect on M cellular localisation and on the cellular activity of CRM1. The exact role of this interaction remains unclear

Le Virus de la Stomatite Vésiculaire est un virus enveloppé affectant principalement les mammifères. Non pathogène pour l'homme et facile à cultiver, il constitue un modèle idéal pour étudier les différents mécanismes du cycle infectieux. Lors de la dernière étape de ce cycle, VSV acquiert sa membrane en bourgeonnant au travers de la membrane cytoplasmique de sa cellule hôte. La protéine de matrice (M), une des cinq protéines virales, joue un rôle clef lors de ce phénomène. Elle est aussi responsable de l'assemblage et de la condensation de la nucléocapside virale, ainsi que d'effets cytopathogènes du virus. Deux propriétés biochimiques de la M liées à l'assemblage et au bourgeonnement ont été identifiées: elle est capable de s'auto-assembler et de s'associer aux membranes. Cette thèse présente d'abord l'étude de la protéine M par protéolyse ménagée menant à la purification de fragments solubles de la protéine ayant permis d'obtenir des cristaux de la protéine. Elle présente ensuite la détermination de la structure de cette protéine par radiocristallographie. Enfin, des études sur l'interaction de la protéine et de certains de ses mutants avec les membranes permettent de proposer un mode d'interaction de la protéine avec les membranes
Vesicular Stomatitis Virus, an enveloped virus, infects mainly mammals. As it is nonpathogenic for humans and easy to grow, VSV is used as a model to study the different mechanisms of the infectious cycle. During the last stage of this cycle, VSV acquires its membrane by budding through the membrane of its host cell. The matrix protein, one of the five proteins of VSV, plays a major role in this process. This protein is also involved in viral assembly and nucleocapsid condensation and is responsible for the cytopathogenic effects of the virus. Two biochemical properties have been linked to the assembly and budding functions of the M protein : the protein self-associates and binds to membranes. The present work describes the study of M protein by limited proteolysis that lead to the purification of soluble fragments that were crystallized. We also present the determination of the structure of the M protein by radiocrystallography. Together with studies of membrane association of native and mutants of the protein, the structure helped us to propose a mode of membrane interaction of the protein

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est un virus enveloppé appartenant au genre Vésiculovirus et à la famille des Rhabdoviridae. Son unique glycoprotéine G reconnait un récepteur à la surface de la cellule hôte puis, après endocytose du virion, déclenche la fusion membranaire grâce à une transition structurale induite à faible pH depuis la forme pré-fusion de G vers sa forme post-fusion. Par ailleurs, G est la cible des anticorps neutralisant le virus. Les structures cristallographiques des formes pré- et post-fusion de l'ectodomaine soluble de G (i.e. sans sa partie transmembranaire) ont été déterminées par radiocristallographie. Ces structures ont installé G comme étant le prototype des glycoprotéines de fusion de classe III. L'organisation de l'extrémité carboxyterminale de l'ectodomaine et du domaine transmembranaire de G, qui jouent un rôle important durant le processus de fusion, n'est cependant pas connue. Nous avons donc réalisé une étude par cryo-microscopie électronique sur la glycoprotéine complète, purifiée à partir de particules virales, seule ou en complexe avec un anticorps monoclonal. Cette étude nous a permis de compléter les structures de l'ectodomaine dans ses conformations pré et post-fusion. Elle suggère que les domaines transmembranaires sont mobiles au sein de la membrane. Par ailleurs, nous avons résolu deux structures de G en complexe avec un FAb dérivé d'un anticorps neutralisant, reconnaissant à la fois les formes pré- et post-fusion de plusieurs souches de Vésiculovirus. Cette première structure d'un complexe entre G et un anticorps nous a permis de caractériser finement l'épitope, d'identifier les résidus de G clefs dans l'interaction et de proposer un mécanisme de neutralisation. Ce travail augmente de façon significative nos connaissances sur la structure de G qui est la glycoprotéine la plus utilisée en biotechnologie pour délivrer un cargo et en thérapie génique pour le pseudotypage de vecteurs lentiviraux. Nous avons également débuté une étude visant à caractériser les glycoprotéines des Lyssavirus, genre appartenant également à la famille des Rhabdoviridae, et dont le virus de la rage est le prototype. Nous avons produit et purifié les ectodomaines de plusieurs Lyssavirus, et nous avons pu obtenir une structure cristallographique de l'ectodomaine du virus Ikoma (IKOV G) qui correspondrait à un intermédiaire monomérique tardif. Afin de poursuivre le travail de caractérisation de cette structure, plusieurs approches sont en cours. Nous avons notamment réalisé une sélection par phage display de ligands alphaReps dirigés contre IKOV G. Les alphareps sont des protéines artificielles constituées par des répétitions hélicoïdales. 6 des 11 alphareps sélectionnées sont capables de lier IKOV G. La caractérisation des complexes IKOV G est en cours. Nous envisageons i) d'utiliser ces alphareps pour piéger des conformations différentes de G que celle obtenues pour en obtenir la structure par cristallographie ou cryo-EM ii) tester l'activité antivirale des apharep sélectionnées
Vesicular stomatitis virus (VSV), an enveloped virus, is the prototype species of the genus Vesiculovirus within the family Rhabdoviridae. Its G glycoprotein is responsible for receptor recognition, on the host cell surface, that triggers clathrin-mediated endocytosis of VSV. Then, within the acidic environment of the endosome, VSV G undergoes a fusogenic conformational change from the pre-fusion form of G to its post-fusion form, leading the fusion of both membranes. G is also the target of virus-neutralizing antibodies. Both structures of the pre- and post-fusion forms of the soluble ectodomain of G (i.e. without its transmembrane part) were determined by radiocrystallography. These structures established G as the prototype of class III fusion glycoproteins. However, the organization of the carboxyterminal part of the ectodomain and the transmembrane domain of G, which play an important role during the fusion process, remains unknown. Therefore, we carried out a cryo-electron microscopy study on the complete glycoprotein, directly purified from viral particles, alone or in complex with a monoclonal antibody. This study led to complete the structures of the ectodomain in its pre- and post-fusion conformations. It also revealed that the transmembrane domains are mobile within the membrane. We have also solved two structures of G in complex with a FAb derived from a neutralizing antibody, recognizing both pre- and post-fusion forms of G from several strains of Vesiculovirus. Based on these first structures of a complex between G and an antibody, we could characterize the epitope, identify the key G residues in the interaction and propose a neutralization mechanism. This work significantly increases our knowledge of the structure of G, which is the most widely used glycoprotein in biotechnology for cargo delivery and in gene therapy (by lentivirus pseudotyping).We also initiated a study aimed at characterizing the glycoproteins of Lyssaviruses, a genus also part of the Rhabdoviridae family, and for which rabies virus is the prototype. We produced and purified the ectodomains of several Lyssaviruses, and we were able to obtain a crystallographic structure of the ectodomain of Ikoma virus (IKOV G), which corresponds to a late monomeric intermediate. Several approaches are underway to further characterize this structure. We also carried out a phage display selection of alphaReps directed against IKOV G. Alphareps are artificial proteins binders consisting of helical repeats. 6 out of 11 alphareps are able to bind IKOVG. Complexes of IKOV G with alphareps are currently being characterized. We plan to i) use these tools as crystallization helpers to trap different conformations of G in crystallography or cryo-EM ii) evaluate the potential antiviral activity of these alphareps

La protéine de matrice (M) du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est une petite protéine multifonctionnelle de 26,6 kDa. La protéine M joue un rôle majeur dans les processus d'assemblage et de bourgeonnement du VSV. Elle est aussi responsable de l'extinction des synthèses cellulaires, elle déstabilise le réseau de microtubule et induit l'apoptose par voie mitochondriale. Pour remplir l'ensemble de ses fonctions, la protéine M recrute des partenaires cellulaires. Certains de ces partenaires étaient déjà connus. Parmi ceux-ci, nous nous sommes intéressés aux protéines Nedd4, une ubiquitine ligase, et TSG101, un composant du complexe ESCRT I. Lors d'un crible double hybride effectué au laboratoire, nous avons identifié trois nouveaux partenaires de la protéine M : la dynamine, une GTPase impliquée dans le processus d'endocytose, LMP2, une sous-unité catalytique de l'immunoprotéasome et l'a-caténine, une protéine appartenant aux complexes formant les jonctions intercellulaires. Dans un premier temps, nous avons étudié les rôles des protéines Nedd4, TSG101 et dynamine dans les étapes tardives du cycle viral : l'assemblage et le bourgeonnement. Nous avons caractérisé des virus recombinants mutants dont la protéine de matrice n'interagit plus avec un ou deux de ces partenaires. Pour ce faire, nous avons mis au point une nouvelle technique, plus précise, de titration du virus par fluorescence. Cette technique a été utilisée pour établir les cinétiques de production des différents virus recombinants dans divers types cellulaires. L'ensemble de nos résultats suggère que TSG101 a un rôle dans le bourgeonnement que l'on ne met en évidence que dans un contexte de double mutation. Nos observations de microscopie électronique nous ont indiqué que la dynamine intervient en amont de la protéine Nedd4. Enfin, les virions dont la protéine de matrice n'interagit plus avec Nedd4 ont une morphologie aberrante et leur protéine de matrice n'est plus ubiquitinylée. Nous nous sommes ensuite intéressés aux nouveaux partenaires de la protéine de matrice : les protéines LMP2 et l'a-caténine. Nous avions exprimé ces protéines en fusion avec la GST et nous avons montré que ces constructions étaient bien capables d'interagir avec la protéine de matrice, confirmant ainsi les interactions mise en évidence par double hybride. Enfin, nous avons précisé les résidus et les domaines impliqués dans les associations M-LMP2 et M-a-caténine. Des expériences préliminaires nous ont aussi permis de voir que la protéine de matrice et l'a-caténine colocalisent au niveau de la membrane des cellules. L'ensemble de ces résultats contribue à une meilleure compréhension de l'interactome complexe de la protéine de matrice et au rôle des diverses protéines le constituant
The matrix protein (M) of vesicular stomatitis virus (VSV) is a multifunctional 26,6 kDa small protein. M protein plays a key role in assembly and budding processes and is responsible for cellular synthesis shut down, microtubules destabilization and apoptosis. For these reasons, M protein recruits several cellular partners. Among cellular proteins identified so far, we are interested in Nedd4, E3 unbiquitin ligase and TSG101, a component of ESCRT I complex. 2-Yeast Hybrid technique allowed us to identify three news partners for M protein: Dynamin, protein involved in endocytic pathway, LMP2, catalytic subunit of immunoproteasome and Catenin a, that belongs to intercellular junctions. First, we studied the implication of Nedd4, TSG101 and dynamin during late stages of the viral cycle: assembly and budding. We characterized recombinants mutant virus containing matrix protein that does not interact anymore with one or two partners. For that, we developed a new technique to titrate with higher accuracy viral supernatants. We applied this technique for growth curves in different cell type. Our results" suggest that TSG101 plays a role during budding that highlighted with double mutant virus. EM observations indicate that dynamin acts upstream Nedd4. We also showed that some viral particles produced from an infection using virus containing M protein that does not interact with Nedd4 display an aberrant morphology and their M protein is no longer ubiquitinated. After, we started the study of new partners of M protein: LMP2 and Catenin a, previously identified. We expressed these proteins in fusion with GST and we have shown that these buildings were well able to interact with the M, confirming both interactions. Finally we could define residues and domains involved in M-LMP2 and M-Catenin a interactions. Preliminary experiments show that M protein and Catenin a colocalize at level of epithelial cells membrane. An results contribute to a better understanding of the interactome complex matrix protein

Il est largement admis qu'un cancer se développe lorsque les cellules cancéreuses échappent au contrôle du système immunitaire et que l'exploitation des défenses immunitaires afin de réactiver les cellules T endogènes anti-tumorales pourrait être une option thérapeutique pour obtenir des réponses complètes et durables.L'interféron de type I est connu pour sa puissante activité antitumorale dans les tumeurs expérimentales de la souris. En outre, il s'est avéré être une cytokine clé nécessaire à l'efficacité de nombreux agents anticancéreux ciblant non seulement les cellules cancéreuses (radiations ionisantes, produits chimiques cytostatiques, AcM...) mais aussi le système immunitaire (vaccination, cellules CAR-T...). Cependant, son utilisation n'est plus envisagée par le clinicien en raison des effets secondaires subis par les patients. Pour répondre à cette préoccupation, une technologie très prometteuse permettant la conception de molécules d'interféron ciblées et spécifiques aux cellules a été développée et l'objectif de notre travail actuel est de générer et d'évaluer pré-cliniquement des composés principaux. Pour cela, il faut s'attaquer à un certain nombre de frontières de la recherche, notamment répondre aux questions fondamentales "où" et "quand" l'interféron doit agir pour exercer son activité antitumorale, seul ou en combinaison avec les stratégies thérapeutiques susmentionnées.La question "quand" est importante car on soupçonne fortement que le moment relatif de l'action de l'interféron et de la stimulation du TCR détermine si l'effet de l'interféron est immunostimulant ou immunosuppresseur. La question "où" est évidente car elle détermine le choix de la partie ciblée des interférons modifiés. Nous savons que l'action de l'interféron sur les cellules dendritiques est nécessaire à son activité antitumorale, mais est-elle suffisante ? Une action sur les cellules T est-elle également obligatoire ? L'action de l'interféron sur les cellules tumorales ou les cellules du stroma est-elle nécessaire pour attirer les cellules immunitaires effectrices ?
It is widely accepted that a cancer develops when cancer cells escape from the control of the immune system and that harnessing the immune defences in order to reactivate endogenous anti-tumor T cells could be a therapeutic option for full and durable responses.Type I interferon is known for its potent antitumor activity in experimental mouse tumors. Furthermore, it has been shown to be a key cytokine necessary for the efficacy of many anticancer agents targeting not only cancer cells (ionising radiations, cytostatic chemicals, mAbs…) but also the immune system (vaccination, CAR-T cells…). However, its use is no longer considered by the clinician owing to the side effects experienced by the patients. To address this concern, a highly promising technology allowing the design of cell-specific targeted interferon molecules has been developed and the objective of our present work is to generate and pre-clinically evaluate lead compounds. For this, a number of research frontiers must be tackled, these include to answer to the fundamental questions 'where' and 'when' interferon must act in order to exert its antitumor activity either alone or in combination with the above-mentioned therapeutic strategies.The question 'when' is important because it is highly suspected that the relative timing of interferon action and TCR stimulation determines whether the effect of interferon is immunostimulant or immunosuppressive. The question 'where' is evident since it determines the choice of the targeting moiety of the engineered interferons. We know that the action of interferon on dendritic cells is necessary for its antitumor activity but is it sufficient? Is an action on T cells also mandatory? Is an interferon action on tumor cells or stroma cells necessary for attracting effector immune cells?

Les preoccupations de l'equipe dans laquelle j'ai effectue ma these s'inscrivent dans le theme general de la transition vesicule-micelle et de la modelisation de membranes biologiques naturelles. Les mecanismes de la transition vesicule-micelle de systemes phospholipide-amphiphile sont intimement relies aux mecanismes de reconstitution des proteines membranaires dans des membranes artificielles lorsque des protocoles utilisant des detergents sont utilises. Le travail de these se separe ainsi en deux parties. L'une porte sur l'etude approfondie d'une sonde fluorescente membranaire, le laurdan, extremement sensible a la transition vesicule-micelle et l'autre sur la solubilisation d'un virus, la reconstitution de son enveloppe et l'incorporation dans des liposomes de l'unique proteine intrinseque de l'enveloppe de ce virus. Au cours de cette seconde partie, le laurdan a ete utilise pour suivre la solubilisation du virus. La premiere partie de mon travail avait pour objet d'obtenir de nouvelles informations concernant la transition vesicule-micelle. Dans un premier temps, nous avons realise une etude fondamentale du comportement du laurdan dilue dans differents solvants. Cette etude nous a permis de determiner les parametres auxquels la sonde etait sensible et de proposer un schema reactionnel pour la desexcitation du laurdan. Dans un second temps, le laurdan a ete insere dans des agregats d'amphiphiles rencontres lors de la transition vesicule-micelle pour obtenir des informations supplementaires sur cette transition. La seconde partie de mon travail a porte sur la reconstitution de l'activite fusogene liee a la proteine g de l'enveloppe du virus de la stomatite vesiculaire. La litterature a montre que les reconstitutions de l'enveloppe virale apres solubilisation par l'octylglucoside (og) n'aboutissaient qu'a des systemes dont l'activite fusogenique differait de celle du virus natif. Nous avons montre que le controle de la solubilisation des virus par l'og conduisait, apres elimination du detergent, a des virosomes dont l'activite fusogene est similaire a celle des virus intacts. Nous avons ensuite reconstitue cette proteine purifiee dans des liposomes preformes destabilises par l'og. Les proteoliposomes obtenus presentent une activite fusogene comparable a celle du virus intact.

Différentes formes plus courtes de la protéine de la matrice (M) du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) peuvent être produites lors de l'infection de cellules in vitro à cause des phénomènes d'initiation interne de la traduction (Jayakar et Whitt, 2002) et de protéolyse (Rosen et al., 1983). L'objectif de la présente étude était de caractériser les formes plus courtes de M produites lors de l'infection de cellules par une souche sauvage du VSV (HR), ou par un variant (T1 026-R1) qui possède une mutation sur sa protéine M (M51R). Pour ce faire, des cellules HeLa, BHK-21 et L929 ont été infectées par ces deux variants lors d'expériences séparées. Des immunobuvardages et des tests de type «pulse-chase» ont permis d'observer l'existence d'au moins quatre formes de M à l'intérieur des cellules infectées (M1, M', M" et Mfc) et ce, indépendamment de la souche virale employée. Lors de l'infection des cellules par la souche sauvage du VSV (HR), les formes M" et Mfc pourraient être produites par initiation interne de la traduction aux positions 33 et 51 de M, respectivement. L'existence de la forme Mfc, ou d'une protéine de taille semblable, à l'intérieur des cellules infectées par T1026-R1, ne peut cependant pas être expliquée par un évènement d'initiation interne de la traduction en position 51 à cause de la mutation M51 R. L'origine de cette protéine pourrait être attibuable à l'action de la trypsine ou une autre protéase activée au cours de l'infection. Des expériences de «pulse-chase» en présence de l'inhibiteur z-VAD ont montré que l'apparition de Mfc pouvait dépendre de l'activation des cystéines protéases. L'analyse des séquences des différentes formes de M par dégradation de Edman et par spectrométrie de masse n'a pas permis d'identifier la portion manquante de la protéine. Aussi, afin de tenter de déterminer le rôle physiologique des formes de M produites par initiation interne de la traduction, des vecteurs d'expression inductible des gènes tronqués ont été construits. L'expression de ces protéines à l'intérieur de cellules HeLa transfectantes stables n'a pu être détectée. La protéase impliquée dans la production de la forme Mfc du mutant T1 026-R1 reste à identifier ainsi que le rôle des différentes formes plus courtes de la protéine M dans la cytopathogénèse et le cycle de réplication du VSV. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Virus stomatite vésiculeuse, Protéine matrice, Initiation interne de la traduction, Protéolyse.

La réponse immunitaire primaire fait appel à l'interféron bêta (IFN-B), une cytokine produite lors d'infections virales. L'expression de l'IFN-B est positivement régulée par le facteur nucléaire kappa B (NF-kB) et celui-ci est retenu au cytoplasme par l'inhibiteur kappa B alpha (IkBa). L'expression d'IFN-B s'effectue lorsque IkBa est dégradé suite à sa phosphorylation. Fait intéressant, l'IFN-B n'est pas induit par le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) sauvage, contrairement à son mutant pour la protéine matricielle M (M51R), T1026. De plus, TP6 est un mutant de VSV qui possède la séquence sauvage de M et qui induit fortement l'IFN-B. Ces informations pourraient suggérer qu'à l'opposé de sa forme mutante, VSV sauvage ne permet pas l'expression du gène du NF-kB et il ne désactive pas IkBa, par sa phosphorylation ou dégradation, ce qui empêcherait l'activation du gène de l'IFN-B. Cette hypothèse a été vérifiée en mesurant l'expression de l'ARNm du NF-kB par PCR en temps réel et la phosphorylation de IkBa par immunobuvardage (IB) lors d'infections de cellules HeLa (humaines) et L929 (murines). Les données de PCR montrent que l'infection des cellules L929 par le virus HR produit une diminution de l'expression de l'ARNm du NF-kB au début de l'infection tandis que le virus TP6 montre une augmentation du NF-kB. Les IB témoignent que la quantité de IkBa et de p-IkBa diminue dans les deux types cellulaires infectés par HR. T1026 amène une expression différente pour les deux formes de IkBa et pour les deux types cellulaires. Ces résultats montrent que l'infection par ces trois souches de VSV affecte différemment l'expression du NF-kB et la dégradation de IkBa, sans toutefois expliquer les différences d'induction de l'IFN-B. La régulation de l'IFN-B au cours de l'infection par VSV pourrait impliquer d'autres mécanismes que la régulation de NF-kB. La progression des études portant sur VSV est importante car il est oncolytique et il fait partie des moyens envisagés dans le futur pour combattre les cancers. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : VSV, IFN-B, NF-kB, IkBa

Malgré les avancées considérables de la cancérologie, de nouvelles thérapies sont toujours recherchées étant donné les effets secondaires des traitements actuels. Peu connue, la virothérapie oncolytique consiste à utiliser un virus pour détruire des cellules cancéreuses tout en épargnant les saines. Sur les mutants T1026R1 et TP3R1 du VSV de la famille des vésiculovirus portant un génome à ARN négatif de 11 kb, des efforts sont entrepris afin de prouver qu'ils sont des armes efficaces contre le cancer. Cependant, leur faible pouvoir apoptique ainsi que la persistance démontrée pour T1026R1 dans les cellules H4 les rendent moins attrayants. D'autres mutants du VSV, soit TR5R1 et TP6R1 pourraient également être de bons candidats dans la virothérapie oncolytique. Ils ne persistent pas, ils sont de meilleurs inducteurs d'apoptose et comme les mutants T1026R1 et TP3R1, ils induisent fortement la réponse des interférons. Afin de comprendre les différences quant au phénotype d'infection des mutants TP5R1 et TP6R1, le séquençage du génome entier de la souche sauvage HR ainsi que tous les mutants thermosensibles et thermorésistants a été entrepris. Les mutations responsables de la thermosensibilité vs thermorésistance pourront du même coup être révélées. Les résultats confirment les mutations M51R sur la protéine de la matrice de T1026R1 et de T1026 et V221F-S226R de TP3R1. Les mutants TP5R1 et TP6R1 portent respectivement les mutations E254Q et E254G sur le « PH domain » de leur glycoprotéine. Les mêmes mutations sont retrouvées chez TP5 et TP6 avec en plus la mutation D232G aussi sur le « PH domain ». L'analyse de la structure secondaire montre des changements par rapport au VSV Indiana HR, alors que l'analyse de la structure tridimensionnelle montre que seule la mutation D232G altère la structure. La présence de cette mutation sur les souches thermosensibles T1026, TP5, TP6 et le VSV Indiana San juan ainsi que sa conséquence sur la structure 3D laissent présager qu'elle pourrait être responsable de la thermosensibilité. La cartographie génétique des virus BR, T1026, T1026R1, TP3, TP3R1, TP5, TP5R1, TP6 et TP6R1 permettra d'approfondir la compréhension de leur phénotype d'infection particulier pour éventuellement construire un virus oncolytique recombinant conjuguant les avantages de chacun.

La faculté du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) à induire l'apoptose dans les cellules tumorales en fait un bon modèle d'étude. Mais contrairement au virus sauvage pour la protéine de la matrice M (TP6), certains mutants de M du VSV, comme T1026, induisent moins fortement l'apoptose. Ils peuvent également persister dans les cellules neurales humaines. Les études préalables ont montré que si la voie apoptotique intrinsèque est impliquée dans la mort cellulaire induite par le VSV, elle ne suffit pas à expliquer la totalité de la mortalité. D'autres voies apoptotiques sont donc impliquées. La calpaïne est une protéine cellulaire impliquée dans différentes voies métaboliques chez les cellules de vertébrés, dont l'apoptose. Cette cystéine protéase dépendante du calcium est particulièrement importante dans les cellules de type neural. L'infection virale d'une cellule pouvant induire une variation de la concentration en calcium cytosolique, la calpaïne peut être activée dès la phase précoce de l'infection et jouer un rôle à différents niveaux. Une fois activée, elle a la capacité de cliver le fodrine, protéine du cytosquelette, et ainsi participer aux changements morphologiques induits par le VSV. La calpaïne peut également cliver Bax, renforçant la voie apoptotique mitochondriale. Le rôle de la calpaïne a été étudié ici lors de l'infection in vitro par le VSV dans un neurogliome de type H4. L'analyse des protéines totales, extraites lors des phases précoces et tardives de l'infection par TP6 et T1026, ont pu être effectuées par immunobuvardage. De plus, des modifications dans la morphologie des cellules infectées ont été observées par microscopie optique. La présence de la calpaïne a été décelée dans la fraction cytosolique des cellules H4. Les deux mutants viraux utilisés ont montré un clivage de cette protéase tôt dans l'infection sans toutefois qu'une augmentation de la concentration en calcium cytosolique n'apparaisse. L'inhibition de la calpaïne a provoqué un ralentissement des changements morphologiques induits par TP6, mais le clivage de la fodrine n'a pu être mis en évidence étant donné l'absence de la forme classique de cette protéine dans les cellules H4. L'inhibition de la calpaïne a également permis de diminuer la mortalité cellulaire lors de la phase précoce de l'infection par TP6 (1-4h p.i). Cependant, cet effet se perd au cours de la phase tardive (16-18h p.i). Dans le cas de T1026, l'inhibition de la calpaïne n'a pas provoqué de différences, que ce soit dans les changements morphologiques ou dans la viabilité cellulaire. Entre 14h et 18h p.i. la pro-caspase-3 a été clivée, montrant ainsi l'apoptose induite par le VSV, et Bax a également été clivé en une sous-unité de 18 kDa, portion à caractère pro-apoptotique pouvant provenir de l'activité de la calpaïne. Les résultats montrent donc que cette protéase est impliquée dans l'infection par le VSV, tant dans les changements morphologiques que dans la mort cellulaire induits lors de l'infection. ______________________________________________________________________________

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sert de modèle pour l'étude de la multiplication des virus (Mononegavirales) alors que la rage(RV) reste un sérieux problème de santé publique. Le génome de VSV et RV code notamment la nucléoprotéine (N) et la phosphoprotéine (P). N s'associe étroitement à l'ARN viral. Ce complexe N-ARN sert de matrice pour la réplication et la transcription virale. P est le cofacteur de la polymérase virale (L) et chaperonne N. En interagissant avec N-ARN (domaine C-terminal) et avec L (domaine N-terminal), P assure le lien physique entre l'ARN viral et L. La stœchiométrie de P, sa structure et son rôle exact pendant la transcription et la réplication restent incertains. Mon travail a consisté à une caractérisation biophysique et structurale de P et des complexes N-ARN-P pour mieux comprendre la dynamique du complexe de réplication de ces virus.
L'analyse biophysique montre que P RV & VSV existent sous forme de dimère allongé en solution. L'analyse bioinformatique a révélé une organisation modulaire, confirmé par des études biochimiques et biophysiques de mutants de P RV. La structure du domaine C-terminal de P VSV a été résolue par RMN et montre une homologie celle du C-ter de P RV. La caractérisation de l'interaction entre P et les anneaux N-ARN a révélé l'existence de deux types de complexes N-ARN-P (contenant un et 2 dimères de P par anneau). L'étude par ME des complexes nucléocapsides-P a permis de mettre en évidence un changement de conformation important.
Pour devenir accessible à L, l'ARN viral doit se dissocier localement de N. L'interaction N-ARN-P représente potentiellement une nouvelle cible pour le développement d'antiviraux.