Dissertations / Theses on the topic 'Virothérapie'

Malgré des améliorations constantes, les thérapies anti-tumorales conventionnelles (chirurgie, chimiothérapie ou radiothérapie) demeurent parfois inefficaces. La virothérapie anti-tumorale apparaît comme une stratégie thérapeutique alternative. Elle repose sur les propriétés de certains virus qui présentent naturellement ou après modification la capacité de cibler les cellules tumorales sans affecter les cellules saines. La souche vaccinale du virus de la rougeole (MV) présente ainsi de façon naturelle de telles propriétés oncolytiques contre plusieurs cancers grâce au ciblage de la molécule CD46, surexprimée par certaines cellules tumorales. J'ai ainsi montré que le virus MV pouvait cibler de façon spécifique des cellules de mésothéliome in vitro et de mélanome, d'adénocarcinomes pulmonaires et colorectaux in vitro et in vivo. L'infection de ces cellules par le virus MV provoque leur mort dans un contexte immunogène permettant le développement d'une réponse immunitaire via la maturation des cellules dendritiques et l'activation de lymphocytes T. L'immunogénicité de la mort cellulaire dépend de la production et de la libération de molécules de danger. J'ai notamment montré que le virus MV induisait la production de la protéine Hsp70, la translocation de calréticuline vers la surface cellulaire et la libération de HMGB-1 dans le milieu extracellulaire par les cellules tumorales infectées. L'implication du système immunitaire permettrait notamment d'améliorer l'activité oncolytique directe du virus MV. Ces résultats apportent de nouveaux arguments pour l'utilisation du virus MV dans le cadre de traitements anti-tumoraux contre les cancers résistants aux thérapies actuelles
Despite continuous advances, conventional anti-tumour therapies (surgery, chemotherapy, radiotherapy) remain partly ineffective. Thus, cancer virotherapy appears as a potential therapeutic alternative. Some viruses exhibit, either naturally or after genetic engineering, the ability of targeting specifically tumour cells without infecting the healthy ones. Vaccinal strain of measles virus (MV) naturally displays such oncolytic properties against a wide range of cancers due to targeting of CD46 receptor that is overexpressed by some cancer cells. I demonstrated that oncolytic MV specifically targets mesothelioma cells in vitro and melanoma, lung and colorectal adenocarcinoma cells both in vitro and in vivo. Infection of these tumour cells by MV induces cell death in an immunogenic way and thus allows an immune response to develop by maturing dendritic cells and activating T lymphocytes. Cell death immunogenicity depends on production and release of danger molecules by dying cells. I showed that MV infection induces Hsp70 production, calreticulin translocation to cell surface and release of HMGB-1 into extracellular medium by infected tumour cells. Involvement of the immune system would improve the direct oncolytic properties of MV. Altogether, these results give new arguments for the use of MV as anti-tumour therapeutics against resistant cancers

Le virus myxomateux (MYXV), agent de la myxomatose chez le lapin européen (Oryctolagus cuniculus), présente une spécificité d'hôte restreinte. Bien qu'aucun cas d'infection n'ai jamais été mis en évidence chez d'autres espèces de vertébrés que les lagomorphes, y compris l'Homme, il est capable d'infecter et de lyser les cellules tumorales humaines. En vue d'utiliser ce nouveau candidat viral prometteur contre les cancers colorectaux, pancréatiques et ovariens chez l'Homme, nous avons exploré et optimisé son potentiel oncolytique in vitro et in vivo. Nous avons mis en évidence la supériorité oncolytique de la souche vaccinale SG33 de MYXV, dans sa capacité à se répliquer, à diffuser et à lyser les cellules d'adénocarcinome colorectal, pancréatique et ovarien humains in vitro. L'efficacité oncolytique étant dépendante de la quantité de virus administré, nous avons montré la possibilité de compenser la diminution de l'effet lytique à de faibles multiplicités d'infection (MOI), en l'associant à la chimiothérapie moléculaire induite par le gène suicide FCU1. Par ailleurs, nous avons abordé la possibilité d'améliorer l'apport des vecteurs oncolytiques sur les sites tumoraux in vivo, grâce à une méthode originale consistant à encapsuler les virus dans une matrice de silice biodégradable. Nous avons vérifié l'innocuité de la souche vaccinale oncolytique chez deux espèces de mammifères, la souris immunodéficiente et le macaque rhésus. Enfin, l'étude de l'efficacité anti-tumorale de la souche SG33 a été entreprise dans un modèle murin de tumeurs colorectales humaines sous cutanées
Myxoma virus (MYXV), agent of myxomatosis in European rabbits (Oryctolagus cuniculus), exhibits highly species-specific host tropism. Although it has been proven to be non pathogenic in all other vertebrate species, including man, MYXV is able to infect and kill human tumour cells. In order to use this promising oncolytic virus (OV) candidate against human colorectal, pancreatic and ovarian cancers, we investigated oncolytic capacities of optimised MYXV in vitro and in vivo. The oncolytic capacities of MYXV (MYXV-SG) SG33 vaccine strain of appeared to be significantly superior compared to the wild type T1 strain (MYXV-T1), in terms of replication and cell killing in human tumour cells in vitro. We demonstrated that the reduced viral activity of OV at low multiplicity of infection (MOI) could be counterbalanced by FCU1-suicide-gene-induced specific molecular chemotherapy. We studied the possibility of in vivo controlled release of oncolytic viral vectors at tumours sites by encapsulating OV in safe, natural and biodegradable sol-gel silica matrix. The safety of local and systemic injection of MYXV was confirmed in two different animal models, namely Swiss nude mice and immunocompetent rhesus macaque. Finally, oncolytic efficacy of MYXV-SG was investigated in nude mice bearing subcutaneous human colorectal tumours

Le cancer du col de l’utérus est encore aujourd’hui la deuxième cause de mortalité par cancer chez la femme dans le monde, et ce, malgré les traitements disponibles et les possibilités de dépistage précoce. Le principal facteur étiologique de ce cancer est l'infection de l'épithélium cervical par certains types de papillomavirus humain (HPV) dits à haut risque (principalement les types 16 et 18). L'effet oncogène de ces HPV à haut risque est dû à l'expression de deux protéines virales E6 et E7. Dans la première partie de ma thèse, nous avons caractérisé trois anticorps monoclonaux capables de détecter efficacement l’oncoprotéine E6 d’HPV de type 16. Nous avons également utilisé ces anticorps pour réaliser une analyse fonctionnelle de E6 et explorer leurs effets sur les interactions avec différents partenaires cellulaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé des fragments d’anticorps capables de bloquer la dégradation de p53 in vitro afin d’induire spécifiquement l’apoptose des cellules transformées par HPV16 validant ainsi le concept d’immunisation intracellulaire. Le dernier volet de ma thèse était consacré au développement de vecteurs adénoviraux permettant une transduction ciblée des cellules cancéreuses du col de l’utérus. Nous avons montré que l’introduction de deux mutations ponctuelles abolissant l’interaction avec le récepteur de l’adénovirus, associée à l’insertion de peptides internalisants sélectionnés par phage-display dans le bouton terminal de la fibre, confèrent à l’adénovirus de type 5 une spécificité pour les cellules transformées par HPV
Cancer of the cervix is the second most common cancer among women worldwide. Infection with oncogenic human papillomavirus (HPV), most frequently HPV16, is the most significant etiological factor of this cancer. The oncogenic effect of these viruses is principally due to the expression of two early viral proteins, E6 and E7. In the fist part of this work, we have characterized three monoclonal antibodies able to efficiently detect E6 from HPV16 (16E6). We have also used these antibodies to test their effects on the interaction with different partners of E6. In the second part of the thesis, we have used antibody fragments able to block E6-dependent degradation of p53 in vitro to induce specific apoptosis in the HPV16 transformed cells, demonstrating the feasability of the anti-16E6 intracellular immunization for specific killing of cervical cancer cells. In the last part of this work, we generated fiber modified adenoviral vectors which combine the introduction of two point mutations and the insertion of differents peptide sequences selected by phage-display. We show that these modifications ablate the native tropism of the serotype 5 adenovirus confer specificity to HPV-transformed cervical cancer cell lines

Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur deux sujets complémentaires. Le premier a concerné l’étude des interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement, dans quatre modèles de mésothéliomes malins (MM) de rat. Les analyses histologiques du stroma, associées à des analyses protéomiques et de l’expression de différentes cytokines/chimiokines ont permis d’identifier trois stades d’invasivité croissante, associés à des modifications quantitatives de nombreuses protéines et à un infiltrat immunitaire décroissant. La tumeur la plus invasive a été caractérisée par une immunosuppression avec un profil moléculaire spécifique augmentant le potentiel métastatique. Le second sujet a concerné l’évaluation de l’efficacité de la virothérapie anti-tumorale, basée sur l’utilisation de la souche vaccinale du virus de la rougeole MV et de son variant MV-ΔC, pour le traitement du MM. Les deux virus ont induit des régressions tumorales chez des souris NOD SCID transplantées avec deux lignées de MM humains, le MV-ΔC amplifiant cet effet en induisant une mort cellulaire plus rapide, attestée par une réduction plus marquée de la masse tumorale. Ce potentiel apoptotique est associé, in vitro, à une production accrue du signal de danger HMGB1 et à la synthèse d’une grande quantité d’ARN double brin viral. Ces cellules infectées par le MV-ΔC sont aussi capables de favoriser la maturation des cellules dendritiques grâce à la réplication virale et à l’activation de Protéine Kinase R. Ce travail de caractérisation de nouveaux modèles immunocompétents et de nouvelles stratégies thérapeutiques permet d'envisager un meilleur traitement des patients souffrant de mésothéliome
As a PhD student, I worked in parallel on two complementary subjects. The first one concerned the study of the interactions between tumor cells and their microenvironment in four models of rat malignant mesothelioma (MM), differing in both their immune infiltrate and their metastatic potential. Histological analyses of stroma, together with proteomic analyses and expression of different cytokines, chemokines and growth factors, led us to the identification of three stages of increasing invasiveness, associated with quantitative changes in many proteins and a decreased immune infiltrate. The most invasive tumor was characterized by immunosuppression with a specific molecular profile increasing the metastatic potential. The second topic was the evaluation of the efficacy of anti-tumor virotherapy, based on the use of the Schwarz strain of measles virus (MV) and its variant MV-ΔC for the treatment of MM. Both viruses induced tumor regressions in NOD SCID mice transplanted with two human MM cell lines, but MV-ΔC amplified this effect by inducing faster cell death, as revealed by a marked reduction of the tumor mass. This apoptotic potential is associated, in vitro, with an increased production of the danger signal HMGB1 and the synthesis of a large amount of viral double-stranded RNA. These MV-ΔC-infected cells are also capable of promoting the maturation of dendritic cells through viral replication and activation of the Protein Kinase R. This characterization of new immunocompetent models and novel promising therapeutic strategies may lead to better clinical management of patients with mesothelioma

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des agrégats organisés de cellules immunitaires qui se développent dans les tissus non-lymphoïdes à la suite d'une inflammation chronique. Les TLS matures, dont l'organisation est proche de celle d'un ganglion, sont associées à un bon pronostic dans les cancers à tumeurs solides et servent de prédicteur efficace de la réponse des patients traités par immunothérapie. Notre objectif a été d'étudier la virothérapie oncolytique comme stratégie pour induire des TLS dans le microenvironnement tumoral (TME) afin d'intensifier les réponses antitumorales.Les virus oncolytiques (OV) ont la capacité d'infecter et de se répliquer spécifiquement dans les cellules cancéreuses, induisant leur lyse directe ainsi que leur destruction par le système immunitaire via la mort immunogène. Nous supposons que la modulation du microenvironnement tumoral suite à l'infection par des OV, ainsi que la production locale de chimiokines exprimées par ces derniers, pourrait favoriser la néogenèse de TLS et amplifier les réponses antitumorales.Mes travaux ont alors consisté à générer et caractériser des virus de la vaccine oncolytiques (oVV) recombinants, armés avec trois chimiokines, CCL20, CCL21 et CXCL13, que nous supposons impliquées dans la néogenèse de TLS.J'ai observé que l'expression des chimiokines par les oVV recombinants n'affectait pas leurs propriétés oncolytiques et que les chimiokines étaient bien fonctionnelles in vitro. Bien que la réplication des oVV fût réduite dans les modèles murins syngéniques, j'ai détecté les chimiokines murines dans les tumeurs infectées avec les oVV armés ainsi que la formation d'agrégats immunitaires dans les modèles de tumeur chaude. Néanmoins, aucune amélioration thérapeutique n'a été observée avec l'oVV armé avec les chimiokines par rapport au virus non armé.J'ai alors étudié la capacité de TLS induites par un oVV, à établir des réponses antitumorales, dans le modèle orthotopique TC-1 luc qualifié de chaud. Dans ce modèle, j'ai observé que l'administration intranasale de l'oVV induisait plus de TLS que l'administration d'un virus de la vaccine non oncolytique, le MVA. De plus, j'ai observé que les TLS induites par l'infection virale par le MVA n'étaient pas associées à une réponse antitumorale alors que j'ai détecté à long terme la présence de lymphocytes T spécifiques antitumoraux et un contrôle de la tumeur pulmonaire chez une souris infectée par l'oVV. Ainsi, nous supposons que les propriétés oncolytiques des oVV peuvent induire des TLS efficaces contre les tumeurs.Pour favoriser la réplication des oVV et l'expression des chimiokines, ainsi que pour faciliter l'observation des réponses antitumorales tardives avec des cinétiques de croissance tumorale plus lentes, nous avons évalué l'efficacité d'une souche recombinante armée avec les trois chimiokines humaines (oVV-3hCK) dans un modèle de souris humanisées HIS-NXG greffées avec des tumeurs humaines.Dans ce modèle, les oVV (oVV-3hCK et oVV non armé) ont été particulièrement efficaces, ce qui n'a pas permis d'observer des différences d'efficacité thérapeutique entre les deux souches. Néanmoins, une augmentation significative de l'infiltration en cellules immunitaires CXCR5+ et en lymphocytes T et B naïfs a été observée dans les tumeurs infectées avec l'oVV-3hCK, confirmant l'activité chimiotactique des chimiokines et laissant supposer la présence de TLS dans les tumeurs.En conclusion, mes travaux de thèse ont confirmé que les trois chimiokines CCL20, CCL21 et CXCL13 exprimées par un oVV sont capables d'induire des agrégats immunitaires (ou TLS) dans le TME, et ont démontré la pertinence de cette stratégie pour améliorer la réponse antitumorale à long terme
Tertiary lymphoid structures (TLS) are organized aggregates of immune cells that develop in non-lymphoid tissues as a result of chronic inflammation. Mature TLS, which resemble lymph nodes in their organization, are associated with favorable prognoses in solid tumor cancers and serve as effective predictors of patient responses to immunotherapy. Our objective was to investigate oncolytic virotherapy as a strategy to induce TLS in the tumor microenvironment (TME) to enhance anti-tumor responses.Oncolytic viruses (OV) have the ability to specifically infect and replicate within cancer cells, inducing their direct lysis as well as their destruction by the immune system through immunogenic cell death. We hypothesize that the modulation of the TME following OV infection, along with the local production of chemokines expressed by these viruses, could promote TLS neogenesis and amplify anti-tumor responses.My work involved generating and characterizing recombinant oncolytic vaccinia viruses (oVV) armed with three chemokines, CCL20, CCL21, and CXCL13, which we hypothesize are involved in TLS neogenesis.I observed that the expression of chemokines by the recombinant oVVs did not affect their oncolytic properties and that the chemokines were functional in vitro. Although the replication of the oVVs was reduced in syngeneic murine models, I detected the murine chemokines in tumors infected with the armed oVVs and observed the formation of immune aggregates in hot tumor models. However, no therapeutic improvement was observed with the chemokine-armed oVV compared to the non-armed virus.I then studied the ability of TLS induced by an oVV to establish anti-tumor responses in the hot orthotopic TC-1 luc model. In this model, I observed that intranasal administration of the oVV induced more TLS than administration of a non-oncolytic vaccinia virus, MVA. Furthermore, I observed that TLS induced by MVA infection were not associated with an anti-tumor response, whereas I detected long-term presence of tumor-specific T lymphocytes and tumor control in the lungs of a mouse infected with oVV. Thus, we hypothesize that the oncolytic properties of oVVs can induce TLS that are effective against tumors.To promote oVV replication and chemokine expression, as well as to facilitate the observation of late anti-tumor responses with slower tumor growth kinetics, we evaluated the efficacy of a recombinant strain armed with the three human chemokines (oVV-3hCK) in a HIS-NXG humanized mouse model grafted with human tumors.In this model, the oVVs (oVV-3hCK and non-armed oVV) were particularly effective, making it difficult to observe differences in therapeutic efficacy between the two strains. Nonetheless, a significant increase in the infiltration of CXCR5+ immune cells and naïve T and B lymphocytes was observed in tumors infected with oVV-3hCK, confirming the chemotactic activity of the chemokines and suggesting the presence of TLS in the tumors.In conclusion, my thesis work confirmed that the three chemokines CCL20, CCL21, and CXCL13 expressed by an oVV are capable of inducing immune aggregates (or TLS) in the TME, and demonstrated the relevance of this strategy to improve long-term anti-tumor responses

La gemcitabine constitue le traitement de référence des adénocarcinomes pancréatiques, mais se heurte à l’apparition de chimiorésistance. L’objectif de ce travail a consisté à potentialiser son efficacité thérapeutique par l’utilisation de la thérapie génique. Nous avons d’abord démontré que l’inhibition de l’oncogène k-ras sensibilisait les cellules tumorales à cette drogue. Nous nous sommes également intéressés aux gènes impliqués dans l’altération du métabolisme de la gemcitabine, et nos résultats ont prouvé que la surexpression de la protéine de fusion dCK::UMK et l’inhibition des gènes TS et RR, restauraient la sensibilité des cellules à la gemcitabine. Finalement, nous avons exploité les propriétés oncolytiques et oncotropiques naturelles du parvovirus H-1. Un parvovirus recombinant exprimant le gène suicide de la cytosine déaminase de levure sous le contrôle du promoteur spécifique de l’antigène carcinoembryonnaire a montré une cytotoxicité accrue, restreinte au niveau tumoral
Gemcitabine is the treatment of choice for pancreatic adenocarcinoma, but comes up against appearance of chemoresistance. The current work aimed to improve gemcitabine efficacy using gene therapy. We first demonstrated that inhibition of k-ras oncogene resulted in a sensitization of cells to gemcitabine treatment. We were also interested to genes involved in alteration of the gemcitabine prodrug metabolism. Our results demonstrated that overexpression of the dCK::UMK fusion protein and inhibition of TS and RR genes restored tumor cell sensitivity to gemcitabine. Finally, we exploited the oncolytic and oncotropic natural properties of H-1 parvovirus. A recombinant parvovirus expressing the yeast cytosine deaminase suicide gene under the control of the carcinoembryonic specific promoter showed increased cytotoxic effects restricted to pancreatic tumor cells

La radiovirothérapie est définie comme étant l'utilisation de virus infectant les cellules cancéreuses pour guider un traitement radio-isotopique. Les virus oncolytiques sont des virus capables de se répliquer sélectivement dans les cellules cancéreuses, et de tuer ces cellules. Associer une radiovirothérapie à une radiothérapie externe est une méthode innovante pour augmenter la dose totale d'irradiation sélectivement dans la tumeur. L'objectif de ce travail a été d'évaluer une approche de radiovirothérapie avec un virus de la rougeole oncolytique codant le symporteur sodium/iodure NIS (MV-NIS). MV-NIS a été associé à un traitement par 131I, à une radiothérapie externe, et à un traitement par SAR-020106, un nouvel agent radiosensibilisant inhibiteur de Checkpoint-1. Cette approche a été testée dans des modèles de cancer ORL et colorectal (HCT-116). In vitro, l'association de MV-NIS et de radiothérapie externe a eu des effets antitumoraux synergiques. La radiothérapie a augmenté l'expression fonctionnelle du NIS dans les cellules infectées. SAR-020106 a eu des effets synergiques avec la radiothérapie externe et avec MV-NIS. MV-NIS a permis de guider un traitement par 131I dans les cellules infectées. Dans les cellules HCT-116, cet effet a été augmenté par SAR-020106. Dans un modèle murin de xénogreffe tumorale sous-cutanée HCT-116, MV-NIS et une radiothérapie externe ont eu des effets synergiques. La quadrithérapie a eu une activité antitumorale significative, avec amélioration de la survie des animaux. Ces résultats supportent fortement de futures recherches translationnelles et cliniques sur l'association de MV-NIS, de radiothérapie et d'agents radiosensibilisants
Radiovirotherapy is defined as the use of viruses to deliver radioisotopic treatment into infected cells. Oncolytic viruses are able to selectively target and kill cancer cells. Combining external beam radiation therapy (EBRT) with radiovirotherapy is an innovative method to increase the total radiation dose selectively within tumour cells. Our aim was to evaluate a radiovirotherapy approach using Edmonston strain measles virus engineered to express the sodium/iodide symporter NIS (MV-NIS). We evaluated the therapeutic efficacy of a combination of MV-NIS, NIS-guided radioiodide, EBRT and a specific checkpoint-1 inhibitor (SAR-020106). This approach was investigated in head and neck and colorectal (HCT-116) cancer cells lines. We show that EBRT and MV-NIS exerted synergistic in vitro anti-tumour effects. EBRT increased NIS expression in infected cells. SAR-020106 had synergistic antitumour effect both with EBRT and with MV-NIS. We have demonstrated that MV-NIS mediated 131I toxicity. In HCT-116 cells, this effect was enhanced by SAR-020106. In vivo, we have demonstrated that MV-NIS and EBRT had synergistic effects in an HCT-116 subcutaneous tumour model. The combination of MV-NIS, virally-directed 131I, EBRT and SAR-020106 was evaluated in vivo in the same HCT-116 tumour model. This quadruplet regimen had significant antitumour activity, associated with an increased survival of animals. Our study strongly supports further translational and clinical research on MV-NIS in combination with radiation therapy and radiosensitising agents

Les virus de la vaccine délétés du gène de la thymidine kinase ont montré, après une injection par voie systémique, une certaine efficacité sur des tumeurs implantées dans la souris. Ce virus utilisé comme vecteur pour exprimer le gène suicide FCU1, capable de métaboliser la prodrogue 5-FC non toxique pour l’homme en métabolites cytotoxiques, montre une augmentation de la réponse anti-tumorale. De plus, afin d’améliorer la spécificité tumorale et diminuer la toxicité virale, nous avons construit plusieurs virus délétés de différents gènes combinés à la délétion du gène TK. Les premiers résultats in vitro montre une réplication virale modifiée suivant l’état des cellules, réplicatives ou non. Des études thérapeutiques in vivo mettent en évidence une activité oncolytique équivalente avec cependant une diminution des signes secondaires de toxicité. Ces travaux illustrent l'efficacité des virus de la vaccine recombinants dans le cadre d'une thérapie gène suicide anti-cancéreuse
Recombinant thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector targets tumor tissue after systemic delivery, making it ideal for a tumor-directed enzyme/prodrug approach. We have generated a tk-deficient recombinant expressing the suicide gene FCU1 which catalyses the direct conversion of the nontoxic 5-fluorocytosine into toxic metabolites. This vaccinia virus demonstrated a significant tumor regression after systemic injection in combination with administration of 5-FC. Moreover, to enhance the safety and efficacy of this vector, deletion of other genes was combined with thymidine kinase gene deletion. We evaluated in vivo the therapeutic efficacy after intravenous injection in nude mice bearing subcuteanous human tumors and we compared the toxicity between single and double-deleted viruses. The results of this study demonstrate that double-deleted viruses are capable of selective tumor replication and are significantly less pathogenic than the single-deleted virus

Les virus oncolytiques sont une nouvelle classe d’agents thérapeutiques pouvant être une alternative au traitement des cancers. Plusieurs virus oncolytiques sont actuellement développés en clinique, néanmoins de nombreuses améliorations sont à apporter afin de créer une nouvelle classe de virus plus efficaces et moins toxiques. Le premier objectif de cette thèse a été d’améliorer la spécificité tumorale du virus de la vaccine via le ciblage de l’antigène MUC1 présenté à la surface des cellules tumorales. Pour cela un virus recombinant présentant à sa surface un fragment d’anticorps (scFv) dirigé contre l’antigène tumoral MUC1 a été construit et produit. Les tests in vitro n’ont toutefois pas permis de mettre en évidence un ciblage spécifique du virus recombinant. Un deuxième aspect de cette thèse a été de tester le potentiel oncolytique de virus de la famille des Poxviridae. Durant ce travail de thèse, les capacités oncolytiques de douze poxvirus, appartenant à 8 genres différents, ont été étudiés. Leurs effets sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines ont été évalués. Les virus caractérisés par un effet oncolytique élevé ont été, par la suite, modifiés et armés par ingénierie virale afin d’augmenter leur efficacité. La dernière partie de cette thèse a été consacrée à la génération et la sélection de virus chimériques basées sur la méthode d’évolution dirigée. Cette méthode est utilisée pour mimer le processus naturel de sélection évolutif. Appliqué à la virothérapie oncolytique, ce procédé nous a permis de générer un nouveau virus oncolytique chimérique caractérisé par un potentiel anti-cancéreux amélioré. En résumé, cette thèse a permis, par des techniques d’ingénierie virale, par un criblage de nouveaux virus et par la méthode d’évolution dirigée, de créer et de sélectionner une nouvelle génération de poxvirus oncolytiques présentant une activité thérapeutique accrue avec un profil de toxicité atténué et pouvant être utilisés dans diverses indications thérapeutiques
Oncolytiques viruses are a new class of therpeutic agents which could be an alternative for cancer treatment. Currently, several oncolytic viruses are evaluated in clinical trial, nevertheless improvements are needed to create a new class of more efficiente and less toxic viruses. The first objective of this thesis was to improved the vaccinia virus specificity through the targeting of the tumor-associated antigen MUC1. To address this goal, a recombinant virus expressing an scFv targeting the MUC1-protein was engineered and produced. However, in vitro, the demonstration of a specific targeting by the recombinant virus was not possible. A second aspect of this thesis work was to evaluate the oncolytic potential of Poxviridae family viruses. Oncolytic capacities of twelve viruses, belonging to eight genera, were evaluated. Their impact on human cancer cells was tested. In order to increase their efficacity, viruses with the highest oncolytic capacities were then modified and armed by genetic engineering. The third part of this work was devoted to the generation of chimeric viruses based on directed evolution process. This methodology is used to mimic the natural process of evolutionary selection. Applied to oncolytic virotherapy, this technique allowed the generation of a new chimeric oncolytic virus caracterised by an enhanced antitumoral potential. In summary, this thesis has allowed, through viral engineering, poxviruses screening and directed evolution methodology, the creation and selection of a new generation of oncolytic poviruses. These viruses demonstrate an increased therpeutic activity and greatest safety profil enabling their application in several therapeutic indication

Nous avons mis en place au cours de ce travail de thèse différentes stratégies permettant d'améliorer l'efficacité thérapeutique des adénovirus (Ad) oncolytiques contre différents types de tumeurs. Une première stratégie a été de combiner un inhibiteur d'histone-désacétylase, l'acide valproique (VPA) avec un Ad oncolytique à capside sauvage E1Δ24 (CRAd) dans le traitement de carcinomes côliques. Nous avons dans un premier temps démontré que la combinaison du CRAd et du VPA permettait une diminution plus importante de la survie des cellules cancéreuses côliques comparé au simple traitement basé sur le CRAd ou le VPA in vitro mais aussi in vivo.De plus, nous avons observé que cet effet n'était pas lié à une meilleure réplication du CRAd par le VPA. En effet, le VPA provoquait un ralentissement de la réplication virale à des temps précoces mais ne modifiait pas la production virale. Nous avons également découvert que le co-traitement CRAd+VPA conduisait à une forte inhibition de la croissance cellulaire mais aussi à une mort cellulaire non apoptotique. Par ailleurs, nous avons mis en évidence que les cellules co-traitées par le CRAd et le VPA affichaient une forte polyploïdie accompagnée d'une augmentation de la phosphorylation de l'histone H2AX, un marqueur de dommages à l'ADN. Une deuxième stratégie a été de fournir aux Ad oncolytiques de nouvelles voies d'entrée afin d'infecter et de détruire plus efficacement des cellules de carcinomes rénaux réfractaires à l'infection adénovirale. Nous avons démontré que les CRAd à hexon modifié porteurs d'un ligand CKS-17 (Ad-HCKS-17-E1Δ24) ou à fibre modifiée de sérotype 3 (AdF3-E1Δ24) étaient capables d'infecter et de tuer plus efficacement ces cellules qu'un CRAd à capside sauvage in vitro. Malheureusement in vivo, les modifications de capside n'ont permis ni d'améliorer l'entrée des CRAd dans les tumeurs rénales, ni d'améliorer leur efficacité anti-tumorale. Cependant, nous avons observé qu'après administration intra-tumorale, les Ad à capside modifiée présentaient un plus faible tropisme hépatique comparé à un Ad à capside sauvage.

Le virus atténué de la rougeole est proposé comme agent oncolytique pour infecter et lyser les cellules tumorales sans affecter les cellules saines. Les propriétés immuno-adjuvantes du virus pourraient aussi contribuer à l'efficacité de la virothérapie anti-tumorale. Dans cette étude nous avons évalué les propriétés cytotoxiques et immuno-adjuvantes du virus oncolytique de la rougeole (MV). Dans une première étude, nous avons démontré que le MV infecte et tue efficacement des lignées d'adénocarcinome pulmonaire et de carcinome colorectal in vitro et in vivo, dans des modèles de xénogreffes de tumeurs humaines sur des souris immunodéficientes. Dans une seconde étude, je me suis intéressé aux propriétés immuno-adjuvantes du MV sur les cellules dendritiques plasmacytoides (pDC). Après avoir mis au point l'obtention et la culture des pDC humaines dans le laboratoire, j'ai démontré que les cellules tumorales infectées induisent la maturation des pDC et une large production d'IFN-α. En utilisant un inhibiteur spécifique, j'ai mis en évidence que cette production d'IFN-α est due à l'engagement du Toll-Like Receptor 7 (TLR-7) probablement par l'ARN simple brin du MV. Enfin, j'ai montré que les pDC sont capables de réaliser, à partir des cellules tumorales infectées, la présentation croisée de l'antigène de tumeur NY-ESO-1 à un clone de lymphocyte T CD8+ spécifique à un niveau équivalent aux cellules dendritiques dérivées de monocytes (Mo-DC). Ces résultats suggèrent que l'utilisation du MV en virothérapie anti-tumorale induit une mort cellulaire immunogène permettant la maturation, la sécrétion de grandes quantités d'IFN-α, et la cross-présentation d'antigènes par les pDC
Live attenuated and replicative competent measles virus (MV) has been proposed to specifically infect and kill tumor cells without, or limited if any, infection of healthy counterparts. Immuno-adjuvant properties of MV may also have a beneficial role on virotherapy efficacy. Here, we studied cytotoxicity and immuno-adjuvant properties of MV. In a first study, we showed that MV efficiently infects and kills pulmonary and colorectal adenocarcinoma in vitro and in vivo, in a human tumor xenografts model in immunodeficient mice. In a second study, I focused on MV immuno-adjuvant properties on pDC. I developed sorting and culture of human pDC in our laboratory. Then, I showed that MV-infected tumor cells induce pDC maturation and large production of IFN-α. Using a specific inhibitor, I demonstrated that IFN-α production was due to Toll-like Receptor 7 (TLR7) triggering probably by MV single stranded ARN. Finally, I showed that pDC cross-present NY-ESO-1 tumor antigen to a specific CD8+ T cell clone, from MV-infected tumor cells, at a similar level than monocyte-derived dendritic cells (Mo-DC). Altogether, this work suggests that the use of measles virus vaccine in antitumor virotherapy induces immunogenic tumor cell death, allowing pDC to mature, produce high amounts of IFN-α, and cross-present tumor antigens

Les virus présentant un tropisme pour les cellules tumorales et une capacité à induire leur lyse, sont appelé des virus oncolytiques. Ils sont utilisés dans le cadre de la virothérapie et permettent de stimuler la réponse immunitaire antitumorale par le recrutement et l’activation de cellules immunitaires innées et adaptatives. Les travaux issus de ma thèse ont permis d'approfondir la compréhension du rôle des lymphocytes Tϒ9δ2 dans le cadre des infections oncolytiques, en mettant notamment en lumière leur activation spécifique par la souche Schwarz du virus de la rougeole. J’ai ensuite développé un virus oncolytique capable de coder pour un anticorps conçu pour activer de manière ciblée les lymphocytes Tϒδ. L’évaluation thérapeutique de ce virus dans un modèle murin a révélé des résultats prometteurs, notamment sur le contrôle de la croissance tumorale. Par ailleurs, j’ai développé une stratégie thérapeutique visant à favoriser la formation d'organes lymphoïdes tertiaires au sein du micro-environnement tumoral. En utilisant un virus oncolytique pour vectoriser des protéines clés de la néo-genèse des organes lymphoïdes tertiaires, j'ai observé que la combinaison de trois virus distincts facilite l’infiltration non seulement des lymphocytes T, mais aussi des lymphocytes B dans le micro-environnement tumoral. Cette approche offre une perspective prometteuse pour améliorer la réponse immunitaire antitumorale et mérite une exploration plus approfondie pour confirmer son potentiel clinique
Viruses exhibiting a tropism for tumor cells and an ability to induce their lysis, are called oncolytic viruses. They are used in the context of virotherapy and make it possible to stimulate the anti-tumor immune response by recruiting and activating innate and adaptive immune cells. The work resulting from my thesis made it possible to deepen the understanding of the role of ϒ9δ2 T cells in the context of oncolytic infections, in particular by highlighting their specific activation by the Schwarz strain of the Measles virus. | then developed an oncolytic virus capable of encoding an antibody designed to specifically activate ϒδ T cells. Therapeutic evaluation of this virus in a mouse model revealed promising results, particularly on the control of tumor growth. Furthermore, | developed a therapeutic strategy aimed at promoting the formation of tertiary lymphoid structures within the tumoral microenvironment. Using an oncolytic virus to vectorize key proteins in tertiary lymphoid structures neogenesis, | observed that the combination of three distinct viruses facilitates the infiltration of not only T cells, but also B cells into the tumoral microenvironment. This approach offers a promising prospect for improving the antitumor immune response and deserves further exploration to confirm its clinical potential

Au cours de ma thèse, j'ai étudié la virothérapie antitumorale basée sur l'utilisation du virus atténué de la rougeole (MV) pour le traitement du mésothéliome pleural malin (MPM). Il est décrit que le MV cible préférentiellement les cellules tumorales surexprimant son récepteur CD46 à leur surface. Suite à l'étude in vitro de 22 lignées de MPM, j'ai démontré que la sensibilité à l'infection par le MV ne dépend pas du niveau d'expression de CD46, mais de défauts de la réponse anti-virale interféron (IFN) de type I acquis pendant la tumorigenèse. Les cellules saines, capables de développer une réponse IFN de type I, ne sont pas sensibles. J'ai pu estimer que 70% des patients seraient donc potentiellement sensibles à cette thérapie. D'autre part, notre équipe a montré que le MV induit une mort immunogène des cellules tumorales, capable d'activer les cellules dendritiques (DCs) et leur capacité de présentation croisée d'antigènes de tumeur. J'ai poursuivi la caractérisation de l'effet du MV sur les DCs. J'ai montré que les DCs myéloïdes CD1c+ et les DCs plasmacytoïdes (pDCs) du sang expriment la protéine TRAIL à leur surface en réponse au MV, suite à la sécrétion d'IFN-α induite par la détection de l'ARN viral par les senseurs cytoplasmiques RLRs (RIG-I like receptors) dans les deux types de DCs, et par le TLR7 (Toll-like receptor 7) dans les pDCs seulement. Ces DCs exercent alors une activité cytotoxique envers des cellules sensibles à la lyse médiée par TRAIL. Mes résultats permettent de mieux comprendre l'activité oncolytique du MV, dont l'efficacité passe non seulement par l'infection et la lyse des cellules tumorales mais aussi par l'activation du système immunitaire
I worked on an antitumor virotherapy strategy based on the use of an attenuated strain of measles virus (MV) to treat malignant pleural mesothelioma (MPM). It is described that MV preferentially infects tumor cells which overexpress its major receptor CD46 on their surface. By studying in vitro 22 human MPM cell lines, I demonstrated that 70% of the MPM cell lines are sensitive to the infection and that the sensitivity to MV depends on defects of their antiviral type I interferon (IFN) response rather than on the overexpression of CD46. Healthy cells are not sensitive to MV since they develop a full type I IFN response. Thus, 70% of patients may be sensitive to this therapeutic approach. It is admitted that MV induces immunogenic death of tumor cells, which is able to activate dendritic cells (DCs) and their capacity to cross-present tumor antigens. I continued to characterize the effects of MV on DCs and I showed that blood myeloid CD1c+ DCs and plasmacytoid DCs (pDCs) express TRAIL on their surface in response to MV. This TRAIL expression depends on their IFN-α secretion which is induced by the detection of viral RNA by the cytosolic sensors RLRs (RIG-I like receptors) in both types of DCs, and by TLR7 (Toll-like receptor 7) activation in pDCs only. These DCs are then able to induce the lysis of TRAILsensitive cells. Altogether, my results lead to a better understanding of the oncolytic activity of MV, which relies not only on the infection and lysis of tumor cells but also on the activation of the immune system against tumors

Les cancers des voies aérodigestives supérieures (VADS) concernent 500 000 nouvelles personnes par an dans le monde avec un taux de survie à 5 ans d’environ 50%. Leur étiologie est liée à la consommation d’alcool et/ou de tabac ou aux infections par les papillomavirus humains de génotype 16 et 18 (HPV). Les traitements de ces cancers restent insuffisamment efficaces et de nouvelles approches thérapeutiques doivent être développées. Dans ce contexte l’effet des adénovirus oncolytiques a été caractérisé dans des lignées cellulaires murines modèles des tumeurs des VADS HPV-induites ou chimio-induites. Les résultats obtenus indiquent que les Ad oncolytiques sont capables d’infecter et de tuer les cellules tumorales murines in vitro et de s’y répliquer. De plus nos résultats ont révélé que les cellules infectées par les Ad oncolytiques libéraient de l’ATP, un marqueur de la mort immunogène. Après co-culture de cellules dendritiques et de cellules tumorales préalablement infectées par les Ad oncolytiques, une augmentation de l’expression des marqueurs CD40 et CD86 a été observée à la surface des cellules dendritiques démontrant leur activation. Après injection intra-tumorale des adénovirus oncolytiques dans un modèle de greffe syngénique de cellules tumorales, un ralentissement significatif de la croissance tumorale allant dans certains cas jusqu’à l’éradication de la tumeur a été observé. Des analyses par immunohistochimie et cytométrie en flux ont révélé une augmentation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans les tumeurs injectées avec les Ad oncolytiques. Enfin, des tests de restimulation antigénique réalisés sur les splénocytes ou les cellules du ganglion drainant ont démontré que ces Ad oncolytiques pouvaient aider à l’établissement d’une réponse immunitaire CD8+ dirigée contre la protéine oncogénique E7 d’HPV exprimée par les cellules tumorales
Head and neck cancers (HNC) affect 500 000 new patients each year worldwide, with a 5-year survival rate around 50%. Their etiology is due to alcohol and/or tobacco consumption or infections by human papillomavirus serotypes 16 and 18 (HPV). Treatments of these cancers remain inefficient, and new therapeutic approaches need to be developed. In this context, the effect of oncolytic adenoviruses (OAds) was characterized on murine cell lines of HPV- induced (mEERL95 and AT84) or chemically-induced (OSCC13 and MOC-1) HNC. The results indicate that OAds are able to infect and kill murine tumor cells in vitro and to replicate within them. Additionally, our results revealed that cells infected with OAds released ATP, a marker of immunogenic cell death. Co-culture experiments between infected tumor cells and dendritic cells showed the activation of dendritic cells, with an increase in the expression of activation surface markers CD40 and CD86. Intratumoral injections of OAds in the syngeneic model of the mEERL95 cell line showed a significant slowdown in tumor growth and, in some cases, tumor eradication. Immunohistochemistry and flow cytometry analyses revealed an increase in CD4+ and CD8+ T lymphocytes in tumors injected with OAds. Finally, restimulation tests of splenocytes or cells from the draining lymph node revealed the presence of a CD8+ immune response directed against adenoviral antigens and, to a lesser extent, against the oncogenic protein E7 of HPV

Le transfert d'un cargo, contenu dans une vésicule, vers des cellules d'intérêt reste un défi pour les thérapies ciblées. Les glycoprotéines virales, se liant à un récepteur cellulaire et induisant la fusion membranaire, constituent des outils prometteurs pour ce type d'approche. La glycoprotéine G du VSV est la glycoprotéine virale la plus utilisée pour pseudotyper des lentivirus en thérapie génique. Il y a néanmoins des limites à l'utilisation de G : les récepteurs de G (membres de la famille du LDLR) sont ubiquitaires et présents à la surface de cellules non cibles. Les travaux de l'équipe sur la structure du complexe VSVG/LDLR avaient identifié des mutants de G ne liant plus le LDLR mais conservant leur activité de fusion. Ce découplage entre reconnaissance du récepteur et fusion ouvrait la possibilité de recibler spécifiquement la glycoprotéine vers des récepteurs d'intérêt. Nous avons construit une glycoprotéine chimérique en fusion avec un nanobody dirigé contre la mCherry en position aminoterminale de G. L'insertion de ce nanobody dans G est délétère. Par évolution expérimentale, nous avons identifié deux mutations dans G améliorant le repliement de la chimére. Ces mutations favorisent le repliement des G chimériques quel que soit le nanobody inséré en position amino-terminale. Les virus pseudotypés (VSV et lentivirus) avec ces G chimériques ont un titre 10 fois plus élevé lorsque les mutations d'optimisations sont présentes. Nous avons ensuite construit des glycoprotéines chimériques avec plusieurs nanobodies ciblant le récepteur HER2. Dans ces glycoprotéines, nous avons introduit les mutations abolissant la reconnaissance des récepteurs naturels de G. Les virus pseudotypés par ces glycoprotéines n'infectent plus que des cellules exprimant le récepteur HER2. Nous avons donc identifié des mutations de G permettant de conférer un nouveau tropisme à G par insertion aminoterminale de nanobodies. Ceci ouvre la voie à des thérapies ciblées personnalisées
The transfer of vesicles containing cargos toward cells of interest remains a challenge for targeted therapy. Viral fusion glycoproteins having the property of receptor recognition and fusion activity constitute promising tools for this kind of approach. VSV glycoprotein (G) is the most used viral glycoprotein to pseudotype lentiviruses in gene therapy. However, we encounter limits to the use of G: G cellular receptors (from LDLR family) are ubiquitous and expressed at the surface of non-target cells. The work of the team on VSVG/LDLR structure enabled us to identify G mutants that no longer bind the LDLR without affecting its fusion activity. This uncoupling between the recognition of the receptor and the fusion capacity opened up the possibility of retargeting G towards receptors of interest. A chimeric glycoprotein fused with a nanobody directed against the mCherry protein, in N-terminal, of G has been constructed. The insertion of a nanobody in G is deleterious for its activity. Using experimental evolution, we identified two mutations on G enhancing the chimera folding. Remarkably, these mutations improve the folding of chimeric Gs, regardless of the sequence of the nanobody inserted in amino-terminal. Pseudotyped viruses (both VSV and lentiviruses) with these chimeric Gs at their surface show 10 times higher titers with these mutations of optimisation. We then constructed chimeric Gs with several nanobodies targeting the receptor HER2. We introduced the mutations abolishing LDLR recognition in these Gs. Viruses pseudotyped with these glycoproteins only infected cells expressing HER2. We therefore identified G mutations conferring a new tropism of G thanks to the N-terminal insertion of a nanobody. All this work opens the way to personalised targeted therapies

L'apport des anticorps immunomodulateurs ciblant PD-1, PD-L1 et CTLA-4 ont récemment révolutionné la prise en charge thérapeutique du cancer. Cependant, seule une minorité de patients développent des réponses objectives à ces traitements. Par conséquent, de nouvelles innovation thérapeutiques sont nécessaires afin d'augmenter l'immunogénicité des tumeurs et de surmonter la résistance à la thérapie contre les anticorps immunomodulateurs. Les propriétés oncolytiques de certains virus peuvent être exploitées afin de permettre un amorçage de l'immunité anti-tumorale. Différents virus oncolytiques (OVS) sont actuellement en développement clinique intense en combinaison avec des thérapies par anticorps immunomodulateurs. Nous avons trouvé qu'un vaccin viral pédiatrique disponible dans le commerce a des propriétés oncolytiques. Ce virus pédiatrique peut tuer directement les cellules cancéreuses, avec des caractéristiques de mort cellulaire immunogène. De plus, ce virus a des propriétés pro-inflammatoires et peut activer la voie NF-kB indépendamment des voies de danger cellulaire (TLR et IRF). Ces propriétés biologiques in vitro se traduisent in vivo en une activité anti-tumorale. L'Injection intra-tumorale du vaccin a des effets anti-tumoraux directs mais également à médiation immunitaire. De façon intéressante, dans des modèles de souris immunocompétentes porteuses de tumeurs murines, l'injection intra-tumorale de vaccin a un effet synergique avec des anti CTLA-4 permettant la guérison de 100% des souris. Les vaccins sont des produits pédiatriques et adultes de grade clinique. Par conséquent, des stratégies de vaccination in situ par injection intra-tumorale pourraient être rapidement mises en clinique
Immune checkpoint targeted therapies against PD-1, PD-L1 and CTLA-4 are currently revolutionizing cancer care. However, only a minority of patients develop objective responses with these treatments. Therefore, new therapeutic interventions are needed to increase the immunogenicity of tumors in order to overcome resistance to immune checkpoint blockade therapy. Oncolytic properties of common viruses can be exploited for the priming of anti-tumor immunity and such oncolytic viruses (OVs) are currently in intense clinical development in combination with immune checkpoint targeted therapies. We have found that commercially available virus vaccines do have oncolytic properties. These pediatric vaccine virus can directly kill cancer cells with features of immunogenic cell death. Moreover, it has pro-inflammatory properties and can activate the NF-Kb pathway in a toll-like receptor and IRF3 independent manner. These in vitro biological properties translate in vivo into anti-tumor activity. Intra-tumoral vaccine therapy has anti-tumor effects which are partly immune mediated. Interestingly, in immunocompetent murine pediatric tumor models, intra-tumoral injection overcome resistance and synergize with immune checkpoint targeted therapy. Vaccines are pediatric and adult clinical grade products. Therefore, in situ intra-tumoral immunization strategies could be implemented quickly in the clinic

Le parvovirus H-1 (PVH-1) montre plusieurs propriétés anti-cancéreuses. Il se réplique préférentiellement dans les cellules transformées humaines (oncotropisme). Ceci peut mener à la destruction de ces cellules (oncolyse) et à la libération, dans le milieu extracellulaire, de particules virales néo-formées, pouvant à leur tour infecter et détruire les cellules transformées avoisinantes. Ces propriétés observées in vitro sont complétées par des données in vivo, qui montrent que le PVH-1 protège les animaux de laboratoire du développement tumoral (oncosuppression). Toutes ces caractéristiques font du PVH-1 une potentielle alternative thérapeutique aux traitements antimitotiques actuels. L'éventuelle utilisation du PVH-1 en clinique nécessite cependant une connaissance plus approfondie de son mode de fonctionnement. Nous nous sommes intéressés en particulier à deux problèmes rencontrés avec les traitements actuels, afin de voir si le PVH-1 pouvait y apporter une réponse satisfaisante. La spécificité des molécules actuelles est relativement limitée, et celles-ci peuvent donc porter atteinte aux cellules saines de l'organisme. Dans une cellule humaine non transformée, le PVH-1 ne présente généralement pas d'effet délétère. En effet, le promoteur parvoviral P4 n'y est pas activé, et la protéine NS1, principal acteur de la toxicité induite par le PVH-1, n'est donc pas produite. Nous avons cependant cherché à savoir ce qu'il adviendrait si la protéine NS1 venait à être exprimée dans une cellule normalement insensible à l'infection parvovirale. Pour cela, nous avons utilisé un modèle permettant l'expression ectopique de NS1, contrôlée par un promoteur fort, constitutivement actif, dans un type particulier de cellules embryonnaires humaines, non immortalisées et présentant un phénotype normal, les cellules MRC-5. Nos travaux montrent que, dans ce modèle, l'expression massive de la protéine NS1 induit des modifications importantes du réseau d'actine du cytosquelette et la mort de ces cellules. L'utilisation d'une construction permettant l'expression d'une forme de NS1 mutée au niveau de son résidu de sérine en position 473 empêche à la fois les déformations du cytosquelette et la mort cellulaire. En revanche, alors que les cellules MRC-5 SV2, équivalents transformés des MRC-5, meurent sous l'effet de la surexpression des formes native et mutante de NS1, la mutation de la sérine 473 empêche l'induction de la déformation du cytosquelette. Un autre problème rencontré avec les thérapies oncologiques actuelles est la possibilité de résistance au traitement. De récents travaux démontrent que le PVH-1 peut être efficace contre des tumeurs résistantes à certains traitements classiques, notamment dans le cas de gliomes et de certains cancers du pancréas. Nous nous sommes intéressés à des cellules humaines de cancer du sein présentant un haut risque de formation de métastases, les cellules de la lignée SK-BR-7. Ces cellules montrent une résistance à l'apoptose, par l'intermédiaire d'un système autocrine inhibant l'induction de celle-ci. Nos travaux montrent que ces cellules sont sensibles à l'infection par le PVH-1, qui induit leur lyse. L'infection par le parvovirus H-1 n'induit pas l'expression de la caspase 3 comme le modèle autocrine initial aurait pu le laisser penser. En revanche, il ne nous a pas été possible de déterminer la nature exacte des voies de mort mises en oeuvre par le PVH-1. En effet, après avoir examiné les effets d'un composé non commercial, critique pour l'utilisation du modèle étudié, et dont l'activité inhibitrice du système s'est révélée défaillante, des délais prolongés dans la production de nouvelles doses de ce composé par nos collaborateurs nous ont empêché de formuler des conclusions certaines quant aux résultats obtenus pour ce projet.

Le premier objectif a été de sélectionner des promoteurs de gènes cellulaires actifs spécifiquement dans les HCC à l’aide d’une recherche bibliographique puis en utilisant la base de donnée UniGene. Leur activité a été vérifiée par RT-qPCR et CHIP dans des lignées modèles HCC et dans des hépatocytes. Ces promoteurs ont été clonés en amont de la luciférase dans la région intergénique 20 du génome HSV-1 afin d’étudier leur force d’activité, 2 types de cinétiques et leur activité différentielle en fonction du type cellulaire et dans le contexte d’une infection virale. Le deuxième objectif a été de construire des virus oncolytiques ciblés pour l’expression de la protéine Us3, une protéine virale impliquée dans le contrôle de la réponse apoptotique induite par HSV-1. L’expression de la protéine Us3 est placée sous contrôle d’un promoteur cellulaire spécifique d’HCC. L’hypothèse est qu’en l’absence d’activité du promoteur cellulaire dans les cellules non HCC, la protéine Us3 ne sera pas synthétisée et, par conséquent, l’apoptose qui ne sera pas réprimée, inhibera le cycle de réplication et par conséquent, la production virale dans les cellules saines. Dans les cellules HCC, le promoteur actif permettra la réplication virale aboutissant à la destruction de lamasse tumorale. Un virus HSV-1 Us3- a été construit en utilisant la technique de recombinaison en plasmide BAC (Bacterial artificial chromosome), puis 2 virus oncolytiques en réintroduisant le gène Us3 sous contrôle du promoteur ANGPTL3 ou du promoteur HRE (hypoxia responsive element). Leur comportement oncolytique a été étudié en réalisant des courbes de croissance sur lignées cellulaires d’HCC et cellules hepatocyte-like
Our long-term purpose is to develop transcriptionally targeted oncolytic vectors, derived from herpes simplex virus type 1 (HSV-1), designed to eradicate hepatocellular carcinomas (HCC). We have identified several HCC-specific promoters, as well as other cancer-specific promoters, that maintain their specificity when expressed from the virus genome. More precisely, we have demonstrated that these promoters are able to drive reporter gene (luciferase) expression from the virus genome in HCC-derived cells, both in cultured cells and in nude mice, but not in fresh human hepatocytes or in the WRL38 hepatocyte-like cells. HSV-1 infection induces, but then inhibits, a cellular antiviral apoptotic response, and the early virus protein US3 is a key actor in inhibiting apoptosis. We have hypothesized that inhibition of US3 expression in hepatocytes should led to early apoptotic death of these cells, therefore precluding virus multiplication and spread. In contrast, expression of US3 in cancer cells is expected to block apoptosis, leading to the achievement of the virus life cycle, cell lysis, and virus spread within the tumours. We report in this communication the construction and properties of two different potentially oncolytic HSV-1 vectors. One of them expresses US3 protein under the control of the HCC-specific promoter ANGPTL3, while the second promoter contains 9 repeats of the hypoxia responsive elements of vascular-endothelial growth factor (VEGF) (9xHRE promoter). Growth curves of these viruses were performed on different HCC cell lines to show their oncolytic properties

Dans l’approche expérimentale de l’immunothérapie des tumeurs solides, les modèles murins sont utilisés pour des raisons de rapidité et de reproductibilité. Le plus souvent, les modèles tumoraux murins sont ectopiques ce qui constitue un modèle artificiel qui ne reflète qu’une partie de la réalité biologique de tumeurs provenant de diverses origines.Mon projet de thèse a consisté à mettre au point de nouveaux modèles pré-cliniques murins permettant de mieux mimer les situations pathologiques des tumeurs solides chez l’homme. Pour cela, je me suis notamment intéressée à un modèle orthotopique de cancer du rein (implantation de cellules RenCa ou RenCa-MUC1 dans la capsule rénale) et à un modèle spontané de cancer du sein (souris MMTV-PyMT). Ces modèles ont ensuite permis l’évaluation de trois différentes approches d’immunothérapie à savoir la thérapie virale oncolytique, la vectorisation d’antigènes tumoraux au moyen d’un vecteur viral ainsi que la thérapie via un anticorps monoclonal
In experimental approaches to immunotherapy of cancer, mouse tumor models are used for reasons of speed and reproducibility. Ectopic mouse tumor models are the most often used, but they constitute artificial models that reflect only a part of the biological reality of tumors from various origins.The aim of my thesis project was to develop new mouse preclinical tumor models to better mimic the pathological situations of solid tumors in humans. First, I developed an orthotopic model of kidney cancer (subcapsular kidney implantation of a renal carcinoma cell line which either expressed or did not express the human xeno-antigen, MUC1). In addition to this, I also studied a spontaneous model of breast cancer (MMTV-PyMT).These models enabled us to evaluate the efficacy of three different immunotherapy approaches namely oncolytic virus strategy, tumor antigen vectorization by using a viral vector, and monoclonal antibody

Malgré les avancées considérables de la cancérologie, de nouvelles thérapies sont toujours recherchées étant donné les effets secondaires des traitements actuels. Peu connue, la virothérapie oncolytique consiste à utiliser un virus pour détruire des cellules cancéreuses tout en épargnant les saines. Sur les mutants T1026R1 et TP3R1 du VSV de la famille des vésiculovirus portant un génome à ARN négatif de 11 kb, des efforts sont entrepris afin de prouver qu'ils sont des armes efficaces contre le cancer. Cependant, leur faible pouvoir apoptique ainsi que la persistance démontrée pour T1026R1 dans les cellules H4 les rendent moins attrayants. D'autres mutants du VSV, soit TR5R1 et TP6R1 pourraient également être de bons candidats dans la virothérapie oncolytique. Ils ne persistent pas, ils sont de meilleurs inducteurs d'apoptose et comme les mutants T1026R1 et TP3R1, ils induisent fortement la réponse des interférons. Afin de comprendre les différences quant au phénotype d'infection des mutants TP5R1 et TP6R1, le séquençage du génome entier de la souche sauvage HR ainsi que tous les mutants thermosensibles et thermorésistants a été entrepris. Les mutations responsables de la thermosensibilité vs thermorésistance pourront du même coup être révélées. Les résultats confirment les mutations M51R sur la protéine de la matrice de T1026R1 et de T1026 et V221F-S226R de TP3R1. Les mutants TP5R1 et TP6R1 portent respectivement les mutations E254Q et E254G sur le « PH domain » de leur glycoprotéine. Les mêmes mutations sont retrouvées chez TP5 et TP6 avec en plus la mutation D232G aussi sur le « PH domain ». L'analyse de la structure secondaire montre des changements par rapport au VSV Indiana HR, alors que l'analyse de la structure tridimensionnelle montre que seule la mutation D232G altère la structure. La présence de cette mutation sur les souches thermosensibles T1026, TP5, TP6 et le VSV Indiana San juan ainsi que sa conséquence sur la structure 3D laissent présager qu'elle pourrait être responsable de la thermosensibilité. La cartographie génétique des virus BR, T1026, T1026R1, TP3, TP3R1, TP5, TP5R1, TP6 et TP6R1 permettra d'approfondir la compréhension de leur phénotype d'infection particulier pour éventuellement construire un virus oncolytique recombinant conjuguant les avantages de chacun.