Dissertations / Theses: 'Vésicule membranaire'

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Pansu, Robert. "Photochimie dans les membranes synthétiques de chlorure de di-octadecyl, di-méthyl ammonium (DODAC) : la vésicule de DODAC, mythe ou réalité ?" Paris 11, 1988. http://www.theses.fr/1988PA112122.

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Abstract:

Nous avons étudié le DODAC (Chlorure de Di-Octadecyi, Di-methyl Ammonium) en vue d'application en photochimie. L'organisation de surfactants en vésicules leur attribue des propriétés spécifiques:- La micro-compartimentation a été mise à profit pour séparer un compartiment oxydant et un compartiment réducteur. - Le champ électrique membranaire permet de favoriser et d'orienter une séparation de charges photoinduite. Dans une première partie, nous avons montré, par diffusion quasi élastique de la lumière (QELS), la stabilité des préparations à faible force ionique, et mesuré le rayon des vésicules: 80+8nm. La présence d'un volume interne a été contrôlée par chromatographie et par l'existence d'une réponse aux chocs osmotiques. Le système a été exploité pour montrer l'existence, suggérée par le calcul théorique, à faible force ionique, d'un champ électrique membranaire de contact. Pour cela nous avons utilisé la neutralisation, par un réducteur hydrosoluble, du cation de l'anthracène produit au centre de la membrane, par photoionisation biphotonique. Le réducteur neutralise les cations, seulement s'il est présent dans la phase aqueuse externe. Cela montre la localisation sélective des cations sur la surface extérieure des vésicules et l'existence d'un champ membranaire de contact, à condition que les vésicules ne soient pas minoritaires dans l'échantillon. Or nous avons montré par QELS que les vésicules peuvent être détruites par les ultrasons puis régénérées, avec leur rayon d'origine, par recuit. Les fragments produits sont cinétiquement stables. Dans la deuxième partie, nous avons déterminé en RPE, par l'étude de l'incorporation de sondes chargées, le pourcentage de vésicules dans les échantillons et le potentiel transmembranaire. L'incorporation est mesurée par une réduction sélective de la population externe. La localisation membranaire et la perméabilité de 9 nitroxydes et de deux réducteurs ont été mesurées. Les mesures de surface et de volume intérieurs indiquent que seul 16% du DODAC est sous forme de vésicules. Le retraitement quantitatif des résultats publiés par d'autres auteurs montre que, dans tous les cas, la majorité de l'échantillon est effectivement constituée de fragments de membrane. Le potentiel transmembranaire a été mesuré : il est de l'ordre d'une dizaine de millivolts. Un modèle qui rend compte de la coexistence d'une population, très bien organisée, de vésicules monodisperses de 80nm de rayon et d'un mélange hétérogène de fragments membranaires métastables est proposé.

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Castagnos, Pauline. "Vésicules catanioniques : design et mécanismes de délivrance de principes actifs." Toulouse 3, 2011. http://thesesups.ups-tlse.fr/1412/.

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Abstract:

Les tensioactifs catanioniques dérivés de sucre s'associent spontanément sous forme de vésicules, qui peuvent aussi bien encapsuler des principes actifs hydrophiles dans leur cœur aqueux qu'insérer des drogues hydrophobes ou amphiphiles dans leur bicouche membranaire. Leur biocompatibilité ainsi que leur stabilité dans le temps et à la dilution dans des milieux biologiques en font des systèmes moléculaires organisés adaptés à la vectorisation d'actifs pharmaceutiques. L'étude mécanistique développée dans le cadre de ces travaux a montré que ces systèmes éco-conçus et de composition ajustable sont capables de fusionner spontanément avec des assemblages lipidiques mimant la composition de membranes cellulaires, à condition que ceux-ci présentent des défauts d'organisation de la bicouche. Les mécanismes d'interaction cellulaire de tels systèmes supramoléculaires ont par ailleurs été élucidés sur des lignées cancéreuses par des techniques de microscopie confocale et de cytométrie en flux. D'une part, la macropinocytose, la voie des clathrines et la voie des cavéoles constituent les processus actifs majoritaires d'internalisation des vésicules par les cellules. L'intervention simultanée de ces trois voies d'endocytose permet un relargage progressif des drogues par des mécanismes complémentaires. D'autre part, les résultats expérimentaux ont permis de vérifier que les vésicules catanioniques sont capables de fusionner spontanément avec les membranes cellulaires. Cette fusion membranaire spontanée et concomitante à l'endocytose fournit à ces nanovecteurs innovants la capacité de délivrer des composés hydrophiles directement dans le cytoplasme des cellules. De nombreuses perspectives peuvent être envisagées pour de tels systèmes. Une application à la vectorisation de principes actifs photosensibilisateurs dans le cadre d'une thérapie photodynamique anticancéreuse a été initiée dans le cadre de ces travaux. Ces systèmes de vectorisation sont particulièrement stables et les résultats obtenus in vitro sont très prometteurs pour le traitement de mélanomes de la peau et de carcinomes de la muqueuse buccale
Sugar-derived catanionic surfactants self-assemble spontaneously into vesicles, which can encapsulate either hydrophilic drugs inside their aqueous core or hydrophobic and amphiphilic drugs inside their bilayer. Their biocompatibility, as well as their stability under time and dilution in biological media, allow to consider the use of these organized molecular systems for drug vectorization and delivery. In the present work, a mechanistic study showed these eco-designed and adjustable systems are able to fuse spontaneously with lipid assemblies mimicking cell membranes, provided that these latter present organization defects inside the bilayer. Cellular interaction mechanisms of such supramolecular systems were elucidated on cancer cell lines, by confocal microcopy and flow cytometry techniques. On the one hand, macropinocytosis, clathrin and caveolae pathways were shown to intervene as major active processes of cellular uptake of vesicles. The simultaneous intervention of these three pathways of endocytosis enables a progressive drug release through complementary mechanisms. On the other hand, experimental results verified that catanionic vesicles are capable of fusing with cell membranes. This spontaneous membrane fusion, concomitant with endocytosis, provides to these innovative systems the ability to deliver hydrophilic compounds directly inside cytoplasm. Numerous perspectives of such systems can thus be foreseen. An application towards vectorization of photosensible drugs was initiated in the present work, in order to fight cutaneous cancer through photodynamic therapy. These vectors, charged with hydrophobic active principles, showed enhanced stability and promising in vitro results for treatment of skin melanoma and oral squamous carcinoma

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Silva, Rosa da Luz Brenda. "Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées de staphylococcus aureus et leur impact sur la réponse de l'hôte." Electronic Thesis or Diss., Rennes, Agrocampus Ouest, 2022. http://www.theses.fr/2022NSARB361.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des bio-particules dérivant de la membrane bactérienne et transportant des molécules impliquées dans les interactions avec l’hôte. Le pathogène Staphylococcus aureus (SA) libère des VEs encore largement inexplorées. Cette thèse fournit le premier travail de caractérisation approfondie de la composition en ARN et en protéines des VEs de SA et de ses cellules productrices. Les VEs contiennent toutes les classes d’ARN sous formes intactes ou fragmentées, dont des petits ARN régulateurs. Le contenu en protéines des VEs comprend des facteurs de virulence, des régulateurs transcriptionnels et des enzymes de voies métaboliques variées. Des différences de composition entre les VEs et les cellules productrices ont été détectées, suggérant des processus d’empaquetage sélectif de leur contenu. Au niveau de leurs fonctions biologiques, nous avons montré que l'ajout de VEs à des cultures bactériennes de SA améliorait leur croissance en conditions carencéeDans le cadre des interactions hôte-pathogène, la réponse cellulaire induite par les VEs différait de celle induite par les bactéries vivantes, indiquant que les VEs pourraient avoir d'autres fonctions physiologiques en lien avec l’infection que celles des bactéries. Dans l'ensemble, nous démontrons que les VEs de SA contienent de nouveaux éléments et modulent la réponse de l'hôte avec différentes intensités, temps d'exposition et par des voies différentes de celles des bactéries vivantes. Cette étude apporte des connaissances sur les rôles fonctionnels potentiels des VEs dans le contexte de la physiologie bactérienne et des infections staphylococciques
Bacterial extracellular vesicles (EVs) are nanoparticles carrying macromolecules that can influence host-pathogen interactions. The pathogen Staphylococcus aureus (SA) releases EVs whose characteristics are still largely explored. This thesis’s project provides the first work extensively characterizing the RNA and protein content of profile of SA clinical HG003 strain and its producing cells. We found that EVs comprised all RNA classes including small regulatory RNA. The protein content of EVs was also diverse with various important elements such as virulence factors, transcriptional regulators, and metabolic enzymes. Interestingly, the protein and RNA content of EVs differed from that of its producing cells, suggesting that selective cargo packing exists. The intra- and interspecies role of EVs was also investigated.We found that the addition of HG003 EVs to bacterial cultures improved their growth in restrictive media. In the context of host-pathogen interactions, the cellular response induced by EVs differed from that induced by the living bacteria in both human and bovine models, indicating that EVs could display other physiological functions than those of bacteria which may be important to the infection process. Overall, our data evidence that SA EVs carry important newly discovered elements, and modulate the host response with different intensities, exposure periods, and by different routes from that of live bacteria. This study brings new knowledge about SA EVs potential functional roles in the context of bacterial physiology and staphylococcal infections

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Kremer, Sébastien. "Extrusion de nanotubes membranaires : de la vésicule à la cellule vivante." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066066.

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Abstract:

Les tubes membranaires sont des structures rencontrées dans le monde vivant et notamment dans l'environnement cellulaire. L'extrusion artificielle de tubes représente un outil idéal pour sonder les propriétés de la membrane et ses interactions avec la matrice sous-jacente. Notre technique d'extrusion hydrodynamique a permis d'extraire des tubes membranaires à partir de vésicules géantes ou de cellules ancrées ponctuellement à une micro-pointe et soumises à un écoulement. On s'est intéressé tout d'abord à caractériser la dynamique d'extrusion de tubes extraits de vésicules rendues poreuses par l'action de la streptolysine O. La comparaison avec les dynamiques d'extrusions sur des vésicules classiques a permis de mieux définir le comportement singulier des vésicules poreuses. La multitude de pores présents au sein de la membrane des vésicules entraîne une perte de ses propriétés élastiques. D'autres expériences ont été menées sur des vésicules encapsulant un gel de Poly(Nipam), permettant ainsi de se rapprocher d'un système plus réaliste de la cellule. L'extrusion de tubes sur des vésicules décorées par un polyélectrolyte, le chitosane, a également été étudié. On a poursuivi notre étude sur une lignée de cellules endocrines, les cellules BON. Les relations entre la force et la vitesse d'extrusion obtenue expérimentalement ont été confrontées à notre modèle théorique. Plusieurs paramètres membranaires tels que la viscosité membranaire, l'énergie d'adhésion membrane-cytosquelette ont pu être estimés. Enfin, on s'est intéressé à étudier l'effet d'un apport massif de membrane, provoqué par le déclenchement volontaire de l'exocytose, sur la dynamique d'extrusion de tubes.

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Borghi, Nicolas. "Nanotubes membranaires : extrusion hydrodynamique." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066556.

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Solon, Jérôme. "Interactions entre membranes lipidiques chargées : instabilités, déformations et mouvement." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066580.

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L'Heureux, Gaétan. "Utilisation de sondes fluorescentes dans la caractérisation des vésicules lipidiques : application au transfert d'énergie membranaire." Thèse, Université du Québec à Trois-Rivières, 1990. http://depot-e.uqtr.ca/6783/1/000583341.pdf.

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Gaudin, Marie. "Etude des vésicules membranaires produites par les Archées hyperthermophiles marines de l'ordre des Thermococcales." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00716699.

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Abstract:

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n'ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d'Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l'enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d'une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l'ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d'ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L'un d'eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d'adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l'apparition des virus.En plus d'être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces " thermococcines " nécessitent d'être caractérisées, il s'agit de la première mise en évidence d'une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales.

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Gaudin, Marie. "Etude des vésicules membranaires produites par les Archées hyperthermophiles marines de l’ordre des Thermococcales." Thesis, Paris 11, 2012. http://www.theses.fr/2012PA112093/document.

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Abstract:

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n’ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d’Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l’enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d’une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l’ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d’ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L’un d’eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d’adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l’apparition des virus.En plus d’être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces « thermococcines » nécessitent d’être caractérisées, il s’agit de la première mise en évidence d’une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales
Secretion of membrane vesicles (MVs) is an important physiological process that has been extensively studied in Bacteria and Eukarya. The recent discovery that Archaea produce MVs shows that this process is universal and suggests that the Last Universal Common Ancestor, LUCA, certainly produced MVs. As these archaeal MVs have been only studied in some Crenarchaeota (ex: G/ Sulfolobus), we started characterizing MVs produced by Thermococcales, a group of hyperthermophilic anaerobic Euryarchaeota.In the first part of this study we examined the mechanism of production as well as the protein and lipid composition of MVs produced by three strains of Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans and Thermocococus sp. 5-4. We observed that MVs are released by a budding process from the cell envelope that is similar to ectosome formation in eukaryotic cells. Moreover, clusters of MVs often form filamentous structures and protuberances on cell surfaces, resembling recently described bacterial nanopods. Differences in structure are observable between MVs of the three species, as well as in their protein composition. However, MVs and cell membranes from the same species have a quite similar protein and lipid composition, confirming that MVs are produced from cell membranes. A major protein present in cell membranes and MVs from the three strains is the oligopeptide-binding proteins (OppA), which has homologues in MVs from Sulfolobus species. Thermococcales MVs harbor DNA and protect this DNA against thermodegradation. Here, we show that T. kodakaraensis cells transformed with the shuttle plasmid pLC70 release MVs harboring this plasmid. Interestingly, these MVs can be used to transfer pLC70 into plasmid-free cells, suggesting that MVs could be involved in DNA transfer between cells at high temperature. In the second part of this study, we were specially interested in the strain Thermococcus nautilus, a Thermococcale that produces MVs selectively enriched in two plasmids from the cell. Notably, one of them corresponds to the genome of a defective virus from PRD1-adenovirus lineage. This indicates that MVs can be used as vehicles for the transport of viral genomes and suggests that production of MVs by ancestral cells could have played a role in the origin of viruses.In addition to be involved in transport of plasmids/viruses, MVs from T. nautilus display a toxic effect on some strains of Thermococcales, maybe due to the delivery of toxins. Even if these “thermococcins” remain to be characterized, this is the first time that a toxic activity associated with MVs has been shown in Thermococcales

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Dilda, Pierre. "Caractérisation de CFTR dans des vésicules membranaires purifiées a partir d'épithélium de trachée bovine : approche pharmacologique." Paris 5, 1995. http://www.theses.fr/1994PA05CD08.

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Abstract:

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) est le produit du gène impliqué dans la mucoviscidose. Lorsque ce gène est muté, CFTR contenu dans les membranes plasmiques des épithélia sécréteurs n'assure plus convenablement sa fonction de canal chlore sensible à l'AMP cyclique. Il en résulte tous les dysfonctionnement épithéliaux liés à la maladie. Dans le but de créer un outil biochimique afin de tester des effecteurs pharmacologiques de CFTR, nous avons utilisé l'épithélium de trachée bovine. Ce modèle animal est d'un grand intérêt puisqu'il existe une très grande homologie entre CFTR humain et bovin. A partir de ce tissu, disponible en grande quantité, nous avons purifié des vésicules membranaires d'origine apicale orientées à l'envers. Des études d'immunoempreintes nous ont permis de détecter CFTR mature (170 kDa) dans les vésicules membranaires apicales et de déterminer sa distribution au niveau de la membrane plasmique des cellules épithéliales de trachée bovine. Les mesures de flux de chlore radioactif dans ces vésicules, les immunoprécipitations suivies de phosphorylations ont démontrées que ce CFTR isolé est fonctionnel. La pharmacologie du canal chlore CFTR, que nous observons, confirme et complète les résultats antérieurs obtenus en électrophysiologie. Nous avons mis en évidence une forte activité ATPasique présente dans les vésicules membranaires apicales ne correspondent à aucune ATPase connue. Le parallélisme évident entre l'inhibition par une nouvelle molécule à la fois de la fonction canal de CFTR et l'activité ATPasique détectée est un nouvel argument en faveur d'une hydrolyse d'ATP par CFTR.

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Da, Costa Grégory. "RMN des petites vésicules unilamellaires lipidiques (SUV) : une approche adaptée à l'étude des interactions périphériques membranaires." Rennes 1, 2007. http://www.theses.fr/2007REN1B106.

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Abstract:

Les SUVs (Small Unilamellar Vesicles),petites vésicules formées d'une seule bicouche lipidique, constituent un modèle membranaire jusqu'à présent relativement peu utilisé en RMN du proton. Nous montrons, à partir de dérivés de porphyrines métallés ou non, diamagnétiques ou paramagnétiques, que la cinétique d'association-dissociation peut permettre d'annuler en moyenne les interactions anisotropes et d'obtenir des signaux fins pour les molécules associées. A partir de l'étude de systèmes SUVs-stérols, nous démontrons que la mobilité intrinsèque des molécules insérées dans la bicouche peut permettre de moyenner efficacement les interactions anisotropes. Ces résultats permettent de rationaliser les conditions de visibilité de molécules en interaction avec des SUVs et de déterminer les conditions nécessaires pour l'étude par RMN de médicaments, peptides et protéines en interaction périphérique avec les SUVs
SUV (Small Unilamellar Vesicles) are constituted of one lipidic bilayer. They have beeb so far only poorly used as model membrane for proton NMR studeis. Based on this work, on porphyrins, free of metallated, diamagnetic of paramgnetic, we show that the kinetic dissociation rate constant is able to cancel the anisotropic interactions, thus allowing the recording of sharp signal even for the molecule bound to the SUV. Using various sterol derivatives, we demonstrated the intinsic mobility of incorporated molecules is able to induce a good averaging of anisotropic interaction. Overall, these results have permit to rationalize the required conditions for recording NMR spectra of drugs, peptides in interaction with SUV

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Martin, Solenne. "La P-glycoprotéine : analyse des différents sites de liaison de ses substrats et de sa fonction de transport." Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA112106.

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Coste, Virginie. "Formation de domaines de type "rafts" dans des vésicules unilamellaires et mécanismes physico-chimiques de l'extraction de domaines membranaires." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116250.

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Abstract:

Les membranes modèles représentent un outil indispensable pour l'étude des membranes biologiques, elles ont en effet grandement contribué à leur description. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l'étude de la coexistence de phases liquide-ordonnée (lo) et liquide-désordonnée (ld) au sein de membranes modèles de type LUV (« Large Unilamellar Vesicle »). Nous avons cherché en premier lieu à mettre au point une méthodologie permettant de détecter la formation de la phase lo et d'estimer quantitativement la fraction membranaire Φo en phase lo dans des LUVs de composition ternaire PC/SM/Chol (phosphatidylcholine / sphingomyéline / cholestérol), capable d'induire une coexistence de phase. Pour cela, les propriétés d'auto-extinction de fluorescence et de distribution sélective en fonction de la phase lipidique d'une sonde fluorescente unique (C12NBD-PC) ont été mises à profit. La deuxième partie de notre travail a été consacrée à l'étude de la solubilisation par le détergent Triton X-100 des membranes de LUVs présentant une coexistence de phase lo/ld. Nous avons cherché à démontrer qu'il était possible d'extraire la fraction membranaire se trouvant strictement en phase lo. Pour cela, les transitions de structure induites par l'interaction du Triton X-100 avec des LUVs à 4°C ont été étudiées par une procédure de séparation par gradient de densité. Nous avons tenté d'évaluer le rapport effectif approprié détergent/lipides nous permettant d'isoler les fractions résistantes correspondant aux domaines en phase lo existant au niveau de la membrane des LUVs avant l'addition de détergent.

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Coste, Virginie. "Formation de domaines de types "rafts" dans des vésicules unilamellaires et mécanismes physico-chimiques de l'extraction de domaines membranaires." Paris 6, 2006. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116250.

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Abstract:

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’étude de la coexistence de phases liquide-ordonnée (lo) et liquide-désordonnée (ld) au sein de membranes modèles de type LUV (« Large Unilamellar Vesicle »). Nous avons cherché en premier lieu à mettre au point une méthodologie permettant de détecter la formation de la phase lo et d’estimer quantitativement la fraction membranaire Φo en phase lo dans des LUVs de composition ternaire PC/SM/Chol (phosphatidylcholine/sphingomyéline/cholestérol). Pour cela, les propriétés d’auto-extinction de fluorescence et de distribution sélective en fonction de la phase lipidique d’une sonde fluorescente unique (C12NBD-PC) ont été mises à profit. La deuxième partie de notre travail a été consacrée à l’étude de la solubilisation par le détergent Triton X-100 des membranes de LUVs présentant une coexistence de phase lo/ld. Nous avons cherché à démontrer qu’il était possible d’extraire la fraction membranaire se trouvant strictement en phase lo par l’étude des transitions de structure induites par l’interaction du Triton X-100 avec des LUVs à 4°C
In this work, we have been interesting in the study of the liquid-ordered/liquid-disordered (lo/ld) phase coexistence within LUV (Large Unilamellar Vesicle) membranes model. First, we have attempted to develop a methodology both allowing the detection of lo phase formation and the quantitative estimation of membrane fraction Φo occupied by lo phase in LUV of ternary composition: PC/SM/Chol (phosphatidylcholine /sphingomyeline /cholesterol). For this purpose, the properties of fluorescence self-quenching and selective partitioning between lipid phases of a unique fluorescent probe (C12NBD-PC) were used. The second part of our work has been dedicated to the study of the solubilization of LUVs showing lo/ld phase coexistence by Triton X-100 detergent. Our aim was to demonstrate the possibility to extract strictly lo phase membrane fraction, by the study of structural transitions induced by Triton X-100 interactions with LUVs at 4°C

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Perbet, Romain. "Rôle des vésicules extracellulaires dans la propagation de la protéine Tau." Thesis, Lille 2, 2020. http://www.theses.fr/2020LIL2S023.

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Abstract:

L’agrégation de tau intra-neuronale est une caractéristique commune d’un groupe hétérogène de maladies neurodégénératives appelées tauopathies. Dans certaines d’entre elles, la pathologie affecte une région cérébrale avant de se propager à d’autres régions.Cette évolution stéréotypée dans le temps et dans l’espace est probablement liée à une propagation de type prion d’espèces de tau ayant des propriétés de recrutement. Ces espèces pathologiques de tau identifiées dans le liquide interstitiel cérébral (ISF) de souris transgéniques et dans le liquide céphalorachidien humain (LCR) peuvent être internalisées par des cellules et induire une agrégation intracellulaire de tau (Takeda et al., 2016). Ces espèces pathologiques sont encore mal caractérisées mais plusieurs mécanismes potentiellement impliqués dans leur propagation ont été démontrés. Parmi eux nous avons démontré que tau est sécrétée dans les vésicules extracellulaires (EV) (Dujardin et al., 2014).Dans ce contexte nous avons voulu : 1/ vérifier l’hypothèse selon laquelle la protéine Tau pathologique est présente dans les VE extraites de tissus de patients atteints de différentes Tauopathies et que ces dernières peuvent induire de la pathologie chez l’animal. 2/ détecter des espèces pathologiques de Tau dans les VE contenues dans le plasma et le LCR, potentiels biomarqueurs de Tauopathies. 3/déterminer si de la protéine Tau peut être transférée d’un neurone à un astrocyte et dans le cas échéant, de déterminer la/les voies de transfert.Afin de tester la présence de tau avec potentiel de recrutement dans les EV extraites d’ISF de patients atteints de tauopathie set de souris transgéniques nous avons utilisé un biosenseur biologique sensible et spécifique. Nos résultats démontrent que des EV extraites d’ISF de patients atteints de maladie d’Alzheimer, de paralysie supranucléaire progressive (PSP) et de souris Tau30 contiennent de la tau pro-nucléantes. Ces capacités de recrutement sont corrélées à la sévérité de la pathologie pour la MA (préfrontal>occipital>cervelet) et induisent de la pathologie chez la souris transgénique. La présence de tau dans ces VE supporte l’idée que les EV pourraient avoir un rôle dans la propagation de tau.Nous avons également démontré par différentes approches in-vitro que la protéine Tau peut être transférée de neurone à astrocyte. Ce transfert se fait principalement par les vésicules extracellulaires
Intra-neuronal accumulation of tau protein aggregates is one of the common feature of a group of heterogeneous neurodegenerative diseases called tauopathies. In some of them, the pathology will first affect a region before spreading to other regions.This staging could be linked to the prion-like propagation of pathological seed-competent tau species. These seeds, identified in transgenic mice interstitial fluid (ISF) and in human cerebrospinal fluid (CSF) are uptaken by cells and induce subsequent intracellular tau aggregation (Takeda et al., 2016). The pathological species of tau which are spreading are not yet well characterized but several mechanisms mediating their transfer (secretion and capture) have been highlighted. Among them, we demonstrated that tau is secreted in extracellular vesicles (EV´s) (Dujardin et al., 2014). We also know that neurons are implicated in this transfer but the role of glial cells is unknown.In this context, we wanted to: 1 / demonstrate that pathological Tau protein is present in EVs extracted from brain of patients suffering from different Tauopathy and that those EVS induce pathology in animals. 2 / detect pathological Tau species in EVs extracted from plasma and CSF, potential biomarkers of Tauopathies. 3 / demonstrate that Tau protein can be transferred from neuron to astrocyte and, if so, to determine the transfer pathway.To test the seeding potential of EV’s containing in ISF derived from human brain of patient presenting tauopathies, and Tau 30 mouse brain we have used a sensitive and specific tau biosensor assay. Our results demonstrate that EVs isolated from ISF of AD patient, PSP patient and Tau 30 mouse contain seed prion-like properties. The ability of these seeds to recruit tau seems to be correlated to the severity of tau pathology (prefrontal>occipital>cerebellum) for AD. This might reflect the slight presence of neurofibrillary degeneration as well as extracellular tau in this pathology in comparison to AD. Finally, the presence of seeds-containing EV’s in the extracellular space supports the idea that these shuttles might be implied in the prion-like propagation of tau pathology in Humans. Additionally, tau pathology spreading is driven by EV’s rather than by free-floating tau species.We also demonstrated that tau can be transferred from neuron to astrocyte; this transfer is more efficient with EV’s than with free floating tau.These data open new avenues for therapeutic interventions that might targets the toxic and propagative species

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Huang, Xiao Hang. "Etude du trafic membranaire chez les algues marines : les vesicules mantelees de laminaria digitata et ulva lactuca." Paris 5, 1988. http://www.theses.fr/1988PA05S006.

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Abstract:

Nous avons, pour la premiere fois, isole et caracterise les vesicules mantelees a partir d'algues marines: laminaria digitata et ulva lactuca representantes des algues brunes et des algues vertes respectivement. Les fractions enrichies en vesicules mantelees ont ete preparees par gradient discontinu de saccharose. Les polypeptides de 170-175 kda correspondent aux chaines lourdes de la clathrine de buf et un des polypeptides de 70 kda est semblable au composant de la clathrine de carotte. Tous ces polypeptides montrent une reponse positive a l'anticorps anticlathrine de buf obtenu chez la chevre ou chez le lapin. Chez u. Lactuca, la proportion de la clathrine varie pendant les etapes de croissance de la plante. Les images de microscopie electronique revelent une structure reguliere du manteau vesiculaire. L'analyse lipidique montre la presence des phospholipides dans les vm de ces algues. L'analyse des glucides montre une proportion elevee de galnac et glcnac dans les vm, alors qu'ils ne sont pas detectables dans les extraits totaux de ces algues. La composition chimique des vesicules mantelees, quantitativement specifique pour chaque type d'algue etudie, suggere l'implication des vesicules mantelees dans l'edification des parois cellulaires ainsi que dans le transport des glycoproteines et glycolipides vers les differentes membranes cellulaires

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Gerbeaud, Claire. "Effet de l'insertion de protéines et de peptides membranaires sur les propriétés mécaniques et les changements morphologiques de vésicules géantes." Bordeaux 1, 1998. http://www.theses.fr/1998BOR10649.

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Abstract:

Certains processus cellulaires sont gouvernés par les propriétés mécaniques intrinsèques des membranes biologiques. L'une d'elles, l'élasticité de courbure, peut être mesurée sur des membranes modèles par analyse des fluctuations thermiques de vésicules géantes. Dans un premier temps, on étudie l'influence du cholestérol sur l'évolution du module d'élasticité de courbure, kc, de membranes lipidiques. La dépendance de kc avec la nature, la concentration et le mode d'insertion de divers peptides et protéines membranaires est ensuite démontrée. Finalement, l'élaboration d'un montage de micromanipulation sous microscope de vésicules géantes a permis d'étudier les perturbations morphologiques induites par l'action d'un peptide lytique, la mélittine.

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De, rezende rodovalho Vinicius. "Caractérisation du contenu protéomique et des propriétés immunomodulatrices des vésicules extracellulaires secrétées par la bactérie probiotique Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA129." Thesis, Rennes, Agrocampus Ouest, 2021. http://www.theses.fr/2021NSARI082.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanoparticules sphériques impliquées dans la communication intercellulaire et l'échange de molécules, telles que les protéines. Plusieurs organismes produisent des VEs, y compris les bactéries probiotiques. Propionibacterium freudenreichii est une bactérie à Gram positif qui a émergé comme probiotique en raison de propriëtës bënëfiques comme l'immunomodulation. Certaines de ces ont été attribuées à des facteurs exposés à la surface ou sécrétés par la bactérie. Par conséquent, nous avons cherché à savoir si P. freudenreichii produisait des VEs qui pourraient médier ses propriétés bénéfiques. La bactérie a été cultivée dans un milieu ultrafiltrat de lait ou extrait de levure-lactate,et les surnageants de culture concentrés ont ensuite été purifiés par chromatographie d'exclusion de taille ou ultracentrifugation en gradient de et densité. Des nanoparticules sphériques ont été obtenues, confirmant la production de VEs. L'analyse du contenu protéique des VEs et de l’interactomique a indiqué des rôles immunomodulateurs potentiels, qui ont été confirmés par des modèles cellulaires en mesurant la libération d'IL-8 et l’activité du facteur NF-xB. De plus, les propriétés et l’acti\lité propriétés des VEs variaient selon le milieu de culture et la méthode de purification. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à la compréhension des mécanismes de l’effet probiotique chez P. freudenreichii et montrent le potentiel de développement de nouveaux systèmes de livraison nanotechnologiques, avec un impact potentiellement important en santé humaine
Extracellular vesicles (EVs) are spherical nanoparticles involved in the intercellular exchange of molecules, such as proteins. Several organisms produce EVs, including probiotic bacteria. Propionibacterium freudenreichii is a Gram-positive bacterium that emerged as a probiotic due to notable beneficial properties, including immunomodulation. Some of these properties have been attributed to factors exposed on the surface or secreted by the bacterium. Therefore, we investigated wether P. freudenreichii produced EVs that could mediate its beneficial properties. The bacteria were cultured in milk ultrafiltrate or yeast extract-lactate medium,and the concentrated culture supernatants were then purified by size exclusion chromatography or density gradient ultracentrifugation. Spherical nanoparticles were obtained, confirming the production of EVs by the bacterium. Analysis of the EVs protein content and interactomics indicated potential immunomodulatory roles, which was confirmed by cell culture assays measuring IL-8 release and NF-KB activity. Additionally, the properties and activity of EVs varied depending on the culture medium and the purification method. Overall, these results contribute to the understanding of the mechanisms of the probiotic effect in P. freudenreichii and show the potential for the development of novel nanotechnological delivery systems, with a potentially significant impact on human health

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Sauvage, Sophie. "Structures membranaires à base de tensioactifs fluorés non ioniques : phases aqueuse et émulsions-gels concentrées." Nancy 1, 1993. http://www.theses.fr/1993NAN10374.

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Abstract:

La topologie de membranes constituées de tensioactifs non ioniques fluorés de type hydrophobes est étudiée en phase aqueuse et dans les émulsions-gels concentrées en eau. Dans celles-ci (système étudié: r#f#6e#2/eau/perfluorodecaline), la membrane est une monocouche stabilisant la phase dispersée aqueuse sous la forme de globules sphériques, au sein du milieu continu: la microémulsion e/h. Nous avons mesuré le rayon des globules en fonction de la température, du rapport huile/tensioactif, et des teneurs en eau et en additifs (nacl et fructose), par diffusion des rayons X et des neutrons aux petits angles (drxpa ou dnpa). La membrane de type bicouche est étudiée pour des tensioactifs hydrophobes (r#f#me#n, m=6 a 8 et n=3 a 6), dans l'eau dans les domaines monophasiques l# et l#3. Dans la série de tensioactifs étudiée, on montre que r#f#6e#5 constitue des membranes fluides dont nous avons mesuré le module de rigidité moyenne à l'aide de la diffraction des rayons X (RX), dans le domaine monophasique l#. La mesure de k en fonction de la température permet de montrer que la flexibilité des membranes augmente avec la température (k/kt=1,3 a 10c 0,5 a 60c). La structure à grande échelle de la phase l#3 est étudiée dans le cas du système r#f#7e4/eau, par drxpa et dnpa, conductimètrie et diffusion élastique de la lumière (DEL): les membranes multiconnectées sont organisées en un réseau tridimensionnel dont la maille semble être du type tétragonal. L'étude du domaine biphasique w+l# nous a permis d'aborder le problème des phases transitoires apparaissant au cours de la démixtion. Nous montrons que la structure empilée de la phase l# subit une délitescence sous l'effet de l'agitation mécanique. La sonication de tels systèmes dilués permet de clarifier les échantillons. L'analyse par drxpa et DEL permet de montrer qu'on formerait des vésicules à membranes monofeuillet qui seraient en équilibre avec des lambeaux de bicouches

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Habib, Lamice. "Étude des propriétés membranaires des vésicules lipidiques incorporant des triterpènes oxygénés bioactifs d'origine végétale : application à la cucurbitacine E et à l'érythrodiol." Thesis, Lyon 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LYO10022/document.

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Abstract:

La cucurbitacine E et l'érythrodiol sont des triterpènes naturels oxygénés ayant respectivement un squelette tétra et pentacyclique. Ils sont reconnus pour leurs diverses propriétés biologiques. Dans ce travail de thèse, nous étudions leur interaction avec les membranes des vésicules lipidiques dans le but de mieux comprendre leur pharmacodynamie. Nous avons préparé des liposomes en absence et en présence de la cucurbitacine E et de l'érythrodiol par les techniques d'évaporation en phase inverse suivie d'une extrusion, d'hydratation du film lipidique et d'injection d'éthanol. Les caractéristiques physicochimiques des vésicules lipidiques incorporant ou non la molécule triterpénique ont été étudiées par des techniques adéquates. Les analyses de la cucurbitacine E et de l'érythrodiol par la chromatographie liquide à haute performance ont montré que leurs taux d'incorporation dans les liposomes sont élevés. Les mesures de taille obtenues par la diffusion dynamique de la lumière ont démontré que les liposomes incorporant les triterpènes présentent une taille moyenne inférieure à celle des liposomes témoins. Les images obtenues par la microscopie électronique à transmission ont confirmé la formation de vésicules sphériques. Les mesures des dimensions des vésicules observées par la microscopie à force atomique (AFM), ont révélé que les liposomes incorporant la cucurbitacine E sont plus hauts et résistent mieux à la force exercée par la pointe AFM que les liposomes témoins. Par ailleurs, les liposomes incorporant l'érythrodiol sont plus fragiles que les liposomes témoins et ont tendance à éclater en bicouches lipidiques à la surface du support. Les courbes thermiques obtenues par la calorimétrie différentielle à balayage ont permis de conclure que la cucurbitacine E est localisée à l'interface polaire-apolaire de la membrane liposomiale alors que l'érythrodiol s'insère entre les chaînes acyles des phospholipides et aboutit à la formation des domaines hétérogènes au niveau de la membrane. La cinétique de libération de la sulforhodamine B, mesurée par la spectroscopie de fluorescence, a révélé que la membrane liposomiale devient, en présence de la cucurbitacine E, plus perméable à la sulforhodamine B incorporée dans la phase aqueuse interne. L'ensemble des résultats suggère que la cucurbitacine E et l'érythrodiol interagissent avec la membrane lipidique et affectent ses propriétés physico-chimiques. Leur effet sur la membrane ne semble pas être similaire. Des études ultérieures impliquant d'autres triterpènes sont envisagées pour identifier le (s) motif (s) structural (aux) et les paramètres physico-chimiques régissant leur interaction et localisation membranaire
Cucurbitacin E and erythrodiol are natural oxygenated triterpenes having respectively, a tetra and pentacyclic skeleton. They are known for their numerous biological properties. In this thesis, we studied their interaction with the membranes of lipid vesicles to better understand their pharmacodynamics. We have prepared liposomes in the absence and presence of cucurbitacin E and erythrodiol using the reverse phase evaporation technique followed by extrusion, the hydration of lipid film and the ethanol injection techniques. The physicochemical characteristics of lipid vesicles incorporating or not the triterpenic molecules were investigated by appropriate techniques. The determination of cucurbitacin E and erythrodiol in the vesicles by high performance liquid chromatography showed high incorporation efficiencies of both triterpenes. Size measurements obtained by dynamic light scattering showed that liposomes incorporating triterpenes were smaller than empty liposomes. The images obtained by transmission electron microscopy confirmed the formation of spherical vesicles. Measurements of vesicles dimensions by atomic force microscopy (AFM) demonstrated that liposomes incorporating cucurbitacin E were higher and more resistant to the force exerted by the AFM tip than the blank liposomes. Liposomes incorporating erythrodiol were more fragile and tend to break up into lipid bilayers on the mica surface. Results obtained by differential scanning calorimetry suggested that cucurbitacin E is localized at the polar-apolar interface of the liposomal membrane while erythrodiol is inserted between the acyl chains of the phospholipids leading to the formation of heterogeneous lipid domains. The release kinetics of the sulforhodamin B encapsulated into the aqueous phase and measured by fluorescence spectroscopy revealed that the liposomal membrane becomes in the presence of cucurbitacin E, more permeable to this probe. The overall results suggest that cucurbitacin E and erythrodiol affect differently

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Mauroy, Chloé. "Fusion d'auto-assemblages lipidiques." Toulouse 3, 2010. http://thesesups.ups-tlse.fr/1039/.

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Abstract:

Les processus de fusions membranaires sont des processus vitaux dans les systèmes biologiques. Ils nécessitent une déstructuration de l'organisation membranaire. La fusion est un phénomène parfaitement contrôlé qui ne s'effectue pas de façon spontanée du fait de l'existence de barrières énergétiques. Pour abolir ces barrières, il est nécessaire d'apporter de l'énergie au système. Dans une première partie est étudiée l'électrofusion entre deux vésicules unilamellaires géantes (GUVs), pour laquelle il est nécessaire d'appliquer un champ électrique exogène ayant pour effet l'électroperméabilisation des membranes pour créer un état fusogène. Le champ électrique externe peut induire la déstabilisation des membranes permettant alors la fusion entre ces deux édifices membranaires en contact lors de l'impulsion. Nous avons caractérisé, d'une part, le rôle des états de phase des auto-assemblages lipidiques et les valeurs seuil du potentiel transmembranaire nécessaire à l'électroperméabilisation, et, d'autre part, les modifications morphologiques associées à cette homofusion. Dans une seconde partie est étudiée la fusion spontanée entre des vésicules catanioniques et des GUVs de différentes compositions et états de phase. Nous avons pu mettre en évidence le fait que les interactions entre ces deux systèmes dépendaient d'une part de l'état de phase des GUVs et d'autre part des interactions électrostatiques entre ces deux systèmes. Pour que la fusion soit effective, il apparaît nécessaire d'avoir une désorganisation de l'édifice membranaire. Cette désorganisation est ici induite par la présence d'un champ électrique endogène révélé par le potentiel zêta des vésicules catanioniques
Membrane fusion processes play a key role in biological system. Fusion processes involve destabilization of membrane organization. This is a controlled phenomenon which is not spontaneous because of energetic barriers. To abolish these barriers, it is necessary to provide energy to the system. In a first part, electrofusion between two giant unilamellar vesicles (GUVs) was studied. The fusogenic state was obtained by the application of an exogenous electric field to induce membrane electropermeabilization. External electric field can induce membrane destabilization allowing fusion between these two membrane systems in contact during the electric pulse. We characterized, on the first hand, the role of phase states of the membrane and the critical electric field for electropermeabilization and, on the other hand, the morphological modifications associated to this homofusion. In a second part, spontaneous fusion between catanionic vesicles and GUVs with different compositions and phase states was studied. We underline the fact that the interactions between these two systems depend, on the first hand, on the phase states of the GUVs and, on the other hand, on the electrostatic interactions between them. Fusion is induced when the membrane is destabilized. This destabilization is induced here by the presence of an endogenous electric field revealed by the zeta potential of the catanionic vesicles

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Perrot, Nahuel. "Production dans Escherichia coli de vésicules enrichies en cavéoline-1(32-178) canine ou son fragment (76-178)." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLS067.

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Abstract:

La cavéoline-1, une petite protéine membranaire de 21 kDa, est la protéinemembranaire majoritaire d'invaginations de la membrane cytoplasmique appeléescavéoles. Enrichis en cholestérol et sphingolipides, ces domaines ont un rôleimportant dans de nombreux aspects de la vie cellulaire et constituent une véritableplateforme d'interactions protéiques et lipidiques. Ces dernières années, malgré lenombre important de travaux concluant à l'implication de la cavéoline-1, ou descavéoles, dans de nombreux processus cellulaires ou pathologiques, les donnéesquant à l'organisation de cette protéine au sein de la membrane plasmique restent trèséparses. Aussi, l'objectif principal de ce travail est de contribuer à l'acquisition dedonnées structurales sur cette protéine. Ce travail se base sur les expressionshétérologues d'une isoforme de la cavéoline-1 canineou de l'un de ses fragments, dans un hôte bactérien, sous la forme de protéines defusion associées à la Maltose Binding Protein. Ces expressions induisent laformation de vésicules intracytosoliques composées majoritairement de la protéineexprimée. Aussi, la première partie du travail est consacré à la mise en place d'unprotocole de purification de ces vésicules dans des conditions natives, répondant aucritère de réaliser une étude structurale de cette protéine n'impliquant pas l'usage dedétergent. La deuxième partie porte sur une application potentielle de ces vésicules, eten particulier pour des essais de caractérisation d'une enzyme membranaire,la glutathion-S-transférase microsomale de rat. Enfin une troisième partie est dédiée àl'analyse de simulations de dynamique moléculaire dans le cadre d'étudesd'interactions au sein de systèmes membranaires
Caveolin-1, a 21 kDa membrane protein, is the principal membrane protein ofcytoplasmic membrane domains named caveolae. Specifically enriched incholesterol and sphingolipids those domains are important in many aspect of the cell's life and make up a proteins and lipids interaction platform. In the past years, despite a large number of publications stating the implication of caveolin-1 or caveolae in many cell processes and pathologies, very few is known about theway this protein is organized at the cell membrane. Hence, the main purpose of thiswork is to contribute to the acquisition of structural data on this protein. At the base of this work is the heterologous expression within a bacterial host, and as a fusion protein, of the canin beta isoform of cavéolin-1 or one of its fragment. These expressions lead to the formation of cytoplasmic vesicles composed mainly ofthe expressed protein. Thence, the first part of this work focus on developping a method to purify those vesicles that does not rely on using any kind of detergent which could enable structural studies in a native environnment. The second part present a potentiel application of those vesicles and inparticular the use of those vesicles to characterize a membrane enzyme, namelythe murin microsomal glutathion-Stransferase. The last part will be a contribution to data analysis within the context of molecular dynamics simulationof membraneous systems

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Ruffiot, Pauline. "Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii : intéractions des protéines de granules denses (protéines GRA) avec des vésicules unilamellaires." Phd thesis, Grenoble 1, 2007. http://www.theses.fr/2007GRE10104.

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Abstract:

Les protéines GRA sont sécrétées par le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii dans la vacuole parasitophore, où elles interagissent pour la plupart avec deux systèmes de membranes tubulaires: les tubules séquestrant des organites de l'hôte (HaSTs) et le réseau de nanotubes membranaires (RNM). Bien que la plupart des protéines GRA contiennent des domaines transmembranaires potentiels, elles sont sécrétées sous des formes solubles et ne s'associent à des membranes qu'une fois qu'elles ont atteint leurs membranes-cibles dans la vacuole. Cette propriété inhabituelle nous a amenés à les considérer comme des modèles intéressants pour l'étude d'interactions protéine-membrane. J'ai développé deux approches expérimentales pour étudier les interactions des protéines GRA, extraites du parasite ou de la vacuole, avec des membranesmodèles. Premièrement, des approches biochimiques m'ont amenée à caractériser les formes de solubilisation des protéines GRA et leur association avec les membranes des petites vésicules unilamellaires (SUVs). Deuxièmement, j'ai développé une approche par spectroscopie de fluorescence, de protéines GRA associées aux membranes de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Les résultats fournissent des éléments de réponse qui (1) aident à décrypter le trafic des protéines dans le parasite et dans la vacuole et (2) ouvrent la voie pour la mise en place d'un système in vitro pour l'étude de la maturation de la vacuole parasitophore et de ses membranes tubulaires internes
GRA proteins are secreted by the intracellular parasite Toxoplasma gondii into the parasitophorous vacuole, where most of them interact with two systems of tubular membranes: the Host Organelle Sequestering Tubules (HaSTs) and the Membrane Nanotubules Network (RNM). Although most of the GRA proteins contain potential transmembrane domains, they are secreted as soluble forms and become membrane-associated only when they reach their target membranes. This unusual property led to consider them as attractive models of protein-membrane interactions. 1 developed two experimental approaches to study the interactions of GRA proteins, extracted trom the parasite or trom the vacuole, with model membranes. Firstly, biochemical approaches using Small Unilamellar Vesic1es (SUVs) led to characterize the solubilisation forms of GRA proteins and their association with SUVs membranes. Secondly, 1 developed a Giant Unilamellar Vesic1es (GUVs) model to study the interactions of GRA proteins with membranes by fluorescence spectroscopy methods. The results provide elements 1) which help to decipher the traffic of GRA proteins within the parasite and the PV, and 2) which open the way to set up an in vitro minimal system to study the building up of the parasitophorous vacuole and of its associated tubular membranes

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Fagla-Amoussou, Akouavi Balbine. "Etude des interactions polluants aromatiques polycycliques (HAP)-récepteurs adrénergiques-phospholipides membranaires dans le tissu adipeux." Thesis, Vandoeuvre-les-Nancy, INPL, 2010. http://www.theses.fr/2010INPL080N/document.

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Abstract:

L'obésité est une maladie définie par une accumulation de masse grasse dans le tissu adipeux ayant des conséquences néfastes pour la santé. Les causes de l’obésité sont multiples. Dans un travail récent, il y a été démontré le rôle de la pollution environnementale dans la prise de poids. Dans ce travail, les hypothèses selon lesquelles les récepteurs adrénergiques situés à la surface des cellules adipeuses seraient le siège de l’action des polluants aromatiques polycycliques ont été vérifiées par le dosage de plusieurs agonistes et antagonistes spécifiques et non spécifiques en présence ou non du benzo[a]pyrène sur des récepteurs humains et de cellules d’hamster chinois (CHO). Les quantités d’AMPc obtenues montrent que les HAP ne se déposent pas sur les récepteurs β1, β2, β3 adrénergiques.Cette accumulation se fait au niveau des phospholipides de la membrane cytoplasmique des cellules. Ce qui cause une rigidité des membranes.Cette observation tend à renforcer l'hypothèse selon laquelle le benzo[a]pyrène induirait une inhibition de la lipolyse par l'accumulation au niveau de la bicouche de phospholipides et des changements de conformation de la bicouche de phospholipides dans les environs des récepteurs à sept domaines transmembranaires qui sont β-adrénergiques.La liaison de la bicouche phospholipidique avec les HAP utilisés est une réaction exothermi-que avec un faible dégagement de chaleur
Obesity is a disease defined by an accumulation of fat in adipose tissue with adverse consequences for health. The causes of obesity are many.In recent work, there was demonstrated the role of environmental pollution in weight gain.In this work, the assumptions that the adrenergic receptors on the surface of fat cells would home to the accumulation of polycyclic aromatic pollutants have been verified by measurement of several agonists and antagonists specific and non-specific in the presence or absence of benzo[a]pyrene receptors on human cells and Chinese hamster (CHO). The amounts of cAMP obtained showed that PAHs are not deposited on β-receptors, β1, β2, β3 adrenergic receptors.This accumulation occurs at the cytoplasmic membrane phospholipids of the cells. What cau-ses stiffness of the membranes. This observation tends to reinforce the hypothesis that benzo [a]pyrene induce an inhibition of lipolysis by the accumulation in the phospholipid bilayer and conformational changes of the bilayer phospholipids in the vicinity of receptors seven transmembrane domains which are β-adrenergic receptors

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Marconi, Séverine. "Dosage de l'activité endoprotéolytique de neurotoxines clostridiales." Aix-Marseille 2, 2008. http://www.theses.fr/2008AIX20690.

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Abstract:

L’utilisation croissante des neurotoxines botuliques comme agents thérapeutiques et cosmétiques mais aussi le risque qu’elles constituent en tant qu’armes biologiques potentielles nécessitent l’élaboration de nouveaux tests de détection de leur activité protéolytique in vitro, pour remplacer à terme le test de référence de létalité in vivo chez la souris. Un dosage in vitro de l’activité des BoNT/B par résonance plasmonique de surface (SPR, mis au point par Ferracci et al. En 2005, est basé sur la quantification directe de la VAMP2, protéine des vésicules synaptiques, par son immuno-capture sur des anticorps spécifiques immobilisés sur la sensor chip. Ce test est 200 fois plus sensible et jusqu’à 25 fois plus rapide que le test de référence in vivo. Le clivage de la VAMP2 des vésicules synaptiques par la BoNT/B a été estimé par SPR, ELISA et cytométrie de flux. Les EC50 déterminés sont similaires entre les trois méthodes alors que l’analyse SPR est beaucoup plus rapide et économique. D’autre part, les VS constituent un substrat très robuste, lyophilisable, permettant de détecter l’activité enzymatique de la BoNT/B dans des milieux complexes. L’utilisation d’un protocole d’immunoisolation de la BoNT/B dans le sérum rend le test 30 fois plus sensible que la méthode in vivo. Nous avons développé une méthode SPR permettant la quantification de protéines de la membrane plasmique et le dosage de l’activité de la BoNT/A. Des antigènes membranaires intracytoplasmiques, dont la SNAP-25 (cible de la BoNT/A), ont été dosés sans solubilisation avec une sensibilité de l’ordre du picogramme. En utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement la SNAP-25 clivée par la BoNT/A, nous avons établi une méthode de dosage rapide et sensible de ce sérotype. La méthode a été appliquée au dosage de l’activité de la BoNT/A dans des cultures cellulaires en 24 ou 96 puits
Neurotransmitter-filled synaptic vesicles fuse in a calcium-dependent manner with the plasma membrane to release their content into the synaptic cleft. VAMP2, a synaptic vesicle membrane protein, interacts with SNAP-25 and syntaxin1 localized on the plasma membrane. These proteins, called SNAREs, assemble into a heterotrimeric complex that brings the vesicle and the plasma membranes into close apposition. Botulinum neurotoxins (BoNTs), the most toxic biological substances known, inhibit synaptic neurotransmission by cleaving SNAREs. There are seven BoNT serotypes named A to G of which BoNT/ B and F cleave VAMP2 and BoNT/A and E cleave SNAP-25. The increasing use of BoNTs as therapeutic and cosmetic agents, but also the threat they constitute as potential bioweapons, highlight the need for development of in vitro assays to detect their endoproteolytic activity. These alternative methods should replace the mouse bioassay which is the current reference method. An in vitro assay for the detection of the catalytic activity of BoNT/B and F has been developed by Ferracci et al. In 2005. It is based on the direct quantification of synaptic vesicle proteins, in particular VAMP2, by their immuno-capture on specific antibodies immobilized on the sensor chip surface. For BoNT/B, this test was shown to be 200 times more sensitive and up to 25 times faster than the reference in vivo toxicity test in mice. Using synaptic vesicles as a substrate, a comparison of the EC50s for BoNT/B obtained by SPR, ELISA or flow cytometry indicated similar sensitivity although SPR assays were more rapid and economical. We also showed that synaptic vesicles are a robust substrate, that can be lyophilized, allowing the detection of BoNT/B activity in complex media. With an immunoisolation step of BoNT/B from serum, the assay was shown to be 30 times more sensitive than the mouse bioassay. We developed an SPR-based method allowing the quantification of plasma membrane proteins and the detection of BoNT/A activity. Sonication of brain or neuronal cultures generated plasma membrane fragments with accessible intra-cellular epitopes adapted to analysis by SPR. SPR responses were proportional to antigen concentration permitting detection of as little as 4 pM SNAP-25 in crude lysates. BoNT/A activity was assayed using monoclonal antibodies that specifically recognize a SNAP-25 epitope generated by the proteolytic action of the toxin. The SPR biosensor method was sensitive enough to monitor BoNT/A and B activity in cells cultured in a 96-well format and could favourably replace time-consuming techniques for the measurement of toxin activity

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Salim, Cláudio. "Expression de la protéine géante AHNAK après lésion de la moelle épinière et dans le système nerveux périphérique : études fonctionnelles sur les cellules de Schwann in vitro." Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066507.

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Abstract:

Le gène ahnak de rat a été identifié lors d’un criblage différentiel visant à déterminer les protéines impliquées dans les lésions de la moelle épinière. Après la lésion chez le rat, AHNAK est produite en quantité accrue de 48h à 6 mois. AHNAK est présente dans la composante fibrotique de la cicatrice, exprimée par des types cellulaires variés. Sa localisation en bordure des cavités suggère une participation dans la formation d’une barrière protégeant le parenchyme sain après lésion. Dans le système nerveux périphérique, AHNAK est constitutivement exprimée par les neurones sensoriels de petits et de moyens diamètres, ainsi que par les cellules satellites, et les cellules de Schwann du nerf. Pendant la myélinisation la protéine AHNAK est redistribuée d’un compartiment péri-myélinique du cytoplasme externe, à une distribution diffuse et associée à des vésicules au niveau de la membrane abaxonale. In vitro AHNAK et dystroglycan sont associés aux filopodes de cellules de Schwann non confluentes. L’interférence de l’expression de ahnak, induit la rétraction des processus et le détachement du substrat, s’accompagnant d’une chûte du taux de bêta- dystroglycan et la délocalisation de son partenaire Dp116. AHNAK pourrait participer à la stabilisation du complexe d’attache contenant le dystroglycan et contribuer ainsi au maintien de la myéline
Ahnak gene in rat has been first identified by a differential screening that aimed in identifying proteins overexpressed in a spinal cord injury. After a spinal injury in rat, AHNAK is expressed by different types of cells invading the lesion epicenter as soon as 48h after injury. Those cells constitute the fibrotic component of the glial scar, and produce ahank at least until 6 months after injury. AHNAK expressing cells delineate the inner border of cystic cavities in the lesion epicenter, suggesting that AHNAK may participate in the formation of a tissue-protective barrier. In the peripheral nervous system, AHNAK is constitutively expressed by sensory neurons of the dorsal root ganglia, satellite cells, and Schwann cells from the nerve. During myelination in rat, AHNAK is redistributed from a strictly perimyelinic compartment of the external cytoplasm, to a more diffuse distribution associated with the outer surface of vesicles, and with the abaxonal plasma membrane. In non confluent Schwann cells in vitro, AHNAK and the laminin-receptor dystroglycan are associated with filopodia-like cell extensions. Ahnak interference in Schwann cells induces retraction of cell processes and detachment from laminin coated surfaces, associated with a reduction of the Schwann cell content in beta-dystroglycan and a nuclear translocation of Schwann cell specific dystrophin Dp116 which normally binds beta dystroglycan with the actin cytoskeleton. . We suggest AHNAK to be implicated in targeting and/or scaffolding of the dystroglycan-associated complex to the abaxonal membrane. Thus, similarly to periaxin with which it shares certain features, AHNAK may contribute to SC-basal lamina interaction, and myelin formation and/or maintenance

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Boom, Alain. "Etude de la perméabilité hydrique de l'épithélium vésical de "Bufo marinus" sensible à l'hormone antidiurétique: rôle des protéines G et de la perméabilité membranaire à l'adénosine monophosphate cyclique (cAMP)." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2001. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/211527.

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Rousseau, France. "Régulation pré-synaptique de la transmission inhibitrice par le transporteur neuronal de la glycine (GlyT2)." Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066239.

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Abstract:

La glycine et le GABA sont accumulés par le même transporteur vésiculaire (VIAAT) bien qu’agissant sur des récepteurs ionotropiques différents. Dans les neurones GABAergiques, la transmission GABAergique peut être contrôlée par les enzymes de biosynthèse du GABA. Au contraire, peu de choses sont connues sur les mécanismes permettant un remplissage vésiculaire efficace de la glycine. Dans ces neurones le transporteur neuronal de glycine (GlyT2) pourrait jouer un rôle métabolique essentiel dans le maintien de la transmission glycinergique. L’objectif de cette thèse a été d’étudier le rôle de GlyT2 dans le remplissage des vésicules synaptiques en glycine par VIAAT dans des neurones spinaux en culture. L’ensemble des résultats obtenus indique une dépendance fonctionnelle entre le transport actif de glycine par GlyT2 dans les neurones et le remplissage des vésicules synaptiques par VIAAT et démontre le rôle primordial joué par GlyT2 dans la détermination du phénotype inhibiteur.

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Allain, Jean-Marc. "Instabilités des membranes lipidiques inhomogènes : implications biologiques." Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011333.

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Abstract:

Cette thèse est consacrée à l'étude analytique et numérique d'instabilités de forme de vésicules lipidiques à deux phases. Les vésicules sont un système modèle de choix pour étudier les propriétés mécaniques et physico-chimiques de la membrane cellulaire. Aussi, elles ont été largement étudiées depuis une trentaine d'années et, dans le cas d'une bicouche homogène, leurs propriétés sont désormais bien comprises. On sait maintenant réaliser des vésicules formées d'un mélange de lipides. Il peut alors se produire une séparation de phase conduisant à la formation de domaines de composition différente. Des structures similaires de très
petite taille, appelées 'rafts', existeraient dans les membranes cellulaires. Différentes expériences sur des vésicules multiphasiques montrent que cette inhomogénéïté latérale favorise des instabilités de forme. Nous avons modélisé trois instabilités différentes, observées expérimentalement, pour mieux comprendre comment les propriétés mécaniques des vésicules sont affectées par l'existence d'un domaine. Deux instabilités concernent des déformations hors du plan de la bicouche : la rupture d'un tube de membrane, provoquée par les contraintes mécaniques internes, et l'éjection d'un domaine d'une vésicule tendue, soit par l'absorption de molécules soit par un changement de pression osmotique. Enfin, nous avons modélisé une instabilité illustrant le comportement hydrodynamique de la bicouche, qui justifie le concept de viscosité associé à celle-ci tout en soulignant son caractère bidimensionnel.

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Payet, Laurie-Anne. "Effets des acides gras saturés sur la voie de sécrétion. Relation avec la mucoviscidose." Thesis, Poitiers, 2013. http://www.theses.fr/2013POIT2299/document.

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Abstract:

Les acides gras saturés (AGS) altèrent la fonctionnalité des organites dans de nombreux types cellulaires. Il a été proposé que ce processus, également nommé lipointoxication, puisse être responsable de plusieurs pathologies humaines telles que le diabète de Type 2.Au niveau cellulaire, l'accumulation d'AGS est associée à une augmentation du taux de saturation des phospholipides (PL) membranaires, les composants majoritaires des membranes des organites, mais également du taux de céramides, impliqués dans l'induction de l'apoptose.Dans une première partie de ce travail, nous avons étudié, chez le modèle cellulaire simple Saccharomyces cerevisiae, la contribution relative des PL saturés et des céramides à la cytotoxicité des AGS. Nous avons pu démontrer que les céramides agissaient à des étapes précoces de la voie de sécrétion, alors que les PL saturés impactaient des étapes plus tardives en altérant en particulier la formation de vésicules de sécrétion.Parallèlement, nous avons également constaté que le taux d'AGS était significativement augmenté dans les PL membranaires des patients atteints d'une maladie génétique, la mucoviscidose. La mutation la plus fréquente responsable de cette maladie, résulte en la rétention de la protéine correspondante dans le réticulum endoplasmique. Des molécules pharmacologiques, capables de corriger le trafic de la protéine à sa destination finale ont été isolées in vitro, mais des limitations importantes ont pu être observées lors des tests cliniques. Nous proposons dans le présent manuscrit que la lipointoxication liée aux AGS pourrait être un écueil important à l'utilisation des correcteurs actuels pour le traitement de la mucoviscidose
Saturated fatty acids (SFA) have been reported to alter organelle integrity in many cell types. This process, also known as lipotoxicity, has been proposed to be responsible for several human pathologies such as type 2 diabetes.At the cellular level, SFA accumulation is associated with an increase of the saturation rate of membrane phospholipids (PL), the major components of organelle membranes, and an increase of ceramides levels, implicated in apoptosis induction.In the first part of this work, we took advantage of a simple yeast-based model to study the relative contributions of saturated PL and ceramides to SFA cytotoxicity. We demonstrated that ceramides act early in the secretory pathway, while saturated PL impact the later steps, and particularly the formation of secretory vesicles.In parallel, we observed that SFA amounts were significantly increased in the membrane PL of cystic fibrosis (CF) patient cells. The most common mutation responsible for this genetic disease results in the retention of the corresponding protein in the endoplasmic reticulum. Pharmacological agents, which correct the mistrafficking of the protein, have been isolated in vitro, but they did not show significant improvements in clinical trials. We propose in the present manuscript, that SFA-related lipointoxication could be an important bottleneck for the use of these pharmacological agents in clinical trials

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Liu, Yi. "Calcium-related fungal genes implicated in arbuscular mycorrhiza." Phd thesis, Université de Bourgogne, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00985826.

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Abstract:

Fluctuations in intracellular (Ca2+) calcium levels generate signaling events and regulate different cellular processes. Whilst the implication of Ca2+ in plant cell responses during arbuscular mycorrhiza (AM) interactions is well documented, nothing is known about the regulation or role of this secondary meesenger in the fungal symbiont. The molecular basis of fungal calcium homeostasis in the AM symbiosis was analyzed by investigating the expression of Ca2+-related fungal genes. In a first study, G. mosseae genes putatively encoding a MAP3k-like protein kinase (Gm2) and a P-type ATPase (Gm152) were investigated. Both Ca2+-related genes were up-regulated by A. sinicum root exudates, suggesting a role in early interactions prior to symbiosis establishment. The full-length cDNA sequence of Gm152 obtained from germinating spores of G. mosseae confirmed its identity. The role of Ca2+ in fungal processes leading to establishment of an AM symbiosis was investigated in more detail in G. intraradices-M. truncatula interactions. Enhanced expression of genes encoding six membrane transport proteins and one nuclear protein kinase, selected from the G. intraradices transcriptome database, was related to colonization of wild-type M. truncatula (line J5) roots and not observed with the mycorrhiza-resistant mutant dmi3/Mtsym13. Laser microdissection mapping of transcripts indicated that the Ca2+-related G. intraradices genes were differentially up-regulated in arbuscules and/or in intercellular hyphae. The tempo-spatial variations in fungal gene expression suggest different roles in the development or functioning of the AM symbiosis. Full-length cDNA of three G. intraradices genes putatively encoding a PMR-like endoplasmic reticulum P-type ATPase, a VCX1-like vacuolar Ca2+ ion transporter and a nuclear CCaMK were obtained for functional analyses in yeast mutants to gain insight into their role in the mycorrhizal symbiosis. Possible mechanisms are discussed in which Ca2+-related proteins of G. intraradices may play a role in the mobilization and perception of the intracellular messenger by the AM fungus during symbiotic interactions with host roots

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Beillevaire, Déborah. "Rôle de l’autophagie dans la biogenèse des vésicules membranaires apoptotiques." Thèse, 2019. http://hdl.handle.net/1866/23509.

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Abstract:

L’ischémie/reperfusion (I/R) occurrente à toutes transplantations d’organe solide, constitue un stimulus pro-autophagique/pro-apoptotique pour les cellules endothéliales. Nous avons récemment démontré que les cellules endothéliales apoptotiques (CEapo) sécrètent des vésicules apoptotiques exosome like (ApoExo) qui induisent une réponse auto-immune et accélèrent le rejet vasculaire dans un modèle de greffe aortique chez la souris. Ces ApoExo qui diffèrent des corps apoptotiques classiques par leur structure et leur contenu protéique contiennent le fragment C-terminal du perlécan, LG3. Le LG3, un auto-antigène d’importance en transplantation, favorise le remodelage vasculaire et est augmenté en circulation chez les patients greffés rénaux atteints d’un rejet vasculaire. De plus, la présence d’anticorps anti-LG3 avant la transplantation est associée à un risque plus élevé de développer un rejet vasculaire chez des patients greffés du rein et à la perte du greffon à long terme. Il est connu que la génération du fragment LG3 implique la protéolyse du perlécan par la cathepsine L, une protéase lysosomiale, mais le mécanisme de transport de ce fragment au sein des ApoExo est encore inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité lysosomiale et l’autophagie jouent un rôle important dans la maturation et le chargement du LG3 dans les vésicules ApoExo sécrétées par les CEapo. Une étude longitudinale de microscopie électronique chez les cellules endothéliales humaines carencées en sérum pendant 1h, 2h et 3h, nous a révélé la présence du perlécan / fragment LG3 au sein de compartiments autophagiques (autophagosomes et autophagolysosomes) à différentes étapes du processus autophagique. Après 3 heures de carence en sérum, nous avons identifié le fragment LG3 dans des vésicules membranaires situées au sein de grands réseaux vacuolaires s’apparentant à des autophagolysosomes. L’inhibition de la cathepsine L, de l’acidification du lysosome et de l’autophagie diminuent la présence du fragment LG3 dans les vésicules ApoExo sans affecter la sécrétion de vésicules démontrant donc le rôle de l’autophagie dans l’intégration du fragment LG3 au sein des ApoExo. Toutefois, l’injection de vésicules ApoExo LG3-, provenant de cellules murines aortiques traitées à la bafilomycine, dans un modèle murin de greffe aortique induit une réponse auto-immune anti-LG3 ainsi qu’un remodelage vasculaire à des niveaux similaires aux souris ayant reçu des ApoExo véhicule. Une analyse protéomique de ces vésicules ApoExo LG3-, nous a révélé que la bafilomycine modifie le contenu protéique des ApoExo en induisant une augmentation de la présence de protéines lysosomiales et de la matrice extracellulaire dont le perlécan. Ceci suggère que la présence du motif LG3 au sein du perlécan natif non clivé dans les ApoExo LG3- pourrait être responsable de la mise en place de la réponse anti-LG3 observées chez les souris. Les travaux de ce doctorat ont permis de mettre en évidence que l’autophagie dans les cellules endothéliales productrices d’ApoExo ne régule pas l’immunogénicité des ApoExo. Cependant, elle régule au sein des cellules endothéliales apoptotiques le transport et le clivage du perlécan qui lui est immunogène. En effet, l’autophagie module les différentes formes de perlécan natif et clivé sécrétées dans les ApoExo. L’étude chez la souris greffée nous a donc permis de considérer non plus l’implication du fragment LG3 mais l’implication du motif LG3 présent au sein du perlécan natif non clivé et de ses différentes formes intermédiaires dans la réponse auto-immune anti-LG3 et le rejet vasculaire. La modulation de la sécrétion du perlécan et du LG3 dans les ApoExo constitue une cible thérapeutique potentielle afin de diminuer la réponse auto-immune pouvant augmenter le dommage vasculaire après la greffe
Ischemia/reperfusion (I/R) occurring in all solid organ transplantation, constitute a proautophagic / pro-apoptotic stimulus on endothelial cells. We recently demonstrated that apoptotic endothelial cells (CEapo) secrete apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) that induce autoimmune response and accelerate vascular rejection in a mouse aortic transplant model. These ApoExo, that differ from classical apoptotic bodies in structure and protein content, contain the C-terminal fragment of perlecan, LG3. LG3, an autoantigen of importance in transplantation, promotes vascular remodeling and is increased in circulation in renal transplant patients undergoing vascular rejection. In addition, the presence of anti-LG3 antibodies prior to transplantation is associated with a higher risk of developing vascular rejection in kidney transplant patients and long-term graft loss. It is known that the generation of LG3 fragment involves the proteolysis of perlecan by cathepsin-L, a lysosomal protease, but the mechanism of export of this fragment within ApoExo is still unknown. We hypothesized that lysosomal activity and autophagy play an important role in the maturation and the secretion of LG3 in ApoExo vesicles secreted by CEapo. Longitudinal electron microscopy study after 1h, 2h and 3h in serum starved endothelial human cells revealed the presence of perlecan / LG3 fragment within autophagic compartments (autophagosomes and autophagolysosomes) at different stages of the autophagic process. After 3 hours of serum starvation, we identified LG3 fragment in membrane vesicles located within large vacuolar networks reminiscent of autophagolysosomes. Inhibition of cathepsin-L, of lysosomal acidification and of autophagy decrease the presence of LG3 fragment in ApoExo vesicles without affecting vesicle secretion thus demonstrating the role of autophagy in the secretion of LG3 fragment within ApoExo. However, Injection of ApoExo LG3- vesicles from bafilomycin-treated aortic murine cells into a murine aortic transplant model induces autoimmune anti-LG3 response and vascular remodeling at levels similar to the ApoExo vehicle mice control group. Proteomic analysis of ApoExo from bafilomycin-treated aortic murine cells has demonstrated that bafilomycin modifies ApoExo protein content by inducing an increase of the presence of lysosomal proteins and the extracellular matrix, including perlecan. This suggests that the presence of LG3 motif in uncleaved native perlecan in ApoExo LG3- could be responsible for the establishment of the anti-LG3 response as well as the vascular remodeling observed in mice. Collectively, these results demonstrate that autophagy in endothelial cells producing ApoExo does not regulate the immuogenicity of ApoExo. However, it regulates within apoptotic endothelial cells the processing and cleavage of perlecan who is immunogenic. Indeed, autophagy modulates the different forms of native and cleaved perlecan secreted in ApoExo. Grafted mice study thus allowed us to consider neither the involvement of the LG3 fragment but the implication of the LG3 motif present in the uncleaved native perlecan and its intermediate forms in the anti-LG3 autoimmune response and vascular rejection. Modulating perlecan and LG3 secretion in ApoExo vesicles is a potential therapeutic target to reduce the autoimmune response that can increase vascular damage after transplantation.

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Schmidt, Maxime. "Développement d’une méthode de production de vésicules membranaires permettant l’étude du mode d’action des toxines insecticides de Bacillus thuringiensis." Thèse, 2016. http://hdl.handle.net/1866/19119.

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Abstract:

La plupart des toxines de Bacillus thuringiensis perméabilisent la membrane intestinale des insectes sensibles en formant des pores qui abolissent le potentiel électrique et les gradients ioniques. Plusieurs toxines ont été étudiées avec des vésicules purifiées de la bordure en brosse intestinale des insectes. Malheureusement, la membrane intestinale de beaucoup d’insectes ne forme pas des vésicules suffisamment étanches pour les expériences de perméabilisation. Une nouvelle technique utilisant des liposomes géants et une sonde de perméabilité membranaire a été développée pour caractériser deux nouvelles toxines particulièrement prometteuses pour le biocontrôle d’un des principaux ravageurs du maïs, la chrysomèle des racines du maïs (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 et la toxine binaire DS10/DS11. Les deux toxines perméabilisent efficacement les liposomes. La toxine binaire forme des pores qui sont légèrement sélectifs pour les cations, comme la plupart des toxines de B. thuringiensis. Bien que la Cry6Aa1 puisse former des pores sélectifs pour les anions, les résultats suggèrent aussi qu’elle pourrait, contrairement aux autres toxines de cette bactérie, ne former des pores qu’en présence d’une force ionique élevée. La formation des pores par ces deux toxines semble être sensible à la courbure de la membrane cible étant donné qu’elle est beaucoup plus efficace dans des liposomes géants que dans des liposomes de même composition, mais plus petits. Ce travail jette les bases de la mise au point d’une technique qui permettrait l’étude des toxines dans des liposomes géants enrichis avec des protéines et des lipides provenant de la membrane intestinale des insectes cibles.
Most Bacillus thuringiensis toxins permeabilize the intestinal membrane of susceptible insects by forming pores that abolish transmembrane electrical potentials and ionic gradients. Several toxins have been studied using brush border membrane vesicles purified from the insect midgut. Unfortunately, the intestinal membrane from many insects does not form vesicles that are tight enough to be used in permeabilisation experiments. A new technique using giant liposomes and a membrane permeability probe was developed to evaluate the pore-forming ability of two particularly promising toxins for the biocontrol of a major corn pest, the Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 and the binary toxin DS10/DS11. Both toxins permeabilized the liposomes efficiently. However, analysis of the permeabilisation rates under different experimental conditions indicates that these toxins differ in their biophysical properties. The binary toxin forms pores which are slightly selective for cations, like most B. thuringiensis toxins. On the other hand, although the results suggest that Cry6Aa1 could form anion-selective pores, they could also indicate that, in contrast with other toxins produced by this bacterium, it could form pores only under high ionic strength conditions. Pore formation by both toxins appears to be sensitive to membrane curvature since it is much more efficient in giant liposomes than in liposomes with identical composition, but smaller in size. This study sets the bases for the development of a technique that would allow the toxins to be studied in giant liposomes enriched with proteins and lipids from the intestinal membrane of target insects.

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Kirouac, Martin. "Effets des toxines insecticides du Bacille de Thuringe sur la perméabilité des vésicules de membrane à bordure en brosse intestinale du sphinx du tabac." Thesis, 2006. http://hdl.handle.net/1866/17385.

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Ruffiot, Pauline. "Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii :Interactions des protéines de granules denses (protéines GRA) avec des vésicules unilamellaires." Phd thesis, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00177965.

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Abstract:

Les protéines GRA sont sécrétées par le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii dans la vacuole parasitophore, où elles interagissent pour la plupart avec deux systèmes de membranes tubulaires : les tubules séquestrant des organites de l'hôte (HOSTs) et le réseau de nanotubes membranaires (RNM). Bien que la plupart des protéines GRA contiennent des domaines transmembranaires potentiels, elles sont sécrétées sous des formes solubles et ne s'associent à des membranes qu'une fois qu'elles ont atteint leurs membranes-cibles dans la vacuole. Cette propriété inhabituelle nous a amenés à les considérer comme des modèles intéressants pour l'étude d'interactions protéinemembrane. J'ai développé deux approches expérimentales pour étudier les interactions des protéines GRA, extraites du parasite ou de la vacuole, avec des membranes-modèles. Premièrement, des approches biochimiques m'ont amenée à caractériser les formes de solubilisation des protéines GRA et leur association avec les membranes des petites vésicules unilamellaires (SUVs). Deuxièmement, j'ai développé une approche par spectroscopie de fluorescence, de protéines GRA associées aux membranes de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Les résultats fournissent des éléments de réponse qui (1) aident à décrypter le trafic des protéines dans le parasite et dans la vacuole et (2) ouvrent la voie pour la mise en place d'un système in vitro pour l'étude de la maturation de la vacuole parasitophore et de ses membranes tubulaires internes.

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Aouameur, Rym. "Caractérisation du co-transporteur Na+/myo-inositol SMIT2 dans les membranes en bordure en brosse de rein de lapin et d’intestin de rat." Thèse, 2009. http://hdl.handle.net/1866/2846.

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Abstract:

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.
Myo-inositol (MI) is an organic solute involved in various aspects of cell physiology, including cell signaling. It is also known as a compatible osmolyte. Three secondary active MI cotransporters have been identified; two are Na+- coupled (SMIT1 and SMIT2) and one is H+-coupled (HMIT). The main aim of this study was to characterize MI uptake throught SMIT2 as expressed in epithelial cells and in Xenopus laevis oocytes. In order to achieve the characterization of this transport system, we used purified brush border membrane vesicles (BBMv) isolated from rabbit kidney and rat intestine. We first performed a quantification of mRNA levels in rabbit kidney using real time PCR for both SMIT1 and SMIT2. We found that SMIT1 is mainly expressed in the renal medulla while SMIT2 is mainly localized in the renal cortex. This result was confirmed on Western blots using an antibody raised against SMIT2. Through inhibition studies using selective substrates for SMIT1 (inhibited by L-fucose) and SMIT2 (inhibited by D-chiroinositol), we showed that SMIT2 seems to be responsible for all the apical transport of MI into the proximal convoluted tubule with a Km of 57 ± 14 µM. By transport studies we established that rabbit intestine seems to lack apical transport of MI while rat intestine has a very active uptake of this molecule. qRT-PCR quantification confirmed the absence of MI transporters in rabbit intestine. As for kidney, SMIT2 seems to be the only transporter responsible for apical MI uptake in enterocytes with a Km of 150 ± 40 µM. Functional analysis of rat SMIT2 activity, via electrophysiological studies in Xenopus oocytes, demonstrated similarities to the activities of SMIT2 from rat intestine and rabbit kidney. SMIT2 displays high affinities for MI (270 ± 19 µM), DCI (310 ± 60 µM) and no affinity for L-fucose. SMIT2 is very sensitive to phlorizin (Pz; 16 ± 7 µM). Although these functional characteristics essentially confirmed those found in rat intestine, a iv discrepancy exists between the two systems studied. Indeed, the affinity constant for glucose was approximately 40-fold lower in vesicles than in oocytes. We also tested the ability of SGLT1 and GLUT5, other sugar transport systems present in enterocytes apical membranes, to perform MI uptake. Because the inhibition of these transporters did not alter radiolabeled MI uptake, we concluded that they had no significant contribution to MI transport in rat intestine. Finally, the basolateral efflux of MI was not mediated by GLUT2 because when expressed in oocytes, this transporter was not able to transport MI.

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Dissertations / Theses on the topic 'Vésicule membranaire'

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