Dissertations / Theses on the topic 'Ultrastrutturale'

Psoriasis has recently been defined as “a T-cell mediated inflammatory skin disease with T helper cell type 1 (Th1), type 17 (Th17) and IL-22-producing CD4+ T cells as principal mediators”. The interplay between pro-inflammatory cytokines such as Tumour Necrosis Factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-17 and IL-22 and the two main epidermal cytotypes, i.e. keratinocytes and Langerhans cells, is a central issue in the pathogenesis of psoriasis. The aim of our study was to evaluate the early, direct, and specific effect of TNF-alpha, IL-17 and IL-22 alone or in combination by immunofluorescence on keratinocyte proliferation, keratin (K) 10, 14 and 17 expression, the molecular composition of intercellular junctions (desmocollin 1, E-cadherin, occludin and filaggrin), number of epidermal Langerhans cells. Transmission electron microscopy (TEM) was used to analyse the fine structure of the skin. An innovative model of human skin culture standardized in our laboratory, in which a psoriatic microenvironment was reproduced, was used. Skin explants were obtained from plastic surgery of healthy 20-40 year-old women (n = 7) after informed consent. Bioptic fragments were divided before adding TNF-alpha or IL-17 or IL-22 or a combination of the three cytokines (Triple), and harvested 24, 48, and 72 hours after cytokine incubation. Interestingly, keratinocyte proliferation was inhibited after exposure to TNF-alpha, IL-17 and the combination of cytokines while this parameter was not affected by IL-22 incubation. In all experimental groups, starting from 24 hours, occludin immunostaining was not homogeneously distributed. K10 immunostaining gradually decreased in scattered clusters in the spinous layer only after exposure to IL-22 or to a combination of the three cytokines. K14 staining became widely discontinuous with both IL-22 and the triple, starting from 48 hours. K17 expression was induced and progressively increased with time in the suprabasal layers of epidermis in all experimental groups, except TNF-alpha group. No differences were found in the expression of desmocollin 1 and the distribution of E-cadherin, at any time point. By immunofluorescence analysis with anti-human Langerin antibody we calculated the percentage of Langerhans cells/mm2 of living epidermis after 24 and 48 hours of incubation (considering control as 100%). At 24 hours Langerhans cells number was significantly higher in samples treated with a combination of IL-17 and TNF-alpha (216.71 + 15.10%; p < 0.001) and in TNF-alpha (125.74 + 26.24%; p < 0.05). No differences were observed in IL-17- treated samples (100.14 + 38.42%). After 48 hours, the number of epidermal Langerin-positive cells in IL-17- and TNF-alpha treated samples slightly decreased (94.99 + 36.79 % and 101.37 + 23% vs. their controls, respectively). With the combination of IL-17 and TNF-alpha epidermal Langerhans cells strongly decreased (120 +13.36%). At ultrastructural level, after IL-22 incubation we observed keratin aggregates in the perinuclear cytoplasm of cells, while the combination of the three cytokines induced an enlargement of intercellular spaces. By TEM, upon TNF-alpha stimulus, Langerhans cells appeared with few organelles, mostly mitochondria, lysosomes, and scattered peripherical Birbeck granules. Upon IL-17 stimulus, Langerhans cells showed a cytoplasm with many mitochondria and numerous Birbeck granules close to the perinuclear space and Golgi apparatus, but also at the periphery, at the beginning of the dendrites. The addition of a combination of IL-17 and TNF-alpha did not affect Langerhans cells ultrastructure. Altogether, our results support the hypothesis that a synergistic effect exists among the pro-inflammatory cytokines of psoriasis and that they interplay with each other in the microenvironment of the psoriatic plaque, with consequent amplification of the effect of each cytokine.

Le Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE) o Malattie da Prioni, costituiscono un gruppo di malattie neurodegenerative fatali, ad eziologia sporadica, genetica o infettiva che colpiscono l’uomo e diverse specie animali. Il meccanismo patogenetico responsabile delle TSE consiste nella conversione conformazionale della normale proteina prionica cellulare (PrPC), con una struttura prevalentemente ad α-elica, in una forma aberrante, ricca in β-sheet, parzialmente insolubile in detergenti non ionici e resistente alla digestione con proteasi, denominata PrPSc, che rappresenta il marcatore diagnostico di queste malattie. Nei bovini, sono due le forme di TSE conosciute: l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE) e l’encefalopatia spongiforme amiloidotica bovina (BASE). Della prima sono ampiamente note sia la manifestazione fenotipica sia la caratterizzazione biochimica del ceppo proteico grazie al fiorire di studi in seguito all’epidemia che a partire dal 1985 ha colpito molti allevamenti bovini della Gran Bretagna. Della seconda, invece, non esiste ancora una completa caratterizzazione a causa della sua recente identificazione. Infatti solo nei primi anni del 2000 sono state riconosciute due nuove forme atipiche di BSE, chiamate high type (BSE-H) and low type (BSE-L) in base alla differente migrazione elettroforetica dell’isoforma non glicosilata della PrPSc bovina. Anche la BASE è stata definita una forma atipica di BSE per le notevoli differenze molecolari e neuropatologiche presentate dalla proteina prionica. Infatti la PrPSc associata alla BASE è risultata paragonabile a quella della BSE-L, per il peso e il profilo di glicosilazione delle isoforme, e distinguibile dalla BSE per la presenza di depositi ricchi di amiloide, chiamati placche kuru, a livello cerebrale. E’ stata così suggerita l’ipotesi dell’esistenza di un ceppo di prione della BASE diverso rispetto a quello della BSE, ma uguale a quello della BSE-L. Anche recenti studi di trasmissione in topi PrP-bovinizzati hanno contribuito a confermare tali dati, dimostrando come la BASE sia una patologia più aggressiva e più facilmente trasmissibile della BSE. Mancando sia le conferme a queste preliminari sperimentazioni sia l’identificazione del fenotipo clinico-patologico associato alla BASE, abbiamo progettato uno studio di trasmissione intraspecie di ceppi di BSE e BASE in bovini di razza Frisona e Bruna Alpina. Utilizzando la stessa specie di quella che ha contratto in origine l’infezione, si sono raggiunti due obiettivi: ridurre il periodo di incubazione, evitando il fenomeno dell’adattamento e tutti i processi atti a superare la barriera di specie, e delineare il quadro fenotipico della BASE. Gli animali inoculati con BASE hanno manifestato un comportamento affine alla depressione diverso da quello più irrequieto degli animali infettati con BSE, associato ad una progressiva amiotrofia. Inoltre i bovini hanno presentato profili molecolari e neuropatologici affini alle caratteristiche del donatore, confermando la diversità dei due strains proteici. Lo studio si è avvalso anche di un’analisi ultrastrutturale, che, oltre a confermare la diversità del pattern di deposizione della PrPSc nelle due forme di TSE, ha rilevato significative differenze nella localizzazione subcellulare della proteina prionica. Questa sperimentazione ha permesso di valutare tutti gli aspetti clinici, biochimici, istologici, immunoistochimici e ultrastrutturali associati alla PrPSc ed ottenere quindi una completa caratterizzazione della BASE, confermando i dati già presenti in letteratura sulla diversità del ceppo proteico rispetto quello della BSE e riproducendo per la prima volta la manifestazione fenotipica.
Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE) or Prion diseases are a group of rare, fatal and transmissible neurodegenerative disorders that affect both humans and animals. Clinically these diseases exist in sporadic, genetic and acquired forms, and present with a variety of neurological signs. TSE diseases are characterized by accumulation, primarily in the brain, of an abnormal isoform of the normal host-encoded prion protein (PrPC), named PrPSc that is considered the disease-associated agent. The central event of the TSE is a post-translational conformational change of the PrPC, a plasma membrane glycoprotein, rich in α-helix, into the PrPSc that has a higher β-sheet content. In bovine there are two forms of TSE: Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) and Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy (BASE). After the epidemy in cattle in UK in 1985, many researches characterized the phenotype and the biochemistry of PrPSc in BSE. Recently new atypical forms of BSE are discovered and called BSE-H (higher) and BSE-L (lower) for the different molecular mass of unglycosilated isoform of PrPSc. Also BASE is classified as atypical BSE with a prion protein similar to BSE-L and it is distinguishable from BSE for differences in pattern of deposition, consistent in the presence of amyloid plaques, in distinct molecular masses and in glycosilation profile of prion isoforms. These observations suggest that cattle may have two distinct prion strains, refered to two forms of TSE and that prion protein of BASE could be the same of BSE-L. Also recent studies on PrP-bovinized transgenic mice have showed that BASE is a more aggressive disease than BSE, characterized by shorter period of incubation. To investigate the characteristics of prion strains responsible of BSE and BASE, we carried out transmission by inoculation of BSE and BASE isolates in Fresian and Alpine brown cattle. Intraspecies transmission permitted firstly to reduce the period of incubation, overcoming the species barrier, and secondly to identify the phenotype of BASE. BASE inoculated cattle showed a progressive muscle atrophy and a dull behaviour, in contrast with aggressiveness and hypersensitivity of BSE-infected animals. The prion strains of inoculi preserved their different biochemical and neuropathological properties also after transmission. Finally, a more detailed ultrastructural analysis confirmed the distinction in patterns of PrPSc deposition and it showed different subcellular localization of prion protein between BSE and BASE infected bovine. By evaluation of biochemical, immunoistochemical and ultrastructural results, our study gave an improvement in the characterization of BASE prion strain, describing the clinical phenotype.

Il surfattante polmonare è una miscela di fosfolipidi e proteine strutturali sintetizzati dagli pneumociti di tipo II. Riveste come una sottile pellicola la parete interna degli alveoli e svolge il ruolo fondamentale di ridurre la tensione superficiale all’interfaccia aria-liquido, prevenendo così il collasso alveolare nella fase di espirazione del ciclo respiratorio. Il deficit di surfattante rappresenta la maggiore causa di sindrome da di stress respiratorio (RDS) nei neonati. In molti casi la RDS è transitoria ed è legata all’immaturità del polmone, invece un’insufficienza respiratoria progressiva in neonati a termine e vicini al termine, potrebbe essere causata da difetti nei geni delle proteine correlate al surfattante. In particolare due proteine svolgono un ruolo critico per le proprietà tensioattive del surfattante, le proteine del surfattante B (SP-B), e C (SP-C), che rappresentano circa il 4% del surfattante e sono codificate rispettivamente dai geni SFTPB e SFTPC. Mutazioni sui geni codificanti per queste proteine sono la causa di insufficienza respiratoria neonatale acuta e interstiziopatia polmonare nel lattante e nel bambino. Recentemente, mutazioni sul gene “ATP binding cassette A3” (ABCA3) che codifica una proteina trasportatrice di fosfolipidi espressa specificatamente negli pneumociti di tipo II, sono state associate anch’esse a sindrome di distress respiratorio letale e polmonite interstiziale infantile idiopatica nel neonato a termine e nel bambino. Obiettivo di questo lavoro è l’identificazione di alterazioni genetiche associate a deficit del surfattante nei neonati e lattanti affetti da malattie respiratorie progressive ed inspiegate, e lo studio dei meccanismi molecolari ad esse correlati. Un gruppo di 15 pazienti con tale quadro clinico è stato sottoposto allo studio genetico per i geni correlati al surfattante e, per quei pazienti per i quali era disponibile la biopsia polmonare, ad analisi istopatologica e ultrastrutturale del polmone. I difetti genici dell’ABCA3 sono apparsi in questo studio come la causa principale di malattia parenchimale polmonare inspiegata nei neonati e lattanti. Dai risultati ottenuti si deduce l’importanza della combinazione dello studio genetico con l’analisi ultrastrutturale per eseguire la diagnosi completa di queste malattie rare e ancora in gran parte sconosciute.
Pulmonary surfactant is a mixture of phospholipids and structural proteins synthetized by type II pneumocytes. It spreads as a thin layer on the alveolar wall and plays the fundamental role of lowering surface tension at the air-liquid interface, thus preventing alveolar collapse in the expiratory phase of the respiratory cycle. Surfactant deficiency is the leading cause of the respiratory distress syndrome in newborns. Whereas most cases are transient and related to lung immaturity, progressive lung disease in term and near-term infants may be caused by surfactant-related gene defects. Two proteins play a critical role for the surface tension properties: the structural surfactant proteins B (SpB) and C (SpC), that represent about 4% of surfactant and are encoded respectively by the STPFB and STPFC genes. Mutations in these genes may lead to both acute respiratory failure and chronic interstitial lung disease in newborn and infants. Recently, mutations of the ATP binding cassette A3 gene (ABCA3), that encodes a phospholipid carrier protein specifically expressed in type II pneumocytes, have been associated as well with lethal neonatal respiratory distress syndrome and chronic interstitial lung disease. The aim of this study is the identification of genetic changes connected with surfactant deficiency in newborns and infants with progressive and unexplained respiratory lung disease, and the study of related molecular mechanism. 15 patients with this clinical presentation underwent genetic analysis for surfactant-correlated genes and, when pulmonary biopsy was available, lung histopatological and ultrastructural analysis was performed. The genetic defects of ABCA3 appear to be, in this study, the first cause of unexplained parenchimal lung disease in newborns and infants. These results underline the importance of combined genetic studies and ultrastructural analysis, in order to perform the complete diagnosis of these rare disease still largely unknown.

Musca domestica Linnaeus, 1758, a relevant synanthropous pest, is the most frequent dipteran species in animal farms and waste landfills. Fly infestations cause heavy economic losses and often lawsuits against cattle or poultry farms near residential areas. For control of pest arthropods, including M. domestica, since 1940 neurotoxic adulticides with very low selectivity and high environmental impact were employed regardless of their toxicity to vertebrates, bioaccumulation and development of resistance. A more recent insecticide class, the Insect Growth Regulators (IGR), has species-specific toxicity and low health and environmental impact. The IGR activity is mostly exerted on larval stages but some of them also induce sterility in adults. The aim of this doctoral thesis is to investigate on a sensitive strain of M. domestica the effects of diofenolan, an IGR analogue of juvenile hormone, unregistered for control of this species in Italy. The toxicity of diofenolan on immature stages was evaluated by topical treatments on 3rd instar larvae at different concentrations, verifying the main toxicological parameters and monitoring morphological effects of the active ingredient by optical and scanning electron (SEM) microscopy. The effects of diofenolan were also investigated on female reproductive ability (egg laying and hatching) by suitable tests along the gonotrophic cycles, monitoring ovarian and ovariole alterations by optical and transmission electron (TEM) microscopy. The interactions between diofenolan and ecdysteroids, produced by ovariole follicle cells in adult females and involved in the ovarian cycle, were also investigated by enzymatic immunoassay (EIA). The interactions between diofenolan and the activity of corpora allata, endocrine gland producing juvenile hormone required for ovarian development, were also tested by morphological and ultrastructural investigations. The results showed a dose-dependent toxicity of diofenolan against M. domestica, mainly affecting pupae by inducing larviform puparia and apparently normal ones with altered respiratory plates, together with puparium-trapped adults. Tests on reproductive ability according to the gonotrophic cycle showed that treated females were able to lay eggs only in the first cycle and that hatching ability reduced to 24% along the gonotrophic cycles. In the second gonotrophic cycle the reproductive ability was 1/6 of the initial one and in the third cycle lowered to 1/16 of the initial one. The results show that diofenolan is very efficient in affecting the reproductive ability (egg laying and hatching) in M. domestica. The morphological investigations on ovarioles at different time intervals since emerging from puparium showed nine morphotypes which could be arranged into three “transformation paths”: a “precocious degenerative” path involving the primary follicle and associated to secondary follicle hypertrophy, an “intermediate degenerative” path involving the secondary follicle, and a “degenerative/hypertrophic” path in which the secondary follicle may degenerate or increase its size by hypertrophy. The most frequent path is the “intermediate degenerative” one and these data agree with the previous ones obtained on M. domestica reproductive ability. The ecdysteroid content measured by EIA in M. domestica females treated at different time intervals shows a modified profile in comparison to controls, closely related to the degenerative events detected in ovariole follicles. In adult insects corpora allata are known to exhibit periodical activation/inactivation phases related to the ovarian cycle. The effects of diofenolan on corpora allata, investigated and confirmed for the first time at the ultrastructural level in M. domestica adults, together with original data on cell number and volume of the gland, show in treated females widespread alterations of nucleus, cytoplasm and mitochondria which strongly suggest that the gland undergoes a rapid transition from an inactive stage to a degenerative one. This study also shows the presence within the gland of light and dark cells, never previously identified in morphological and ultrastructural investigations of corpora allata in M. domestica. In conclusion, the main effects of the juvenile hormone analogue diofenolan in this species include inhibition of emerging from puparium and abatement of the reproductive ability in terms of egg laying and hatching, probably related to anomalous ecdysteroid profiles and marked alterations in corpora allata. Further investigations may involve the effects of diofenolan on other stages of the biological cycle and on male reproductive ability. The biocide and sterilizing effects of diofenolan in M. domestica are very interesting for integrated pest management programs since the multiple activity of this active ingredient may significantly reduce the need for adulticides with higher environmental and health impact. It is therefore recommended to extend studies on this IGR in M. domestica by appropriate field trials.

Il verme di fuoco Hermodice carunculata è un polichete anfinomide urticante diffuso nell’Oceano Atlantico orientale e nel Mediterraneo centrale e meridionale. Sebbene H. carunculata sia una specie termofila in aumento lungo le coste italiane, le informazioni disponibili su abitudini alimentari, ruolo ecologico e potenziali impatti sulle comunità bentoniche rocciose sono molto limitate. I principali obiettivi delle mie ricerche di Dottorato hanno riguardato lo studio della sinecologia, biogeografia ed ecologia chimica dei vermi di fuoco. Sono stati svolti esperimenti di predazione in laboratorio per investigare le interazioni tra esemplari mediterranei di H. carunculata ed altri invertebrati marini sessili o sedentari. I vermi di fuoco si sono rivelati predatori generalisti efficienti. Le loro capacità potrebbero essere dovute ad una combinazione di “armi” (dimensioni cospicue, chete urticanti e faringe estroflettibile succhiante), che sembrano uniche tra gli anellidi marini, e permetterebbero ad H. carunculata di far fronte a cambiamenti nella composizione delle comunità di prede e pressioni selettive dovute ai cambiamenti climatici in atto. Per valutare i migliori parametri morfometrici atti a stimare la taglia individuale dei vermi di fuoco, sono state analizzate variabili allometriche di popolazioni del sud Italia. Le analisi della regressione hanno suggerito l’esistenza di relazioni significative tra tratti allometrici, un dato chiave per studi futuri sulle dinamiche di popolazione. Inoltre, analisi di demografia storica su marcatori molecolari hanno confermato un recente evento di espansione in Puglia, incentivando ulteriori studi sulle popolazioni attuali di H. carunculata. Le informazioni esistenti sulla presenza dei vermi di fuoco sono state raccolte per capire i cambiamenti spazio-temporali avvenuti finora lungo le coste italiane. L’integrazione di diverse fonti ha permesso di ricostruire gli shifts verificatisi negli ultimi 50 anni, coerenti con il trend di aumento delle temperature superficiali del Mediterraneo. Questi risultati forniscono importanti conoscenze sull’espansione di H. carunculata, supportando una futura diffusione verso il Mediterraneo settentrionale ed occidentale. Gli anfinomidi sono famosi per le loro chete dorsali urticanti (notochete), ma non è ancora chiaro se la causa dell’irritazione sia meccanica o chimica. Inoltre, la composizione delle chete non è stata studiata finora e forti dibattiti sono in corso sulla loro struttura interna. La composizione chimica e mineralogica, l’ultrastruttura e la struttura esterna delle chete di H. carunculata sono state esaminate. Al SEM, le notochete risultano cave e potrebbero veicolare tossine. Per determinare la presenza e localizzazione di sostanze deterrenti, sono state testate diverse parti del corpo di H. carunculata coinvolte in interazioni inter-specifiche. Mediante feeding bioassays, sono state valutate palatabilità verso un consumatore generalista ed azione deterrente al contatto con prede dei vermi di fuoco. I risultati hanno evidenziato che solo le notochete sono deterrenti. Ad oggi, l’unica sostanza infiammatoria isolata da un anfinomide è la “complanina”, un composto trimetil-ammonio. Analisi LC-MS/MS ad alta risoluzione ed NMR hanno suggerito la presenza di composti correlati alla complanina in tutti i distretti corporei dei vermi di fuoco ed in misura molto minore in altri policheti, mentre sembrano assenti in cnidari, molluschi, echinodermi e tunicati. Alla base dell’irritazione provocata dai vermi di fuoco vi è una sinergia tra danno meccanico e rilascio di un veleno. Questa peculiarità supporterebbe il successo dei vermi di fuoco negli ambienti bentonici marini, migliorando notevolmente le conoscenze sull’ecologia chimica degli anfinomidi.
The bearded fireworm Hermodice carunculata is an amphinomid stinging polychaete widespread in the Eastern Atlantic Ocean, and in the Central and Southern Mediterranean Sea. Whereas H. carunculata is a thermophilic species increasing in abundance along the Italian peninsula, very little information is available on its feeding habits, ecological functions and potential impacts on rocky benthic communities. The main goals of my PhD research activity were the investigation of fireworm sinecology, biogeography and chemical ecology. Laboratory feeding experiments were performed to investigate interactions between Mediterranean H. carunculata and species of sessile or sedentary marine invertebrates. Fireworms proved to be voracious generalist predators. Their predatory ability may be due to a combination of several 'weapons' (large size, motility, stinging chaetae and eversible, sucking pharynx), which seems unique among marine worms and could enable H. carunculata to persist also after radical changes in prey community composition and withstand selective pressures associated to ongoing environmental changes. Populations from South Italy were analyzed using allometric variables to assess the best morphometric parameters to estimate individual size. Regression analyses suggested the existence of significant relationships among allometric traits, a key information for future studies on fireworm population dynamics. Besides, demographic history analysis on molecular markers confirmed a recent expansion event in Apulia, as a crucial step forward in the study of present-day H. carunculata populations. An exhaustive collection of existing information on fireworm presence was examined to investigate the spatiotemporal changes that have occurred in H. carunculata abundances and distribution along the Italian coasts so far. The integration of different data sources allowed the reconstruction of the shifts that have happened over the last 50 years, which are coherent with the consistent warming trend of Mediterranean Sea surface temperatures. These findings provide unique insights into the expansion of H. carunculata, supporting future spreading throughout the Northern and Western Mediterranean. Amphinomid fireworms are notorious for their stinging dorsal bristles (notochaetae), but if the cause of the irritation is merely mechanical or chemical is still unclear. Besides, chaetae composition has not been investigated to date and strong debates are ongoing on their internal structure. The chemical and mineralogical composition, the ultrastructure and the external structure of H. carunculata chaetae were examined for the first time. SEM micrographs showed that the notochaetae are hollow and may be able to vehicle toxins. To determine whether and where chemical or structural deterrents were present, different H. carunculata body parts involved in inter-specific interactions were tested. Feeding bioassays were performed to assess palatability against generalist consumers and deterrent action on contact with fireworm prey. The results highlighted that only the notochaetae display deterrent activity. To date, the only acute inflammation inducer isolated from an amphinomid is “complanine”, a trimethylammonium compound. High-resolution LC-MS/MS and NMR analyses suggested the presence of complanine-related compounds in all fireworm body parts and in other polychaetes, but in a far lesser extent, while they seem absent in cnidarians, mollusks, echinoderms and tunicates. The urticating system of fireworms is triggered by a synergy between mechanical injury and venom release. This unique feature could support the success of fireworms in marine benthic environments and significantly improves knowledge on the chemical ecology of amphinomids.

2006/2007
RIASSUNTO Il recente Codice dell’Ambiente (D.lgs 152/2006) prevede il raggiungimento di ‘standard’ di qualità dei corpi idrici con particolare riferimento ai metalli pesanti (sostanze pericolose prioritarie, PP). Il passato piano di monitoraggio (2001-2004) del Ministero dell’Ambiente ha messo in luce il frequente superamento dei limiti di legge nelle stazioni del Golfo di Trieste. I metodi chimico/fisici utilizzati per determinare le concentrazioni di metalli in acqua o nei sedimenti non sono in grado di determinare l’effettiva biodisponibilità degli elementi, da cui dipende la reale tossicità, né un preciso rapporto causa/effetto. Tuttavia, è risaputo che anche basse concentrazioni possono innescare fenomeni di bioaccumulo e di biomagnificazione, alterando gli equilibri naturali soprattutto negli ambienti marini costieri. Tali processi interessano principalmente la componente macroalgale, molto importante dal punto di vista ecologico ed economico in quanto è alla base della catena trofica. Lo studio dell’impatto delle sostanze tossiche su questa matrice risulta, perciò, fondamentale per preservare da una parte la biodiversità degli ecosistemi dall’altra proporre sistemi alternativi/innovativi per il mantenimento della capacità auto-depurativa. Per le alghe e per le Cianoficee, in particolare, è stata dimostrata un’elevata capacità di difesa contro la tossicità di diversi metalli attraverso vari e complessi meccanismi, le cui modalità sono abbastanza conosciute. E’ oggi noto che le risposte difensive possono dipendere dalla natura del metallo, dalle dosi e dai tempi di esposizione, dai differenti stadi di crescita, e, non ultimo, dalla diversa ‘sensibilità’ delle alghe. Tuttavia, negli studi in campo ed in laboratorio, i diversi approcci sperimentali rendono la comparazione, sia nell’ambito della stessa specie che tra specie diverse, estremamente difficile e possono portare alla determinazione di dosi subletali (LC50) molto diverse. Da qui la necessità di un protocollo unificato che, a differenza delle micro-alghe, non è ancora standardizzato per le macro-alghe. Tale mancanza ha comportato, infatti, risultati molto diversi senza discriminazione delle risposte adattative da quelle difensive. Inoltre, raramente vengono analizzati l’eventuale ripristino della funzionalità cellulare durante il recupero in assenza del metallo ed i possibili effetti a livello ultrastrutturale. Scopo, percorso del progetto e metodi utilizzati Il progetto si basa principalmente sull’approfondimento delle conoscenze dei meccanismi di adattamento/tolleranza/difesa contro il Cadmio di micro- e macro-alghe marine a livello fisiologico, biochimico ed ultrastrutturale. L’obiettivo principale è rivolto alla possibilità di mettere a punto un protocollo standardizzato per le macroalghe in grado di discriminare specie ‘sensibili’, utilizzabili come ‘bioindicatori’ nei saggi ecotossicologici, da quelle utili come bioaccumulatori. Nel corso dei tre anni il materiale bibliografico, selezionato e continuamente aggiornato, è stato inserito in un archivio digitale con i dati relativi alle specie algali, ai metalli, alle dosi/tempi di esposizione, ai parametri saggiati con le rispettive metodiche e alle dosi soglia di tossicità. Una parte dei lavori può essere consultata a video (PDF) attraverso un collegamento ipertestuale (dati non presentati). L’attività di ricerca è stata suddivisa in tre parti: Parte I. Studio su micro-alghe. Sono stati approfonditi i meccanismi di adattamento/difesa ed i principali ‘siti bersaglio’ a livello fisiologico ed ultrastrutturale della Cyanoficea coloniale (Leptolyngbya sp.) mantenuta in coltura. Lo studio è mirato soprattutto alla valutazione del metodo fluorimetrico (PAM), di nuova acquisizione nel nostro laboratorio, scelto per la minor invasività rispetto alle altre analisi (ossimetria e pigmenti). Parte II. Studio su macro-alghe. La ricerca è stata condotta in tre fasi per individuare e scegliere specie sensibili/tolleranti, valutare la potenzialità delle specie considerabili buoni ‘bioaccumulatori’ e verificarne le potenzialità d’uso come ‘biofiltri riciclabili’, attraverso la stima del recupero funzionale in assenza del tossico. Parte III. Studio su macro-alghe in situ. E’ stato valutato il bioaccumulo dei popolamenti presenti nella Baia di Punta Olmi (Località ‘Boa’ – Muggia), area inquinata da metalli pesanti. Le specie macroalgali sono state prelevate in due in due siti costieri (Baia Punta Olmi – Muggia e Porto Franco Vecchio - Trieste). Dopo la stima delle curve di saturazione i campioni sono stati adattati in cella di coltura in condizioni controllate. Al mezzo di coltura sono state aggiunte dosi di cadmio [Cd(NO3)2] e le analisi, differenziate per le diverse fasi sperimentali, sono state effettuate dopo 1-2-7 giorni di ‘stress’ e dopo 7 giorni di recupero. Sono state stimate la fotosintesi (ossimetria e fluorimetria PAM), la respirazione, il contenuto di pigmenti liposolubili e condotte osservazioni al TEM. Su alcuni campioni è stata effettuata la microanalisi ai Raggi-X (SEM-EDS) variando la modalità di allestimento dei preparati. Conclusioni La stima delle condizioni di coltura ed il controllo incrociato dei risultati di questa ricerca forniscono le basi per interessanti sviluppi a livello interpretativo e sembrano essere un buon punto di partenza per valutare in modo più analitico le informazioni sulle possibili alterazioni del processo fotosintetico. La tecnica fluorimetrica offre, perciò, indubbi vantaggi in quanto non invasiva/distruttiva, ma soprattutto in relazione al numero dei parametri disponibili. Per l’applicazione corretta del metodo fluorimetrico è risultato fondamentale verificare i vantaggi ed i limiti dello strumento. L’analisi contemporanea di più parametri (ecologici, fisiologici, biochimici, ultrastrutturali), con dosi e tempi fissi, dipendendo da quest’ultimi l’ampiezza della risposta, è un approccio valido per individuare e descrivere in maniera più completa le risposte di adattamento/difesa delle alghe contro gli agenti tossici. Per quanto attiene ai tempi di esposizione, gli intervalli delle analisi (1S-2S-7S) sono risultati sufficienti per la valutazione delle risposte fisiologiche, biochimiche ed ultrastrutturali allo ‘stress’, mentre i 7 giorni di recupero in assenza del metallo (7R) sono risultati sufficienti per valutare le diverse capacità di ripresa funzionale delle specie. Le tecniche ultrastrutturali si confermano indispensabili per la localizzazione dei siti di sequestro ed accumulo del metallo, per lo studio delle modifiche cellulari, e per l’interpretazione dei risultati fisiologici. Diversamente, la microanalisi ai Raggi-X con il programma attualmente in dotazione (SEM-QUANT, ZAF), non è una tecnica valida per stimare il grado di bioaccumulo in popolamenti naturali, poiché le basse concentrazioni di metalli nei campioni biologici risultano spesso inferiori al limite di rilevabilità del sistema. Le diverse fasi sperimentali hanno permesso di identificare le specie più sensibili al cadmio, che potrebbero essere utilizzate in laboratorio come specie ‘test’ nei saggi ecotossicologici e in campo come ‘biosensori’. Quelle tolleranti/resistenti sarebbero, invece, utili come bioaccumulatori. In relazione ai tempi di esposizione, alle dosi applicate e sulla base dei risultati fisiologici ed ultrastrutturali mediante i quali sono stati messi in evidenza i principali siti di accumulo, sono state individuate specie con potenzialità diverse: a) P. pavonica, S. lomentaria, R. pseudopalmata, Z. typus e C.multifida come specie ‘sensibili’; b) R. thysanorhizans come specie ‘sensibile’ di ambiente naturale; c) H. musciformis, C. fragile, D. dichotoma come specie tolleranti/resistenti; d) F. virsoides e S. scoparium come specie tolleranti/resistenti con pronto recupero della piena funzionalità in assenza del tossico. Sono queste, quindi, le potenziali candidate da utilizzare come ‘biofiltri’ nel biorimedio. Al fine di poter utilizzare micro- e soprattutto macro-alghe (per l’abbondante biomassa), come biofiltri nel biorimedio, senza depauperamento delle risorse naturali, ed evitare nel contempo problemi di smaltimento del materiale contaminato, appare necessario non solo selezionare ‘buoni bioaccumulatori’ (specie tolleranti e/o resistenti), anche attraverso stime quantitative degli elementi per via chimica (spettrometria di massa), ma anche valutare le loro capacità di detossificarsi e di recuperare la piena funzionalità fisiologica in assenza del tossico. Solo in questo modo le alghe possono essere riutilizzate più volte per assorbire nuovo metallo.
XX Ciclo
1972

Macroscopical and microscopical observations on extant and fossil plants have been made. Observations on extant plants led to study the effects of volcanic gases on the cuticle ultrastructure of Pinus halepensis and Erica arborea sampled in the volcanic area of Phlegrean Italy. TEM observations on P. halepensis cuticles fumigated or not by volcanic gases revealed: 1) insignificant thickness variations of the cell wall plus cuticle among current- and first-year-old needles of both fumigated and not fumigated trees; 2) a calcium oxalate accumulation in fumigated leaves; 3) moreover, in respect to the cell surface, fibrils are disposed parallel to the surface of the cuticle. In specimens of E. arborea fumigated or not by volcanic gases, 1) the total thickness of cuticles varies significantly; 2) in plants experiencing chronic fumigation the A2 layer increases its thickness. As for fossil plants, the cuticles of Cretaceous Fossil-Lagertätten of Cusano Mutri and Pietraroja have been studied. In the former: 1) numerous taxa belonging to conifers have been identified; 2) the new species Frenelopsis cusanensis has been described; 3) Montsechia vidalii has been found outside of Spain. Taxonomical studies allowed the description of typical Euro-Sinian fossil plants. Sedimentological and taxonomical studies suggest semi-arid or arid conditions in a subtropical or tropical climate. It is worth noting as for Cusano Mutri locality, evidence of wildfire (fusain) suggests a periodic combination of arid periods, high temperatures and lightning strikes.

I dati riguardanti la morfologia degli organi luminosi degli organismi marini, ed in particolare dei pesci, presenti in letteratura sono stati, negli ultimi anni, aggiornati grazie alla riscoperta di questa interessante branca della ricerca. (Cavallaro et al., 2004, 2015a, 2015b, 2017; Copeland 1991; Johnsen et al., 2004; Herring & Cope, 2005; Herring et al., 2002). Tuttavia, al fine di fornire ulteriori ed importanti contributi alla conoscenza degli aspetti della biologia di questi organismi, che occupano un posto di assoluta prevalenza negli importanti equilibri delle catene trofiche marine e quindi nella regolamentazione dei bilanci energetici degli ecosistemi (Karakulak et al., 2009; Battaglia et al., 2013). Con il presente lavoro si intende approfondire lo studio della struttura e dell’ultrastruttura dei fotofori di diversi teleostei marini, appartenenti a diverse famiglie, tutti provenienti dallo Stretto di Messina. Grazie all’utilizzo di tecniche di microscopia ottica è stata delineata la struttura morfologica dei singoli organi luminosi mettendo in particolare evidenza la descrizione dei singoli componenti ghiandolari e diottrici dei fotofori. Le tecniche di microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM), utilizzate per alcune specie, hanno permesso di approfondire la natura di tali organi chiarendone i vari aspetti della morfologia, e quindi facilitando l’interpretazione e lo studio della funzione di tali apparati.

XXVI Ciclo di Dottorato in “Biotecnologie della Riproduzione Umana” – Università “Sapienza” di Roma. Riassunto 3° anno (anno accademico 2012/2013) Dottoranda: Claudia Boninsegna Titolo del progetto di ricerca: “Invecchiamento ovocitario umano: parametri strutturali ed ultrastrutturali” L’infertilità è definita come l’incapacità di una coppia di concepire dopo un anno o più di rapporti sessuali regolari non protetti. Negli ultimi decenni si è riscontrato un notevole aumento dei tassi di infertilità, dovuto principalmente al ritardo nella programmazione della gravidanza. L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è determinata dalla graduale diminuzione che si verifica con l’età sia nella quantità che nella qualità dei gameti femminili, gli ovociti. Lo scopo di questo lavoro è l’osservazione approfondita, tramite microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, dei tratti morfologici che caratterizzando l’invecchiamento ovocitario, sia nel processo fisiologico dell’invecchiamento riproduttivo (reproductive aging, RA), sia nel corso dell’invecchiamento in vitro (in vitro aging, IvA). Lo studio è stato condotto su 61 ovociti maturi (MII) soprannumerari donati alla ricerca, previa firma di un consenso informato e secondo le leggi vigenti, da 23 pazienti che si sono sottoposte a trattamenti di fecondazione assistita (IVF o ICSI) nel periodo compreso tra Ottobre 2007 e Luglio 2013. I trattamenti sono stati eseguiti presso la UOC OGC03 - Infertilità e FIVET (Prof. C. Aragona) del DAI (Dipartimento di Attività Integrata) di Ginecologia e Ostetricia, Perinatologia e Puericultura (Prof Pierluigi Benedetti Panici) dell’Azienda Policlinico Umberto I, Università “Sapienza” di Roma (DU -Dipartimento Universitario- di Scienze Ginecologico-ostetriche e Scienze Urologiche, Prof Vincenzo Gentile) Gli ovociti sono stati suddivisi in due gruppi in base all’età delle pazienti: A (età inferiore a 35 anni, 25 ovociti) e B (età uguale o superiore ai 35 anni, 36 ovociti). Un totale di 31 ovociti (13 ovociti nel gruppo A e 18 del gruppo B) sono stati fissati poco dopo il pick up (tempo 0); i rimanenti 30 (12 nel gruppo A e 18 del gruppo B) sono stati fissati dopo 24 ore di coltura. La successiva analisi di microscopia ottica ed elettronica è stata condotta presso la UO Microscopia elettronica (Prof. Giuseppe Familiari), sezione di Anatomia Umana (Prof. E. Gaudio) del Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche, Medico Legali e dell’Apparato Locomotore (Prof. Elio Ziparo) dell’Università “Sapienza” di Roma. Tale analisi è stata condotta in collaborazione con la sezione di Anatomia (Prof. Guido Macchiarelli) del Dipartimento di Scienze della Salute dell’Università degli studi dell’Aquila. I gruppi in esame erano perciò i seguenti: • gruppo <35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età inferiore a 35 anni • gruppo <35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età inferiore a 35 anni • gruppo ≥35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età uguale o superiore a 35 anni • gruppo ≥35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età uguale o superiore a 35 anni Per la valutazione della preservazione strutturale (microscopia ottica) e ultrastrutturale (microscopia elettronica a trasmissione) degli ovociti sono stati presi in considerazione diversi parametri morfologici; l’analisi statistica si è concentrata su 5 di essi - spessore della zona pellucida (zona pellucida thickness, ZPt) - numero di granuli corticali (cortical granules, CG) per 10 um di superficie lineare - numero di microvilli (Mv) per 10 um di superficie lineare - densità degli aggregati di mitocondri e tubuli di reticolo endoplasmatico liscio (mitochondria-smooth endoplasmic reticulum aggregates, M-SER) per 10 um2 di area citoplasmatica - densità dei complessi di mitocondri e vescicole di reticolo endoplasmatico liscio (mitochondria-vesicle complex, MVC) per 10 um2 di area citoplasmatica Gli ovociti del gruppo <35 mostrano le caratteristiche ultrastrutturali tipiche degli ovociti MII ideali: MVC piccole e scarsamente rappresentate (densità 0,35±0,26 per 10um2) ed aggregati M-SER ben rappresentati (densità 2,89±0,68 per 10um2), una quantità adeguata di CGs e di Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 18,32±1,93um. Negli ovociti del gruppo <35c si osserva un aumento della densità di MVC (1,31±0,36 per 10um2) ed una contemporanea riduzione dei complessi M-SER (1,80±0,35 per 10um2) e, in misura più lieve, dei CG e dei Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 18,27±1,74um. Neli ovociti del gruppo ≥35 i MCV sono presenti in numero maggiore (densità 2,05±0,48 per 10um2), i complessi M-SER sono scarsi (0,97±0,28 per 10um2) e si osserva una ulteriore riduzione dei CG e dei Mv (rispettivamente 7,45±1,37 e 6±1 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 21,73±1,79um. Negli ovociti del gruppo ≥35c si osserva un aumento notevole della densità dei MVC (3,19±0,40 per 10um2) e una marcata diminuzione dei complessi M-SER (0,57±0,31 per 10um2). Si osserva anche una riduzione della quantità di CG e di Mv (rispettivamente 2,55±1,37 e 4,73±1,13). Lo spessore medio della ZP era 21,55±1,57um. Rispetto agli ovociti di “controllo”, appartenenti al primo gruppo (<35), le variazioni numeriche mostrano dunque un andamento graduale, essendo minime nel gruppo <35c, più evidenti nel gruppo ≥35 e molto accentuate nel gruppo ≥35c. In conclusione, gli ovociti invecchiati in vitro e quelli invecchiati in vivo condividono molte caratteristiche ultrastrutturali tipiche che possono essere considerate markers morfologici di invecchiamento. Inoltre i dati presentati in questo lavoro rivelano che gli ovociti di donne giovani sembrano meno sensibili all’invecchiamento in vitro rispetto a quelli di donne in età avanzata, già soggetti a invecchiamento riproduttivo. Questi ultimi ovociti sembrano subire un invecchiamento in vitro prematuro, che potrebbe spiegare la loro ridotta finestra di fecondazione e la minore competenza di sviluppo.

Uno dei problemi legati alla crioconservazione del liquido seminale è la riduzione dei parametri vitali quali la vitalità e la motilità. La cri preservazione può inoltre indurre modificazioni della normale morfologia della componente nemaspermica. Attualmente la crioconservazione è applicabile attraverso due metodologie: congelamento lento/scongelamento rapido e vitrificazione/riscaldamento. Il primo metodo tende a prevenire la formazione di ghiaccio intracellulare tramite un lento abbassamento della temperatura: in tal modo la cristallizzazione che avviene all’esterno della cellula dovrebbe non disturbare l’ambiente intracellulare; il secondo invece mira ad evitare la formazione di ghiaccio intracellulare attraverso un istantaneo abbassamento della temperatura facendo in modo che il tempo richiesto per la transizione termica non sia tale da permettere il passaggio di stato. Per crioconservare con successo limitando il danno intracellulare si utilizzano delle sostanze dette crioprotettori, che sono però particolarmente tossici per le cellule. Una questione controversa nel campo della crioconservazione/crioprotezione dei gameti riguarda la presenza o assenza del liquido seminale durante la crioconservazione degli spermatozoi. Il potenziale protettivo del liquido seminale è stato confermato dalla presenza in esso di ioni come zinco e di antiossidanti; esso può però contenere alti livelli, potenzialmente tossici, di specie reattive dell’ossigeno. Lo scopo di questa tesi è stato quello di testare gli effetti di un medium di coltura artificiale simile nella composizione al liquido seminale ma privo degli effetti collaterali negativi e valutare il suo effetto sugli spermatozoi umani andando ad analizzare una serie di parametri prima e dopo la vitrificazione. In particolare mediante analisi microscopica sono stati valutati motilità, vitalità, morfologia e ultrastruttura. Sono stati selezionati 30 campioni di liquido seminale e ogni campione è stato sottoposto a swim-up e successivamente trattato in modo da ottenere 5 gruppi di spermatozoi a fresco e vitrificati in diversi media: HTF a fresco (Human Tubal Fluid), ASF a fresco (Artificial Seminal Fluid), Vit HTF (vitrification in Human Tubal Fluid), Vit SF (vitrification in Seminal Fluid), Vit ASF (vitrification in Artifical Seminal Fluid). Dopo vitrificazione e scongelamento tutti i campioni sono stati sottoposti ad analisi seminale mediante l’utilizzo della Microscopia Ottica, e successivamente sono stati trattati per l’analisi ultrastrutturale mediante l’uso della Microscopia Elettronica a Trasmissione. Nei gruppi a fresco HTF e ASF, tutti i parametri nemaspermici sono risultati simili e paragonabili. Invece, come era prevedibile, i parametri relativi alla morfologia normale, motilità e vitalità sono apparsi significativamente ridotte nei gruppi vitrificati rispetto a quelli a fresco (p<0.001). Andando a paragonare i parametri in condizioni di vitrificazione diverse invece, la motilità progressiva, la vitalità e la normale morfologia sono significativamente più alte in Vit ASF rispetto a Vit HTF, mentre tutti i parametri risultano in generale migliori in Vit ASF rispetto a Vit SF ma solo la vitalità sembra differire in maniera significativa. I tassi di recupero di vitalità e della normale morfologia erano significativamente maggiori nel gruppo Vit ASF rispetto a Vit SF e Vit HTF (p<0.05). I tassi di recupero della motilità progressiva e della normale morfologia erano significativamente maggiori nel gruppo Vit ASF rispetto a Vit HTF (p=0.03). Analizzando le immagini scattate al microscopio elettronico a trasmissione degli spermatozoi a fresco e vitrificati, i campioni a fresco hanno mostrato membrana plasmatica intatta e normali acrosomi. Nonostante si sia notata una migliore preservazione nel gruppo Vit ASF sono stati osservati diversi tipi di danno in tutti i gruppi vitrificati, nei quali l’acrosoma è risultata la parte anatomica più sensibile al crio-danno. La membrana plasmatica ha mostrato molti difetti dopo lo scongelamento come rigonfiamento, rotture, raggrinzimenti. Nei nuclei dei vitrificati è stata osservata una minore elettrodensità rispetto ai controlli a fresco e sono state osservate inclusioni granulari, voluminosi vacuoli apparentemente vuoti e non delimitati da membrana posizionati solitamente al centro del nucleo. I mitocondri sono apparsi tondi con creste poco definite e visibili. In conclusione abbiamo potuto dimostrare che il liquido seminale (SF) può fungere da crioprotettore in soggetti normospermici. Abbiamo dimostrato inoltre che l’ASF può effettivamente meglio preservare tutti i parametri nemaspermici degli spermatozoi in confronto al SF, ma soprattutto in confronto al HTF, incrementato con albumina sierica e saccarosio.

La Distonia Cervicale (DC), una delle più comuni forme di distonia focale, è caratterizzata dalla presenza di movimenti o posture anormali del collo e della testa. Benchè la DC possa essere secondaria a lesioni a carico dei nuclei della base o in altre strutture del sistema nervoso centrale, gli studi standard di Risonanza Magnetica (RM) in genere non mettono in evidenza la presenza di lesioni cerebrali nelle forme di DC Primaria. Queste conoscenze sono ora in continuo cambiamento grazie a studi che utilizzano tecniche avanzate di neuroimaging con le quali si è potuta mettere in evidenza la presenza di alterazioni ultrastrutturali in aree cerebrali che funzionalmente possono essere coinvolte nei meccanismi patofisiologici della distonia. Studi di RM con il tensore di diffusione (Diffusion Tensor Imaging, DTI), tecnica non convenzionale di RM, e studi combinati di imaging di RM con analisi morfometrica VBM (voxel based Morphometry), tecnica che permette di valutare le differenze voxel-wise inter-gruppo e intra-gruppo in un dato volume di sostanza grigia (gray matter, GM), hanno messo in evidenza la presenza di alterazioni ultrastrutturali cerebrali nel tessuto cerebrale apparentemente normale in pazienti con DC. Di seguito vengono presentati i risultati della ricerca di analisi dei dati RM-DTI e dell'analisi morfometrica mediante tecnica VBM nei pazienti con DC.