Academic literature on the topic 'Trichoderma reesei – Innovation'

The aim of this study was to produce and characterize a cellulase-rich fraction using submerged or solid state fermentation of Trichoderma reesei (QM 1914) strain. The carbon sources were the wheat bran or sawdust, the production yield of this enzyme production was higher in both fermentation types using sawdust substrate, and especially by solid state fermentation, after five days of fermentation. The optimum pH and temperature for the efficient crude enzyme production was established to be 5 and 60°C, respectively, but lost 50% of its activity after 30 minutes, when heated at 60°C. Comparatively with other fungi, the efficiency of Trichoderma sp. to synthesize cellulase rich extract was higher.Â

Les combustibles fossiles sont un contributeur majeur au réchauffement climatique, et leur nature non renouvelable est un obstacle à la construction de sociétés durables. Dans ce contexte, les biocarburants de seconde génération se présentent comme une alternative attractive et plus respectueuse de l'environnement. Le processus de production de biocarburants de deuxième génération comprend plusieurs étapes incluant le prétraitement physico-chimique de la biomasse lignocellulosique (non comestible), l'hydrolyse enzymatique de la cellulose en glucose et par la fermentation de sucres simples en biocarburants, comme le bioéthanol. Un des problèmes principaux pour une large application est cependant le coût relativement élevé des enzymes hydrolytiques, les cellulases, utilisées pour déconstruire la biomasse lignocellulosique prétraitée en sucres fermentescibles.Le champignon filamenteux Trichoderma reesei est le choix privilégié pour la production industrielle de cellulases car il possède des capacités d'hyperproduction et d'hypersécrétion. Les souches industrielles de T. reesei peuvent sécréter jusqu'à 100 g/L de cellulases dans des fermenteurs industriels contrôlés. En particulier, la souche mutante Rut-C30 est une souche hyperproductrice de référence, mais notre compréhension incomplète de son système de sécrétion performant complique l'amélioration de sa capacité d'hypersécrétion par génie génétique. C'est pourquoi, ce travail visait à éclaircir les voies de régulation contrôlant la sécrétion et les réponses au stress de sécrétion pour identifier des goulots d'étranglement et pour développer de nouvelles souches dotées d'une capacité de sécrétion supérieure dans le futur.Dans ce but, des données transcriptomiques étaient générées à partir de cultures de T. reesei Rut-C30 dans différentes conditions de stress de sécrétion et ont permis d'identifier de composants potentiels de régulation de la sécrétion qui pouvaient être ciblés pour invalidation. Pour compléter cette approche, un datamining de données transcriptomiques obtenues avec d'autres champignons filamenteux cultivés dans des conditions de stress de sécrétion a révélé d'autres gènes cibles potentiellement impliqués dans la régulation de la voie de sécrétion. Finalement, neuf gènes ont été invalidés dans la souche Rut-C30 et les mutants obtenus ont été caractérisés phénotypiquement. Tous ont montré une croissance ralentie et un comportement de sécrétion altéré. Un séquençage de l'ARN a été réalisé sur les mutants ∆res2, ∆rpn4 and ∆snd1 et comparé à celui de Rut-C30 dans les mêmes conditions de culture. Aucun des trois facteurs de transcription n'impacte la transcription des gènes impliqués dans la sécrétion ou dans la réponse au stress de sécrétion dans nos conditions. En revanche, des gènes codant pour des enzymes du métabolisme des lipides sont différentiellement exprimés dans les trois mutants ce qui pourrait affecter la sécrétion indirectement. Les résultats délivrent des premiers indices pour atténuer les goulots d'étranglement de la sécrétion dans T. reesei Rut-C30 et ouvrent la voie vers le développement de souches possédant une capacité de sécrétion améliorée
Fossil fuels are a major contributor to global warming, and their non-renewable nature is an impediment for building sustainable societies. In this context, second generation biofuels represent an attractive and more environmentally friendly alternative. The process of second-generation biofuel production consists of several steps including a physicochemical pretreatment of lignocellulosic (non-edible) biomass, the enzymatic hydrolysis of cellulose into glucose and the fermentation of simple sugars into biofuels, such as bioethanol. One of the main bottlenecks for a large implementation of this process is, however, the relatively high cost of hydrolytic enzymes, namely cellulases, used to deconstruct the pretreated lignocellulosic biomass into fermentable sugars.The filamentous fungus Trichoderma reesei is the preferred choice for industrial production of cellulases since it has hyperproduction and hypersecretion capacities. Industrial strains of T. reesei can secrete up to 100 g/L of cellulases in controlled industrial fermenters. In particular, the mutant strain Rut- C30 is a reference hyperproducer strain, but our incomplete understanding of its enhanced secretion system complicates further improvement of its hypersecretion capacity by genetic engineering. Therefore, this work aimed at unravelling the regulatory pathways controlling secretion and the secretion stress response in order to identify bottlenecks and to develop new strains with enhanced secretion capacity in the future.To this end, transcriptomic data were generated from cultivations of T. reesei Rut-C30 in different secretion stress conditions which allowed to identify potential components of secretion regulation that were targeted for deletion. As a complementary approach, mining of transcriptomic data obtained with other filamentous fungi in secretion stress conditions revealed further target genes potentially involved in the regulation of the secretion pathway. Finally, nine genes were deleted in the Rut-C30 strain, and the resulting strains phenotypically characterized. All of them displayed reduced growth and showed altered protein secretion behavior. RNA sequencing was performed on ∆res2, ∆rpn4 and ∆snd1 mutant strains and compared to that of Rut-C30 in the same culture conditions. Neither of the three transcription factors impacts transcription of genes involved in secretion or the secretion stress response in our conditions. However, in all three mutants, genes encoding enzymes of lipid metabolism are differentially expressed which could affect secretion in an indirect way. The results represent first clues to alleviate bottlenecks in secretion in T. reesei Rut-C30 and pave the way to develop strains with still improved secretion capacity

Dans le cadre de la production de bioéthanol de deuxième génération, l’ingénierie génétique de Trichoderma reesei est une des solutions envisagées pour diminuer le coût de l’étape d’hydrolyse enzymatique. Elle permet d’améliorer les performances de sécrétion de ce champignon filamenteux producteur de cellulases et les propriétés de ces enzymes. Comme de nombreux champignons industriels, T. reesei a longtemps été considéré comme possédant exclusivement un cycle asexuel. La mise en évidence récente d’un cycle de reproduction sexuée chez ce champignon filamenteux ouvre de nouvelles perspectives d’amélioration des souches utilisées en biotechnologie. Cependant, comme toutes les souches industrielles de T. reesei dérivent de l’isolat sauvage QM6a, elles sont toutes de type sexuel MAT1-2 et stériles en tant que femelles. L’objectif de ce travail de thèse est de mettre en place la reproduction sexuée comme outil génétique et d’amélioration des performances des souches industrielles. Son utilisation en complément des outils d’ingénierie génétique permet de combiner des caractères intéressants ou d’en générer de nouveaux, de stabiliser les souches industrielles en éliminant les mutations non désirées, de s’affranchir des marqueurs de sélection et d’identifier les gènes et mutations responsables d’un caractère d’intérêt. La première partie de ce travail a été consacré à l’optimisation de la reproduction sexuée puis à l’étude des étapes et des mécanismes de la reproduction sexuée entre souches sauvages et hyperproductrices. Dans un deuxième temps, nous avons mis en place la reproduction sexuée entre des souches hyperproductrices femelles stériles, à l’aide de la stratégie originale de la « souche assistante », qui a abouti au rétablissement partiel de leur reproduction sexuée. Afin de compléter ce rétablissement, une étude de l’étape de fécondation que nous supposons être l’étape problématique dans notre stratégie a été initiée. Parallèlement, l’exploitation de la reproduction sexuée entre souches sauvage et hyperproductrices a permis de générer une souche hyperproductrice de cellulases, de type sexuel MAT1-1 donc compatible avec toutes les souches industrielles, femelle fertile et possédant une activité β-glucosidase améliorée. Enfin, la reproduction sexuée associée à la génétique classique (« Bulk Segregant Analysis ») et aux techniques de séquençage haut débit a été mise en oeuvre pour permettre l’identification de mutations impliquées dans des phénotypes d’intérêt
Genetic engineering of Trichoderma reesei is one of the solutions considered to reduce the cost of the enzymatic hydrolysis step in second-generation ethanol production processes. It allows the improvement of the secretory performances of this cellulase producer fungus and the properties of its enzymes. Like many industrial fungi, T. reesei has long been considered to possess exclusively an asexual cycle. The recent discovery of a sexual reproduction cycle in this filamentous fungus opens up new prospects of improvement for strains used in biotechnology. However, all industrial strains of T. reesei are derived from the wild isolate QM6a and therefore possess the MAT1-2 mating type and are female sterile.The aim of this work was to develop sexual reproduction as a genetic tool and to improve the performance of the industrial strains. In combination with the genetic engineering tools, it would enable combination of interesting traits or generation of new ones, improve strains stability by purging deleterious mutations, selection markers elimination and identification of genes and mutations responsible of interesting characteristics.The first part of this work was dedicated to the optimization of sexual reproduction and to the study of the steps and mechanisms of sexual reproduction between wild-type and hyperproducer strains. In a second step, we set up sexual reproduction between female sterile hyperproducer strains, using the original "assistant strain" strategy, which resulted in the partial restoration of their sexual reproduction. A study of the fertilization step was also initiated, as we suspect it to be the blocking point in our strategy. In a second part, we took advantage of sexual reproduction between wild-type and hyperproducer strains for (i) the generation of a MAT1-1 mating-type strain compatible with all industrial strains, female fertile and possessing improved β-glucosidase activity and (ii) the implementation of a bulk segregation analysis associated with high-throughput sequencing techniques to identify mutations involved in phenotypes of interest

L’une des alternatives envisagées pour remplacer les ressources fossiles est l’utilisation de biomasse lignocellulosique. Cette ressource abondante et renouvelable, issue de la paroi des végétaux, est composée de polysaccharides et de polymères aromatiques liés entre eux qui lui confèrent une grande résistance. Aujourd’hui, la biomasse lignocellulosique est transformée en bioéthanol via un procédé dont l’une des étapes clé est la dégradation des polysaccharides en sucres fermentescibles. Pour cela, des enzymes, notamment des cellulases, hémicellulases et « lytic polysaccharide monooxygenases» (LPMO) sont utilisées. Ces enzymes sont sécrétées par des organismes dégradeurs de la biomasse tels que l’ascomycète Trichoderma reesei, un champignon filamenteux capable de sécréter de très grandes quantités de cellulases, mais qui possède une faible diversité enzymatique. L’hydrolyse enzymatique restant à ce jour une étape très coûteuse, il est nécessaire d’en améliorer encore les rendements. L’apport d’activités enzymatiques manquantes chez T. reesei à partir d’autres organismes fongiques est une approche prometteuse, qui a été développée dans le cadre de ce projet de thèse.Différentes souches du genre Aspergillus ont été étudiées afin d’y trouver des activités enzymatiques permettant d’améliorer l’hydrolyse de biomasses prétraitées. Pour cela, 5 souches ont été cultivées en présence de 3 inducteurs, et le contenu protéique de ces différents sécrétomes a été déterminé par spectrométrie de masse. Les sécrétomes ont ensuite été testés pour leur capacité à supplémenter un cocktail de T. reesei en améliorant ses rendements d’hydrolyse. L’analyse des protéines contenues dans quelques sécrétomes performants a révélé la présence d’une protéine appartenant à une famille putative de LPMO. Plusieurs protéines de cette famille ont été produites de manière recombinante et testées sur différents substrats en présence de partenaires redox. Une activité de clivage oxydatif de la cellulose a été démontrée, permettant la définition d’une nouvelle famille de LPMO fongiques, nommée AA16. Le prétraitement de substrats cellulosiques par les LPMO AA16 entraîne une amélioration significative de leur hydrolyse par une des cellulases de T. reesei, ce qui démontre l’intérêt potentiel de cette nouvelle famille d’enzymes pour des applications biotechnologiques dans le domaine des bioraffineries
Lignocellulosic biomass is considered as a promising alternative to fossil resources. This abundant and renewable feedstock, derived from plant cell wall, is composed of polysaccharides and aromatic polymers linked together to form a highly resistant structure. Its transformation into bioethanol or other products requires the degradation of polysaccharides into fermentable sugars, using enzymes such as cellulases, hemicellulases and lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs). These enzymes are secreted by biomass-degrading microorganisms, such as bacteria and filamentous fungi. The most commonly used is Trichoderma reesei, a fungal species that is known for its efficient secretion of cellulases, but has a low diversity of other enzymes. Enzymatic hydrolysis is still a bottleneck for the cost-effective utilization of lignocellulosic biomass, and needs to be optimized. Providing activities that are missing in T. reesei using enzymes produced by other fungal organisms is a promising approach, which has been implemented during this PhD project.Using a proteomic approach, different Aspergillus strains were studied in order to find enzymatic activities that could improve the hydrolysis of pretreated biomass. For this purpose, 5 strains were grown on 3 inducers, and the protein content of these different secretomes was determined by mass spectrometry. The secretomes were then tested for their ability to improve hydrolysis yields by supplementing a T. reesei cocktail. Analysis of the protein content of some of the best-performing secretomes revealed the presence of a protein belonging to a putative family of LPMO. Several proteins of this family were recombinantly produced and tested on different substrates in the presence of redox partners. Oxidative cleavage of cellulose was demonstrated, leading to the creation of a new LPMO family, called AA16. The pretreatment of cellulosic substrates by AA16 LPMOs resulted in a significant improvement of their hydrolysis by a cellulase from T. reesei, demonstrating their potential interest for biotechnological applications in biorefineries