Dissertations / Theses on the topic 'Trapianto di cellule staminali emopoietiche'

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche rappresenta la terapia di scelta per numerose patologie ematologiche. Tuttavia, la mortalità da trapianto (non relapse mortality-NRM), ha limitato per lungo tempo il suo utilizzo in pazienti di età >65 anni. L’età non può più essere considerata una controindicazione assoluta al trapianto e il suo utilizzo in fasce di età un tempo ritenute non idonee è in sensibile aumento. La NRM è legata a tre ordini di complicanze: immunologiche (malattia del trapianto contro l’ospite, Graft versus-Host Disease -GVHD-), infettive e tossiche. La tossicità d’organo è direttamente correlata alla intensità del condizionamento che quindi viene ridotta in caso di comorbidità e nel paziente anziano. Tuttavia, ridurre l’intensità del condizionamento significa anche aumentare il rischio di ripresa della malattia ematologica di base e quindi tale aggiustamento deve essere fatto in funzione di indici di invecchiamento e di comorbidità, al fine di non ridurre la potenzialità curativa del trapianto. Per valutare le comorbidità abbiamo uno score altamente predittivo (Hematopoietic Cell Transplant-Comorbidity Index, di Sorror), mentre per valutare l’invecchiamento c’è una grande necessità clinica di marcatori innovativi di età biologica. Il presente lavoro ha l’obiettivo di valutare, nei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche per tutte le indicazioni ematologiche, lo stato di metilazione del DNA, indice di età biologica. Lo scopo è di correlare l’epigenoma al rischio trapiantologico del singolo individuo.
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a well-established therapy for several life-threatening hematological disorders, mostly malignancies. However, non-relapse mortality (NRM) has limited its use in patients aged over 65 years. Nowadays age cannot be considered an absolute contraindication for this treatment and the use of transplantation, in patient groups once considered unsuitable, is increasing significantly. NRM is due to three types of complications: immunological (graft versus host disease), infectious and toxic. Organ toxicity is directly related to the intensity of conditioning which is therefore reduced in case of comorbidities and in elderly patients. However, reducing the intensity of chemotherapy also means increasing the risk of relapse of the underlying haematological disease and therefore this adjustment must consider aging and comorbidity indexes in order not to reduce the curative potential of the transplant. To evaluate comorbidities we have a highly predictive score (the Comorbidity Index Score by Sorror, HCT-CI), while to evaluate aging there is a great clinical need to apply innovative biological age markers. The present work aims to evaluate the state of DNA methylation, a biological age index, in the setting of patients undergoing allogeneic haematopoietic stem cell transplantation for all haematological indication. The aim is also to correlate the epigenome with the transplant risk of the single individual.

Allogenic stem cell transplantation represents an important therapeutic option for the treatment of a number of haematological diseases. Particularly in the context of onco-haematological diseases this treatment has been shown to improve outcome thanks to the graft versus tumour (GVT) effect. Although recent improvements in transplantation procedures, still some limitations to the applicability of these treatment persist. First, not all patients may have available an HLA (human leukocyte antigens) identical donor and secondly, conditioning regimens before transplantation may be too toxic for elderly patients or for patients with other co-morbidities. To overcome this limitations in last few years many researchers have been exploiting new approaches. The introduction of not fully matched transplantations (mismatched or haploidentical) and reduced intensity regiments have partially overcome the limitations. In the onco-haematological context the most common complications of allogenic stem cell transplantation are relapse, opportunistic infections and activation of transplanted immune system against the normal tissues of the host (graft versus host disease – GVHD). All of these represent alterations of the normal functions of the immune system and demonstrate the importance of monitoring immunity in allo-transplanted patients. Studies in these field are mostly limited to the evaluation of the first year after transplantation and data from longer follow up are limited. In this study we monitored patients undergoing haematopoietic stem cell transplantation from an alternative donor after reduced intensity regimen over one year after transplantation (up to 4-5 years after transplantation). Particularly we evaluated 6 patients (age at transplantation 34; range 15-49) undergoing haploidentical stem cell transplantataion associated with T cell depletion in vitro (immunomagnetic selection of CD34 stem cells) and in vivo (anti CD52 antibody – Alemtuzumab) followed by infusion of CD8 depleted donor lymphocytes and 18 patients (age at transplantation 40; range 22-60) undergoing transplantation from a match unrelated donor (MUD) followed by in vivo T cell depletion (anti thymocyte globulins – ATG). All the patients have been analysed at the times of clinical remission and not under pharmacological treatment. In order to compare data obtained by the single cohorts to a normal situation we also evaluated 10 healthy donors (age 37; range 24-55). The evaluation of the immune recovery has been carried out through 4 different techniques: - analysis of chimerism through amplification of 9 different short tandem repeats (STR); - evaluation of the lymphoid sub population B, T and NK (and their maturation stages) through flow cytometry immunophenotype; - analysis of the thymic productivity trough quantification of the episomal DNA sjTREC (signal joint T-cell receptor excision circle); - evaluation of the receptorial complexity of the T and B cell compartment trough analysis of the CDR3 (complementary determinating region 3) of the β chain of the T cell receptor and of the heavy chain of the immunoglobulins. Our results show no significant differences between the two groups of patients analysed in the long term immune reconstitution, neither respectively the counts of the lymphoid sub population nor regarding the complexity values for the B and T cell receptors comparing the data to the ones from healthy subjects. We show a reduction in the thymic productivity that persist over 3 years post transplantation although there are no difference comparing the two cohorts of patients. Even though the counts of the main populations normalize between 1 and 2 years after transplantation the analysis of the maturation of the B and T cell compartments highlights the persistence of alterations in the normal maturation process in all the follow up points. Particularly both patients undergoing haploidentical or MUD transplantation present an increase in the B naïve subpopulation and a decrease in the B memory subsets demonstrating an alteration in the normal B cell development probably due to an alteration in the normal function of the germinal center. Concerning the T cell compartment it has been seen a decrease in the production of naïve T cells, that reflects the low thymic production, and an increase in the effector and terminal memory compartment. These might be a mechanism involved in the control of the oncological disease . In conclusion, patients that do not relapse and do not experience other clinical problems are able to recover immunity in the long term although thymic production remains low. No significant difference are found between the two types of transplantation highlighting that haploidentical transplantation is a good alternative to HLA identical transplantation implying less problems for donor recruitment. Analysis of the maturation steps of the B and T cell compartment demonstrated the persistence of alterations long term after transplantation indicating that this evaluation should be further studied in order to elucidate the mechanism at the basis of the immune recovery. Moreover this could be a good marker for monitoring the clinical course of the patients.

L'outcome dei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche è fortemente influenzato da graft versus leukemia (GvL) e graft versus host disease (GvHD) che sono mediate, almeno in parte, dagli antigeni minori di istocompatibilità (mHAgs). In letteratura sono stati identificati 26 mHAgs che sono stati correlati a GvHD/GvL con risultati incompleti e in alcuni casi contrastanti; inoltre manca una metodica che sia in grado di genotipizzare contemporaneamente un pannello così ampio. Il lavoro è stato finalizzato alla preparazione di un protocollo di laboratorio che permetta di studiare in modo efficace i 26 mHAgs identificati, per poi correlarli con GvHD/GvL all’interno di uno specifico gruppo di trapiantati. Utilizzando la metodica IPlex Gold Mass Array Sequenom e tecniche di biologia molecolare convenzionale sono stati genotipizzati 26 antigeni minori di istocompatibilità per 46 coppie full-matched. Tutti i pazienti inclusi nel progetto di studio erano stati sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche da donatore familiare o volontario full-compatibile per leucemia mieloide cronica (n=46) o leucemia acuta linfoblastica Philadelphia positiva (LAL-Ph+, n=24). Il progetto ha confermato l'efficienza (98.6%) e la fattibilità delle metodiche proposte. Dal lavoro è inoltre emerso che, le differenze tra donatore e ricevente a libello mHAgs ACC-1, ACC-4, ACC-5, LB-MTHFD1-1Q, UGT2B17, DPH1, LRH1 potrebbero essere fattori predittivi di GvHD (p<0.05). La seconda evidenza è legata a un trend secondo cui il mismatch per LB-ADIR1 protegge dalla recidiva di malattia, in particolare nei confronti della LAL-Ph+ che è scarsamente responsiva all'allo-immunoterapia. Questo lavoro pilota, la cui casistica deve quindi essere ampliata, ha dimostrato l’efficacia della genotipizzazione con IPlex Gold Sequenom e l’elevato potenziale degli mHAgs sia come fattori predittivi di GvHD che come driver di GvL.
The outcome of allogeneic stem cell transplantation (Allo-SCT) is closely related to graft versus host disease (GvHD) and graft versus leukemia (GvL) effects which, in part, are mediated by mHAgs. Twenty-six mHAgs have been identified and reported to be differently and variably correlated with GVHD or GVL, but a simultaneous method to genotype a so large panel of mHAgs has never been employed. The aim of this work has been to develop a feasible method to genotype all the 26 mHAgs described so far and to test them for their correlation with GVHD and GVL in a group of donor/recipient pairs submitted to allo-SCT. For a multi-genotyping of 23 mHAgs we used iPlex Gold Mass Array technology (3 multiplex). For the other three mHAgs we designed other three assays based on conventional molecular biology. By these methods, we tested the 26 mHAgs in 46 donor/recipient pairs full-matched that underwent allo-SCT (sibling or MUD) because of Philadelphia positive CML (n=46) or ALL-Ph+ (n=24). Maldi-Tof IPlex Gold technology proved a high degree of efficiency (98.6%). As expected, sibling pairs showed most identity of MUD pairs. Notably, donor/recipient mismatch on ACC-1, ACC-4, ACC-5, LB-MTHFD1-1Q, UGT2B17, DPH1, LRH1 can drive GvHD effect (p<0.01). Next we identified that LB-ADIR1 can enhance (p=ns, but there is a trend) GvL effect specially on ALL-Ph+ that is otherwise un-responsible to allo-immunotherapy. Our data generated by a multi-genotype technique confirm the role of mHAgs in addressing GvL (in some cases without GvHD) and suggest that a study of mHAgs could be perfomed before transplant in order to better investigate the role of the known and new mHAgs involved in GvHD and GvL effects.

L'outcome dei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche è fortemente influenzato da graft versus leukemia (GvL) e graft versus host disease (GvHD) che sono mediate, almeno in parte, dagli antigeni minori di istocompatibilità (mHAgs). In letteratura sono stati identificati 26 mHAgs che sono stati correlati a GvHD/GvL con risultati incompleti e in alcuni casi contrastanti; inoltre manca una metodica che sia in grado di genotipizzare contemporaneamente un pannello così ampio. Il lavoro è stato finalizzato alla preparazione di un protocollo di laboratorio che permetta di studiare in modo efficace i 26 mHAgs identificati, per poi correlarli con GvHD/GvL all’interno di uno specifico gruppo di trapiantati. Utilizzando la metodica IPlex Gold Mass Array Sequenom e tecniche di biologia molecolare convenzionale sono stati genotipizzati 26 antigeni minori di istocompatibilità per 46 coppie full-matched. Tutti i pazienti inclusi nel progetto di studio erano stati sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche da donatore familiare o volontario full-compatibile per leucemia mieloide cronica (n=46) o leucemia acuta linfoblastica Philadelphia positiva (LAL-Ph+, n=24). Il progetto ha confermato l'efficienza (98.6%) e la fattibilità delle metodiche proposte. Dal lavoro è inoltre emerso che, le differenze tra donatore e ricevente a libello mHAgs ACC-1, ACC-4, ACC-5, LB-MTHFD1-1Q, UGT2B17, DPH1, LRH1 potrebbero essere fattori predittivi di GvHD (p<0.05). La seconda evidenza è legata a un trend secondo cui il mismatch per LB-ADIR1 protegge dalla recidiva di malattia, in particolare nei confronti della LAL-Ph+ che è scarsamente responsiva all'allo-immunoterapia. Questo lavoro pilota, la cui casistica deve quindi essere ampliata, ha dimostrato l’efficacia della genotipizzazione con IPlex Gold Sequenom e l’elevato potenziale degli mHAgs sia come fattori predittivi di GvHD che come driver di GvL.
The outcome of allogeneic stem cell transplantation (Allo-SCT) is closely related to graft versus host disease (GvHD) and graft versus leukemia (GvL) effects which, in part, are mediated by mHAgs. Twenty-six mHAgs have been identified and reported to be differently and variably correlated with GVHD or GVL, but a simultaneous method to genotype a so large panel of mHAgs has never been employed. The aim of this work has been to develop a feasible method to genotype all the 26 mHAgs described so far and to test them for their correlation with GVHD and GVL in a group of donor/recipient pairs submitted to allo-SCT. For a multi-genotyping of 23 mHAgs we used iPlex Gold Mass Array technology (3 multiplex). For the other three mHAgs we designed other three assays based on conventional molecular biology. By these methods, we tested the 26 mHAgs in 46 donor/recipient pairs full-matched that underwent allo-SCT (sibling or MUD) because of Philadelphia positive CML (n=46) or ALL-Ph+ (n=24). Maldi-Tof IPlex Gold technology proved a high degree of efficiency (98.6%). As expected, sibling pairs showed most identity of MUD pairs. Notably, donor/recipient mismatch on ACC-1, ACC-4, ACC-5, LB-MTHFD1-1Q, UGT2B17, DPH1, LRH1 can drive GvHD effect (p<0.01). Next we identified that LB-ADIR1 can enhance (p=ns, but there is a trend) GvL effect specially on ALL-Ph+ that is otherwise un-responsible to allo-immunotherapy. Our data generated by a multi-genotype technique confirm the role of mHAgs in addressing GvL (in some cases without GvHD) and suggest that a study of mHAgs could be perfomed before transplant in order to better investigate the role of the known and new mHAgs involved in GvHD and GvL effects.

Background.Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is now the therapeutic treatment for malignant and nonmalignant hematologic diseases and could represent a challenge to pediatric patients and their families. Advances in HSCT procedure have significantly increased the number of HSCT performed each year and have improved long term survival rates, so studies have shifted their focus from survival time to Quality of Life (QoL). Childhood HSCT survivors have been shown to be prone to develop psychological, cognitive, social and familiar, as well as medical, adverse outcomes. (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). The aim of the present study is to evaluate psychosocial and behavioral features and QoL of childhood HSCT survivors and their families (including siblings). Secondary aims are to evaluate the level of agreement between survivor-parents reports as for psychopathological areas and QoL; to evaluate parental stress and finally to identify risk and protective factors for mental health. Methods. Paediatric HSCT survivors (at least 5 years post transplantation) and their parent each completed a questionnaire package that included Achenbach test (Child Behaviour Checklist-CBCL; Youth Self Report-YSR), Pediatric Quality of Life Inventory 4.0 (PedsQL) and a brief unstructured text. Parents were also asked to complete an anamnestic interview and two other test: Short Form-36 (SF-36) and Parenting Stress Index scale (PSI). Siblings were asked to complete YSR and a brief unstructured text. Data were analysed using SPSS software. Results From 2012, 37 pediatric HSCT survivors (62% male) were enrolled in the study. The age at HSCT was 10 yrs on average (range 0,7-11,2 yrs). Fifty four percent of survivors were treated with allogenic unrelated HSCT. Seventy-four parent and 38 siblings were also tested. YSR scores exceeded the normative cut off for total competences (22%), social competences (13%) and somatic complains (8%), while CBCL scores were mainly pathological for total competences (49%), activities (22%) and somatic symptoms (11%). Symptoms reported to CBCL were more if: the survivor is female, there were a allogenic related HSCT, there were medical toxicities and if timing since communication of therapeutic choice and HSCT were longer. CBCL and YSR present a good level of agreement only for total competences scale (K=0.06, p= 0.002), somatic symptoms (K=0.21, p= 0.003) and attention problems (k=0.13; p=0.02). As for PedsQL, there was a poor level of agreement between survivors and parents only for physical area (K=0.05; p=0.31) and emotional area (K=0.09; p=0.06). In SF-36 mothers, perceive a worse QoL for “role limitation” scale when they have only one child or more than three children, if timing since communication and HSCT was brief and if survivor was treated with allogenic related HSCT. Fathers perceive a worse mental health if they have one child or more than two children, and if they were married. Siblings who were closer to survivor appear to present a worse QoL according to parents. Conclusion. Pediatric HSCT survivors present psychological distress in many areas (internalizing, externalizing, attention and social areas), with a prevalence of somatic symptoms.As for QoL, parents report better emotional function and lower physical function of the survivor. The first sibling appears to perceive a worse QoL. Mother and father perceive different kind of distress, but having two children appears to be homogeneously protective. Studies are needed to explore discordant perception and finally to improve outcomes and care for pediatric HSCT patients and their families.
Premesse. Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) rappresenta ad oggi la terapia per alcune patologie ematologiche maligne e non maligne e costituisce una sfida per iI paziente in età pediatrica e per la sua famiglia. Il progresso medico relativo alla procedura di HSCT ha significativamente aumentato il numero di trapianti eseguiti ogni anno ed ha migliorato le percentuali di sopravvivenza a lungo termine, pertanto gli studi scientifici hanno spostato il loro focus dalla valutazione dei tassi di sopravvivenza all’esplorazione della Qualità di Vita (QoL). I sopravvissuti a HSCT avvenuto in età pediatrica sono stati dimostrati essere una popolazione più suscettibile allo sviluppo di sequele psicologiche, cognitive, sociali e familiari, oltre che mediche (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). L’obiettivo dello studio è la valutazione degli aspetti psicosociali e comportamentali oltre che della QoL dei soggetti pediatrici sopravvissuti ad HSCT e delle loro famiglie (includendo i fratelli). Obiettivi secondari sono: la valutazione del livello di accordo tra survivor e genitori relativamente agli aspetti psicopatologici ed alla QoL, la valutazione dello stress genitoriale e infine l’identificazione di fattori di rischio e fattori protettivi per la salute mentale di questi soggetti. Metodo. Sono stati testati soggetti pediatrici sopravvissuti ad HSCT (almeno 5 anni dopo il trapianto) e i loro genitori. Ad ognuno è stato richiesto di completare una batteria di test che includeva i questionari di Achenbach (Child BehaviourChecklist-CBCL; Youth Self Report-YSR) e il PediatricQuality of Life Inventory 4.0 (PedsQL) e di produrre un breve testo libero. Ai genitori è stata richiesto inoltre di completare una intervista anamnestica ed ulteriori due test: il Short Form-36 (SF-36) e il Parenting Stress Index (PSI). Ai fratelli del sopravvissuto è stato chiesto di completare la YSR e di produrre un breve testo libero. I dati sono stati elaborati con l’utilizzo del software SPSS. Risultati. Dal 2012 sono stati reclutati 37 soggetti sopravvissuti ad HSCT (62% maschi). L’età media al momento dell’HSCT era 10 anni (range 0,7-11,2 anni). Cinquantaquattro percento dei sopravvissuti era stato sottoposto a trapianto allogenico non familiare. Sono stati inoltre testati 74 genitori e 38 fratelli. I punteggi dello YSR superano i cut off per competenze totali (22%), competenze sociali (13%) e lamentele somatiche (8%), mentre i punteggi alle CBCL risultano patologici principalmente nelle aree di competenze totali (49%), attività (22%) e sintomi somatici (11%). I sintomi riportati alla CBCL appaiono più significativi se: il sopravvissuto è femmina, in caso di trapianto allogenico familiare, presenza di tossicità mediche e se il tempo intercorso tra la comunicazione della scelta terapeutica e l’HSCT era più lungo. CBCL e YSR presentano un buon grado di accordo solo relativamente alle scale competenze totali (K=0.06, p= 0.002), sintomi somatici (K=0.21, p= 0.003) e problemi di attenzione (k=0.13; p=0.02). Rispetto alla PedsQL genitori e survivor non appaiono in accordo per l’area fisica (K=0.05; p=0.31) ed emotiva (K=0.09; p=0.06). Nella SF-36 le madri percepiscono una peggiore QoL nella scala relativa alla “limitazione del ruolo” quando hanno un solo figlio o più di tre figli, se il tempo intercorso tra la comunicazione della scelta terapeutica e l’HSCT è breve e in caso di trapianto allogenico familiare. I padri percepiscono una salute mentale peggiore se hanno un unico figlio o più di due e se sono sposati. I fratelli più vicini al sopravvissuto per ordine di genitura sembrano presentare una peggiore QoL secondo i genitori. Conclusioni.I soggetti sopravvissuti a HSCT in età pediatrica presentano livelli di stress psicologico in diverse aree (internalizzante, esternalizzante, dell’attenzione e della socializzazione), con una prevalenza di sintomi somatici. Rispetto alla QoL, i genitori riportano un funzionamento emotivo del sopravvissuto migliore a fronte di un peggiore funzionamento fisico. Il primo fratello sembra percepire una QoL peggiore. Madri e padri percepiscono diversamente il proprio distress, ma il fatto di avere due figli appare rappresentare in modo omogeneo un fattore protettivo. Saranno necessari ulteriori studi per approfondire la discordanza tra le percezioni e infine migliorare l’outcome e la cura dei pazienti pediatrici sottoposti ad HSCT e delle loro famiglie.

Background. The term metabolic syndrome (MS) identifies a cluster of cardiovascular risk factors having insulin resistance as a key pathogenetic clue. A high prevalence of a MS-like pattern has been reported in cancer chemotherapy survivors, notably among patients affected by oncohematologic diseases. However, MS in cancer patients clinically differs from its “spontaneous” counterpart, bearing a resemblance to other MS-like pictures observed in solid transplant recipients and in HIV survivors, attributed to immunosuppressive and anti-retroviral drugs. These observations enabled to coin the term “secondary MS” characterized by possible pathogenetic differences with spontaneous MS. Disturbances in adipokine homeostasis have been sometimes claimed as possible alternative pathogenetic clues for “secondary MS”. Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a particularly interesting field of investigation, due to the delivery of high dose chemotherapy in autologous and of immunosuppression combined with chemotherapy in allogeneic HSCT. Over the last 15 years, an increased prevalence of MS has been recognized in HSCT recipients as a post-transplant long term effect. Nevertheless, most of the available study have a retrospective design and mainly refer to allogeneic HSCT, overlooking the contribution of high dose chemotherapy alone. Moreover, the inclusion criteria are widely different among the reports and do not consider possible pathogenetic clues. In a previous retrospective study, our group reported an increased prevalence of MS among HSCT long term survivors in continuous CR and off therapy, associated with an altered pattern of adipokine expression. In a subsequent study we proved that post-transplant MS differ from spontaneous MS by distribution of the single MS features and by adipokine profile. Aim of the study The above considerations enabled us to plan a prospective study aimed at evaluate in a series of HSCT recipients, at fixed intervals, the prevalence of MS features and the evolution of biochemical and biological parameters possibly involved in MS pathogenesis. Materials and methods After approval by the local Ethic Commission, patients referred either to autologous or allogeneic HSCT, were enrolled to the study over a two years period. For each patient, an anonymous record including anamnestic and clinical data, laboratory and adipokine profile was made. Data were collected at fixed interval: before transplant, after a month, after 100 days, after a year and subsequently every each year. According to the ATPIII criteria a diagnosis of MS was established and each of its components was defined. At each time, patients with MS were compared with those without. In order to better assess the risk of developing MS, the series was also split into three groups: patient with baseline MS, patients developing MS and patients never developing MS. Baseline values were also compared with those of 27 post-transplant MS patients, 27 healthy controls and 27 patients with spontaneous MS of a subsequent comparative study. The following variables were considered as possibly linked to the development of MS or each of its component: age, sex, baseline disease, type of transplant (autologous or allogeneic), blood glucose, insulin, insulin resistance index (HOMA IR = fasting insulin mcU/mL x fasting glucose mmol/L), HbA1c, triglycerides, total cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol according to Friedewald formula, uric acid, microalbuminuria, CRP, fibrinogen, TSH, FSH, LH, testosterone, 17-beta estradiol, familiar history for diabetes or cardiovascular diseases, leptin, alpha-TNF, resistin, adiponectin, hypogonadism (testosterone < 231 ng/100 mL in men, 17- -estradiol < 20 pg/mL in women), GVHD and smoking. Relationships between the selected variables and MS or its single features were assessed at each time point with a univariate analysis, through the Student t test for differences in median values and through the chi-square test for differences in incidences, and with a multivariate analysis through a Cox regression model. Results Ninety-nine patients undergoing HSCT (M/F 58/41, autologous 52, allogeneic 47, median age 49 years, range 20-69) were enrolled in the study and had completed a year of follow up. Relying on basal values, a diagnosis of MS could be established 24 patients, 11 referred to autologous and 13 to allogeneic HSCT. Eleven additional patients had double dyslipidemia, 6 referred to autologous and 5 to allogeneic HSCT. Patients with MS had significantly higher leptin (p<0.01) and fibrinogen (p<0.01) and lower adiponectin (p<0.01) levels in comparison with patients without MS. Patients with double dyslipidemia (DD) had significantly higher leptin (p<0.01) and fibrinogen (p<0.05) and lower adiponectin (p<0.01) levels in comparison with patients without DD. Patients referred for HSCT differed from a local reference population because of higher leptin (p<0,01) and lower adiponectin (p<0,05) levels; conversely, their leptin levels were comparable with those of patients with spontaneous MS and lower than those of post-transplant MS. Adiponectin levels were comparable with those of patients with post-transplant MS and significantly higher than those of patients with “spontaneous” MS ( p<0,05). After one month 43 HSCT patients, 13 autologous and 30 allogeneic HSCT patients, had MS. Eight additional patients had isolated double dyslipidemia, 5 after autologous and 3 after allogeneic HSCT. After 100 days, 9 patients had died, 6 of them having MS; a diagnosis of MS could be established in 34 patients. Isolated double dyslipidemia was observed in 9 patients, one autologous and 8 allogeneic HSCT recipients. After one year, 77 patients were still alive and in follow up. Of 16 deceased patients, 12 had MS. A diagnosis of MS could be established in 21 patients, whereas in three additional patients a previous diagnosis of MS could not be more confirmed. Isolated DD was observed in 8 patients, one autologous and 7 allogeneic HSCT recipients. At each interval, leptin levels were significantly reduced and adiponectin levels significantly increased in comparison to basal values. Nevertheless, patients with MS still retained a significantly altered adipokine pattern in comparison to those without. The excess in mortality of MS patients in comparison to those without, was statistically significant (p<0.04). At univariate analysis, basal adiponectin, resistin, leptin and fibrinogen levels were risk factors for developing MS. At subsequent times, leptin and resistin still resulted as risk factors for developing MS in the whole series and in autologous HSCT, but not in allogeneic HSCT; similar results were obtained for HOMA and insulin. At the different time intervals, leptin, resistin and HOMA proved to be risk factors more frequently related to the development of the single HSCT features. Moreover, patients with likely reduced previous chemotherapy exposition (multiple myeloma and autoimmune diseases) had a significantly lower risk of developing MS (p<0.02). At multivariate analysis, baseline HOMA (p<0.002), microalbuminuria (p<0.04), leptin (p<0.001) and type of transplant (p<0.002) were significant linked to the presence MS. At +30 days, HOMA (p<0.05), HBA1c (p<0.003) and type of transplant (p<0.03) were significantly linked to the presence of MS. Moreover, the presence of one of the MS features (waist circumference p<0.0001, hypertension <0.01, blood glucose p<0.03 and triglycerides p<0.0001) at baseline evaluation were predictor of developing +30 days MS. Conclusions The study bears no resemblance to the other available due to the prospective design, the inclusion of autologous HSCT patients and the evaluation of insulin resistance and adipokines. The major limitation is the relatively small size of the series. Baseline data show that patient referred to HSCT, are a population with a high prevalence of metabolic syndrome. This finding is in keeping with multiple papers dealing with MS among cancer chemotherapy survivors. Moreover, we confirm our and other previous findings that MS both after cancer chemotherapy and HSCT differ by clinical features because of higher prevalence of dyslipidemia and a lower rate of hypertension, so suggesting a somewhat different pathogenesis. Univariate and multivariate analysis underscore the major role of an altered adipokine profile, notably hyperleptinemia. As in the only comparable retrospective study, we found a burst of MS at +30 day after HSCT. The major determinants were insulin resistance and immunosuppression. The effect of previous chemotherapy cannot be underestimated, since patients with a presumably lower load of previous chemotherapy had a significantly lower risk of developing MS. As suggested by other investigations, double dyslipidemia patients built up a major reservoir of new MS cases. More generally, multivariate analysis reveals that patients with one baseline MS feature had an increased risk of subsequently developing MS. An apparent decrease in MS prevalence at +100 days and at one year, is significantly related to an higher short term mortality among patients developing post-transplant MS. Since both autologous and allogeneic HSCT recipients are involved, both TRM and early relapse are related to MS. The presented data help defining a model encompassing post chemotherapy and post-transplant MS. Cancer chemotherapy patients are a population characterized by an increased prevalence of MS with some particular clinical features pathogenetically related to adipokine profile disturbances. In the early post-transplant, a burst of MS is registered, mainly related to insulin resistance and immunosuppression and mainly deriving from patients with one baseline MS feature but not full blown MS. A medium term decrease in MS is related to an increase in mortality among patients developing post-transplant MS. A subsequent progressive increase in MS rate is attributable to an adipokine profile derangement among long term HSCT survivors, as suggested in our previous retrospective study.

L’impatto del microbiota intestinale(MI) sulla mortalità correlata al trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche(TCSE) è stato recentemente dimostrato. Questa osservazione corrobora l’idea di un ruolo significativo del MI nella ricostruzione immunologica successiva al TCSE e nella genesi della Graft-versus-Host-Disease acuta(GvHD). Abbiamo pertanto condotto il primo studio longitudinale sul ruolo del MI nella genesi di GvHD in pazienti pediatrici sottoposti a TCSE. Sono stati arruolati 10pazienti, di cui 5 con GvHD. Per ogni paziente sono stati raccolti campioni fecali seriati ogni 10-15 giorni fino a 100 giorni dopo il TCSE. Il profilo filogenetico del MI è stato caratterizzato mediante pyrosequencing 454 della regione ipervariabile V4 della subunità 16S dell’rRNA. Il profilo funzionale è stato valutato mediante l’analisi degli acidi-grassi-a-corta-catena utilizzando la gas cromatografia-spettroscopia di massa. Dopo il TCSE è stata osservata una profonda distruzione strutturale e funzionale del normale assetto mutualistico dell’ecosistema intestinale. La traiettoria di ricostruzione del MI dopo il TCSE è risultata essere significativamente differente tra i pazienti con e senza GvHD. In particolare, nei pazienti senza GvHD è stata evidenziata prima del TCSE una precisa signature del MI, caratterizzata da un’elevata concentrazione di Bacteroidetes e Parabacteoidetes(p<0.05, Fig. 1). Parallelamente nei pazienti senza GVHD è stato osservato un aumento significativo degli acidi-grassi-a-corta-catena e di propionato in particolare(p<0.05). Questa caratteristica signature si è proiettata dopo il TCSE, persistendo alla distruzione dell’ecosistema intestinale e dimostrando l’elevata adattabilità di questi germi. I nostri dati indicano che le dinamiche dell’ecosistema microbico intestinale possono essere un fattore in grado di influenzare l’insorgenza di GvHD. In particolare, la presenza di un profilo mutualistico pre-TCSE del MI, caratterizzato dalla presenza di germi produttori di acidi-grassi-a-corta-catena con riconosciute proprietà immunomodulatorie, sembra mitigare il rischio di sviluppare GVHD. Questi risultati aprono quindi nuove prospettive sulla possibilità di manipolare il MI pre-TCSE per modulare la ricostruzione del sistema immunitario.
The impact of the gut microbiota(MI) on allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(HSCT) has been recently demonstrated. This observation supported the idea of a significant role of MI in the immunological reconstruction after HSCT and in the genesis of acute Graft-versus-Host-Disease(GvHD). We therefore conducted the first longitudinal study on the role of MI in the onset of GvHD in pediatric patients undergoing HSCT. 10 patients were enrolled, including 5 with GvHD. For each patient were collected seriated fecal samples every 10-15 days up to 100 days after HSCT. The phylogenetic profile of MI was characterized by pyrosequencing 454 of the hypervariable V4 region of the 16S rRNA subunit. The functional profile was evaluated by analysis of fatty acid-fat-to-short-chain using the gas chromatography-mass spectroscopy. After HSCT a profound structural and functional destruction of the normal position mutualistic gut ecosystem was observed. The reconstruction of the trajectory of the MI after HSCT was significantly different between patients with and without GVHD. In particular, in patients without GVHD, a precise of the MI signature before the HSCT was highlighted, characterized by a high concentration of Bacteroidetes and Parabacteoidetes(p <0.05, Fig. 1). In parallel in patients without GVHD it was observed a significant increase of the fatty-acid-to-short-chain and in particular propionate(p <0.05). This characteristic signature was projected after HSCT, persisting to the intestinal ecosystem destruction and demonstrating the high adaptability of these germs. Our data indicate that the intestinal microbial ecosystem dynamics can be a factor influencing the onset of GvHD. In particular, the presence of a mutualistic profile pre-HSCT of the MI, characterized by the presence of germs producers of acid-fat-to-short-chain recognized with immunomodulatory, seems to mitigate the risk of developing GVHD. These results therefore open new perspectives on the possibility of manipulating the MI pre-HSCT to modulate the reconstruction of the immune system.

L’impatto del microbiota intestinale(MI) sulla mortalità correlata al trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche(TCSE) è stato recentemente dimostrato. Questa osservazione corrobora l’idea di un ruolo significativo del MI nella ricostruzione immunologica successiva al TCSE e nella genesi della Graft-versus-Host-Disease acuta(GvHD). Abbiamo pertanto condotto il primo studio longitudinale sul ruolo del MI nella genesi di GvHD in pazienti pediatrici sottoposti a TCSE. Sono stati arruolati 10pazienti, di cui 5 con GvHD. Per ogni paziente sono stati raccolti campioni fecali seriati ogni 10-15 giorni fino a 100 giorni dopo il TCSE. Il profilo filogenetico del MI è stato caratterizzato mediante pyrosequencing 454 della regione ipervariabile V4 della subunità 16S dell’rRNA. Il profilo funzionale è stato valutato mediante l’analisi degli acidi-grassi-a-corta-catena utilizzando la gas cromatografia-spettroscopia di massa. Dopo il TCSE è stata osservata una profonda distruzione strutturale e funzionale del normale assetto mutualistico dell’ecosistema intestinale. La traiettoria di ricostruzione del MI dopo il TCSE è risultata essere significativamente differente tra i pazienti con e senza GvHD. In particolare, nei pazienti senza GvHD è stata evidenziata prima del TCSE una precisa signature del MI, caratterizzata da un’elevata concentrazione di Bacteroidetes e Parabacteoidetes(p<0.05, Fig. 1). Parallelamente nei pazienti senza GVHD è stato osservato un aumento significativo degli acidi-grassi-a-corta-catena e di propionato in particolare(p<0.05). Questa caratteristica signature si è proiettata dopo il TCSE, persistendo alla distruzione dell’ecosistema intestinale e dimostrando l’elevata adattabilità di questi germi. I nostri dati indicano che le dinamiche dell’ecosistema microbico intestinale possono essere un fattore in grado di influenzare l’insorgenza di GvHD. In particolare, la presenza di un profilo mutualistico pre-TCSE del MI, caratterizzato dalla presenza di germi produttori di acidi-grassi-a-corta-catena con riconosciute proprietà immunomodulatorie, sembra mitigare il rischio di sviluppare GVHD. Questi risultati aprono quindi nuove prospettive sulla possibilità di manipolare il MI pre-TCSE per modulare la ricostruzione del sistema immunitario.
The impact of the gut microbiota(MI) on allogeneic hematopoietic stem cell transplantation(HSCT) has been recently demonstrated. This observation supported the idea of a significant role of MI in the immunological reconstruction after HSCT and in the genesis of acute Graft-versus-Host-Disease(GvHD). We therefore conducted the first longitudinal study on the role of MI in the onset of GvHD in pediatric patients undergoing HSCT. 10 patients were enrolled, including 5 with GvHD. For each patient were collected seriated fecal samples every 10-15 days up to 100 days after HSCT. The phylogenetic profile of MI was characterized by pyrosequencing 454 of the hypervariable V4 region of the 16S rRNA subunit. The functional profile was evaluated by analysis of fatty acid-fat-to-short-chain using the gas chromatography-mass spectroscopy. After HSCT a profound structural and functional destruction of the normal position mutualistic gut ecosystem was observed. The reconstruction of the trajectory of the MI after HSCT was significantly different between patients with and without GVHD. In particular, in patients without GVHD, a precise of the MI signature before the HSCT was highlighted, characterized by a high concentration of Bacteroidetes and Parabacteoidetes(p <0.05, Fig. 1). In parallel in patients without GVHD it was observed a significant increase of the fatty-acid-to-short-chain and in particular propionate(p <0.05). This characteristic signature was projected after HSCT, persisting to the intestinal ecosystem destruction and demonstrating the high adaptability of these germs. Our data indicate that the intestinal microbial ecosystem dynamics can be a factor influencing the onset of GvHD. In particular, the presence of a mutualistic profile pre-HSCT of the MI, characterized by the presence of germs producers of acid-fat-to-short-chain recognized with immunomodulatory, seems to mitigate the risk of developing GVHD. These results therefore open new perspectives on the possibility of manipulating the MI pre-HSCT to modulate the reconstruction of the immune system.

La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

Bone, a specialized connective tissue, consists of cells and mineralized extracellular matrix. The main cell types of bone tissue are: the osteoblasts, the osteocytes and the osteoclasts. Osteoblasts produce extracellular matrix, osteoclasts are responsible of its resorption, hence bone physiology is a delicate balance between synthesis of new bone and resorption of the old one. Osteoporosis is a disease in which catabolic activity of osteoclasts overtakes anabolic activity of osteoblasts leading to increased bone resorption and progressive bone fragility. Primary osteoporosis is a common disease among post-menopausal female population. Pathologies as diabetes mellitus, hyperparathyroidism and long-term treatment with glucocorticoids cause secondary osteoporosis. Glucocorticoid-induced osteoporosis is the most common type of secondary osteoporosis. Glucocorticoid treatment is a well known method to induce osteoporosis in animal models, hence it could be an example of “translational model” in which injured bone could be repopulated by stem cells or progenitors in clinical trials. The aim of this thesis is to investigate whether preosteoblasts could repopulate injured bone in an animal model treated with glucocorticoids. Preosteoblasts have been isolated from newborn calvariae of GFP mice. In these cells, expression of the osteogenic marker Runx2 has been assessed by Real time PCR, while osteogenic potential has been analysed by cytochemistry assays to detect alkaline phosphatase and mineralized bone nodules (Alizarin Red and Von Kossa staining). To realize the in vivo model, C57BL/6 three months aged mice have been divided into three groups [group I (n=4): mice not treated with drug and not infused with cells, group II (n=4): mice treated with drug and not infused with cells, group III (n=4): mice treated with drug and infused with cells]. Drug (methylprednisolone) has been administered for one month with a dose of 75 mg/Kg/week. In mice of group III, 5 x 105 GFP preosteoblasts, previously expanded in vitro, have been infused with injection into the tail vein. Mice have been sacrificed, tibial and femoral bones have been harvested, processed and analysed by istomorphometry and immunoistochemistry. Expression of Runx2, osteonectin (SPARC) and alkaline phosphatase (ALP) in these tissues has been detected with Real time PCR. In vitro preosteoblasts produce alkaline phosphatase during early time in culture with normal medium, while the level decreases in differentiating conditions with medium containing ascorbic acid and β-glycerophosphate. Preosteoblasts maintained in differentiation medium for 30 days are positive to Alizarin and Von Kossa staining, hence they are able to produce mineralized extracellular matrix that is a feature of functional mature osteoblasts. Runx2 expression increases during differentiating conditions; in cells maintained in differentiation medium for 30 days there is an increase of 50% compared to cells maintained in normal medium (p<0.05). In mice of group III an increased level of parameters concerning osteoid has been detected (O.Th, OS/BS, OV/BV) and an increased number of active osteoblasts (during synthetic activity) has been observed compared to group II. Between these two groups, significant variations of bone volume (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular number (Tb.N) and trabecular separation (Tb.Sp) have not been detected. Microarchitecture parameters (Nd.N/TV, Nd/Tm) have not been affected. Similar results have been obtained from inderect microarchitecture parameters as Marrow Star Volume and Fractal Dimension. Real time PCR analysis revealed a reduction in osteogenic gene expression in group II compared to group I (ALP: -50%, p<0.01; Runx2: -56.75%, p<0.01; SPARC: -44.5%, p<0.05). In group III there is a recovery of expression of osteogenic markers (ALP: +40%, p<0.05; Runx2: +66.28%, p<0.001; SPARC: +55%; p<0.01) compared to group II. Immunoistochemistry is under investigation. In our glucocorticoid-induced osteoporosis model we sacrificed mice only one week after infusion of cells, this preparatory investigation shows that our model induces the engraftment of preosteoblasts in injured bone. However, a longer time, at least of 1-2 months, is needed to investigate if preosteoblasts are able not only to graft onto host tissue, but also to proliferate in vivo and to differentiate in full mature and functional osteoblasts.
L’osso è un tessuto connettivo specializzato costituito da cellule e matrice extracellulare mineralizzata. Le cellule principali sono gli osteoblasti, gli osteociti e gli osteoclasti. Gli osteoblasti depongono la matrice ossea, mentre gli osteoclasti sono i responsabili del suo riassorbimento. La fisiologia dell’osso è quindi il risultato di un delicato equilibrio tra deposizione di matrice ossea e suo riassorbimento. Quando l’azione catabolica degli osteoclasti è maggiore rispetto a quella anabolica degli osteoblasti si produce una progressiva fragilità ossea che porta ad un quadro clinico osteoporotico. L’osteoporosi primaria colpisce soprattutto la popolazione femminile dopo la menopausa. Molte patologie come il diabete mellito, l’iperparatiroidismo ed il trattamento a lungo termine con glucocorticoidi causano l’osteoporosi secondaria. L’osteoporosi indotta da glucocorticoidi è la più comune causa di osteoporosi secondaria. Il trattamento con glucocorticoidi è un noto procedimento di induzione dell’osteoporosi in modelli animali e può dunque rappresentare un primo esempio di modello “traslazionale” potenzialmente applicabile in clinica per indurre un ripopolamento dell’osso con cellule staminali mesenchimali o precursori osteogenici. Lo scopo di questo lavoro è stato pertanto valutare nel modello animale se sia possibile ripopolare l’osso danneggiato con preosteoblasti. I crani di topi neonati transgenici (GFP) sono stati prelevati e messi in coltura per ottenere preosteoblasti. Nelle colture in vitro è stata valutata l’espressione del gene Runx2 con la tecnica di Real time PCR, mentre la capacità osteogenica è stata analizzata con colorazioni citochimiche per la fosfatasi alcalina e per la deposizione di matrice ossea mineralizzata (Alizarin Red e Von Kossa). Per la realizzazione del modello in vivo topi C57BL/6 maschi di 3 mesi sono stati divisi in 3 gruppi [gruppo I (n=4): topi non trattati con farmaco e non infusi con cellule; gruppo II (n=4): topi trattati con farmaco non infusi con cellule; gruppo III (n=4): topi trattati con farmaco ed infusi con cellule]. Il farmaco (metilprednisolone) è stato somministrato per un mese alla dose di 75 mg/Kg/settimana. Negli animali appartenenti al gruppo III sono state infuse, attraverso iniezione nella vena della coda, 5 x 105 preosteoblasti GFP precedentemente espansi in vitro. I topi sono stati sacrificati, le tibie ed i femori sono stati prelevati e processati per l’analisi istomorfometrica e della microarchitettura ossea e per l’ immunoistochimica. In questi tessuti, l’espressione genica di Runx2, osteonectina (SPARC) e fosfatasi alcalina (ALP) è stata valutata tramite Real time PCR. In vitro i preosteoblasti producono fosfatasi alcalina durate i primi giorni di coltura in medium non differenziante, mentre il livello decresce in condizioni differenzianti, cioè in medium contenente acido ascorbico e β-glicerofosfato. I preosteoblasti mantenuti in medium di differenziamento per 30 giorni sono positivi alle colorazioni Alizarin Red e Von Kossa, quindi sono in grado di produrre matrice ossea mineralizzata, caratteristica degli osteoblasti funzionali e maturi. L’espressione del gene Runx2 aumenta durante il differenziamento, si ha un aumento del 50% nelle cellule differenziate per 30 giorni rispetto alle cellule non differenziate (p<0.05). L’inoculazione dei preosteoblasti nei topi del gruppo III ha evidenziato un aumento dei parametri statici di neoformazione ossea relativi all’osteoide (O.Th, OS/BS, OV/BV) ed un aumento del numero di osteoblasti attivi, cioè in corso di deposizione di osteoide, rispetto al gruppo II. Tra questi due gruppi non si sono osservate, invece, variazioni significative in termini di volume osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th) numero delle trabecole (Tb.N) e separazione fra esse (Tb.Sp). Non sono state rilevate, inoltre, differenze dei parametri di microarchitettura (Nd.N/TV, Nd/Tm). Risultati simili sono emersi dalla valutazione dei parametri indiretti di microarchitettura (Marrow Star Volume e Fractal Dimension). L’espressione genica ha dimostrato che nel gruppo II si ha una riduzione dell’espressione dei geni osteogenici rispetto al gruppo I (ALP: -50%, p<0.01; Runx2: -56.75%, p<0.01; SPARC: -44.5%, p<0.05). Nel gruppo III si è avuto un recupero dell’espressione dei geni osteogenici (ALP: +40%, p<0.05; Runx2: +66.28%, p<0.001; SPARC: +55%, p<0.01) rispetto al gruppo II. I campioni di tessuto per l’ immunoistochimica devono essere processati. Nel nostro modello sperimentale di osteoporosi indotta da glucocorticoidi nel topo, abbiamo sacrificato gli animali solo una settimana dopo l’infusione delle cellule; questi dati preliminari dimostrano che il nostro modello induce l’engraftment dei preosteoblasti nell’osso danneggiato. Tuttavia è richiesto un tempo di osservazione più lungo, di almeno 1-2 mesi per valutare se le cellule trapiantate siano in grado, non solo di integrarsi nel tessuto dell’ospite, ma anche di proliferare in vivo e di differenziare in osteoblasti maturi e funzionali.

Abbiamo studiato una strategia per migliorare i sintomi motori di topi che avevano ricevuto lesioni con una neurotossina specifica, MPTP, un modello murino di morbo di Parkinson, attraverso il trapianto di precursori cellulari post mortem nello striato. I precursori cellulari neurali post-mortem (PM-NPC) sono stati isolati dalla zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali del topo, coltivati in vitro e la loro capacità di differenziarsi è stata studiata valutando l'espressione di diversi marcatori neurali. PM-NPC differenziano in neuroni e in gran parte a differenza di molti altri precursori, mantengono la capacità di migrazione e integrazione, quando trapiantate nel cervello adulto. Abbiamo eseguito il trapianto di PM-NPC nei gangli della base di topi MPTP lesionati. PM-NPC trapiantate sopravvivono, differenziano e si integrano nel circuito di accoglienza, e modificano il comportamento motorio nei topi MPTP lesionati. I nostri dati suggeriscono che il trapianto di PM-NPC nel corpo striato è un approccio promettente per investigare i potenziali benefici di rimodellamento dei circuiti dei gangli basali nelle malattie neurodegenerative.
We investigated a strategy to ameliorate the motor symptoms of mice that received MPTP lesions, a rodent model of Parkinson’s disease, through transplantation of adult precursor post-mortem cells into the striatum. Post mortem neural precursors (PM-NPCs) were isolated from the subventricular zone (SVZ), grown in vitro and their differentiation capability was investigated by evaluating the expression of different neuronal markers. PM-NPCs differentiate mostly in neurons and unlike most other precursor cells, retain the capacity for migration and integration when transplanted into the adult brain. We performed PM-NPCs transplantation into the basal ganglia of MPTP lesioned mice. Transplanted PM-NPCs survived, differentiated and integrated into host circuitry, and modified motor behavior in MPTP lesioned mice. Our data suggest that PM-NPCs transplantation into the the striatum is a promising approach to invenstigate the potential benefits of remodeling basal ganglia circuitry in neurodegenerative diseases.

Le cellule staminali sono molto rare e per questo il loro impiego in campo clinico è problematico. L’utilizzo del cordone ombelicale, che risolverebbe il problema del donatore, ha purtroppo un’applicazione limitata a causa proprio del numero insufficiente di cellule staminali. Per questo motivo è di fondamentale importanza lo sviluppo di un sistema per l’espansione delle cellule staminali. Nello stesso tempo, per l’applicazione delle cellule staminali in ingegneria tissutale (ad esempio per la riparazione del tessuto osseo) risulta indispensabile l’individuazione di uno scaffold idoneo a tale scopo. Per questo motivo, da un lato è stato studiato un sistema per l’espansione delle cellule staminali emopoietiche di cordone ombelicale, dall’altro è stato fatto uno screening di scaffold diversi per l’applicazione in ingegneria del tessuto osseo. In un nostro precedente studio è stato dimostrato che l’interleuchina (IL)-16 è capace di indurre le cellule CD34+ a proliferare e differenziare in cellule dendritiche mature. In questo lavoro, è stato investigato il ruolo dell’IL-16 nell’espansione delle cellule CD34+ isolate da sangue di cordone ombelicale. E’ stato osservato che l’IL-16 aggiunta al cocktail di base costituito da stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3, aumenta significativamente il numero delle cellule CD34+, della popolazione più primitiva CD34+CD38-, dei progenitori emopoietici e delle LTC-IC (long-term-culture-initiating-cells), non alterando la capacità delle cellule CD34+ di differenziare in linfociti-B e cellule natural killer (NK). L’aggiunta dell’IL-16 aumenta l’attività migratoria delle cellule CD34+ espanse e diminuisce la percentuale delle cellule CD34+CD4+. Questi risultati sembrano suggerire che l’IL-16 possa avere un ruolo importante nell’espansione delle cellule staminali emopoietiche e possa essere utilizzata in clinica per l’espansione delle cellule CD34+ (Articolo I). Scaffold diversi di policaprolattone (PCL) sono stati analizzati al fine di individuare un nuovo biomateriale in grado di promuovere il differenziamento delle cellule staminali mesenchimali di coniglio in osteoblasti. I risultati ottenuti dimostrano che lo scaffold PCL/TZ-HA, ottenuto mescolando PCL e proteina termoplastica zeina, sembra favorire l’adesione ed il differenziamento osteogenico, dimostrando un ottimo potenziale applicativo nell’ingegneria del tessuto osseo (Articolo II). Recentemente è stato sviluppato un nuovo modello dello sviluppo tumorale basato sulle cellule staminali tumorali. Con l’introduzione di tale ipotesi si è fatta avanti la necessità di individuare nuovi marcatori molecolari e sviluppare nuove terapie. Studi precedenti hanno dimostrato che l'aumento d’espressione dei recettori Eph e dei loro ligandi ephrin è in vari casi collegato con fenomeni di progressione tumorale ed angiogenesi. In questo lavoro, è stata valutata l'espressione dei ligandi ephrin-B1-B2 e dei recettori EphB1-B4 in linee cellulari di rabdomiosarcomi e tumori primari. I risultati ottenuti evidenziano deregolazione sia dei ligandi sia dei recettori nelle linee cellulari, mentre un generale aumento dell'espressione delle proteine analizzate è stato registrato nei tumori primari. E’ stata inoltre dimostrata anche una correlazione tra l'espressione di EphB2 ed EphB4 in entrambi i tipi tumorali. La generale deregolazione dell'espressione genica e le correlazioni registrate tra ligandi e recettori e tra EphB2 e EphB4 suggeriscono un ruolo di ephrin-B e EphB nello sviluppo dei RMS (Articolo III).
Stem cells are very rare and this represents a big problem for clinical application. The use of umbilical cord blood, that could be a good alternative source of stem cells, is limited because of the poor number of stem cell that is not sufficient for transplantation. Accordingly, it will be very important to develop an assay to expand ex-vivo stem cell population. At the same time, for stem cell application in tissue engineering (for example bone tissue engineering) it could be very important to prepare a scaffold. This is why we studied an assay for ex-vivo expansion of hematopoietic stem cells isolated from cord blood and we did a screening of biomaterials for bone tissue engineering. A previous work reported that interleukin (IL)-16 can induce CD34+ hematopoietic cells to proliferate and differentiate in-vitro into phenotypically and functionally mature DCs. In this study, the effects of IL-16 on the expansion of CD34+ cells from human cord blood were investigated. IL-16 added to a basal cocktail (BC) composed of stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3,of cytokines significantly enhanced the expansion of CD34+ cells, CD34+CD38-, early stem cells progenitor cells and long-term-culture-initiating-cells (LTC-IC). Moreover, CD34+ cells expanded with IL-16 maintained the capacity to differentiate into the lymphoid-B and -NK lineage. The addition of IL-16 to BC increased the migratory capacity of expanded CD34+ cells compared to BC alone and decreased the percentage of CD34+CD4+ cells. Overall, this study suggests that IL-16 may have a new role in promoting the expansion of hematopoietic stem cells and may represent a new tool for the expansion of CD34+ cells for clinical applications (Paper I). Scaffolds of different composition have been analysed to develop a novel multiphase biomaterial able to promote osteogenic differentiation of rabbit mesenchymal stem cells (rMSC). Results demonstrated that the multi-phase PCL/TZ-HA system showed improved rMSCs adhesion and osteoblast differentiation, thus demonstrating great potential for bone regeneration. (Paper II). Recent advances in tumour progression introduce the concept of cancer stem cells. According to this hypothesis, it will be important to identify new tumour markers and to develop new therapeutic strategies. Previous works demonstrated that increased expression of Eph receptors and their ephrin ligands have been implicated in promoting angiogenesis and tumour progression in several malignancies. Here the expression of mRNA for ephrin-B and EphB receptors in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines and primary tumours were measured. A dysregulation of both ligands and receptors was found in all cell lines. A global up-regulation of ephrin-Bs and EphB receptors in RMS tumours was found. In embryonal tumours, a correlation between ligand and receptor was found. A correlation between EphB2 and EphB4 receptors was demonstrated in both tumour types. The dysregulation of ephrin-B and Eph-B in RMS and the correlations between ligand and receptors and between EphB2 and EphB4 suggest a possible role for ephrin-B and EphB in RMS development (Paper III).

IDENTIFYING NEW MOLECULAR PATHWAYS AND PREDICTOR BIOMARKERS OF GVHD AFTER ALLOGENEIC HSCT Background and rationale Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is a potentially curative option for patients with hematological malignancies. However, its success is limited by life-threatening graft-versus-host disease (GVHD). Strategies to control GVHD are often associated with suppression of the immune system leading to the impairment of the beneficial graft versus tumor (GVT) effect. The ideal approach to prevent and treat GVHD would limit alloantigen-specific reactivity while preserving immunity against malignant cells and pathogens. Chemokines are well known inducers of leukocyte trafficking and activation. Stimulation of the chemokine receptor signaling pathway leads to initiation of the Janus Kinase (JAK)/Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) pathway that contributes to the pathogenesis of GVHD. The key role of JAK signaling in normal and abnormal lymphocyte development and function prompted us to hypotesize that the inhibition of the JAK/STAT signaling could prevent GVHD from developing. We therefore evaluated the efficacy of two distinct JAK inhibitors, CP-690,550 and INC-424, in the allogeneic setting. Moreover, we tested whether the treatment with JAK inhibitors preserved the GVT effect in a mouse model of aGVHD. However, it would be a great advantage to predict aGVHD before its onset in order to tailor the immunosuppressive therapy in a patient-specific manner. To date, noninvasive, diagnostic and prognostic tests for aGVHD are lacking but necessary to predict aGVHD and improve the safety of allo-HSCT. We therefore performed a prospective analysis of miRNA expression profile in plasma of allografted patients to detect specific miRNAs with predictive role for aGVHD. Methods A major histocompatibility complex (MHC) mismatched HSCT mouse model was set up. Lethally irradiated BALB/c mice received spleen (SC) and bone marrow (BM) cells from donors C57BL/6 (B6) mice, and were treated with CP690,550 or INCB18424 for 14 days at 15mg/Kg/day or 45mg/Kg/day respectively. Syngeneic transplants (B6-B6) and BALB/c recipients treated with B6 BM cells only were also used. To determine the GVT activity, allo-HSCT recipients were co-injected with either a B-cell lymphoma cell line (A20) or a myeloid leukemia cell line (RMB-1) and treated or not with INC-424 at the dose of 45mg/kg/day. Mice were monitored for overall survival (OS) and weight loss. GVHD was histologically scored in tissues harvested on day 14, 30 and 60 and cytokine production by ELISA. Immune reconstitution and tumor cells were monitored by flow cytometry. For biomarker discovery, plasma samples from 24 patients who received unmanipulated allo-HSCT were collected weekly. MicroRNAs were isolated from plasma and miRNA expression profile examined using quantitative Real Time PCR. Results JAK/STAT inhibition, especially by INC-424 treatment, caused significantly less GVHD when compared to untreated animals, as determined by survival, weight loss, and histopathology of GVHD target organs. Plasma levels of inflammatory cytokines (IL-6 and IL-12) were significantly reduced in all treated animals when compared to controls. Daily administration of INC-424 post allo-HSCT did not alter hematologic parameters and did not impair immune reconstitution but shifted the CD4+ Treg to CD8+ effector cell ratio because of a relative decrease in the latter population and a relative increase in Treg in GVHD treated mice. A reduction in the Th17/Treg ratio was also observed. When allo-HSCT recipients were challenged with tumor cells, the GVT activity in INCB-424 treated mice was intact in the absence of GVHD, resulting in significantly improved survival compared to untreated animals (p<0.001) and reduced the presence of tumor cells. On the other hand, circulating miRNA profiling before aGVHD onset was able to identify patients at high risk of developing the disease. Two unique miRNAs (miR-194 and miR-518f) were upregulated in samples of patients that would lately develop aGVHD. Pathway prediction analysis indicated that these miRNAs are critical in GVHD pathogenesis. Conclusions The inhibition of JAK/STAT signaling using the sensitive and specific inhibitor of JAK1/JAK2 INC-424 at the optimal dose of 45mg/kg/day, conferred effective protection from lethal acute GVHD in a MHC mismatched HSCT mouse model. Mice retain the ability to mount aggressive graft-versus-tumor (GVT) effects and to generate complete donor T-cell reconstitution. Taken together, these data suggest that INC-424, recently approved for the treatment of myelofibrosis, might also be tested for GVHD prophylaxis and treatment in clinical trials. In addition, considering the non-invasive characteristics of plasma sampling and the feasibility of detecting miRNAs after allo-HSCT, our results indicate that circulating miRNAs represent a promising tool for the early diagnosis of aGVHD. However, inconsistencies with prior published data highlight the need to develop standards for circulating miRNA studies to move their discovery from the molecular biology laboratory to the clinic.

Background. Several studies have shown that patients undergoing HSCT in pediatric age may manifest issues on different areas, psychological, social and medical (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). Few studies have focused on simultaneous analysis of quantitative data with qualitative data (Bingen et al., 2012). The aim of this study is to analyze the perception of illness experience in patients, survivor, and their families. Another aim of the study is to correlate qualitative with quantitative data. Method. Three different populations were asked to answer an open-ended single question about subjective experience of the disease by writing a brief composition. For the first group (Group A), composed by pediatric patients, their parents and siblings, the brief composition was collected before HSCT and one year after the transplantation. In the same way, psychological problems, of the patients and their siblings, were detected with the Child Behavior Checklist 6-18 (CBCL) (Achenbach and Rescorla, 2001) and the HRQoL of parents with the 36-Item Short Form Health Survey (SF-36). The second group (Group B) was composed by survivors, their parents and siblings at least 5 years after HSCT. CBCL was used for the identification of psychological problems in survivors. The third group (Group B-over) included adult subjects undergoing HSCT in pediatric age, at least 5 years after transplantation; the HRQoL was evaluated, for this group, using the SF-36. Socio-demographic and medical data were also collected. For the qualitative analysis of brief composition was used the software T-LAB (Ver. 8.1.4; Lancia 2012), which is capable of connecting evaluation of quantitative data, collected with the use of psychometric questionnaires, with qualitative data, obtained through the brief compositions. Results For the Group A 47 compositions were obtained in T0 and 27 in T1. Abnormal scores in the investigated scales of the CBCL (internalizing problems, externalizing problems) and the SF-36 (Mental Health) recurrently shows some semantic groups. In the waiting for HSCT are frequent lemmas as OTHER_CHILDREN_SICK, OTHER_PARENTS, UNCERTAINTY, DESPAIR, MD_INSTRUMENTS, HSCT and WITH_TOGETHER. Instead, one year after transplant, the lemmas, that are easily used, were ANXIETY_ANGUISH, ACCUSTOM, GOD, LUCK, TOO_MUCH and DEATH. The absence of abnormal scores, in the investigated scales, are related to different semantic themes such as WAIT, DO_NOT_SEE, WHY, SUCCEED, REACT, FACE, UNITED. A year away instead there are lemmas as HELP, FORCE, MOTHER, FATHER, MET_WAR, SERENITY. For Group B 98 compositions were obtained. Abnormal scores of the CBCL scales investigated (Internalizing Problems, Externalizing Problems, Total Problems) show a recurrence with semantic themes such as SIBLINGS, SICK_CHILD, HEALTHY_CHILD, MOTHER, BATTLE. High Scores instead were more correlated with themes such as DESCRIBE, THINKING, MENTAL and DEATH. For the Group B-over 18 brief composition were obtained. We can detect the differences between the genders as males focus more on lemmas such as BODY, CANCER_TREATMENT, OPERATION_MD, MEDICAL_TREATMENT, TEST_MD, while females focuses on semantic themes such as MOTHER, PEOPLE, DONOR, SIBLINGS, FATHER, PSYCHOLOGISTS, MD. Abnormal scores of SF-36 questionnaire (General Health scale) are correlated with the group of patients undergoing autologous HSCT and lemmas such as BODY, CANCER_TREATMENT, OPERATION_MD, TOO_MUCH. High Scores instead are related to keywords like MOTHER, FATHER, PEOPLE, DONOR, SUPPORT and with an allogeneic transplant un-related donor. Conclusion. The first group shows significant differences in the narrations between the various members of the family group even when comparing the scales of the questionnaires used. These differences, present during both stages of the research, indicate that the unit or division of the family, as well as the attitude of acceptance of the disease and how the disease is faced, have an important impact on the mental health status of family members. The family separation, as well as all expressions referring to the disease as a fight, battle and war, appear as a fundamental semantic core in the second group for abnormal scores of the scales investigated. The third group shows significant differences respect to the gender and the type of HSCT. In general we can assume that the care approach should have a particular focus on how the disease acts on the family relationship of all its components.
Premesse. Numerosi studi hanno mostrato come i pazienti sottoposti a HSCT in età pediatrica possano manifestare alcune problematicità su diversi ambiti, come quello psicologico e sociale oltre che su quello medico (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). Pochi studi si sono concentrati sull’analisi simultanea di dati quantitativi con dati qualitativi (Bingen et al., 2012). Lo scopo di questo studio è quello di analizzare la percezione dell’esperienza di malattia sia nei pazienti, o survivor, che nei loro familiari. Altro scopo è quello di correlare dati di natura qualitativa con dati di natura quantitativa. Metodo. Abbiamo chiesto a tre popolazioni differenti di soggetti di rispondere ad una singola domanda aperta con una breve composizione scritta rispetto alla loro esperienza di malattia. Per il primo gruppo (Gruppo A), che ha compreso pazienti pediatrici, genitori e fratelli tale scritto è stato raccolto prima del trapianto e ad un anno da questo. In maniera medesima sono state indagate eventuali problematiche psicologiche nei pazienti e nei loro fratelli mediante il questionario Child Behavior Checklist 6-18 (CBCL) (Achenbach and Rescorla, 2001) e la QdV per i genitori attraverso il 36-Item Short Form Health Survey (SF-36). Il secondo gruppo (Gruppo B) invece ha compreso ex-pazienti pediatrici e i loro familiari testati a cinque anni dal trapianto. È stato utilizzato il questionario CBCL per l’individuazione di problematiche psicologiche negli ex-pazienti. Il terzo gruppo (Gruppo B-over) ha compreso soggetti adulti sottoposti a HSCT in età pediatrica, ad almeno 5 anni distanza dal trapianto, per questo gruppo è stata valutata anche la QdV mediante il questionario SF-36. Dati socio-demografici e sanitari sono stati raccolti. Per le analisi qualitativa dei testi è stato utilizzato il software T-LAB (Ver. 8.1.4; Lancia, 2012), che permette anche la valutazione congiunta di dati quantitativi raccolti mediante i test psicometrici e i dati qualitativi ottenuti attraverso le composizioni scritte. Risultati. Per il gruppo A sono stati raccolti 47 testi in T0 e 27 testi in T1. Punteggi anomali nelle scale indagate della CBCL (Problemi Internalizzanti, Problemi Esternalizzanti) e del SF-36 (Salute mentale) indicano in maniera ricorrente alcuni nuclei semantici. Nell’attesa del trapianto sono frequenti lemmi come ALTRI_BAM_MALATI, ALTRI_GENITORI, INCERTEZZA, DISPERAZIONE, MD_OGGETTI, HSCT E CON_INSIEME. Ad un anno di distanza invece i lemmi che facilmente ricorrono sono ANSIA_ANGOSCIA, ABITUARE, DIO, FORTUNA, MOLTO_TANTO e MORTE L’assenza di punteggi anomali nelle scale indagate invece si correlano a temi semantici differenti come ATTESA, NON_VEDERE, PERCHE_MOT, RIUSCIRE, REAGIRE, AFFRONTARE, UNITI. Ad un anno di distanza invece vi sono lemmi come AIUTO_AIUTARE, FORZA, MAMMA, PAPA, MET_GUERRA, SERENITA. Per il gruppo B sono stati ottenuti 98 scritti. I punteggi anomali delle scale indagate mediante la CBCL (Problemi Internalizzanti, Problemi Esternalizzanti, Problemi Totali) indicano una ricorrenza con temi semantici come FRATELLO_SORELLA, FILGIO_A, FIGLIO_SAN, MAMMA, BATTAGLIA. Punteggi migliori invece correlano maggiormente con temi come DESCRIVERE, PENSARE, PSICHICO_MENTALE, MORTE. Per il gruppo B-over invece sono stati ottenuti 18 brevi scritti. Possiamo rilevare delle differenze tra i generi per cui i maschi si concentrano maggiormente su lemmi come CORPO, CHEMIO_RADIO, OPERAZIONE_MD, CURE_MEDICHE, ESAMI_MD; mentre le femmine su temi semantici come MAMMA, PERSONE, DONATORE, FRATELLO_SORELLA, PADRE, PSICOLOGI, MD. I punteggi anomali indagati mediante il questionario SF-36 (Salute Generale) sono correlati con il gruppo di soggetti sottoposti ad autotrapianto e lemmi come CORPO, CHEMIO_RADIO, OPERAZIONE_MD, MOLTO_TROPPO. Punteggi migliori invece sono legati a parole chiave come MADRE, PADRE, PERSONE, DONATORE, SOSTENERE e con il trapianto allogenico da banca. Conclusioni. Per il primo gruppo emergono differenze significative rispetto alle narrazioni tra i vari membri del gruppo famiglia anche rispetto alle scale dei questionari utilizzati. Tali differenze oltre ad essere presenti rispetto ai due tempi della ricerca indicano come l’unità o la segregazione familiare abbia un’importante impatto sul proprio stato di salute mentale e dei propri figli, così come l’atteggiamento di accettazione e di come viene affrontata la malattia. La segregazione familiare compare come nucleo semantico fondamentale anche nel secondo gruppo per i punteggi anomali rispetto alle scale da noi indagate, come anche tutte le espressioni riferite alla malattia come lotta, battaglia e guerra. Nel terzo gruppo emergono differenze significative rispetto al genere come al tipo di trapianto effettuato. In generale possiamo ritenere che l’approccio di cura debba avere una particolare attenzione su come la malattia agisca sul vincolo familiare di tutti i suoi componenti.

Introduzione. La malattia del trapianto verso l’ospite cronica (cGVHD) è la più importante complicanza dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche. La terapia standard è l’associazione di ciclosporina (CyA) e cortisone; le complicanze infettive correlate alla terapia immunosoppressiva (ISS) o la insoddisfacente risposta al trattamento sono la principale causa di mortalità. La fotoaferesi extracorporea (ECP) si è dimostrata efficace nel trattamento della cGVHD, ma il suo utilizzo è stato prevalentemente limitato alla cGVHD resistente a trattamento di prima linea. Scopo dello studio. Il presente studio pilota ha l’obiettivo di valutare la fattibilità di un programma di ECP in associazione a terapia standard per il trattamento di prima linea della cGVHD ad alto rischio. Il rischio elevato si definisce in base alla presenza di parametri che predicono una elevata mortalità cGVHD correlata. Obiettivi secondari sono la risposta e la incidenza di complicanze (sicurezza). Pazienti. Su 10 pazienti che rispettavano i criteri di arruolamento, 2 hanno rifiutato di aderire allo studio per problemi logistici o rifiuto di un protocollo sperimentale, 8 sono stati arruolati. L’età media è stata di 40 anni. Il donatore era un donatore familiare HLA identico in 7 casi e un donatore non familiare in 1 caso. Tutti i pazienti presentavano cGVHD estesa o moderato/severa; lo score prognostico (secondo Akpek) era >0 in 3/8 pazienti. Trattamento. I pazienti hanno iniziato il trattamento con Prednisone (PDN) 1 mg/kg e CyA alla diagnosi di cGVHD; la ECP è stata iniziata con una frequenza di 4 sedute / mese nei primi 3 mesi e 2 / mese per i successivi 9 mesi; PDN e CyA sono stati lentamente scalati sino alla sospensione se possibile, altrimenti modulati. La durata dello studio è stata di 1 anno. I criteri di uscita dallo studio erano la sospensione della ECP, la necessità di inserire altri farmaci immunosoppressivi per progressione della cGVHD o infezioni severe. La risposta è stata valutata secondo criteri standard come progressione, risposta parziale (PR), ottima PR (vgPR) o risposta completa (CR). Risultati. La aderenza al protocollo è stata: 6/8 pazienti a 3 mesi, 4/8 a 6 e 9 mesi, 3/8 a 12 mesi; l’uscita dallo studio è stata determinata da complicanze infettive in 2 pazienti, sospensione della ECP in 1 paziente a acusa di una trombosi correlata al catetere venoso (CV) femorale inserito per le procedure di ECP, in 2 pazienti per chiara progressione della cGVHD. Nei pazienti valutabili la risposta (CR + vgPR / <=PR) per trimestre è stata 4/6, 2/4 and 3/4 al I, II e III trimestre rispettivamente; dopo il IV trimestre di trattemento sono state osservate 1 vgPR, 2 PR e 1 progressione. Complicanze sono state osservate in 4 pazienti per un totale di 9 episodi: 1 caso di polmonite, 1 caso di infezione delle vie urinarie, 3 casi di riattivazione di CMV, 1 caso di condilomatosi, 1 caso di infezione CVC correlata, 1 caso di trombosi CV femorale correlata, 1 caso di sindrome uremicoemolitica. Ad 1 anno 2 pazienti su 8 sono deceduti (1 caso per mortalità trapianto correlata, 1 caso per recidiva). Conclusioni. La ECP in associazione a terapia standard è fattibile; la incidenza di complicanze sembra essere sovrapponibile a quella osservata nei pazienti non sottoposti a ECP. Per valutare adeguatamente la risposta e la sicurezza di questo trattamento sarà necessario un numero più ampio di pazienti.
Background. Chronic graft versus host disease (cGVHD) is the major late complication after allogeneic stem cell transplantation. Standard therapy is steroid and Cyclosporine-A (CyA); however, immune suppression (ISS) related infections or unresponsiveness to ISS, are major mortality causes. Extracorporeal photopheresis (ECP) has shown activity in treatment of cGVHD, but its use has been limited to first-line-unresponsive cGVHD. Aim of the study. This is a single center pilot study testing feasibility of a programme of photopheresis in association with standard therapy as first line treatment in high risk cGVHD. High risk was defined as the presence of parameters predicting high cGVHD-related mortality. Secondary objectives were response and complications incidence. Patients. Among 10 pts fitting enrolling criteria, 2 refused due to logistic problem or low compliance with the procedure, 8 were enrolled. Median age was 40. Donor was HLA identical sibling in 7 cases and MUD in 1. All cases presented with extensive/moderate-severe cGVHD; Akpek score was > 0 in 3/8 pts. Treatment plan. Pts started with Prednison (PDN) 1 mg/kg and CyA at cGVHD diagnosis; ECP was started with a frequency of 4 application/month in the first 3 months and 2/month for the subsequent 9 months; PDN and CyA were slowly reduced until suspension, or otherwise modulated. Study duration was 1 year. Pts were ruled out the study in case of ECP suspension, requirement of other ISS drugs in case of GVHD progression unresponsive to standard therapy, or severe infections. Response was evaluated with standard criteria, as progression, partial response (PR), very good PR (vgPR) or complete response (CR). Results. Adherence to protocol was: 6/8 pts at 3 months, 4/8 at 6 and 9 months, 3/8 at 12 mm; exit from the study was due to infectious complications (2), ECP suspension due to venous access related thrombosis (1) and clear cGVHD progression (2). In evaluable pts, response (CR+very good PR / <=PR) per trimester was 4/6, 2/4 and 3/4 at I, II and III respectively; at the IV trimester, 1 very good PR, 2 PR and 1 progression were observed. Complications were observed in 4 pts with : 1 case of pneumonia, 1 case of urinary tract infection, 3 cases of CMV antigenemia activation, 1 case of condilomatosis, 1 case of catheter related infection, 1 case of catheter related thrombosis and 1 case of hemolitic uremic syndrome. At 1 year, 2/8 pts died (1 TRM, 1 relapse). Conclusion. ECP in association with standard therapy is feasible; complications incidence seems to be similar to those observed in patients not treated with ECP; a larger group of patients is needed to evaluate response in this setting.

Il trapianto delle cellule staminali emopoietiche umane CD34+ in combinazione con le cellule T regolatorie CD4+/CD25+ FoxP3+ (Tregs) potrebbe prevenire l'alloreattività verso le cellule staminali emopoietiche e ridurre il rischio di rigetto in trapianti allogenici HLA non correlati. Per dimostrare questa ipotesi abbiamo messo in coltura le cellule CD34+ e le cellule CD4+/CD25+ isolate con metodica immunomagnetica (Miltnyi Biotec)da sangue periferico non manipolato,sangue periferico mobilizzato con G-CSF o da Cordone ombelicale. Gli esperimenti svolti in vitro, hanno evidenziato che le cellule Tregs arricchite, ottenute dalla stessa fonte delle cellule CD34+( autologhe), mostravano un effetto inibitorio maggiore sulle celulle T alloreattive, rispetto alle cellule Tregs ottenute da un donatore terzo(allogenico).Inoltre l'attività immunosoppressoria delle Tregs era mantenuta dopo stimolazione con cellule CD34+ allogeniche e i Tregs non modificavano l'attività clonogenica delle cellule staminali CD34+. Avendo ottenuto questi dati in vitro abbiamo trapiantato in topi NOD/SCID le cellule Tregs e le cellule CD34+ in rapporto 1:1 o 1:2 ed è stato osservato un normale attecchimento delle cellule staminali. Incubando queste cellule con dosi fisiologiche di timoglobulina derivata da coniglio (nota molecola immunosopressoria) non veniva modificato il numero dei Tregs dopo 6 giorni di coltura. Dopo l'esposizione alla Timoglobulina, inoltre, i Tregs mantenevano la loro attività soppressoria, aumentava l'espressione del recettore chemochinico CCR7, e venivano rilasciate diverse citochine principalmente l'interleuchina 10(IL-10). Tali dati dimostrano come sia le cellule tregs autologhe che quelle allogeniche potrebbero essere trapiantate insieme alle cellule staminali CD34+ dopo un regime preparatorio di terapia che include la timoglobulina. A tale scopo sono state eseguite selezioni di Tregs da aferesi di donatori sani mobilizzati con G-CSF su scala clinica utilizzando biglie immunomagnetiche Clinical grade (Miltenyi Biotec) e sono state confrontate 2 modalità di selezione con due o tre passaggi con o senza la deplezione dei monociti CD14+.Si è dimostrato così che è possibile selezionare un numero uguale di CD34+ e Tregs ,che con la metodica che prevede la deplezione dei monociti si ottiene una popolazione di cellule Tregs più pura ( > 80%) e infine le applicazioni possibili di questi risultati includo: trapianto di cellule CD34+ del donatore insieme a cellule Tregs in trapianti aploidentici ; infusione of cellule tregs isolate da PBSC mobilizzati con G-nei casi di pazienti con GVHD steroide-resistente; infusione di G-Tregs del donatore nei casi di rigetto di organo trapiantato da of donatore ancora vivente.

Il trapianto delle cellule staminali emopoietiche umane CD34+ in combinazione con le cellule T regolatorie CD4+/CD25+ FoxP3+ (Tregs) potrebbe prevenire l'alloreattività verso le cellule staminali emopoietiche e ridurre il rischio di rigetto in trapianti allogenici HLA non correlati. Per dimostrare questa ipotesi abbiamo messo in coltura le cellule CD34+ e le cellule CD4+/CD25+ isolate con metodica immunomagnetica (Miltnyi Biotec)da sangue periferico non manipolato,sangue periferico mobilizzato con G-CSF o da Cordone ombelicale. Gli esperimenti svolti in vitro, hanno evidenziato che le cellule Tregs arricchite, ottenute dalla stessa fonte delle cellule CD34+( autologhe), mostravano un effetto inibitorio maggiore sulle celulle T alloreattive, rispetto alle cellule Tregs ottenute da un donatore terzo(allogenico).Inoltre l'attività immunosoppressoria delle Tregs era mantenuta dopo stimolazione con cellule CD34+ allogeniche e i Tregs non modificavano l'attività clonogenica delle cellule staminali CD34+. Avendo ottenuto questi dati in vitro abbiamo trapiantato in topi NOD/SCID le cellule Tregs e le cellule CD34+ in rapporto 1:1 o 1:2 ed è stato osservato un normale attecchimento delle cellule staminali. Incubando queste cellule con dosi fisiologiche di timoglobulina derivata da coniglio (nota molecola immunosopressoria) non veniva modificato il numero dei Tregs dopo 6 giorni di coltura. Dopo l'esposizione alla Timoglobulina, inoltre, i Tregs mantenevano la loro attività soppressoria, aumentava l'espressione del recettore chemochinico CCR7, e venivano rilasciate diverse citochine principalmente l'interleuchina 10(IL-10). Tali dati dimostrano come sia le cellule tregs autologhe che quelle allogeniche potrebbero essere trapiantate insieme alle cellule staminali CD34+ dopo un regime preparatorio di terapia che include la timoglobulina. A tale scopo sono state eseguite selezioni di Tregs da aferesi di donatori sani mobilizzati con G-CSF su scala clinica utilizzando biglie immunomagnetiche Clinical grade (Miltenyi Biotec) e sono state confrontate 2 modalità di selezione con due o tre passaggi con o senza la deplezione dei monociti CD14+.Si è dimostrato così che è possibile selezionare un numero uguale di CD34+ e Tregs ,che con la metodica che prevede la deplezione dei monociti si ottiene una popolazione di cellule Tregs più pura ( > 80%) e infine le applicazioni possibili di questi risultati includo: trapianto di cellule CD34+ del donatore insieme a cellule Tregs in trapianti aploidentici ; infusione of cellule tregs isolate da PBSC mobilizzati con G-nei casi di pazienti con GVHD steroide-resistente; infusione di G-Tregs del donatore nei casi di rigetto di organo trapiantato da of donatore ancora vivente.

NEW MANIPULATIVE STRATEGIES EX VIVO FOR PURGING OF PHERIPHERAL HAEMATOPOIETICS STEM CELLS UNITS AIMED FOR AUTOLOGOUS BONE MARROW TRANSPLANTATION This thesis aims to evaluate the possibility of using the Gemtuzumab ozogamicin in ex vivo purging of autologous pheripheral blood mononuclear cells, in order to eliminate possible contaminants leukaemia cells. The use of this drug is subject to verification that the depletion of malignant cells does not cause cytotoxic effects on normal stem cells and normal multi-potential progenitors, which are in charge restocking stable and enduring new bone marrow. Therefore, these experiments were conducted by exposing to Gemtuzumab ozogamicin haematopoietic stem cells mobilized in pheripheral blood and haematopoietic stem cells obtained from cord blood determining their "rate of growth" through clonogenic tests. Based on the above data it can be concluded that: 1) the Gemtuzumab ozogamicin not significantly inhibit the clonal efficiency of subset primitive CD34+/CD38- and mononuclear cells 2) cryopreservation significantly increases the toxic effects of Gemtuzumab ozogamicin probably because of damage to the mambrane, wich promote endocytosis 3) in the clinical purgin, use of Gemtuzumab ozogamicin, should be avoided treatments longer than 24 hs. These data provide the opportunity for future experiments designed to elucidate the phenomena of toxicity found, and allow to plane clinical trials in order to validate the use of Gemtuzumab ozogamicin in haematopoietic stem cells purging obteined with apheresis methods of acute myeloid leukemia patients elect to the autologous bone marrow transplantation
NUOVE STRATEGIE MANIPOLATIVE EX VIVO PER IL PURGING DELLE UNITA DI CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE PERIFERICHE DESTINATE AL TRAPIANTO AUTOLOGO DI MIDOLLO Questo lavoro di tesi si propone di valutare la possibilità  di utilizzare il Gemtuzumab ozogamicina nel purging ex vivo delle PBSC autologhe, al fine di eliminare le possibili cellule leucemiche contaminanti. L'impiego di tale farmaco è subordinato alla verifica che la deplezione delle cellule maligne non provochi effetti citotossici sulle cellule staminali pluri/multi potenti normali, alle quali è deputato il ripopolamento stabile e duraturo del midollo osseo. Pertanto, tale verifica è stata condotta esponendo al Gemtuzumab ozogamicina cellule ematopoietiche mobilizzate nel periferico e cellule ematopoietiche del sangue cordonale e determinando il loro "rate di crescita" mediante test clonogenici su terreno semisolido. In base ai dati ottenuti è possibile concludere che: 1) il Gemtuzumab ozogamicina non inibisce significativamente l'efficienza clonale del subset primitivo CD34+/CD38- e delle cellule mononucleate normali. 2) Il GO riduce significativamente la crescita clonogenica delle cellule capostipiti granulocitiche-macrofagiche del sangue periferico. 3) La criopreservazione incrementa significativamente gli effetti tossici del GO a causa probabilmente di danni a carico della membrana cellulare, che incentivano l'endocitosi. 4) In previsione di un impiego clinico nel purging del GO, dovranno essere evitati trattamenti superiori alle 24 h. Questi dati offrono lo spunto per ulteriori future sperimentazioni atte a chiarire i fenomeni di tossicità  rilevati e motivano la pianificazione di trials clinici finalizzati all'impiego del Gemtuzumab ozogamicina nel purging delle cellule staminali emopoietiche raccolte con procedure aferetiche di pazienti affetti da AML eleggibili al trapianto di midollo osseo autologo.

La malattia del trapianto contro l ospite (Graft versus Host Disease, GvHD), principale complicanza del trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (alloTCSE), è un disordine immunologico scatenato dai linfociti T del donatore contro gli alloantigeni del ricevente; la gravità dipende dalle differenze HLA tra donatore e ricevente, con interessamento di diversi organi (cute, tratto gastrointestinale, fegato, polmoni). Si distinguono la forma acuta e cronica (aGvHD, cGvHD). Le conoscenze sulla patogenesi della forma acuta sono meglio conosciute rispetto a quelle sulla cGvHD, in cui diagnosi e gestione terapeutica rappresentano uno dei maggiori problemi post allo-TCSE. Non esistono ancora marcatori biologici in grado di permettere una distinzione tra le due forme. Clinicamente la forma cronica presenta manifestazioni simili alle malattie autoimmuni (sclerodermia, sindrome di Sijogren, psoriasi, malattie infiammatorie croniche intestinali). Sulla base di questa osservazione, scopo di questo studio è stato quello di analizzare retrospettivamente l espressione di marcatori biologici in parte già noti nelle patologie autoimmuni, in 29 pazienti pediatrici sottoposti ad alloTCSE nel periodo dal 1995 al gennaio 2012 presso l Unità Trapianti della Clinica di Oncoematologia di Padova che hanno o meno sviluppato GvHD. Secondo la vecchia classificazione temporale e successiva revisione secondo il National Institute of Health (NIH) sono stati inclusi pazienti con aGvHD (vecchia classificazione: 11 pazienti; NIH 2005: 13 pazienti), con cGvHD preceduta dalla forma acuta (vecchia classificazione: 14 pazienti; NIH 2005: 12 pazienti), pazienti che non avevano sviluppato GvHD (4 pazienti). Sono state eseguite analisi di espressione genica di citochine mediante Sybr Green Real Time Quantitative PCR (RQ PCR) e studio del profilo fosfoproteomico delle proteine coinvolte nelle principali vie di trasduzione del segnale, proliferazione e attivazione delle cellule B e T e nell infiammazione mediante Reverse Phase Protein Array (RPPA). In RQ PCR l'IL22 è risultata essere maggiormente espressa nei pazienti con cGvHD in fase attiva rispetto agli altri pazienti (p value 0,02). Per mancanza di dati completi riguardanti la caratterizzazione immunofenotipica dei pazienti analizzati, non è stato possibile attribuire l aumentata produzione di IL22 a nessun sottotipo cellulare specifico. Avendo a disposizione dati precedentemente raccolti sul numero di cellule Natural Killer (NK), non è stata osservata correlazione con l espressione di IL22, sebbene non sia possibile escludere un possibile ruolo delle NK non avendone studiato lo stato di attivazione. Nell ipotesi di un possibile ruolo delle Th17, è stata osservata correlazione tra espressione genica di IL22 e quella di IL17 (rho: 0,7); tale dato è stato avvalorato dallo studio di fosfoproteomica relativo all espressione delle proteine coinvolte nel pathway di espressione dell IL22 nelle Th17 (JAK2, STAT3 e TYK2): dopo rivalutazione dei pazienti secondo i nuovi criteri NIH del 2005 è stata osservata una tendenza della loro maggiore espressione nel gruppo di pazienti con cGvHD in fase attiva rispetto ai pazienti in remissione completa. Le Th17 potrebbero essere implicate nell aumento dell espressione dell IL22, sebbene possano essere coinvolte anche altre popolazioni (Th1, Th22). L IL22 potrebbe rappresentare un potenziale marker di stato attivo di cGvHD. Al fine di valicare i dati ottenuti bsarà necessario: 1) aumentare la casistica, 2) dosare i livelli plasmatici di IL22, 3) valutare la presenza delle sottopopolazioni Th1, Th17 e Th22, nonché studiare lo stato di attivazione delle NK ai vari timepoint considerati post alloTCSE. Sarà infine interessante studiare l attivazione dei pathway a valle del recettore dell IL22 nelle biopsie dei tessuti interessati dalla cGvHD

Recently single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the genes NOD2-CARD15, IL23-R and TLR-4 have been showed to influence the risk for acute GvHD in patients who underwent to allogeneic hematopoietic stem cells (HSCs) transplantation. To investigate whether these genes play a role in the pathogenesis of GvHD also in the Sardinian population, 8 SNPs four for NOD2, two for TLR4 and two for IL23R in 86 recipients, their coupled donors and in 150 healthy Sardinians individualswere genotyped and the SNPs frequencies compared. The SNP rs2066842 of NOD2 gene was significantly increased in the group of patients who did not develop acute GvHD(p = 0.002). Our data, if confirmed in GvHD patients from other population, could suggest the inclusion of the non-HLA NOD2/CARD15 genes genotyping in the attribution of the immunological donor/recipient pre-transplant score.

2008/2009
The NS culture system is an innovative yet not fully characterized method of culturing neural stem cells (NSCs). Previous reports have described the possibility of isolation of a virtually pure NSC culture from embryonic, fetal or adult NSCs (Conti et al., 2005; Pollard et al., 2006; Sun et al., 2008). These cells, grown in adhesion, are called NS cells and show radial glial characteristics. The present thesis aims to characterize the in vitro and in vivo behaviour of human and mouse NS cells. In the first study, we describe the isolation of a new strain of human striatal NS cells. They show unique features in vitro, and can be efficiently differentiated into neurons. After transplantation in newborn rats, they survive, migrate and differentiate in the host brain. In the second part of the thesis, we show that mouse ES-derived NS cells fuse with cortical pyramidal neurons after transplantation in mice or rats. This process is mediated by microglia, which first fuse with the NS cells and then with the neurons. This NS-microglia-neuron fusion has not been previously described, although it occurs both in vivo and in vitro. In summary, we report here previously undescribed features of the NS cells; our results are relevant to better understanding of NSCs in general and their behaviour after transplantation in the brain.
XXII Ciclo
1981

L’osteopetrosi autosomale recessiva (ARO) è un gruppo di malattie dovute a un difettoso funzionamento degli osteoclasti che preclude un rimodellamento osseo corretto. Nel 50% dei casi umani il difetto è dovuto ad una delezione nel gene Tcirg1. Il modello murino mutante oc/oc porta lo stesso difetto genetico e fenotipico umano. Nel lavoro di tesi si è dimostrato che gli epatociti fetali di 12.5 giorni di gestazione trapiantati in utero in feti mutati di 13.5 giorni di gestazione sono in grado di curare il fenotipo malato. Si è inoltre derivata una sottolinea di cellule staminali embrionali murine transgeniche per il costrutto plasmidico GOF18eGFP. Si vuole utilizzare la GFP sotto il controllo del promotore del gene Oct-4 come marcatore del livello di staminalità cellulare per microiniettare le ESC in blastocisti murine mutate oc/oc.
Autosomal recessive osteopetrosis (ARO) is a group of genetic disorders due to defects that preclude normal function of osteoclasts. In half the cases, human ARO is due to mutations in the Tcirg1 gene. The oc/oc mutant mouse closely recapitulates human Tcirg1-dependent ARO. In ths work we demonstrate that in utero injection of allogenic fetal liver cells on 12.5 days into oc/oc fetuses at 13.5 day post coitum completely rescue the osteopetrotic phenotype. Moreover, an embryonic stem cells line transgenic for GOF18eGFP was produced. The goal is to use the GFP under the transcriptional control of the Oct-4 promoter as a marker of pluripotency of the ESC that are to microinject into oc/oc blastocysts.

L’osteopetrosi autosomale recessiva (ARO) è un gruppo di malattie dovute a un difettoso funzionamento degli osteoclasti che preclude un rimodellamento osseo corretto. Nel 50% dei casi umani il difetto è dovuto ad una delezione nel gene Tcirg1. Il modello murino mutante oc/oc porta lo stesso difetto genetico e fenotipico umano. Nel lavoro di tesi si è dimostrato che gli epatociti fetali di 12.5 giorni di gestazione trapiantati in utero in feti mutati di 13.5 giorni di gestazione sono in grado di curare il fenotipo malato. Si è inoltre derivata una sottolinea di cellule staminali embrionali murine transgeniche per il costrutto plasmidico GOF18eGFP. Si vuole utilizzare la GFP sotto il controllo del promotore del gene Oct-4 come marcatore del livello di staminalità cellulare per microiniettare le ESC in blastocisti murine mutate oc/oc.
Autosomal recessive osteopetrosis (ARO) is a group of genetic disorders due to defects that preclude normal function of osteoclasts. In half the cases, human ARO is due to mutations in the Tcirg1 gene. The oc/oc mutant mouse closely recapitulates human Tcirg1-dependent ARO. In ths work we demonstrate that in utero injection of allogenic fetal liver cells on 12.5 days into oc/oc fetuses at 13.5 day post coitum completely rescue the osteopetrotic phenotype. Moreover, an embryonic stem cells line transgenic for GOF18eGFP was produced. The goal is to use the GFP under the transcriptional control of the Oct-4 promoter as a marker of pluripotency of the ESC that are to microinject into oc/oc blastocysts.

Immunotherapy represents a therapeutic option for subgroups of paediatric patients with leukaemia who, despite the impressing advances of the last decades in the field, still show a poor prognosis because of high risk-disease or relapse. A deeper understanding of how the immune system physiologically recognizes and eradicates tumour cells is mandatory. Peptidic antigens are of great interest in the field of immunotherapy because they could be used as vaccines to boost immunity. TEL/AML1 mutant protein, whose sequence is known, is the result of a balanced t(12;21) translocation which generates a fusion gene. Peptides can be artificially synthetized from TEL/AML1 fusion protein and their HLA-binding capacity and immunogenicity can be predicted through bioinformatic tools. This project aimed to investigate whether the excellent prognosis showed by patients who suffer from a B-lineage ALL harbouring the TEL/AML1 mutation could be related to an immune response against peptidic antigens derived from the TEL/AML1 mutant protein. For such purpose, 8 priming experiments were performed with healthy donors’ leucocytes. Six experiments were carried out according to a dendritic cells-mediated protocol, whereas two experiments were performed according to a beads-mediated protocol. Successfully primed lymphocytes (identified by mean of intracellular cytokines production) were selected through flow cytometric sorting and single-cell seeded in order to get T-cell clones. This was possible in 3 out of 8 priming experiments. Growing T-cell clones were tested after stimulation with peptides (or through tetramer staining) but they did not show enough specificity. We also tried to show an immune response against fusion peptides in peripheral blood leucocytes of patients who survived a TEL/AML1 positive B-lineage ALL, through exposure to peptides and a short course stimulation with cytokines. We tested 22 patients, but unfortunately we weren’t able to show an answer against fusion peptides in any of them. Possible reasons might be the lack of specificity of the activation markers we used to identify reactive cells, the not enough restrictive gates we used for sorting, the fact that the HLA super type B*07 (for which the restricted peptides had the best prediction score) was underrepresented in our patients’ cohort. We suggest to perform further experiments using new activation markers, such as CD25 or PD-L1, or different techniques to identify reactive cells (such as Elispot), to use more restrictive gates for sorting and to exploit the beads priming protocol. In order to sample such lymphocyte populations (i.e. antigen specific T-cells) with an extremely low frequency, a possibility may be collect repeatedly blood samples from the same patient at different time points. Further studies are warranted to test the hypothesis of an autologous, spontaneously arising immune response against TEL/AML1 fusion peptides as reason for the good prognosis of TEL/AML1 positive leukaemia. Another possible approach in order to validate fusion peptides might be to test them in a situation of HLA B*07 mismatch between lymphocytes and APCs. The clinical counterpart could be the generation of reactive T-cell clones, cloning of their TCR and its transduction in the patient’s or donor’s lymphocytes, the latter in the perspective of a post-hematopoietic stem cell transplantation adoptive immunotherapy.
L’immunoterapia costituisce un’opzione terapeutica per alcuni sottogruppi di pazienti con leucemia dell’età pediatrica i quali, nonostante i notevoli progressi degli ultimi decenni, ancora non mostrano una prognosi soddisfacente perché affetti da malattia ad alto rischio oppure da ricaduta. Una comprensione più profonda di come il sistema immunitario fisiologicamente riconosce ed elimina le cellule tumorali è essenziale. Gli antigeni peptidici sono di grande interesse nel settore dell’immunoterapia perché possono essere utilizzati come vaccini per potenziare l’immunità. La proteina mutante TEL/AML1, la cui sequenza è nota, è il risultato di una traslocazione bilanciata t(12;21) che genera un gene di fusione. Dalla proteina di fusione TEL/AML1 si possono sintetizzare artificialmente peptidi, la cui capacità di legare le molecole HLA ed immunogenicità si può prevedere attraverso strumenti bioinformatici. Questo progetto ha l’obiettivo di indagare se l’eccellente prognosi dei pazienti affetti da leucemia linfoblastica di linea B con la mutazione TEL/AML1 possa essere correlata ad una risposta immunologica nei confronti di peptide di fusion derivati dalla proteina mutante TEL/AML1. A tale scopo, sono stati realizzati 8 esperimenti di priming con leucociti di donatori sani. Sei sono stati realizzati secondo un protocollo mediato da cellule dendritiche, mentre altri due esperimenti sono stati condotti secondo un protocollo mediato da beads. I linfociti responsivi al processo di priming (identificati mediante la produzione intracellulare di citochine) sono stati selezionati mediante sorting citofluorimetrico e coltivati a singola cellula in modo da ottenete cloni T-cellulari. Ciò è stato possibile in 3 esprimenti su 8. I cloni T-cellulari con evidenza di crescita sono stati testati dopo re-stimolazione con i peptidi (o mediante tetramer-staining) ma non hanno dimostrato sufficiente specificità- Abbiamo inoltre provato a dimostrare una risposta immunologica nei confronti dei peptidi di fusione nei leucociti (da sangue periferico) di pazienti con leucemia linfoblastica di linea B TEL/AML1 positiva in remissione, mediante esposizione ai peptidi e una breve stimolazione con citochine. Sono stati testati 22 pazienti, ma purtroppo non è stato possibile evidenziare una risposta nei confronti dei peptidi di fusione in nessuno di loro. Possibili spiegazioni potrebbero essere la mancanza di specificità dei marcatori di attivazione che sono stati utilizzati per identificare le cellule reattive, i gate non sufficientemente restrittivi utilizzati per il sorting, il fatto che il supertipo HLA B*07 (i peptidi B*07 ristretti avevano il migliore score predittivo) era sotto-rappresentato nella coorte di pazienti presa in esame. Ci riproponiamo di realizzare ulteriori esperimenti utilizzando nuovi marcatori di attivazione, come CD25 o PD-L1, oppure differenti tecniche per identificare le cellule reattive (come l’Elispot), di usare gates più restrittivi per il sorting e di utilizzare esclusivamente il protocollo mediato da beads per il priming. Per riuscire a includere nel campione popolazioni linfocitarie (cellule T antigene-specifiche) la cui frequenza è estremamente bassa, una possibilità potrebbe essere eseguire prelievi ematici ripetuti nel tempo nello stesso paziente. Sono necessari ulteriori studi per testare l’ipotesi di una risposta immune autologa, spontanea, nei confronti dei peptidi di fusione TEL/AML1 come spiegazione della buona prognosi della leucemia linfoblastica di linea B TEL/AML1 positiva. Un altro possibile approccio per validare i peptidi di fusione potrebbe essere quello di testarli in una situazione di HLA B*07 mismatch tra linfociti ed APCs. La ricaduta clinica potrebbe essere la generazione di cloni T-cellulari dalle cellule reattive al priming, il clonaggio del loro TCR e la sua transduzione nei linfociti del paziente o del suo donatore, in quest’ultimo caso nella prospettiva di un’immunoterapia adottiva post-trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) represents the most frequent cancer in childhood. Currently, more than 80% of children with ALL can be cured through intensive and risk-adapted chemotherapy protocols, but unfortunately, the remaining 20% ultimately relapse. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is considered beneficial for approximately 10% of patients who are at high risk (HR) at frontline therapy according to the AIEOP-BFM protocol criteria, and for the majority of patients after ALL relapse. However, also after HSCT, relapse remains the leading cause of treatment failure in pediatric ALL. The strongest prognostic factor in childhood ALL is the monitoring of Minimal Residual Disease (MRD). MRD is defined as the persistence, in bone marrow (BM), of leukemic cells not identifiable through cyto-morphological methods. MRD diagnostics has been implemented into major frontline treatment protocols for pediatric ALL, in which it is routinely used to stratify patients into different risk classes: standard risk (SR), medium risk (MR) or high risk (HR) of relapse. The aim of MRD-based stratification is to refine therapy based on risk-class, maximizing cure and minimizing toxicities. Also for relapsed ALL patients and in patients undergoing HSCT, MRD assessment has been identified as one of the most relevant predictors of prognosis, useful to identify good and poor responders to the therapy. Nevertheless, the clinical significance of MRD in pediatric ALL patients given allogeneic HSCT has not yet been fully validated. The most widely used approach to detect MRD is represented by real-time quantitative PCR (RQ-PCR), a very sensitive and specific molecular assay. RQ-PCR is based on the patient-specific junctional regions of Immunoglobulin (Ig) and T-cell Receptor (TCR) genes rearrangements, detected on BM aspirates collected at diagnosis (or relapse) of ALL patient. In the first project of my PhD training (described in Chapter 1) we quantify MRD by RQ-PCR immediately before HSCT, in order to assess its clinical significance and impact on transplant outcome in a large cohort (119) of pediatric ALL patients in first, second or subsequent complete remission (respectively 1CR, 2CR or others CR). In addition, we consecutively analyzed MRD by RQ-PCR in 98/119 and 59/119 ALL patients, respectively during the first (post-HSCT1) and third (post-HSCT3) trimester after HSCT. The aim of these analyses was to address the question of whether MRD evaluation could provide further information to predict the risk of post-transplant leukemia recurrence. The overall 10-year event-free survival probability (EFSp) for patients with any level of positive MRD pre-HSCT was lower (39% for MRD < 1x10-3 and 18% for MRD ≥ 1x10-3) as compared with negative MRD patients (EFSp = 73%). When patients were analyzed according to the number of CR at HSCT, we observed that different levels of positivity had a different impact on EFSp: low-level MRD positivity had a negative impact only in patients transplanted in second or higher CR; while in first CR, only a high MRD positivity increased the risk of relapse. So pre-transplant MRD assessment confirmed to be a strong predictor of outcome and its effect was consistent throughout the different disease remissions. We also evaluated the EFSp according to the MRD assessment at post-HSCT1 and post-HSCT3. MRD negativity at early post-transplant was associated with a good EFSp (63%), that was even better when negativity was confirmed also at 3th trimester post-HSCT (pEFS = 84%). Also the variations of MRD levels over time were important. In particular the change between 1st and 3th trimester allowed to identify 2 categories of patients, with a dramatically different outcome: a group of patients with very poor prognosis (patients with an MRD increasing from post-HSCT1 to post-HSCT3) with an EFSp of only 8%, and a group of patients with very good prognosis (patients with unchanged negative MRD or decreasing to negative MRD and those with unchanged low-positive MRD) with an EFSp ≥ 80%. Overall, these results confirm that MRD assessment is important both before and after transplant, for early identification of patients with the highest risk of ALL recurrence and with a strong indication to a prompt immunological intervention and to adoption of new drugs. The second project (described in Chapter 2) was a preliminary study. We focused on a third generation PCR, the droplet digital PCR (ddPCR), that allows for an absolute quantification, with accurate concentration of target DNA. Instead, RQ-PCR allows for a relative quantification, since is based on the comparison with a calibration standard curve made with the diagnostic DNA of patient, for MRD level quantification in follow-up sample. Thus, availability of diagnostic sample can limit RQ-PCR assay. A broad spectrum of molecular markers has been yet interrogated using ddPCR for diagnostic purposes in various malignancies. Recently, the absolute method was evaluated for MRD quantification in lymphoproliferative disorders of adult, such as lymphomas and ALL; these reports showed a good correlation between quantitative PCR and ddPCR. However, there are still no studies in pediatric ALLs. In the light of this, we performed ddPCR analyses on BM samples of 65 pediatric ALL transplanted patients with the same primers and probes used for RQ-PCR and in the same reaction conditions. Comparing head-to-head the MRD results obtained with the two molecular approaches, we aimed to investigate the applicability of ddPCR for MRD assessment also in this context. First, we evaluated if positive but not-quantifiable (PNQ) MRD performed by RQ-PCR can be quantified by ddPCR; then we also evaluated the prognostic impact of pre-HSCT MRD levels assessed by ddPCR. A good level of concordance was found in results of both analyses (Pearson r = 0.98, P < 0.0001) and ddPCR was also able to quantify a various number of sample not-quantifiable by conventional RQ-PCR. Our results suggest that ddPCR has sensitivity, accuracy and reproducibility at least comparable with RQ-PCR. Statistical analyses have shown no significant differences in prognostic impact on outcome, if patients were stratified according to MRD levels detected by RQ-PCR and ddPCR, since EFSp of PNQ patients was very similar to that of MRD NEG by ddPCR (71% vs 68%, respectively). Despite this, the digital method was able to measure a positive and quantifiable value for 12 ALL patients who relapsed after HSCT, while RQ-PCR technique failed to identify relapse in advance. These preliminary data confirm that ddPCR may be an accurate and applicable tool for MRD evaluation also in the context of pediatric ALL clinical trials, but highlight the importance of extending the analysis on other retrospectively collected cases, to better define the role of ddPCR for prospective MRD evaluation in pediatric ALLs.
La Leucemia Linfoblastica Acuta (LLA) rappresenta la patologia tumorale più frequente in età pediatrica. Oltre l’80% dei bambini affetti da LLA viene trattato con successo grazie agli attuali protocolli di chemioterapia intensiva e basata sul rischio di ricaduta, ma sfortunatamente, il restante 20% ricade. Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (TCSE) ha un ruolo fondamentale nella guarigione di circa il 10% dei pazienti definiti ad alto rischio di ricaduta LLA in prima linea e per gran parte dei pazienti recidivati. Sfortunatamente, anche dopo il TCSE, la ricaduta si conferma come principale causa di fallimento terapeutico nelle LLA pediatriche. Il principale indicatore prognostico nelle LLA infantili è rappresentato dalla Malattia Residua Minima (MRM). La MRM è definita come la persistenza, all’interno del midollo osseo, di cellule leucemiche a livelli non identificabili attraverso esame citomorfologico. La valutazione della MRM è ormai parte integrante dei principali schemi terapeutici di prima linea, in cui viene usata per stratificare i pazienti in diverse classi di rischio di ricaduta (standard, intermedio o alto), con l'obiettivo di adattare la terapia al rischio individuale di ciascun paziente, ottimizzando le cure e riducendo al minimo la tossicità. Il monitoraggio della MRM è stato identificato come uno dei maggiori fattori predittivi di prognosi, anche per i pazienti ricaduti e per quelli trapiantati, in cui risulta ulteriormente vantaggioso per valutare la risposta alla terapia dei pazienti LLA. Ciononostante, il significato clinico della MRM nei pazienti sottoposti al TCSE non è ancora stato pienamente validato. L’approccio standard utilizzato per monitorare la MRM è attualmente rappresentato dalla real-time quantitative PCR (RQ-PCR), un saggio molecolare altamente sensibile e specifico, basato sulle regioni giunzionali dei riarrangiamenti dei geni delle immunoglobuline e del recettore dei linfociti T, identificati sugli aspirati midollari della diagnosi (o ricaduta) del paziente LLA. Nel primo progetto (descritto nel capitolo 1) del mio percorso di dottorato, abbiamo quantificato la MRM mediante PCR quantitativa immediatamente prima del TCSE, per valutare il suo significato clinico e l’impatto sull’outcome in una vasta coorte di pazienti pediatrici affetti da LLA (119), in prima remissione completa (1RC), seconda (2RC) o altre. Abbiamo poi analizzato MRM mediante RQ-PCR in 98/119 e 59/119 pazienti, rispettivamente durante il primo (post-TCSE1) e il terzo (post-TCSE3) trimestre dopo il trapianto. L’obiettivo di queste analisi è stato quello di capire se la valutazione MRM potesse fornire ulteriori informazioni, utili a identificare preventivamente i pazienti con maggior rischio di ricaduta leucemica dopo il trapianto. Dalle analisi di sopravvivenza in relazione ai livelli di MRM pre-TCSE nei pazienti LLA, qualsiasi livello di positività correla con un outcome sfavorevole (pEFS = 39% per MRM positiva < 1x10-3 e pEFS = 18% per MRM positiva ≥ 1x10-3), rispetto ai pazienti con MRM negativa (pEFS = 73%, P<0.0001). Inoltre, analizzando i pazienti in base al tipo di remissione al TCSE, livelli diversi di positività MRM correlano con un diverso impatto sulla pEFS: bassi livelli di positività MRM indicano infatti, una prognosi sfavorevole solo in pazienti trapiantati in seconda o altre RC, mentre in prima RC solo una positività alta si associa ad un aumentato rischio di ricaduta. Pertanto la MRM pre-TCSE si conferma come importante fattore predittivo di outcome e il suo effetto varia col variare del tipo di remissione al trapianto. È stata valutata, inoltre, la pEFS dei pazienti in base ai livelli di MRM post-TCSE1 e post-TCSE3; MRM negativa post-TCSE correla significativamente con un outcome favorevole, sia al 1° trimestre (pEFS = 63%), che ancor più se riscontrata al 3° trimestre (pEFS = 84%). Anche la valutazione prospettica del cambiamento di MRM è risultata significativa. In particolare, valutando la variazione di MRM dal 1° al 3° trimestre post-TCSE, i pazienti con MRM crescente hanno una prognosi sfavorevole (pEFS = 8%), mentre tutti gli altri gruppi correlano con una buona prognosi (pEFS ≥ 80%). Questi risultati confermano l’importanza del monitoraggio della MRM sia nel periodo precedente che successivo al TCSE, nell’identificare preventivamente pazienti ad alto rischio di ricaduta, possibili beneficiari di interventi immunologici preventivi. Il secondo progetto trattato (descritto nel capitolo 2) è stato uno studio preliminare, focalizzato su una PCR di terza generazione, la Droplet Digital PCR (ddPCR). Essa consente una quantifica di tipo assoluto, con un’accurata concentrazione del DNA target. La RQ-PCR fornisce, invece, una quantifica di tipo relativo, basata su una curva standard di calibrazione fatta con il DNA della diagnosi del paziente, per la quantificazione dei livelli di MRM di ciascun follow-up. Per cui, la PCR quantitativa può essere limitata dalla disponibilità di materiale diagnostico. Un ampio spettro di marcatori molecolari è già stato indagato mediante ddPCR per scopi diagnostici in varie patologie tumorali. Studi recenti hanno valutato l’applicabilità della ddPCR nell’ambito delle malattie linfoproliferative dell’adulto, come i linfomi e le LLA, mostrando una buona correlazione dei risultati fra le due metodiche in entrambi gli ambiti. Tuttavia, non sono ancora disponibili lavori che valutino questa correlazione nel campo delle leucemie pediatriche. Alla luce di questo, abbiamo eseguito analisi ddPCR sugli aspirati midollari di 65 pazienti pediatrici sottoposti a TCSE, utilizzando stessi primer e stesse sonde fluorescenti usati negli esperimenti RQ-PCR, nelle medesime condizioni di reazione. Mettendo a confronto i livelli di MRM emersi coi due approcci molecolari, si è investigata l’applicabilità della metodica assoluta per il monitoraggio della MRM anche in questo contesto. Inizialmente, sono stati valutati campioni risultati, mediante RQ-PCR, positivi ma non quantificabili (PNQ), per verificare se invece si potessero quantificare mediante ddPCR. Successivamente, è stato valutato anche l’impatto prognostico dei livelli MRM pre-TCSE ottenuti tramite ddPCR. Un buon livello di concordanza è emerso dai risultati ottenuti con entrambe le metodiche (Pearson r = 0.98, P < 0.0001); la ddPCR ha permesso, inoltre, di quantificare numerosi campioni risultati non quantificabili tramite RQ-PCR. I risultati suggeriscono che il metodo assoluto possieda sensibilità, accuratezza e riproducibilità almeno paragonabili alla PCR quantitativa convenzionale. I pazienti LLA analizzati sono stati stratificati sulla base dei livelli di MRD ottenuti con le due tecniche molecolari, ma nelle analisi di sopravvivenza non sono emerse differenze significative sulla prognosi. Infatti le pEFS dei pazienti con MRM negativa e positiva quantificabile per i due metodi risultano molto simili (rispettivamente 71% e 68%). Ciononostante, dal presente studio è emerso che col metodo digital sia stato possibile misurare un valore di MRM positivo e quantificabile per almeno 12 pazienti LLA che, in seguito al trapianto, hanno presentato una recidiva; viceversa, la RQ-PCR non era stata in grado di identificare anticipatamente la ricaduta di questi pazienti. Questi dati preliminari mostrano che la ddPCR possa essere un valido strumento per il monitoraggio della MRM e applicabile anche nel contesto dei trials clinici per pazienti LLA pediatrici. Tuttavia una prosecuzione dello studio ddPCR, con estensione della casistica analizzata, potrebbe essere utile a definire con precisione la significatività delle misurazioni con questa recente metodica.