Academic literature on the topic 'Trapianto cellulare'

I disordini nefrologici cronici sono, a oggi, una tra le patologie a maggiore diffusione globale, la cui ricaduta economica ha profondi effetti sui Sistemi Sanitari Nazionali di tutto il mondo. Tali patologie di natura cronica general-mente progrediscono sino all'insufficienza d'organo, ren-dendo necessarie per il paziente terapie sostitutive come il trapianto d'organo. Allo stesso tempo, però, la richiesta di organi per il trapianto supera ampiamente la disponibilità degli stessi, motivo per cui la ricerca si sta sempre più focalizzando sullo sviluppo di nuove soluzioni che possano risolvere tale problematica. Una tra le soluzioni che riscuo-te, a oggi, maggiore successo è quella basata su protocolli che prevedono la decellularizzazione d'organo. La finalità di tali protocolli è quella di fornire impalcature biocompatibili su cui impiantare cellule dello stesso paziente, così da poter dare nuova e completa funzionalità all'organo e, allo stesso tempo, eliminare il rischio di rigetto da parte del ricevente. In questo articolo saranno, perciò, presentate, in campo nefrologico, le principali caratteristiche della decellularizzazione d'organo, così da poter avere una prospettiva di quello che potrebbe potenzialmente essere il futuro della medicina del trapianto.

The incidence of acute rejection of the kidney allograft in the world has been around 15% during the period between 2001 and 2003. It is clinically defined as an elevation in the level of serum creatinine by more than 0.3 mg/dL and is diagnosed by kidney biopsy. On pathologic examination, the interstitium of the allograft is diffusely edematous and infiltrated by CD4 and CD8 lymphocytes. Tubulitis occurs when the lymphocytes and monocytes extend into the walls and lumina of the tubules. Presence of leukocytes determines infection or antibody-mediated rejection. Typically C4d staining is negative. Other causes of acute allograft dysfunction included prerenal factors, interstitial nephritis, infection, acute tubular necrosis, toxicity by drugs, and obstruction in the urinary tract. The primary diagnostic assessments include history, especially adherence to immunosuppressive therapy, physical examination, blood and urine laboratory tests, measurement of the serum levels of the drugs, and ultrasonography. Diagnosis of acute cellular rejection depends on biopsy, CD20 staining for refractory cases, negative C4d staining, presence of markers of activating lymphocyte, and proteomic study. Treatment of acute cellular rejection in kidney transplant recipients include pulse steroid for the first rejection episode. It can be repeated for recurrent or resistant rejection. Thymoglobulin and OKT3 are used as the second line of treatment if graft function is deteriorating. Changing the protocol from cyclosporine to tacrolimus or adding mycophenolate mofetil or sirolimus might be effective. Prognosis depends on number of rejection episodes, the use of potent drugs, time of rejection from transplantation, and response to treatment.

Le osteopetrosi sono un raro gruppo eterogeneo di condizioni patologiche, caratterizzate da aumento della densità dell'osso dovuto ad un disordine del riassorbimento da parte degli osteoclasti. Esse sono più frequenti in gruppi etnici all'interno dei quali sono presenti consanguinei. Ne sono state descritte almeno cinque tipi, ma le forme più note sono la autosomica recessiva (AROP, detta anche maligna), la intermedia (IOP, anch'essa recessiva ma con insorgenza più tardiva), la forma con acidosi tubulare e la autosomica dominante (ADOP). Riportiamo un caso di AROP diagnosticato in epoca neonatale (3 settimane). Esso dimostra come alcune caratteristiche radiologiche (ma non tutte), siano già presenti alla nascita. Alla luce delle recenti acquisizioni terapeutiche (soprattutto trapianto di cellule staminali), una diagnosi precoce della malattia potrebbe, pertanto, prevenire importanti modificazioni patologiche alcune delle quali gravemente invalidanti.

Since its discovery, more than a decade ago, induced pluripotent stem cells (iPS) have had a prominent relevance in the environments of biomedical research and, at the same time, their origin has been related to the search for an ethical alternative to use of the stem cells obtained from internal mass of the human embryo. In this article we intend to give an overview of its possible applications in the advancement of biomedicine and its relationship with bioethics. From its possible application to regenerate tissues, after proceeding to their differentiation; testing of drugs for different conditions; or their use in models of diseases, among which the neurological ones stand out. Also, its application in obtaining germ cells and human embryos. The situation of the first clinical trial to regenerate a tissue from the subject’s own iPS cells, and the recent allogeneic transplantation in Japan, suggest advances in the clinical translation of these cells. On the other hand, the production of germ cells from iPS cells and the new cells called extended pluripotent stem cells (EPS), obtained by genetic reprogramming through a chemical cocktail, that give rise not only to the tissues of the embryonic layers, but also extra- embryonic, are a new path to making clonation by another route.----------Fin dalla sua scoperta, per oltre un decennio, cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) hanno un’importanza notevole nella ricerca biomedica ambienti e, allo stesso tempo, la sua origine è legata alla ricerca di un’alternativa etica all’utilizzo le cellule staminali ottenute dalla massa interna dell’embrione umano. In questo articolo diamo una panoramica delle possibili applicazioni nell’avanzamento biomedicina e la loro relazione bioetica. Dalla sua possibile applicazione di rigenerare il tessuto, quindi procedere alla differenziazione; la sperimentazione di farmaci per diversi disturbi; o il suo uso in modelli di malattie, tra cui spiccano quelle neurologiche. Così come la sua applicazione nell’ottenere cellule germinali e embrioni umani. La situazione del primo studio clinico per rigenerare un tessuto da cellule iPS e proprio trapianto recente del soggetto in Giappone rappresentano passi nella traduzione clinica di queste cellule. Inoltre la produzione di cellule germinali dalle cellule iPS e nuove cellule chiamate cellule staminali pluripotenti estesi (EPS), riprogrammando geneticamente da un cocktail chimico, causando non solo ai tessuti degli strati embrionali, ma extraembrionali anche costituire un nuovo percorso verso la clonazione di un altro itinerario.

In questa seconda parte, l’attenzione viene focalizzata sulle “cellule staminali non embrionali”, cioè le cellule staminali somatiche (di origine fetale o adulta) e le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale. Queste cellule, spesso definite “cellule staminali adulte”, sono state identificate prima delle cellule staminali embrionali. Infatti, l’espressione stessa di cellula “staminale” deriva dall’identificazione delle cellule staminali emopoietiche nel midollo osseo (1961). Più tardi le ricerche hanno evidenziato la presenza di tali cellule immature, multipotenti, che si auto-rinnovano e si auto-differenziano pressoché in tutti i tessuti ed organi del feto e dell’adulto. Appena scoperte, queste cellule staminali “adulte” hanno trovato subito un impiego terapeutico con i primi trapianti di midollo osseo per il trattamento di patologie, maligne e non, del sangue e del sistema linfoide. Oggi le cellule staminali emopoietiche sono usate anche nel trattamento di malattie auto-immuni, come la sclerosi multipla o il lupus erythematosus e nella medicina rigenerativa. Una seconda fonte importante di cellule staminali “adulte” è rappresentata dalle cellule staminali mesenchimali, situate principalmente nel midollo osseo, progenitrici di vari ceppi cellulari: osso, cartilagine, muscolo, tessuto adiposo e astrociti. Queste cellule sembrano avere un ruolo-chiave nella rigenerazione dei tessuti. Sono stati isolati diversi tipi di cellule mesenchimali multipotenti, con proprietà paragonabili a quelle delle cellule staminali embrionali. Il più noto è quello delle MAPCs di Catherine Verfaillie. Queste cellule sono usate clinicamente per vari scopi, tra cui la rigenerazione del miocardio infartuato, l’angiogenesi terapeutica in pazienti con ischemia periferica acuta (specialmente la malattia di Buerger) e il bioengineering (rivestimento cellulare di legamenti o di valvole cardiache sostitutive). In questo ambito si sono registrati risultati incoraggianti nell’animale per il trattamento delle malattie neurodegenerative, dell’ictus, del trauma cerebrale e dei danni del midollo spinale. Sono stati isolati molti altri tipi di cellule staminali “adulte” le cui proprietà riparatrici sono state verificate con successo nell’animale: cellule staminali neuronali (per il morbo di Parkinson, la sclerosi multipla, il morbo di Huntington, l’ictus, il trauma cerebrale, le lesioni del midollo spinale), cellule staminali muscolari (per l’incontinenza urinaria, il danno miocardico), cellule staminali endoteliali (per l’ischemia acuta periferica), cellule staminali cardiache, cellule staminali della retina (per la degenerazione maculare), cellule staminali del limbus della cornea (per il danno corneale). Allo stato attuale, i risultati clinici più promettenti si sono ottenuti con le cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (UCB), che hanno portato allo sviluppo di un’area di mercato caratterizzata dalla creazione di banche private di UCB. Generalmente le cellule UCB provocano, al massimo, una reazione immune piuttosto blanda quando vengono trapiantate in soggetti con donatori non compatibili. Si usano con successo laddove sia necessaria una riparazione o rigenerazione nell’organismo del ricevente. I migliori risultati con cellule staminali UCB, fino ad ora, sono stati ottenuti nel trattamento di bambini con morbo di Krabbe. Benefici si sono ottenuti anche dal trapianto locale di cellule UCB in pazienti con danni al midollo spinale. ---------- In this second part of the article, the attention is focused on “non embryonic stem cells”, that is somatic stem cells (from fetus or adult organisms), and umbilical cord blood stem cells. These stem cells, sometimes referred to as “adult stem cells”, were known and recognized as such before the embryonic ones. In fact the mere expression “stem” cells to designate this particular type of immature cell, from which derive all the others, more differentiated cells, came from the identification of the hematopoietic stem cells, in bone marrow (1961). Later investigations have shown that there are such cells, immature, multipotent, self-renewing, and self-differentiating ones in almost all tissues and organs of fetus or adult organism. As soon as they were discovered, these “adult”, autologous stem cells were immediately put in the service of patients, with the first transplantations of bone marrow performed either for the treatment of malignancies, or for the treatment of hematologic disorders. Today, autologous hematopoietic stem cells are also used for the treatment of auto-immune diseases, such as multiple sclerosis or lupus erythematosus and for regenerative medicine. A second, important source of “adult” stem cells are the mesenchymal stem cells, found mainly in bone marrow, but also in blood, progenitors of multiple cell lineages, including bone, cartilage, muscle, adipose tissue and astrocytes, and which seem to hold the key to tissue regeneration. Different types of multipotent mesenchymal stem cells, with properties comparable to those of embryonic stem cells, have been isolated, the best known being the multipotent adult progenitor cells (MAPCs). These cells are used clinically mainly for the healing of the heart after myocardial infarction, with positive statistically significant results, for therapeutic angiogenesis in patients suffering of peripheric ischemic disease (especially Buerger’s disease), and for bioengineering (cellular coating of artificial ligaments or of prosthetic heart valves). They have given promising results in animals for the treatment of neurodegenerative diseases, ictus, brain trauma and spinal cord injuries. Many other types of “adult” stem cells have been isolated and their healing properties assessed with success in animals, such as neural stem cells (for Parkinson’s disease, multiple sclerosis, Huntington’s disease, ictus, brain trauma, spinal cord injury), muscle stem cells (for urinary incontinence, myocardial infarction), endothelial stem cells (for critical limb ischemia), cardiac stem cells, retinal stem cells (for macular degeneration), limbal stem cells (for damaged cornea). At the moment, the more promising results in patients have been obtained with umbilical cord blood stem cells (UCB), prompting the birth of a commercial trade based on private banks. Umbilical cord blood stem cells offer indeed the advantage of their immaturity: as such, they rarely trigger more than a mild immune reaction when transplanted in unrelated recipient organisms. They are used with profit wherever a healing or regenerative process is necessary in a given patient. Up to now, best results with the UCB cells have been obtained in the treatment of children with Krabbe’s disease. Some patients with injured spinal cords have also experienced benefits from UCB cells grafts.

Background: Human cytomegalovirus (CMV) represents a common cause of morbidity and mortality in solid organ transplant (SOT) patients. The CMV specific cell-mediated immunity recovery plays an important role in reducing the harmful effects of CMV infection. In this study we comared the recovery of cell-mediated immunity CMV-specific twith the ELISpot assay in adult patients undergoing SOT (heart, kidney and liver), in order to standardize the diagnostic and therapeutic process and be able to make therapy tailored based on the individual level of risk of infection. Methods: Observations from 209 adult patients undergoing SOT (47 hearts,102 kidneys 60 livers) during the first year 6 after transplantation. The parameters examined were: ELISpot test, CMV-DNA by PCR Real Time, CMV-IgG and IgG-avidity. Results: 1) in kidney transplants the recover of cell-mediated immunity CMV-specific is slower than hearts and livers; 2) the recovery of cell-mediated immunity CMV-specific is slower in patients CMV R-; 3) humoral immunity plays a marginal role in the control of infection by CMV. Conclusion: the use of ELISpot assay could help identify patients at risk of CMV infection and optimize their treatment, avoiding cases of late infection.
Introduzione: Il citomegalovirus umano (CMV) costituisce una frequente causa di malattia e mortalità nei pazienti sottoposti a trapianto di organo solido (SOT). La ricostituizione dell'immunità cellulo-mediata specifica svolge un importante ruolo nel ridurre gli effetti dannosi di tale infezione. Scopo: Confrontare il recupero dell'immunità cellulo-mediata CMV-specifica attraverso il test ELISpot nei pazienti adulti sottoposti a SOT (cuore, rene e fegato), al fine di standardizzare l'iter diagnostico e terapeutico e poter effettuare delle terapia su misura in base al livello individuale di rischio di infezione. Metodi: Studio osservazionale su 209 pazienti adulti sottoposti a SOT (47 trapianti di cuore, 102 trapianti di rene e 60 trapianti di fegato). Tempo di osservazione 360 giorni dopo il trapianto. I parametri esaminati sono stati: test ELISpot, CMV-DNA con tecnica PCR Real Time, CMV-IgG e IgG-avidity. Risultati: 1) i pazienti nefrotrapiantati recuperano l'immunità cellulo-mediata più lentamente rispetto ai pazienti con trapianto di cuore e fegato; 2) la ricostituzione dell'immunità cellulo-mediata specifica avviene più lentamente nei pazienti sieronegativi per CMV; 3) l'immunità umorale svolge un ruolo marginale nel controllo dell'infezione da CMV. Conclusioni: l'utilizzo del test ELISpot permetterebbe di individuare i pazienti a rischio di infezione da CMV e di ottimizzare il loro trattamento, evitando casi di infezione tardiva.

Impaired glucose metabolism is frequently described in cirrhotic patients. The pathogenesis of diabetes mellitus (DM) in this population is complex and not precisely known. Insulin resistance (IR) plays a central role in the glucose metabolism disturbance and it has been speculated that genetic and environmental factors and some etiologic agents in liver disease impair insulin secretion. Aim of the study: evaluate β cell secretion and insulin sensitivity in a cohort of cirrhotic patients undergoing liver transplantation (LT). 107 cirrhotic patients (31 female e 76 male) were evaluated before LT. The patients who underwent LT were evaluated 3, 6, 12 months after surgery. To evaluate insulin resistance HOMA-IR was used. To assess the β cell secretion, a state-of-art modelling of glucose/C-peptide curves during OGTT was used. Two outputs were provided: dynamic evaluation (1st phase) and proportional evaluation (2nd phase). Before LT the prevalence of DM and prediabetes (pre DM) were 50.5% and 31.8 % respectively. DM patients showed a lower insulin secretion (both 1st and 2nd phase) and tended to have higher HOMA-IR when compared to pre DM and non DM subjects. After LT glucose metabolism improved (impaired glucose metabolism: 6 months 61.1%, 12 months 65.6%). HOMA-IR was decreased (pre LT: 5.48±5.14, 3 months post LT: 2.17±1.62, 6 months post LT: 2.28±1.44, 12 months post LT: 2.36±1.73 P=0.0017). No differences in β cell secretion was found. When the population who underwent LT was divided in 2 groups according to the improvement or not of glucose metabolism, higher insulin secretion was found in improved subjects (2nd phase). No differences in HOMA-IR, age, duration of hepatic disease, family history of type 2 DM, immunosuppressive therapy were observed. In conclusion IR and reduced insulin secretion was observed in cirrhotic diabetic patients. After LT an improved glucose metabolism was observed. Insulin sensitivity was increased in all patients and higher β cell secretion was observed only in subjects with improved glucose metabolism.

The studies presented in my thesis delve into the complex relationship between cancer and aging using analytical approaches shared with the field of regenerative medicine. We took advantage of a model of orthotopic cell transplantation to explore the basic question as to whether the contribution of aging to the risk of cancer is, at least in part, related to alterations in the tissue microenvironment. Previous investigations conducted by our research group had revealed that isolated normal hepatocytes form larger clones of daughter cells when transplanted into the liver of old animals as compared to those formed in young recipients. In a relatively simple experiment we then utilized a similar approach to transplant preneoplastic cells isolated from hepatic nodules into either young or old animals of a syngeneic strain. Results were striking: very limited expansion of transplanted nodular hepatocytes was observed in the liver of young animals, while the same cell preparations grew significantly upon injection into older hosts, with a few cases of progression to hepatocellular carcinoma (HCC). The relevance of these findings is twofold. Firstly, they clearly indicate that preneoplastic cell populations isolated from hepatic nodules are not endowed with any measurable degree of growth autonomy, in that they were unable to form nodules when transferred into the liver of young hosts. Thus, their focal growth is dependent on stimuli originating from the local microenvironment. In this respect they behave like normal hepatocytes. Secondly, it is evident from these results that the microenvironment of the aged liver is able to foster the growth transplanted syngeneic nodular hepatocytes, again reproducing analogous findings already obtained with normal cells. Having established this fundamental fact, it became important to explore possible biological and underlying molecular mechanisms explaining the growth-promoting nature of the aged liver microenvironment. To this end, intriguing insights came again from the field of regenerative medicine. Our research group is involved in the characterization of an experimental model of massive liver repopulation through hepatocyte transplantation. This approach was set up in our laboratory and is based on the administration of retrorsine (RS), a naturally occurring alkaloid, as a preconditioning treatment. Rat liver exposed to RS and then transplanted with isolated normal hepatocytes is entirely replaced by donor-derived cells within a few months. Importantly, transplanted nodular hepatocytes can also selectively expand in the RS-treated liver, rapidly evolving to HCC. Again, neither normal, nor nodular hepatocytes are able to proliferate when injected into the liver of untreated recipients, as already noted above. This pattern of findings is similar to that observed in the aged liver, although the magnitude of the observed phenomena is far greater following exposure to RS. Moreover, it is apparent from the foregoing discussion that the growth of normal and nodular hepatocytes is controlled by fundamentally similar biological mechanisms, such that carcinogenesis and liver repopulation represent in fact “two sides of the same coin”, as it has been proposed. Given the similarities of biological responses between the RS-treated and the aged liver, we then probed into possible cellular and molecular analogies shared by the two systems. Much to our surprise, it was found that exposure to RS is a powerful inducer of cell senescence in hepatocytes in vivo. As reported in the preceding section of this report, several markers of cell senescence were expressed by RS-exposed hepatocytes, including senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal), cell hypertrophy, a persistent block in the cell cycle coupled with activation of cell growth pathways. The picture emerging from these findings is that RS treatment, which sets the stage for the selective growth of both normal and nodular transplanted hepatocytes, leading to massive liver repopulation and emergence of HCC, respectively, is also associated with the induction of a senescent phenotype in resident hepatocytes. Such a senescence phenotype is commonly found in aged tissues including the liver, as also shown in our studies. This phenotype is likely to explain, at least in part, the similarities observed between the microenvironments of the aged liver and that of RS-exposed liver. The last section of this thesis describes studies aimed at reversing the RS-induced alterations in the liver microenvironment and, in doing so, at verifying whether this would modulate the growth of preneoplastic lesions promoted by RS. Animals given the genotoxic agent diethylnitrosamine (DENA) followed by RS developed large hepatocyte nodules within a few months. However, the growth of preneoplastic nodules was significantly delayed in animals receiving hepatocyte transplantation following the DENA+RS regimen. These results represent a proof of principle that an altered microenvironment is indeed a powerful driving force in neoplastic progression; most importantly, they clearly indicate that strategies aimed at “normalizing” such an altered microenvironment might impact on the rate of progression of the neoplastic process.

Background: Heart Transplantation (HTX) is the only curative treatment available for patients with end-stage heart failure (HF).During the first year post-transplantation more than 25% of patients will go through rejection episodes and will face the risk of developing rejection with consequent graft dysfunction with an increased morbidity and mortality. Preventing and treating acute rejection is the most central task for clinicians working with transplanted patients. The ISHLT 2005 and 2013 working formulations defined the histopathologic profile of three types of rejection: Cellular (ACR) Humoral (AMR) and Mixed (MIX). Nowadays serial endomyocardial biopsies (EMB) at decreasing intervals during the first year after transplantation and laboratory tests, such as Donor Specific Antibody (DSA) measurements, remain the gold-standard in diagnosing and monitoring acute rejection but they are morbid and prone to artefacts of sampling, interpretation and testing methodologies. Therefore this histopathological assessment needs integrative new biomarkers to characterize risk stratification for outcomes in heart transplantation. To date, the exact mechanisms involved in rejection after solid transplantation are not completely understood, so investigating process that contribute to acute allograft rejection and find effective biomarkers to diagnose, monitoring and predicting rejection will be of great value for the development of improved anti-rejection strategies. The advent of sequencing technology such as Next Generation Sequencing (NGS) is changing medical genomics by accelerating new disease biomarkers discovery. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules (19-24 nucleotides), highly conserved, which regulate genes expression at the post transcriptional level. Aim: The aim of this study is to identify MicroRNA (miRNAs) expression profile in the first year after heart transplantation (HTX) with Next Generation Sequencing (NGS) technology in formalin fixed paraffin-embedded (FFPE) endomyocardial Biopsies (EMBs), to characterize the three different types of allograft rejection classified as Cellular, Humoral and Mixed. Methods: Two groups of pts. were included: a study group of 19 pts. and a validation group of 14 pts. For each patient we selected the the first formalin fixed paraffin-embedded (FFPE) monitoring endomyocardial biopsies (EMBs) positive for each types of rejection. We excluded presensitized patients (pts) with previous implantation of Left Ventricular Assistance Device (LVAD) and with previous infections. EMBs were examined for the presence of rejection according to updated international classification criteria (ISHLT 2005 and 2013).The EMBs were classified in four groups: Acute Cellular Rejection (ACR) with 12 pts ACR: >=2R, pAMR:0, DSA: Neg ; Mixed with 6 pts ACR: >=2R, pAMR>1 (i+), DSA: Pos; Antibody Mediated Rejection (AMR) with 5 pts ACR: 0, pAMR>1 (i+), DSA: Pos; Control with 10 pts : ACR:0, pAMR:0, DSA: Neg. Small RNA fraction from the study group was sequenced with NGS Ion Proton in order to define the expression of mature miRNAs. We performed subsequent analysis with edgeR package comparing in pairs the groups to identify differentially expressed miRNAs in the different rejections. We selected 13 microRNAs according to bionformatic analysis as possible biomarckers and they have been confirmed by qRT-PCR in all the pts. With multivariate logistic regression analysis we created unique miRNA signatures as predictive model of each rejection. Moreover in situ PCR was carried out on the same EMBs to detect miRNAs expression and localization in cell types within the EMBs. Results: The identification of the best method of extraction for short non coding RNAs in FFPE EMBs was the first result I achieved. I tested different methods in house and commercial available kits and I modified the protocols to obtain good quality and adeguate quantity of RNA from FFPE tissue of small EMBs for the downstream application. With NGS we obtained and analysed more than 2257 mature microRNAs in all the biopsies of the study group. The three types of rejection and control groups were compared in pair with the un-supervised analysis showing a typical profile for each group of differentially expressed miRNAs; in particular: Mixed vs AMR: only 2 miRNAs overexpressed in the Mixed group suggesting a similarity between the two types. ACR vs AMR: 18 miRNAs overexpressed and 2 miRNAs under-expressed in the ACR. Mixed vs ACR : 7 miRNAs underexpressed and 39 miRNAs over-expressed in the ACR group. The analysis revealed that there are de-regulated microRNAs between the three rejections confirming our hypothesis that microRNAs can characterize the three pathological conditions. MiRNAs have been selected for further evaluation and validation, based on the number of reads resulting by NGS, on their highly significant FDR (< 0.05) or fold change, p-value and their involvement in relevant processes related to rejection as shown by a bioinformatic analysis based on validated target genes and reported in public databases such as TarBase (version 6.0) (111) , miRTarBase (112) , miRWalk (113), miRecords (114), DIANA-microT-CDS (115) , miRmap (116), miRDB (117) , TargetScan (118), and miRanda (119). At the end we selected 13 microRNAs. To validate the NGS data through qRT-PCR we enrolled other EMBs from 14 pts selected according to our criteria and we tested on all the 33 EMbs, both the study and validation cohort, the selected microRNAs. The validation analysis has shown a similar expression pattern for all microRNAs in particular: 6 hsa-miRNAs: 29c-3p/-29b-3p/199a-3p/190a-5p/27b-3p/302b-3p can differentiate all rejections compared to controls; 3 hsa-miRNAs: 31-5p/144-3p/218-5p are peculiar of AMR and MIX compared to control and ACR 2 hsa-miRNAs: 451a/208a-5p identify MIX compared to controls. Using miRNAs expression as co-variate and disease status as dependent variable we created logistic regression models: MIX:(miR-208a ,126-5p, 135a-5p); ACR:(miR-27b-3p, 29b-3p,199a-3p, 208a, 302b-3p); AMR: ( miR-208a, 29b-3p, 135a-5p, 144-3p) identifying with high specificity and sensitivity each types of rejection. Finally with in situ PCR we detected some of these microRNAs in different cell types: miR-29b-3p was mostly expressed in smooth muscle cells in ACR; miR-144-3p was expressed in macrophages and in endothelial cells; moreover the expression of this microRNA in macrophages was predominant and diffuse in the ACR compared to AMR. miR-126-5p was expressed in ACR and AMR samples not only in in endothelial cells but also in Cardiomyocytes and smooth muscle cells. For MicroRNA 451a we found a co-localization of signal in endothelial cells and in lymphocytes. Conclusions: This study demonstrate that MicroRNAs can be obtained easily from FFPE tissues, miRNAs differentially expressed are involved in pathophysiological mechanisms of rejection such as immune system cells cycle regulation and proliferation, , inflammatory pathways NFkB mediated and endothelial remodelling. According to our results the miRNAs up or down expressed modulate these pathways in a way peculiar for the different type of rejection. The regressive models might represent a powerful diagnostic tool and in situ detection of the miRNAs casts new light on the pathophysiological mechanisms of rejection. Moreover the expression of MiRNAs 144-3p, 126-5p, 29b-3p and 451a identified by in situ PCR in endothelial cells, smooth muscle and inflammatory cells are diagnostic and are potential pharmacological targets for rejections.
Contesto: Il trapianto di cuore è l'unico trattamento curativo disponibile per i pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale. Durante il primo anno dopo il trapianto più del 25% dei pazienti può subire episodi di rigetto e affrontare il rischio di sviluppare rigetto con conseguente disfunzione dell’ organo trapiantato con un aumento della morbilità e mortalità. Prevenire e trattare il rigetto acuto è l’ obiettivo principale per i medici che lavorano con pazienti trapiantati. Le linee guida ISHLT 2005 e 2013 hanno definito il profilo istopatologico di tre tipi di rigetto: Cellulare (ACR) Humoral (AMR) e Mixed (MIX). Al giorno d'oggi le biopsie endomiocardiche seriali (EMB) a intervalli decrescenti durante il primo anno dopo il trapianto e gli esami di laboratorio, come le misurazioni di anticorpi donatore specifici (DSA), rimangono parametri di riferimento nella diagnosi e nel monitoraggio del rigetto acuto, ma sono soggetti a artefatti dovuti alle metodologie di campionamento, interpretazione e test. Pertanto questa valutazione istopatologica necessita di nuovi biomarcatori integrativi per caratterizzare la stratificazione del rischio nel rigetto da trapianto di cuore. Ad oggi, i meccanismi esatti coinvolti nel rigetto dopo il trapianto non sono completamente compresi, quindi la ricerca sui processi che governano i meccanismi di rigetto e la scoperta di biomarcatori efficaci per diagnosticare, monitorare e prevedere il rigetto sarà di grande valore per lo sviluppo e miglioramento delle terapie contro il rigetto. L'avvento della tecnologia di sequenziamento come Next Generation Sequencing (NGS) sta cambiando la genomica medica accelerando la scoperta di nuovi biomarcatori di malattie. I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA non codificanti (19-24 nucleotidi), altamente conservate, che regolano l'espressione dei geni a livello post-trascrizionale. Obiettivo: Lo scopo di questo studio è identificare il profilo di espressione di MicroRNA (miRNA) nel primo anno dopo il trapianto di cuore (HTX) con la tecnologia Next Generation Sequencing (NGS) in biopsie endomiocardiche (EMB) fissate in formalina e incluse in paraffina (FFPE), per caratterizzare i tre diversi tipi di rigetto da trapianto di cuore classificati come Cellulare, Umorale e Misto. Metodi: due gruppi di pazienti (pz.) sono stati inclusi: un gruppo di studio di 19 pz. e un gruppo di validazione di 14. Per ogni paziente abbiamo selezionato la prima biopsia endomiocardica (EMB) fissata in formalina ed inclusa in paraffina (EMB) per ogni tipo di rigetto. Abbiamo escluso i pz. presensibilizzati con precedente impianto del dispositivo di assistenza ventricolare sinistro (LVAD) e con precedenti episodi di infezione. Le biopsie sono state esaminate per la presenza di rigetto secondo i criteri di classificazione internazionali aggiornati (ISHLT 2005 e 2013). Abbiamo quindi individuato quattro gruppi: Acute Cellular Rejection (ACR) con ACR a 12 punti:> = 2R, pAMR: 0, DSA: Neg; Misto con 6 pts ACR:> = 2R, pAMR> 1 (i +), DSA: Pos; Reiezione mediata da anticorpi (AMR) con 5 punti ACR: 0, pAMR> 1 (i +), DSA: Pos; Controllo con 10 punti: ACR: 0, pAMR: 0, DSA: Neg. La piccola frazione di RNA della coorte di studio è stata sequenziata con NGS Ion Proton per definire l'espressione dei miRNA maturi. Abbiamo eseguito un'analisi successiva con edgeR confrontando a coppie i gruppi per identificare i miRNA espressi differenzialmente nei diversi rigetti. Abbiamo selezionato 13 microRNA secondo l'analisi bionformatica come possibili biomarcatori i quali sono stati confermati da qRT-PCR in tutti i pz. Con l'analisi di regressione logistica multivariata abbiamo identificato gruppi univoci di miRNA come modelli predittivi specifici per ciascun rigetto. Inoltre, la PCR in situ è stata eseguita sulle stesse EMBs per rilevare l'espressione e la localizzazione dei miRNA nei tipi di cellule all'interno delle EMBs. Risultati: l'identificazione del miglior metodo di estrazione di microRNA da EMBs FFPE è stato il primo risultato che ho raggiunto. Ho testato diversi metodi sia manuali che kit commerciali e ho modificato i protocolli per ottenere una buona qualità e una quantità adeguata di microRNA per l'applicazioni successive. Con NGS abbiamo ottenuto e analizzato oltre 2257 microRNA maturi in tutte le biopsie del gruppo di studio. I tre tipi di gruppi di controllo e di rigetto sono stati confrontati in coppia con l'analisi non supervisionata che mostra per ciascun gruppo un profilo tipico di miRNA differenzialmente espressi; in particolare: Misto vs AMR: solo 2 miRNA sovraespressi nel gruppo Misto suggeriscono una somiglianza tra i due tipi di rigetto. ACR vs AMR: 18 miRNA sovraespressi e 2 miRNA sottoespressi nell'ACR. Mixed vs ACR: 7 miRNAs non sovraespressi e 39 miRNA sovraespressi nel gruppo ACR. L'analisi ha rivelato che ci sono microRNA de-regolati tra i tre tipi di rigetto confermando la nostra ipotesi che i microRNA possano caratterizzare le tre condizioni patologiche. I MiRNA sono stati selezionati per un'ulteriore valutazione e convalida, in base al numero di reads risultanti da NGS, sulla loro FDR significativa (<0,05), fold change, p-value e il loro coinvolgimento in processi rilevanti correlati al rigetto come mostrato dalle analisi bioinformatiche basate su geni target validati e riportati in database pubblici come TarBase (versione 6.0) (111), miRTarBase (112), miRWalk (113), miRecords (114), DIANA-microT-CDS (115), miRmap (116) , miRDB (117), TargetScan (118) e miRanda (119). Alla fine abbiamo selezionato 13 microRNA. Per validare i dati NGS tramite qRT-PCR abbiamo arruolato altri EMBs da 14 pz. selezionati in base ai nostri criteri e abbiamo testato su tutte le 33 EMbs, sia quelle della coorte di studio che quelle della coorte di validazione, i microRNA selezionati. L'analisi di validazione ha mostrato un pattern di espressione simile per tutti i microRNA in particolare: 6 hsa-miRNA: 29c-3p / -29b-3p / 199a-3p / 190a-5p / 27b-3p / 302b-3p possono differenziare tutti i rigetti rispetto a controlli; 3 hsa-miRNA: 31-5p / 144-3p / 218-5p sono peculiari di AMR e MIX rispetto al controllo e ACR 2 hsa-miRNA: 451a / 208a-5p identificano MIX rispetto ai controlli. Usando l'espressione di miRNA e la condizione patologica come variabili dipendenti abbiamo creato modelli di regressione logistica: MIX: (miR-208a, 126-5p, 135a-5p); ACR: (miR-27b-3p, 29b-3p, 199a-3p, 208a, 302b-3p); AMR: (miR-208a, 29b-3p, 135a-5p, 144-3p) che identificano con alta specificità e sensibilità ciascun tipo di rigetto. Infine con PCR in situ abbiamo rilevato alcuni di questi microRNA in diversi tipi di cellule: miR-29b-3p era principalmente espresso nelle cellule muscolari lisce in ACR; miR-144-3p era espresso nei macrofagi e nelle cellule endoteliali; inoltre l'espressione di questo microRNA nei macrofagi era predominante e diffusa nell'ACR rispetto all'AMR. Il miR-126-5p è risultato espresso in campioni ACR e AMR non solo nelle cellule endoteliali ma anche nei cardiomiociti e nelle cellule muscolari lisce. Per il MicroRNA 451a abbiamo trovato una co-localizzazione del segnale nelle cellule endoteliali e nei linfociti. Conclusioni: Questo studio dimostra che i microRNA possono essere ottenuti facilmente dai tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina, i miRNA differenzialmente espressi sono coinvolti in meccanismi patofisiologici del rigetto quali regolazione e proliferazione del ciclo cellulare del sistema immunitario, vie infiammatorie mediate da NFkB e rimodellamento endoteliale. Secondo i nostri risultati, i miRNA sovra o sotto espressi hanno mostrato una modulazione di questi processi in un modo peculiare per ciascun tipo di rigetto. I modelli di regressione logistica identificati potrebbero rappresentare un potente strumento diagnostico e il rilevamento in situ dei miRNA getta nuova luce sui meccanismi patofisiologici del rigetto. Inoltre l'espressione di MiRNA 144-3p, 126-5p, 29b-3p e 451a identificati mediante PCR in situ in cellule endoteliali, cellule muscolari lisce e infiammatorie è diagnostica e costituisce un potenziale bersaglio farmacologico contro il rigetto da trapianto di cuore.

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche rappresenta la terapia di scelta per numerose patologie ematologiche. Tuttavia, la mortalità da trapianto (non relapse mortality-NRM), ha limitato per lungo tempo il suo utilizzo in pazienti di età >65 anni. L’età non può più essere considerata una controindicazione assoluta al trapianto e il suo utilizzo in fasce di età un tempo ritenute non idonee è in sensibile aumento. La NRM è legata a tre ordini di complicanze: immunologiche (malattia del trapianto contro l’ospite, Graft versus-Host Disease -GVHD-), infettive e tossiche. La tossicità d’organo è direttamente correlata alla intensità del condizionamento che quindi viene ridotta in caso di comorbidità e nel paziente anziano. Tuttavia, ridurre l’intensità del condizionamento significa anche aumentare il rischio di ripresa della malattia ematologica di base e quindi tale aggiustamento deve essere fatto in funzione di indici di invecchiamento e di comorbidità, al fine di non ridurre la potenzialità curativa del trapianto. Per valutare le comorbidità abbiamo uno score altamente predittivo (Hematopoietic Cell Transplant-Comorbidity Index, di Sorror), mentre per valutare l’invecchiamento c’è una grande necessità clinica di marcatori innovativi di età biologica. Il presente lavoro ha l’obiettivo di valutare, nei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche per tutte le indicazioni ematologiche, lo stato di metilazione del DNA, indice di età biologica. Lo scopo è di correlare l’epigenoma al rischio trapiantologico del singolo individuo.
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a well-established therapy for several life-threatening hematological disorders, mostly malignancies. However, non-relapse mortality (NRM) has limited its use in patients aged over 65 years. Nowadays age cannot be considered an absolute contraindication for this treatment and the use of transplantation, in patient groups once considered unsuitable, is increasing significantly. NRM is due to three types of complications: immunological (graft versus host disease), infectious and toxic. Organ toxicity is directly related to the intensity of conditioning which is therefore reduced in case of comorbidities and in elderly patients. However, reducing the intensity of chemotherapy also means increasing the risk of relapse of the underlying haematological disease and therefore this adjustment must consider aging and comorbidity indexes in order not to reduce the curative potential of the transplant. To evaluate comorbidities we have a highly predictive score (the Comorbidity Index Score by Sorror, HCT-CI), while to evaluate aging there is a great clinical need to apply innovative biological age markers. The present work aims to evaluate the state of DNA methylation, a biological age index, in the setting of patients undergoing allogeneic haematopoietic stem cell transplantation for all haematological indication. The aim is also to correlate the epigenome with the transplant risk of the single individual.

IDENTIFYING NEW MOLECULAR PATHWAYS AND PREDICTOR BIOMARKERS OF GVHD AFTER ALLOGENEIC HSCT Background and rationale Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is a potentially curative option for patients with hematological malignancies. However, its success is limited by life-threatening graft-versus-host disease (GVHD). Strategies to control GVHD are often associated with suppression of the immune system leading to the impairment of the beneficial graft versus tumor (GVT) effect. The ideal approach to prevent and treat GVHD would limit alloantigen-specific reactivity while preserving immunity against malignant cells and pathogens. Chemokines are well known inducers of leukocyte trafficking and activation. Stimulation of the chemokine receptor signaling pathway leads to initiation of the Janus Kinase (JAK)/Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) pathway that contributes to the pathogenesis of GVHD. The key role of JAK signaling in normal and abnormal lymphocyte development and function prompted us to hypotesize that the inhibition of the JAK/STAT signaling could prevent GVHD from developing. We therefore evaluated the efficacy of two distinct JAK inhibitors, CP-690,550 and INC-424, in the allogeneic setting. Moreover, we tested whether the treatment with JAK inhibitors preserved the GVT effect in a mouse model of aGVHD. However, it would be a great advantage to predict aGVHD before its onset in order to tailor the immunosuppressive therapy in a patient-specific manner. To date, noninvasive, diagnostic and prognostic tests for aGVHD are lacking but necessary to predict aGVHD and improve the safety of allo-HSCT. We therefore performed a prospective analysis of miRNA expression profile in plasma of allografted patients to detect specific miRNAs with predictive role for aGVHD. Methods A major histocompatibility complex (MHC) mismatched HSCT mouse model was set up. Lethally irradiated BALB/c mice received spleen (SC) and bone marrow (BM) cells from donors C57BL/6 (B6) mice, and were treated with CP690,550 or INCB18424 for 14 days at 15mg/Kg/day or 45mg/Kg/day respectively. Syngeneic transplants (B6-B6) and BALB/c recipients treated with B6 BM cells only were also used. To determine the GVT activity, allo-HSCT recipients were co-injected with either a B-cell lymphoma cell line (A20) or a myeloid leukemia cell line (RMB-1) and treated or not with INC-424 at the dose of 45mg/kg/day. Mice were monitored for overall survival (OS) and weight loss. GVHD was histologically scored in tissues harvested on day 14, 30 and 60 and cytokine production by ELISA. Immune reconstitution and tumor cells were monitored by flow cytometry. For biomarker discovery, plasma samples from 24 patients who received unmanipulated allo-HSCT were collected weekly. MicroRNAs were isolated from plasma and miRNA expression profile examined using quantitative Real Time PCR. Results JAK/STAT inhibition, especially by INC-424 treatment, caused significantly less GVHD when compared to untreated animals, as determined by survival, weight loss, and histopathology of GVHD target organs. Plasma levels of inflammatory cytokines (IL-6 and IL-12) were significantly reduced in all treated animals when compared to controls. Daily administration of INC-424 post allo-HSCT did not alter hematologic parameters and did not impair immune reconstitution but shifted the CD4+ Treg to CD8+ effector cell ratio because of a relative decrease in the latter population and a relative increase in Treg in GVHD treated mice. A reduction in the Th17/Treg ratio was also observed. When allo-HSCT recipients were challenged with tumor cells, the GVT activity in INCB-424 treated mice was intact in the absence of GVHD, resulting in significantly improved survival compared to untreated animals (p<0.001) and reduced the presence of tumor cells. On the other hand, circulating miRNA profiling before aGVHD onset was able to identify patients at high risk of developing the disease. Two unique miRNAs (miR-194 and miR-518f) were upregulated in samples of patients that would lately develop aGVHD. Pathway prediction analysis indicated that these miRNAs are critical in GVHD pathogenesis. Conclusions The inhibition of JAK/STAT signaling using the sensitive and specific inhibitor of JAK1/JAK2 INC-424 at the optimal dose of 45mg/kg/day, conferred effective protection from lethal acute GVHD in a MHC mismatched HSCT mouse model. Mice retain the ability to mount aggressive graft-versus-tumor (GVT) effects and to generate complete donor T-cell reconstitution. Taken together, these data suggest that INC-424, recently approved for the treatment of myelofibrosis, might also be tested for GVHD prophylaxis and treatment in clinical trials. In addition, considering the non-invasive characteristics of plasma sampling and the feasibility of detecting miRNAs after allo-HSCT, our results indicate that circulating miRNAs represent a promising tool for the early diagnosis of aGVHD. However, inconsistencies with prior published data highlight the need to develop standards for circulating miRNA studies to move their discovery from the molecular biology laboratory to the clinic.

Bone, a specialized connective tissue, consists of cells and mineralized extracellular matrix. The main cell types of bone tissue are: the osteoblasts, the osteocytes and the osteoclasts. Osteoblasts produce extracellular matrix, osteoclasts are responsible of its resorption, hence bone physiology is a delicate balance between synthesis of new bone and resorption of the old one. Osteoporosis is a disease in which catabolic activity of osteoclasts overtakes anabolic activity of osteoblasts leading to increased bone resorption and progressive bone fragility. Primary osteoporosis is a common disease among post-menopausal female population. Pathologies as diabetes mellitus, hyperparathyroidism and long-term treatment with glucocorticoids cause secondary osteoporosis. Glucocorticoid-induced osteoporosis is the most common type of secondary osteoporosis. Glucocorticoid treatment is a well known method to induce osteoporosis in animal models, hence it could be an example of “translational model” in which injured bone could be repopulated by stem cells or progenitors in clinical trials. The aim of this thesis is to investigate whether preosteoblasts could repopulate injured bone in an animal model treated with glucocorticoids. Preosteoblasts have been isolated from newborn calvariae of GFP mice. In these cells, expression of the osteogenic marker Runx2 has been assessed by Real time PCR, while osteogenic potential has been analysed by cytochemistry assays to detect alkaline phosphatase and mineralized bone nodules (Alizarin Red and Von Kossa staining). To realize the in vivo model, C57BL/6 three months aged mice have been divided into three groups [group I (n=4): mice not treated with drug and not infused with cells, group II (n=4): mice treated with drug and not infused with cells, group III (n=4): mice treated with drug and infused with cells]. Drug (methylprednisolone) has been administered for one month with a dose of 75 mg/Kg/week. In mice of group III, 5 x 105 GFP preosteoblasts, previously expanded in vitro, have been infused with injection into the tail vein. Mice have been sacrificed, tibial and femoral bones have been harvested, processed and analysed by istomorphometry and immunoistochemistry. Expression of Runx2, osteonectin (SPARC) and alkaline phosphatase (ALP) in these tissues has been detected with Real time PCR. In vitro preosteoblasts produce alkaline phosphatase during early time in culture with normal medium, while the level decreases in differentiating conditions with medium containing ascorbic acid and β-glycerophosphate. Preosteoblasts maintained in differentiation medium for 30 days are positive to Alizarin and Von Kossa staining, hence they are able to produce mineralized extracellular matrix that is a feature of functional mature osteoblasts. Runx2 expression increases during differentiating conditions; in cells maintained in differentiation medium for 30 days there is an increase of 50% compared to cells maintained in normal medium (p<0.05). In mice of group III an increased level of parameters concerning osteoid has been detected (O.Th, OS/BS, OV/BV) and an increased number of active osteoblasts (during synthetic activity) has been observed compared to group II. Between these two groups, significant variations of bone volume (BV/TV), trabecular thickness (Tb.Th), trabecular number (Tb.N) and trabecular separation (Tb.Sp) have not been detected. Microarchitecture parameters (Nd.N/TV, Nd/Tm) have not been affected. Similar results have been obtained from inderect microarchitecture parameters as Marrow Star Volume and Fractal Dimension. Real time PCR analysis revealed a reduction in osteogenic gene expression in group II compared to group I (ALP: -50%, p<0.01; Runx2: -56.75%, p<0.01; SPARC: -44.5%, p<0.05). In group III there is a recovery of expression of osteogenic markers (ALP: +40%, p<0.05; Runx2: +66.28%, p<0.001; SPARC: +55%; p<0.01) compared to group II. Immunoistochemistry is under investigation. In our glucocorticoid-induced osteoporosis model we sacrificed mice only one week after infusion of cells, this preparatory investigation shows that our model induces the engraftment of preosteoblasts in injured bone. However, a longer time, at least of 1-2 months, is needed to investigate if preosteoblasts are able not only to graft onto host tissue, but also to proliferate in vivo and to differentiate in full mature and functional osteoblasts.
L’osso è un tessuto connettivo specializzato costituito da cellule e matrice extracellulare mineralizzata. Le cellule principali sono gli osteoblasti, gli osteociti e gli osteoclasti. Gli osteoblasti depongono la matrice ossea, mentre gli osteoclasti sono i responsabili del suo riassorbimento. La fisiologia dell’osso è quindi il risultato di un delicato equilibrio tra deposizione di matrice ossea e suo riassorbimento. Quando l’azione catabolica degli osteoclasti è maggiore rispetto a quella anabolica degli osteoblasti si produce una progressiva fragilità ossea che porta ad un quadro clinico osteoporotico. L’osteoporosi primaria colpisce soprattutto la popolazione femminile dopo la menopausa. Molte patologie come il diabete mellito, l’iperparatiroidismo ed il trattamento a lungo termine con glucocorticoidi causano l’osteoporosi secondaria. L’osteoporosi indotta da glucocorticoidi è la più comune causa di osteoporosi secondaria. Il trattamento con glucocorticoidi è un noto procedimento di induzione dell’osteoporosi in modelli animali e può dunque rappresentare un primo esempio di modello “traslazionale” potenzialmente applicabile in clinica per indurre un ripopolamento dell’osso con cellule staminali mesenchimali o precursori osteogenici. Lo scopo di questo lavoro è stato pertanto valutare nel modello animale se sia possibile ripopolare l’osso danneggiato con preosteoblasti. I crani di topi neonati transgenici (GFP) sono stati prelevati e messi in coltura per ottenere preosteoblasti. Nelle colture in vitro è stata valutata l’espressione del gene Runx2 con la tecnica di Real time PCR, mentre la capacità osteogenica è stata analizzata con colorazioni citochimiche per la fosfatasi alcalina e per la deposizione di matrice ossea mineralizzata (Alizarin Red e Von Kossa). Per la realizzazione del modello in vivo topi C57BL/6 maschi di 3 mesi sono stati divisi in 3 gruppi [gruppo I (n=4): topi non trattati con farmaco e non infusi con cellule; gruppo II (n=4): topi trattati con farmaco non infusi con cellule; gruppo III (n=4): topi trattati con farmaco ed infusi con cellule]. Il farmaco (metilprednisolone) è stato somministrato per un mese alla dose di 75 mg/Kg/settimana. Negli animali appartenenti al gruppo III sono state infuse, attraverso iniezione nella vena della coda, 5 x 105 preosteoblasti GFP precedentemente espansi in vitro. I topi sono stati sacrificati, le tibie ed i femori sono stati prelevati e processati per l’analisi istomorfometrica e della microarchitettura ossea e per l’ immunoistochimica. In questi tessuti, l’espressione genica di Runx2, osteonectina (SPARC) e fosfatasi alcalina (ALP) è stata valutata tramite Real time PCR. In vitro i preosteoblasti producono fosfatasi alcalina durate i primi giorni di coltura in medium non differenziante, mentre il livello decresce in condizioni differenzianti, cioè in medium contenente acido ascorbico e β-glicerofosfato. I preosteoblasti mantenuti in medium di differenziamento per 30 giorni sono positivi alle colorazioni Alizarin Red e Von Kossa, quindi sono in grado di produrre matrice ossea mineralizzata, caratteristica degli osteoblasti funzionali e maturi. L’espressione del gene Runx2 aumenta durante il differenziamento, si ha un aumento del 50% nelle cellule differenziate per 30 giorni rispetto alle cellule non differenziate (p<0.05). L’inoculazione dei preosteoblasti nei topi del gruppo III ha evidenziato un aumento dei parametri statici di neoformazione ossea relativi all’osteoide (O.Th, OS/BS, OV/BV) ed un aumento del numero di osteoblasti attivi, cioè in corso di deposizione di osteoide, rispetto al gruppo II. Tra questi due gruppi non si sono osservate, invece, variazioni significative in termini di volume osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th) numero delle trabecole (Tb.N) e separazione fra esse (Tb.Sp). Non sono state rilevate, inoltre, differenze dei parametri di microarchitettura (Nd.N/TV, Nd/Tm). Risultati simili sono emersi dalla valutazione dei parametri indiretti di microarchitettura (Marrow Star Volume e Fractal Dimension). L’espressione genica ha dimostrato che nel gruppo II si ha una riduzione dell’espressione dei geni osteogenici rispetto al gruppo I (ALP: -50%, p<0.01; Runx2: -56.75%, p<0.01; SPARC: -44.5%, p<0.05). Nel gruppo III si è avuto un recupero dell’espressione dei geni osteogenici (ALP: +40%, p<0.05; Runx2: +66.28%, p<0.001; SPARC: +55%, p<0.01) rispetto al gruppo II. I campioni di tessuto per l’ immunoistochimica devono essere processati. Nel nostro modello sperimentale di osteoporosi indotta da glucocorticoidi nel topo, abbiamo sacrificato gli animali solo una settimana dopo l’infusione delle cellule; questi dati preliminari dimostrano che il nostro modello induce l’engraftment dei preosteoblasti nell’osso danneggiato. Tuttavia è richiesto un tempo di osservazione più lungo, di almeno 1-2 mesi per valutare se le cellule trapiantate siano in grado, non solo di integrarsi nel tessuto dell’ospite, ma anche di proliferare in vivo e di differenziare in osteoblasti maturi e funzionali.

Background.Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is now the therapeutic treatment for malignant and nonmalignant hematologic diseases and could represent a challenge to pediatric patients and their families. Advances in HSCT procedure have significantly increased the number of HSCT performed each year and have improved long term survival rates, so studies have shifted their focus from survival time to Quality of Life (QoL). Childhood HSCT survivors have been shown to be prone to develop psychological, cognitive, social and familiar, as well as medical, adverse outcomes. (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). The aim of the present study is to evaluate psychosocial and behavioral features and QoL of childhood HSCT survivors and their families (including siblings). Secondary aims are to evaluate the level of agreement between survivor-parents reports as for psychopathological areas and QoL; to evaluate parental stress and finally to identify risk and protective factors for mental health. Methods. Paediatric HSCT survivors (at least 5 years post transplantation) and their parent each completed a questionnaire package that included Achenbach test (Child Behaviour Checklist-CBCL; Youth Self Report-YSR), Pediatric Quality of Life Inventory 4.0 (PedsQL) and a brief unstructured text. Parents were also asked to complete an anamnestic interview and two other test: Short Form-36 (SF-36) and Parenting Stress Index scale (PSI). Siblings were asked to complete YSR and a brief unstructured text. Data were analysed using SPSS software. Results From 2012, 37 pediatric HSCT survivors (62% male) were enrolled in the study. The age at HSCT was 10 yrs on average (range 0,7-11,2 yrs). Fifty four percent of survivors were treated with allogenic unrelated HSCT. Seventy-four parent and 38 siblings were also tested. YSR scores exceeded the normative cut off for total competences (22%), social competences (13%) and somatic complains (8%), while CBCL scores were mainly pathological for total competences (49%), activities (22%) and somatic symptoms (11%). Symptoms reported to CBCL were more if: the survivor is female, there were a allogenic related HSCT, there were medical toxicities and if timing since communication of therapeutic choice and HSCT were longer. CBCL and YSR present a good level of agreement only for total competences scale (K=0.06, p= 0.002), somatic symptoms (K=0.21, p= 0.003) and attention problems (k=0.13; p=0.02). As for PedsQL, there was a poor level of agreement between survivors and parents only for physical area (K=0.05; p=0.31) and emotional area (K=0.09; p=0.06). In SF-36 mothers, perceive a worse QoL for “role limitation” scale when they have only one child or more than three children, if timing since communication and HSCT was brief and if survivor was treated with allogenic related HSCT. Fathers perceive a worse mental health if they have one child or more than two children, and if they were married. Siblings who were closer to survivor appear to present a worse QoL according to parents. Conclusion. Pediatric HSCT survivors present psychological distress in many areas (internalizing, externalizing, attention and social areas), with a prevalence of somatic symptoms.As for QoL, parents report better emotional function and lower physical function of the survivor. The first sibling appears to perceive a worse QoL. Mother and father perceive different kind of distress, but having two children appears to be homogeneously protective. Studies are needed to explore discordant perception and finally to improve outcomes and care for pediatric HSCT patients and their families.
Premesse. Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) rappresenta ad oggi la terapia per alcune patologie ematologiche maligne e non maligne e costituisce una sfida per iI paziente in età pediatrica e per la sua famiglia. Il progresso medico relativo alla procedura di HSCT ha significativamente aumentato il numero di trapianti eseguiti ogni anno ed ha migliorato le percentuali di sopravvivenza a lungo termine, pertanto gli studi scientifici hanno spostato il loro focus dalla valutazione dei tassi di sopravvivenza all’esplorazione della Qualità di Vita (QoL). I sopravvissuti a HSCT avvenuto in età pediatrica sono stati dimostrati essere una popolazione più suscettibile allo sviluppo di sequele psicologiche, cognitive, sociali e familiari, oltre che mediche (Khera et al., 2012; Syrjala et al., 2012). L’obiettivo dello studio è la valutazione degli aspetti psicosociali e comportamentali oltre che della QoL dei soggetti pediatrici sopravvissuti ad HSCT e delle loro famiglie (includendo i fratelli). Obiettivi secondari sono: la valutazione del livello di accordo tra survivor e genitori relativamente agli aspetti psicopatologici ed alla QoL, la valutazione dello stress genitoriale e infine l’identificazione di fattori di rischio e fattori protettivi per la salute mentale di questi soggetti. Metodo. Sono stati testati soggetti pediatrici sopravvissuti ad HSCT (almeno 5 anni dopo il trapianto) e i loro genitori. Ad ognuno è stato richiesto di completare una batteria di test che includeva i questionari di Achenbach (Child BehaviourChecklist-CBCL; Youth Self Report-YSR) e il PediatricQuality of Life Inventory 4.0 (PedsQL) e di produrre un breve testo libero. Ai genitori è stata richiesto inoltre di completare una intervista anamnestica ed ulteriori due test: il Short Form-36 (SF-36) e il Parenting Stress Index (PSI). Ai fratelli del sopravvissuto è stato chiesto di completare la YSR e di produrre un breve testo libero. I dati sono stati elaborati con l’utilizzo del software SPSS. Risultati. Dal 2012 sono stati reclutati 37 soggetti sopravvissuti ad HSCT (62% maschi). L’età media al momento dell’HSCT era 10 anni (range 0,7-11,2 anni). Cinquantaquattro percento dei sopravvissuti era stato sottoposto a trapianto allogenico non familiare. Sono stati inoltre testati 74 genitori e 38 fratelli. I punteggi dello YSR superano i cut off per competenze totali (22%), competenze sociali (13%) e lamentele somatiche (8%), mentre i punteggi alle CBCL risultano patologici principalmente nelle aree di competenze totali (49%), attività (22%) e sintomi somatici (11%). I sintomi riportati alla CBCL appaiono più significativi se: il sopravvissuto è femmina, in caso di trapianto allogenico familiare, presenza di tossicità mediche e se il tempo intercorso tra la comunicazione della scelta terapeutica e l’HSCT era più lungo. CBCL e YSR presentano un buon grado di accordo solo relativamente alle scale competenze totali (K=0.06, p= 0.002), sintomi somatici (K=0.21, p= 0.003) e problemi di attenzione (k=0.13; p=0.02). Rispetto alla PedsQL genitori e survivor non appaiono in accordo per l’area fisica (K=0.05; p=0.31) ed emotiva (K=0.09; p=0.06). Nella SF-36 le madri percepiscono una peggiore QoL nella scala relativa alla “limitazione del ruolo” quando hanno un solo figlio o più di tre figli, se il tempo intercorso tra la comunicazione della scelta terapeutica e l’HSCT è breve e in caso di trapianto allogenico familiare. I padri percepiscono una salute mentale peggiore se hanno un unico figlio o più di due e se sono sposati. I fratelli più vicini al sopravvissuto per ordine di genitura sembrano presentare una peggiore QoL secondo i genitori. Conclusioni.I soggetti sopravvissuti a HSCT in età pediatrica presentano livelli di stress psicologico in diverse aree (internalizzante, esternalizzante, dell’attenzione e della socializzazione), con una prevalenza di sintomi somatici. Rispetto alla QoL, i genitori riportano un funzionamento emotivo del sopravvissuto migliore a fronte di un peggiore funzionamento fisico. Il primo fratello sembra percepire una QoL peggiore. Madri e padri percepiscono diversamente il proprio distress, ma il fatto di avere due figli appare rappresentare in modo omogeneo un fattore protettivo. Saranno necessari ulteriori studi per approfondire la discordanza tra le percezioni e infine migliorare l’outcome e la cura dei pazienti pediatrici sottoposti ad HSCT e delle loro famiglie.