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Dissertations / Theses on the topic 'Transporteur ABC'
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Matar, Merheb Rachel Rima. "Caractérisation d’une nouvelle génération de détergents stabilisateurs des transporteurs abc en solution : cristallisation de BmrA, transporteur ABC bactérien." Thesis, Lyon 1, 2010. http://www.theses.fr/2010LYO10303.
Full textAbstract:
En raison de leur résistance aux agents chimiothérapeutiques, les transporteurs ABC de phénotype MDR ont attiré l'attention de la communauté scientifique. Notre projet vise à trouver des conditions dans lesquelles les transporteurs ABC restent fonctionnels en solution pour aboutir à la cristallisation de ces protéines dans une conformation active. Dans ce but, nous avons conçu et développé une nouvelle classe de détergents, à base de calix[4]arène, qui stabilisent ces protéines. Afin de résoudre la structure 3D à résolution atomique du transporteur ABC bactérien "BmrA", responsable de la résistance aux antibiotiques, nous avons utilisé une approche classique utilisant des détergents commerciaux en parallèle à nos détergents innovants. En présence de la Foscholine 12, nous avons obtenu des cristaux diffractant jusqu’à 5 Å de résolution. Cependant, les données de diffraction n’étaient pas suffisantes pour déterminer la structure tridimensionnelle complète de la protéine, seuls les domaines transmembranaires ont été résolus. D'autre part, nous avons atteint l'objectif de l'extraction, la purification et la stabilisation de ce transporteur à l'aide des détergents à base de calix [4] arène. Nous avons également montré que ces détergents promeuvent et améliorent la cinétique de cristallisation de BmrA, une étape que nous sommes en train d’optimiser, pour obtenir des cristaux de meilleure résolution, pour résoudre la structure 3D de BmrA qui sera utilisé pour concevoir des inhibiteurs adaptésDue to their preponderance in the resistance to chemotherapies, the MDR ABC transporters have drawn the attention of the scientific community. Our project aimed at finding conditions in which ABC transporters are active in solution to lead the crystallization of these proteins in an active conformation. In this purpose, we conceived and developed a new class of detergents, based on calix[4]arene ring, that stabilize these proteins. In order to solve the 3D-structure to atomic resolution of bacterial ABC transporter “BmrA” responsible for antibiotic resistance, we used a classical approach with commercial detergents in addition to the innovative ones. We have crystallized the protein in presence of Foscholine 12 with a diffraction resolution up to 5 Å. The data was incomplete; solving partially the structure of the transmembrane domains. On the other hand, we have reached the objective of extraction, purification and stabilization of this transporter by using calix[4]arene-based detergents. We have also shown that these detergents promote and enhance the kinetics of crystallization of BmrA, a step that we are improving, to get crystals of better resolution, for resolving the BmrA 3D-structure which will be used to design adapted inhibitors
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Vorac, Jaroslav. "Le fonctionnement du transporteur ABC de Streptococcus pneumoniae impliqué dans la résistance contre les peptides antimicrobiens." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016GREAV009/document.
Full textAbstract:
Streptococcus pneumoniae, le pneumocoque, est un pathogène majeur causant plus d'un million de morts par an dans le monde. De plus en plus de souches de pneumocoques sont résistants aux antibiotiques, en faisant un problème majeur de santé publique dans le monde. Une partie des ces antibiotiques sont les peptides anti-microbiens (AMP), qui sont produit aussi bien par l'hôte que des bactéries pathogènes en tant que premier système de défense. On trouve dans le pneumocoque un transporteur ABC (ATP-Binding Cassette) lié à un système de deux composants (TCS) – la kinase d'histidine (HK) et le régulateur de réponse (RR), qui cible les AMP. Récemment, il a été démontré, que l'absence du transporteur ABC augmente la sensibilité à la bacitracine. Dans ce projet, nous avons essayé à comprendre le mécanisme fonctionnel entre le transporteur ABC et TCS en utilisant des outils in vivo et in vitroStreptococcus pneumoniae, the pneumococcus, is a major human pathogen causing over a million deaths each year. Many pneumococcal strains display resistance towards antibiotics causing world-wide health concern. Some of these antibiotics are antimicrobial peptides (AMP), which are produced as a primary defense by hosts as well as pathogens. The pneumococcus harbors a system comprised of an ATP-binding cassette (ABC) transporter and a two-component system (TCS) composed of a histidine kinase (HK) and a response regulator (RR), which targets these molecules. It has been shown recently that the removal of this ABC transporter increases the sensitivity of the bacteria towards bacitracin. In this project, we tried to understand the functioning mechanism of the ABC transporter and the co-operation with the TCS using both in vivo and in vitro techniques
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Mathieu, Khadija. "Caractérisation d’un transporteur ABC d’antibiotiques de Streptococcus pneumoniae, PatA-PatB." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1052.
Full textAbstract:
Au cours des dernières décennies, une augmentation non négligeable du phénomène de résistance aux antibiotiques des bactéries a été observée. Ces bactéries possèdent plusieurs mécanismes de résistance parmi lesquels l’utilisation de transporteurs de type MDR (MultiDrug Resistance) dont certains appartiennent à la famille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette). Les transporteurs ABC sont des protéines membranaires et ubiquitaires qui possèdent une topologie commune avec deux domaines transmembranaires et deux domaines cytoplasmiques. Les transporteurs ABC de type exportateur permettent le transport de molécules à l’extérieur de la cellule en utilisant l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP. PatA-PatB est un transporteur ABC de Streptococcus pneumoniae, un pathogène humain responsable de pneumonies et de méningites. Cette protéine est impliquée dans la résistance de ce pathogène à des antibiotiques de types fluoroquinolones. Pour étudier son mécanisme moléculaire, nous avons optimisé la surexpression fonctionnelle de ce transporteur chez Escherichia coli. Ainsi, nous avons pu caractériser son activité de transport de drogues et son activité d’hydrolyse de nucléotides. Ces expériences ont révélé que PatA-PatB a la particularité d’utiliser préférentiellement le GTP comme source d’énergie, contrairement aux autres membres de cette famille. Afin d’identifier l’origine de cette propriété au niveau moléculaire, des expériences de mutagénèse dirigée ont été effectuées et nous avons ainsi identifié deux simples mutants qui transportent les drogues aussi bien avec du GTP que de l’ATPThe excessive use of antibiotics during the past decades led to the amplification of multidrug resistance in pathogenic bacteria. Bacteria have developed several mechanisms of antibiotic resistance. One of them involves the antibiotic efflux by MDR (MultiDrug Resistance) transporters, some of which belong to the ABC (ATP-Binding Cassette) transporter family. ABC transporter are ubiquitous membrane proteins with a conserved topology comprising four domains : two «TransMembrane Domain» and two cytoplasmic domains named « Nucleotide-Binding Domain ». ABC exporters expel drugs outside the bacteria using the energy of ATP hydrolysis. PatA-PatB is an ABC transporter from Streptococcus pneumoniae, a human pathogen bacterium responsible for pneumonia and meningitis. This protein is involved in S. pneumoniae resistance against fluoroquinolone antibiotics. To study the molecular mechanism, we optimized the functional expression of this transporter in Escherichia coli. Then, we characterized its drug transport activity and its nucleotide hydrolysis activity. These experiments showed that PatA-PatB, in contrast to other members of the ABC superfamily, preferentially uses GTP as energy supply. To identify the origin of this property at a molecular level, mutagenesis experiments were performed and we identified two mutants capable of an even drug transport with ATP and GTP
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Lakli, Mounia. "Pharmacothérapie ciblée de variants d'ABCB4, le transporteur biliaire de phospholipides." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASQ026.
Full textAbstract:
ABCB4/MDR3 est une protéine transmembranaire qui assure la sécrétion de la phosphatidylcholine, un composant fondamental de la bile, au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. De nombreuses mutations qui touchent le gène encodant ce transporteur sont à l'origine de pathologies cholestatiques rares. La cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3) représente la forme la plus sévère de ces maladies. À ce jour, environ 50 % des patients ne répondent pas aux traitements conventionnels, faisant de la transplantation hépatique l'ultime alternative thérapeutique pour ces jeunes patients. Cette thèse a eu pour objectif d'identifier par une approche de criblage à haut débit, de nouveaux correcteurs pharmacologiques du trafic intracellulaire de trois variants d'ABCB4 (I541F, L556R et I490T), retenus dans le réticulum endoplasmique. Les résultats des analyses biochimiques et morphologiques nous ont permis de valider, dans nos modèles cellulaires, trois correcteurs de la maturation et de la localisation membranaire de deux variants. Néanmoins, à cause d'un effet inhibiteur de ces molécules sur la fonction d'ABCB4, un seul correcteur a pu restaurer de manière significative la fonction de ces deux variants. En association avec l'ivacaftor (VX 770, Kalydeco®), un modulateur d'activité approuvé pour la mucoviscidose, une amélioration et une potentialisation de l'activité a été obtenue. Dans le but d'explorer le mécanisme d'action de ses composés, des analyses de docking moléculaire in silico ont été réalisées et suggèrent une interaction des drogues avec les résidus d'ABCB4 impliqués dans la liaison/hydrolyse de l'ATP expliquant potentiellement l'effet inhibiteur de la fonction. De plus, in vitro, les molécules augmentent la stabilité à la membrane plasmique d'ABCB4-WT et semblent inhiber sa dégradation lysosomale. De façon intéressante, l'effet correcteur de ces molécules est conservé pour un autre variant intracellulaire du transporteur d'acides biliaires ABCB11. Cela permet d'envisager un traitement consensus des déficits des deux transporteurs ABC, ABCB4 et ABCB11. Pour conclure, nous avons identifié de nouveaux composés correcteurs pour les variants d'ABCB4 retenus au niveau intracellulaire. Ces résultats ouvrent la voie à leur optimisation chimique afin de fournir de nouveaux médicaments candidats comme alternative potentielle à la transplantation hépatique pour les patients atteints de formes sévères de maladies liées aux déficits d'ABCB4ABCB4/MDR3 is a transmembrane protein that secretes phosphatidylcholine, a fundamental component of bile, to the canalicular membrane of hepatocytes. Numerous mutations in the gene encoding this transporter are responsible for rare cholestatic diseases, the most severe one being progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 (PFIC3). To date, at least 50 % of patients do not respond to conventional treatments, making liver transplantation the ultimate alternative therapy. Thus, this thesis was dedicated to characterizing and validating new pharmacological correctors for three traffic-defective ABCB4 variants (I541F, L556R and I490T) retained in the endoplasmic reticulum. In cell models, the biochemical and morphological analyses allowed us to identify three molecules able to rescue the maturation and canalicular localization of two variants. However, due to an inhibitory effect of these molecules on ABCB4 function, only one corrector was able to significantly restore the function of these variants. Combined with ivacaftor (VX 770, Kalydeco®), an approved modulator of activity for cystic fibrosis, an improvement and potentiation of ABCB4 activity was obtained. In silico molecular docking analyses were carried out to explore the mechanism of action of these compounds, suggesting an interaction of the drugs with ABCB4 residues involved in ATP binding/hydrolysis, which could explain the function inhibition effect. Furthermore, in vitro, the newly identified molecules increase the plasma membrane stability of ABCB4-WT and appear to inhibit its lysosomal degradation. Interestingly, the corrective effect of these molecules is conserved for an intracellular variant of the bile acid transporter ABCB11. This suggests the prospect of a consensus treatment for deficiencies of both ABC transporters. In conclusion, we have identified novel corrector compounds for intracellularly-retained ABCB4 variants. These results pave the way for their optimization to provide new drug candidates as potential alternatives to liver transplantation for patients with severe forms of ABCB4-related diseases
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Moulin, Pauline. "Caractérisation du transporteur de zinc Adc/Lmb de Streptococcus agalactiae." Thesis, Tours, 2017. http://www.theses.fr/2017TOUR3308/document.
Full textAbstract:
Dans cette étude, le transporteur ABC de zinc de Streptococcus agalactiae, première cause d’infections materno-foetale en France, a été caractérisé. Nous avons montré que ce transporteur se compose, du complexe perméase-ATPase AdcCB, associé à trois protéines membranaires Lmb, AdcA et AdcAII redondantes dans la fixation de zinc. Ce transporteur comporte également deux protéines Sht et ShtII, retrouvées au niveau de la paroi, et nécessaires aux protéines Lmb et AdcAII pour la capture de zinc. L’absence d’un transporteur fonctionnel, par la triple délétion des gènes lmb, adcA et adcAII ou du complexe adcCB, a révélé une inhibition de la croissance et une perturbation de la division de la bactérie lorsqu’elle se trouve dans un environnement carencé en zinc. De plus, nous avons montré que ce transporteur de zinc participe à la survie de la bactérie en milieux biologiques humains, comme le liquide amniotique ou le LCR, où la bactérie est retrouvée lors d’infections, suggérant l’importance du transporteur lors du processus infectieux. Ces résultats ont mis en évidence, pour la première fois, que le zinc assure des fonctions biologiques vitales pour S. agalactiae et que, dans des conditions de forte carence en zinc, le transporteur Adc/Lmb représente le principal système d’acquisition de zinc de la bactérieIn this study, the zinc-ABC transporter of Streptococcus agalactiae, the first cause of materno-foetal infections in France, was characterized. We showed that this transporter is composed of an AdcCB permease-ATPase complex in association with three membrane-associated proteins Lmb, AdcA and AdcAII, which are redundant in zinc-binding. This transporter also possesses two proteins Sht and ShtII, which are associated to the cell wall, and that are necessary for the Lmb and AdcAII proteins for zinc capture. The absence of a functional transporter, by the triple deletion of the lmb, adcA and adcAII genes or the adcCB complex, revealed a growth inhibition and a disruption of the division of the bacterium when it is in a zinc-restricted environment. Furthermore, we showed that the zinc-ABC transporter contributes to the survival of the bacterium in human biological fluids, as the amniotic fluid or the cerebrospinal fluid, where the bacterium is found during infections, suggesting the importance of the transporter during the infectious process. These results hightlighted, for the first time, that zinc has biologically vital functions in S. agalactiae and that, under high zinc deficiency conditions, the Adc/Lmb transporter is the main zinc acquisition system of the bacterium
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Geillon, Flore. "Etude structure/fonction du demi-transporteur ABCD2 dans le contexte de l'Adrénoleucodystrophie liée à l'X." Thesis, Dijon, 2013. http://www.theses.fr/2013DIJOS067/document.
Full textAbstract:
L’Adrénoleucodystrophie liée à l’X est une maladie neurodégénérative rare due à des mutations dans le gène ABCD1. Ce gène code un demi-transporteur ABC peroxysomal, impliqué dans l’importation d’acides gras à très longue chaîne. Deux autres demi-transporteurs sont localisés dans la membrane peroxysomale : ABCD2 et ABCD3. La surexpression d’ABCD2 permet de compenser la déficience en ABCD1, ouvrant ainsi des perspectives thérapeutiques. Dans cette optique, l’objectif principal de ma thèse était d’étudier la fonction et la structure d’ABCD2, et plus largement des transporteurs ABC peroxysomaux.Les demi-transporteurs doivent au minimum se dimériser pour constituer un transporteur fonctionnel. Leur dimérisation alternative pourrait moduler leur spécificité de substrat. Afin de tester cette hypothèse, nous avons réalisé des constructions plasmidiques codant différents dimères chimériques, dont la fonctionnalité a été vérifiée par transfection transitoire dans deux modèles cellulaires (fibroblastes humains et levures). D’après nos résultats, ABCD1 et ABCD2 seraient fonctionnels quel que soit leur agencement dimérique. De plus, comme d’autres transporteurs ABC, les transporteurs ABC peroxysomaux pourraient s’oligomériser. En utilisant différentes techniques biochimiques (co-immunoprécipitation, sédimentation sur gradient de sucrose et électrophorèse en conditions natives), sur un modèle cellulaire surexprimant ABCD2-EGFP, nous démontrons qu’ABCD2-EGFP interagit avec ABCD1 et ABCD3, et que les transporteurs ABC peroxysomaux sont capables de s’oligomériser. Il reste désormais à déterminer les facteurs qui contrôlent cette oligomérisation et comprendre la valeur fonctionnelle de ces interactionsX-linked Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare neurodegenerative disease caused by deficiency of the peroxisomal half-transporter ABCD1, implicated in very long chain fatty acids import. Two additional half-transporters are located in the peroxisomal membrane: ABCD2 and ABCD3. Over-expression of ABCD2 is known to compensate for ABCD1 deficiency, making ABCD2 a therapeutic target for X-ALD treatment. In this context, the main objective of my thesis was to investigate the function and the structure of ABCD2, and more broadly, of peroxisomal ABC transporters.Half-transporters must at least dimerize to form a functional transporter. Alternative dimerization could modulate substrate specificity. In order to test this hypothesis, we engineered plasmidic constructs encoding chimeric ABCD dimers, whose functionality has been evaluated by transient transfection in two cell models (human fibroblasts and yeasts). Our results show that, ABCD1 and ABCD2 are functional whatever their dimeric organization. Besides, like other ABC transporters, peroxisomal ABC transporters could oligomerize. By using a multi-technical approach (co-immunoprecipitation, velocity sucrose gradient and native polyacrylamide gel electrophoresis experiments) on stably transfected hepatoma cells expressing ABCD2-EGFP, we demonstrate that ABCD2-EGFP interacts with ABCD1 and ABCD3, and that peroxisomal ABC transporters oligomerize. The perspectives will consist in determining which factors control the oligomerization process and understanding the functional value of these interactions
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Cescau, Sandra. "Sécrétion de l'hémophore HasA de Serratia marcescens via un transporteur ABC." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077213.
Full textAbstract:
Chez les bactéries à Gram négatif, la voie de sécrétion ABC (T1SS) permet l'export de protéines présentant un signal de sécrétion C-terminal non clivable. Les transporteurs sont constitués de 3 protéines membranaires : une ATPase de la famille largement répandue des protéines ABC, une deuxième protéine de membrane interne et une protéine de membrane externe de la famille de TolC. TolC participe également aux pompes d'efflux de détergents et d'antibiotiques, les T1SS et les pompes d'efflux co-exprimés se partageant TolC sans perte de fonctionnalité. Le complexe de sécrétion n'est pas associé de façon permanente. Sa formation est induite par l'interaction entre le signal de sécrétion et la protéine ABC. L'oligomérisation du transporteur a été étudié par des approches biochimiques : chromatographie d'affinité et pontage chimique. Les mécanismes moléculaires permettant l'association et la dissociation du transporteur sont inconnus. Lors de ces travaux, le T1SS modèle utilisé est celui de l'hémophore HasA de S. Marcescens. Nous avons montré que HasA dépourvu de son signal C-terminal induit une oligomérisation stable du transporteur, séquestrant la protéine TolC. La pénurie de molécules TolC disponibles pour l'association aux pompes d'efflux entraîne une sensibilité accrue au SDS. L'hyperproduction de la protéine TolC réverse le phénotype de sensibilité. L'expression du signal de sécrétion sous forme de polypeptide distinct restaure aussi la résistance montrant que le signal C-terminal est actif de façon intermoléculaire. Ainsi, l'hémophore a deux domaines d'interaction avec la protéine ABC : le signal C- terminal et un 2eme domaine dit domaine d'ancrageThe Type I secretion System makes it possible the Gram negative bacteria to export proteins presenting an uncleaved C-terminal secretion signal. The transporter are constituted of 3 proteins: a membrane ATPase of the large family of ABC proteins, a second cytoplasmic membrane protein and an outer membrane protein belonging to TolC family. TolC is multifunctional. It participates also to efflux pump which expulse detergents and antibiotics. When they are co-expressed, T1SS and efflux pump share TolC without lost of functionality. The secretion complex is not permanently associated. Its formation is induced by the interaction between the secretion signal and the ABC protein. The oligomerisation of the transporter has been studied by several biochemical approaches: affinity chromatography and cross-linking. Th molecular mechanisms of the association-dissociation of the transporter are unknown. During this work, the model studied was the T1SS of the HasA hemophore of S. Marcescens. We have shown that Has deleted for its C-terminal secretion signal induced a stable oligomerisation of the transporter, trapping TolC proteins. The unavailability of TolC molecules for the efflux pump involved a increased SDS sensitivity. The hyperproduction of the TolC protein reversed this phenotype. The expression of the secretion signal as a single molecule also restored the resistance This suggests that the secretion signal is active in an intermolecular manner. Thus, the hemophore presents 2 interaction domains with the ABC protein: the secretion signal and a second site name the anchoring domain
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Paik, Su-Jin. "Couplages entre un transporteur membranaire de type ABC, BmrA et son environnement membranaire." Electronic Thesis or Diss., Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLET010.
Full textAbstract:
Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs constituent une grande famille de protéine transmembranaire présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides... Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de multiresistance aux drogues des bactéries contre les antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux, antiviraux ...Une question fondamentale pour comprendre le transport de drogues est comment les propriétés de membranes modulent la fonction et l’organisation spatio temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B. subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique membranaire. Dans un premier temps, après expression et purification des protéines en détergent, nous avons caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a permis de moduler de façon contrôlée la composition lipidique, la densité et la conformation des protéines et la courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative les contributions respectives de ces paramètres de membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les fortes courbure positives. Dans un second temps, nous avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier les rôles respectifs de la courbure et de la tensions membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des approches de nanotube pulling. Les expériences en collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à la formation de cluster de protéines et que cette préférence varie en fonction de l’état catalytique de la protéine. Finalement, nous avons mis au point une méthode pour étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et de corrélation croisée.L’ensemble des données suggère que organisations spatiales des ABC transporteurs dans les cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de remodelages membranaires mais sans modification importante de la fonctionABCs (ATP binding cassettes) transporters constitute a large family of transmembrane proteins present in all organisms. ABC transporters hydrolyze ATP to translocate an immense quantity of amphiphilic substrates, such as lipids, steroids, peptides... Some ABCs confer a multiresistance cellular phenotype to drugs from bacteria against antibiotics to humans against anticancer agents, antivirals...A fundamental question for understanding drug transport at the molecular level is how the properties of membranes modulate the function and spatial temporal organization of ABCs. We studied in detail these coupling with BmrA, a bacterial ABC of B. subtillis using different in vitro membrane systems and different biochemical and membrane biophysical approaches. Firstly, after expression and purification of proteins in detergent, we characterized the hydrolysis of ATP of BmrA according to its membrane environment, solubilized in detergent micelles and in mixed lipid/detergent micelles. Proteoliposomes were characterized according to protein orientation, incorporation rate, size and lamellarity. This allowed us to modulate in a controlled manner lipid composition, protein density and conformation and membrane curvature to quantitatively determine the respective contributions of these membrane parameters. Thus, we show that ATP hydrolysis is sensitive to lipid specificity when the protein is embedded in a bilayer. This lipid specificity is provided by negative lipids and phosphatidylethanolamine type lipids that synergistically stimulate hydrolytic activity. However, ATP hydrolysis was decreased in high positive membrane curvature. Secondly, we determined the conditions of reconstitution of BmrA in Giant Unilamellar Vesicles, which then allowed our collaborator to study the respective roles of membrane curvature and tension in the spatial organization of BmrA. Nanotube pulling experiments performed in collaboration show that BmrA has a strong preference for highly curved membrane regions leading to protein cluster formation and that this preference varies according to the catalytic state of the protein. Finally, we developed a method to study the dynamics of NBDs by Förster resonance energy transfer at the single molecule level in reconstituted system via fluorescence cross-correlation spectroscopy.The data set suggest that spatial organizations of ABC transporters in bacterial and eukaryotic cells are different with the possibility of sorting during membrane remodeling of eukaryotic membranes in areas of strong membrane curvatures but without significant change in function
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Jeannesson, Elise Siest Gérard Visvikis-Siest Sophie. "Analyse génétique et transcriptomique du transporteur ABCB1 en physiopathologie cardiovasculaire." S. l. : Nancy 1, 2008. http://www.scd.uhp-nancy.fr/docnum/SCD_T_2008_0130_JEANNESSON.pdf.
Full text
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Olivier, Maryline. "Rôle du transporteur ABCG1 dans l’homéostasie lipidique cellulaire : implications physiopathologiques chez l'homme." Paris 6, 2010. http://www.theses.fr/2010PA066733.
Full textAbstract:
L’homéostasie lipidique cellulaire repose sur l’entrée et/ou la synthèse des lipides et la sortie et/ou l’utilisation des lipides cellulaires. L’athérosclérose et l’obésité sont deux maladies pour lesquelles le mécanisme pathogénique repose sur un dysfonctionnement de l’homéostasie lipidique de cellules clés conduisant à l’accumulation de lipides dans le macrophage et l’adipocyte respectivement. Les études sur les modèles cellulaires et les modèles murins ont permis d’identifier un rôle du transporteur ABCG1 dans l’homéostasie et les mécanismes de transport des lipides (phospholipides, cholestérol, oxystérols). Ces travaux ont pour but d’identifier un rôle physiologique du transporteur ABCG1 humain. L’analyse du rôle du transporteur membranaire ABCG1 dans l’homéostasie lipidique chez l’homme m’a permis de mettre en évidence que l’expression de ce transporteur était associée avec l’activité lipoprotéine lipase (LPL). De plus, l’étude des mécanismes cellulaires impliqués sous-jacents à cette association (génotype d’ABCG1-activité LPL) a montré qu’ABCG1 favorise le stockage cellulaire de triglycérides et est fortement associé avec le développement de l’obésité chez l’homme. Enfin, l’étude du rôle physiologique d’ABCG1 dans l’homéostasie lipidique de la cellule hépatique a permis de mettre en évidence que ce transporteur était impliqué dans la captation sélective d’esters de cholestérol associés aux HDL ainsi que dans l’efflux cellulaire de cholestérol libre dans la cellule hépatique humaine. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier pour la première fois un rôle physiologique du transporteur membranaire ABCG1 dans l’homéostasie lipidique cellulaire chez l’homme
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Murad, Fatima. "Etude de la résistance aux macrolides chez Streptomyces ambofaciens et Streptomyces lividans." Paris 11, 2003. http://www.theses.fr/2003PA112172.
Full textAbstract:
Les antibiotiques macrolides inhibent la synthèse protéique en se liant aux ribosomes. Streptomyces ambofaciens produit la spiramycine et possède plusieurs mécanismes de résistance à la spiramycine et aux macrolides. J'ai caractérisé, le déterminant de résistance srmC et montré qu'il était constitué des trois gènes srmC1, srmC2 et srmC3. SrmC1 et srmC2 codent les sous-unités d'un transporteur de la famille ABC (ATP Binding Cassette) et confèrent la résistance à certains macrolides, dont la spiramycine, mais aussi à la daunorubicine. SrmC1/C2 sont co-transcrits et leur expression est réprimée par SrmC3, un répresseur transcriptionnel de la famille TetR. Les gènes srmC ne sont pas localisés parmi les gènes, de biosynthèse de la spiramycine et ne sont pas indispensables chez S. Ambofaciens. En étudiant chez Streptomyces lividans le mécanisme d'induction de l'expression de srmC1/C2, j'ai mis en évidence l'existence dans cette souche d'un nouveau mécanisme de résistance aux macrolides et à d'autres antibiotiques, inductible par un macrolide, la rosaramicine. Des orthologues de srmC1/C2, désignés sclA et sclB, codant les sous-unités d'un transporteur ABC, sont impliqués dans cette résistance. Ils confèrent une résistance multi-drogue (macrolides, daunorubicine, bromure d'éthidium). Leur expression est réprimée par SclR (répresseur transcriptionnel de la famille TetR. ). L'étude d'un mutant SclA ̄ SclR ̄suggère qu'un ou plusieurs autres déterminants participent également à la résistance multi-drogue inductible par la rosaramicine. Parmi les gènes de résistance aux macrolides de S. Ambofaciens, certains ont des orthologues chez S. Lividans, un non-producteur de macrolide, d'autres non. Ceci suggère que certains déterminants de résistance de S. Ambofaciens sont liés à la biosynthèse de spiramycine et jouent un rôle crucial dans la protection de la souche. D'autres, dont srmC, protégeraient la souche contre des produits toxiques présents dans l'environnementMacrolide antibiotics inhibit protein synthesis by binding to ribosomes. Streptomyces ambofaciens produces spiramycin and possesses several resistance mechanisms to spiramycine and other macrolides. The srmC determinant was studied in the work reported here. It is comprised of three genes: srmC1, srmC2 and srmC3. SrmC1/srmC2 encode the two sub-units of an ABC (ATP Binding Cassette) transporter. They confer resistance to several macrolides, including spiramycin, and to daunorubicin. The two genes srmC1/srmC2 are co-transcribed and their expression is repressed by SrmC3, a repressor of the TetR family. The srmC genes are not localized in the spiramycin biosynthetic gene cluster and are dispensable in S. Ambofaciens. During the study of the induction of srmCl/C2 expression in S. Lividans, a new mechanism of resistance to macrolides and other antibiotics, inducible by the macrolide rosaramicin was discovered in this strain. Genes sclA and sclB, orthologous to srmC1/C2, encoding an ABC transporter are involved in this resistance. SclA and sclB confer multidrug resistance (resistance to macrolides daunorubicin and ethidium bromide). Their expression is controlled by SclR (a TetR-like repressor). The study of a SclA ̄SclR ̄mutant strain suggested that other resistance determinant(s) might be involved in the rosaramicin-inducible resistance. Among macrolide resistance genes from S. Ambofaciens, some have homologues in S. Lividans, others do not. This suggests that some S. Ambofaciens resistant determinants could be directly linked to spiramycin biosynthesis and important for self-protection against spiramycin. Others, including srmC might protect the strain against other toxic compounds encountered in the environment
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Zarubica, Ana. "Influence du transporteur ABCA1 sur le microenvironnement lipidique de la membrane plasmique." Aix-Marseille 2, 2009. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2009AIX22025.pdf.
Full textAbstract:
Le transporteur ABCA1 est impliqué dans le transfert des phospholipides et du cholestérol vers Apo A-I sur la membrane plasmique cellulaire. Comme ABCA1 est un transporteur des lipides, nous avons examiné son effet sur le microenvironnement lipidique de la membrane. Nous avons démontré que l'activité ATP-ase d'ABCA1 modifie sa répartition dans les radeaux lipidiques, ainsi que la répartition d’autres protéines de la membrane comme le récepteur de transferrine (TfR), la dynamique cinétique de TfR et réduit l’endocytose de TfR. Nous avons montré par des méthodes biophysiques, cationic sensors et FLIM des modifications significatives dans le feuillet membranaire, interne et externe, par l'expression d'ABCA1. Nous avons démontré aussi par FRAP un changement général de la dynamique de la membrane en présence d'ABCA1. Nous avons corrélé la modification des propriétés de la membrane via ABCA1, avec son influence sur l'activation des macrophages en interférant avec la signalisation de l’IFNγRThe ABCA1 transporter is involved in the Apo A-I/mediated removal of cellular phospholipids and cholesterol at the cell membrane. Considering that ABCA1 acts as lipid translocator we investigated the effect of the transporter on membrane lipid microenvironment. By biochemical assays, we demonstrated that the ATP-ase activity of ABCA1 modifies the partitioning in lipid rafts of the transporter itself and other membrane proteins such as the transferrin receptor (TfR), TfR dynamic kinetics and down regulates TfR-mediated endocytosis. We then assessed by biophysical methods, cationic sensors and FLIM, significant modifications of membrane attributes at the inner and outer leaflet in the presence of ABCA1. Furthermore, we evidenced overall changes in membrane dynamics in the presence of ABCA1 by FRAP. Finally, we correlate the mechanistic basis of ABCA1-dependent modulation of macrophage phenotype with the influence of ABCA1 on lipid raft dependent signaling downstream of IFNγR
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Pozza, Alexandre. "Surexpression hétérologue et purification du transporteur membranaire ABCG2 : mécanisme d'interaction avec des substrats et des inhibiteurs spécifiques." Lyon 1, 2007. http://www.theses.fr/2007LYO10327.
Full textAbstract:
ABCG2 est un demi-transporteur ABC impliqué dans le phénotype de résistance à de multiples drogues des cellules cancéreuses. Notre but est de comprendre le mécanisme de transport et d’interaction avec des inhibiteurs spécifiques. Après des tentatives infructueuses en bactérie, ABCG2 a été surexprimée sous forme fonctionnelle dans le système cellules d’insecte/baculovirus. L’effet de certains inhibiteurs sur l’activité ATPasique de la protéine a été étudié, ainsi que leur fixation sur le transporteur purifié. Cela a permis de mettre en évidence un mécanisme d’inhibition différent pour un même inhibiteur entre les formes sauvage et mutée R482T du transporteur. La différence dans le spectre des substrats transportés induite par la mutation n’est pas due à la fixation, mais plus probablement à la translocation membranaire des substrats. La protéine recombinante apparaît sous forme de deux bandes dont la différence est probablement de nature conformationelleABCG2 is an ABC half-transporter involved in multidrug resistance of cancer cells. Our aim is to understand the mechanism of transport and of interaction with specific inhibitors. After some unsuccessful attempts in bacteria, ABCG2 was functionally overexpressed with the insect cells/baculovirus system. The effects of some inhibitors on ATPase activity were studied, as well as the capacity of binding to the purified transporter. This allowed to bring evidence for a different inhibition mechanism for the same inhibitor between the wild-type and R482T mutant of the transporter. The difference in transport-substrate spectrum induced by the mutation is not due to binding, but more likely related to membrane translocation. The recombinant protein appears as two bands, the difference of which is probably of conformational origin
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Pamard, Davia. "AtABCA1, un transporteur de la famille ATP-Binding Cassette impliqué dans la croissance du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana." Aix-Marseille 2, 2006. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2006AIX22015.pdf.
Full textAbstract:
Au cours de ma thèse, j'ai contribué par des approches moléculaires, génétiques et fonctionnelles à la caractérisation de l'unique transporteur de la sous-famille ABCA présent chez Arabidopsis thaliana et nommé AtABCA1. Nous avons cloné l'ADNc complet correspondant chez Arabidopsis (5649 paires de bases). Nous avons montré que la protéine AtABCA1 présente les motifs caractéristiques et la topologie typique des membres de la sous-famille ABCA. Des expériences de RT-PCR en temps réel et la technique du gène rapporteur GUS montrent que ce gène est exprimé majoritairement dans les anthères au niveau du tapetum et des grains de pollen. Une lignée défective pour AtABCA1 nous a permis de montrer une dérégulation de l'élongation des tubes polliniques in vitro amplifiée par le froid. En conclusion, nous proposons que le transporteur AtABCA1 soit impliqué dans la répartition des lipides et/ou stérols au niveau des couches protectrices et de la membrane des grains de pollen et ainsi régule la croissance des tubes polliniquesHere, we report the study of the only full-length transporter of the ABCA subfamily in Arabidopsis thaliana called AtABCA1. We cloned the AtABCA1 gene which includes 40 exons corresponding to 5,6 kb. It's the largest ABC transporter in Arabidopsis and presents ABCA subfamily specifics motifs and topology, consisting in two structurally related tandem arranged halves with a large exocytoplasmic domain followed by a multispanning membrane domain and a nucleotide binding domain. By northern-blot and quantitative RT-PCR studies, we demonstrate that AtABCA1 is fully expressed in anthers, especially in tapetum and pollen grains. In addition, the expression profile of AtABCA1 transcript is enhanced by cold treatment. Using a knock-out mutant, we demonstrate that AtABCA1 is implicated in regulation of pollen tube elongation. In conclusion, we proposed that AtABCA1 is implicated in lipids and/or sterols repartition at protective layers and cellular membrane of pollen grain and regulate the pollen tube elongation
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Jeannesson, Elise. "Analyse génétique et transcriptomique du transporteur ABCB1 en physiopathologie cardiovasculaire." Thesis, Nancy 1, 2008. http://www.theses.fr/2008NAN10130/document.
Full textAbstract:
ABCB1 est une protéine impliquée dans le transport des médicaments mais aussi probablement du cholestérol. Des phénomènes de résistance médicamenteuse sont associés à ses polymorphismes et à des modulations de son expression via le facteur PXR. Notre objectif était de réaliser une analyse génomique et transcriptomique d’ABCB1 basée sur ces hypothèses : 1) les variants d’ABCB1 expliquent-ils une part de la variabilité des taux de lipides et de lipoprotéines plasmatiques ? 2) le profil d’expression d’ABCB1 dans les cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) constitue-t-il un biomarqueur cardiovasculaire nouveau ? Nous avons déterminé la prévalence de polymorphismes d’ABCB1 chez 371 sujets de la cohorte STANISLAS. Nous montrons que ces variants modulent les concentrations en lipides des sujets sains. Des associations significatives avec les lipides sont aussi notées chez des sujets à haut risque cardiovasculaire. Nous observons qu’une majorité d’enzymes du métabolisme des xénobiotes et de facteurs de transcription sont exprimés dans les PBMCs de sujets sains. Nous montrons par RTPCR qu’ABCB1 et PXR sont exprimés dans les PBMCs de 83 sujets de la cohorte. Enfin, il n’y a pas d’association entre l’expression d’ABCB1 dans les PBMCs et le taux de lipides plasmatiques chez le sujet sain. En conclusion, les polymorphismes d’ABCB1 peuvent moduler le taux de lipides et d’apolipoprotéines. Nous ne pouvons toutefois pas proposer l’expression d’ABCB1 dans les PBMCs comme biomarqueur du risque cardiovasculaire. Il serait intéressant de reproduire cette étude chez des sujets à risque cardiovasculaire élevé ou d’utiliser un modèle in vitro permettant d’induire l’expression d’ABCB1ABCB1 is an ubiquitously expressed membrane transporter. Resistance to drugs is associated with genetic variations of its gene and with modulation of its expression through the PXR transcription factor. Given that ABCB1 could also transport cholesterol, our goal was to conduct a genomic and transcriptomic analysis of ABCB1 based on the following hypotheses: 1) ABCB1 variants would partly explain plasma lipid and apolipoprotein concentrations, and 2) ABCB1 expression profile in PBMCs would be a new, and easily available, cardiovascular biomarker. We have determined frequency of ABCB1 variants in 371 subjects from the STANISLAS cohort. We have shown in these healthy people that ABCB1 variants modulate lipid concentrations, sometimes in a sex-dependant manner. Significant associations were also observed in subjects with a high cardiovascular risk. In addition, DNA microarray analysis showed that most of the xenobiotic metabolizing enzymes and transcription factors are constitutively expressed in PBMCs of healthy subjects. ABCB1 and PXR were measured by quantitative RT-PCR in 83 subjects from the STANISLAS cohort. They are both expressed in PBMCs but their expressions do not correlate. Finally, there is no association between ABCB1, or PXR, expression in PBMCs and lipid plasma concentrations in healthy subjects. To conclude, ABCB1 variants would modulate lipid and apolipoprotein concentrations. However, from our results, we cannot propose ABCB1 expression in PBMCs as a biomarker of cardiovascular risk. It would be of interest to reproduce this study in PBMCs of people at high cardiovascular risk or in an in vitro model of PBMCs with induction studies of ABCB1 expression
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Jacquet-Bouix, Hélène. "Pharmacologie moléculaire d'un transporteur ABC : le récepteur des sulfonylurées, sous-unité du canal Katp." Université Joseph Fourier (Grenoble), 2002. http://www.theses.fr/2002GRE10102.
Full text
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Benabdelhak, Houssain. "Analyse structurale et fonctionnelle du domaine ABC "ATP binding cassette" de la protéine HLYB impliquée dans la secretion de l'hemolysine A chez ESCHERICHIA COLI." Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA112068.
Full textAbstract:
HlyB, protéine de la membrane interne cytoplasmique â'Escherichia coli, forme un complexe avec HlyD (localisée au niveau de la membrane interne et qui traverse le périplasme) et TolC (protéine de la membrane externe et qui traverse également le périplasme). Ce complexe multiprotéique, traversant les deux membranes d'E. Coli avec une stoichiométrie minimale de HlyB, HlyD, TolC, 2:3:3, permet le transport (sécrétion) direct du cytoplasme vers le milieu externe de la toxine hémolysine HlyA. Ce polypeptide (HlyA, 107 kDa) est adressé au complexe de translocation par une séquence signal de sécrétion C-terminale d'environ 46 acides aminés. La sécrétion de HlyA dépend en partie de l'énergie fournie par la force proton motrice et par le transporteur-ABC, HlyB. HlyB, composé d'un domaine transmembranaire et d'un domaine ABC-ATPase cytoplasmique, est également essentielle pour l'oligomérisation de HlyD. Les rôles de HlyD et probablement de TolC, en plus de leur participation intégrale pour la formation d'un canal de transport, ont été mis en évidence à des stades tardifs de sécrétion pour le repliement correct de HlyA avant l'étape finale de son relargage de la surface cellulaire. Pour la translocation de HlyA à travers la membrane cytoplasmique, le domaine de membrane de HlyB est supposé faire partie du canal de transport avec l'énergie d'hydrolyse de l'ATP par HlyB nécessaire au moins pour initier le processus de transport. Afin d'adresser cette question, le domaine ABC-ATPase de HlyB a été purifié, cristallisé et sa structure à haute résolution (2. 55 A) a été déterminée. D'autres essais ont également cherché à élucider le rôle du domaine ABC dans la fonction de HlyB par des analyses détaillées in vitro de la régulation de son activité ATPasique. En effet, nous avons établi in vitro d'une part les conditions qui permettent de manière réversible la fixation ou non de l'ATP par le domaine ABC-ATPase et d'autre part les conditions qui contrôlent la transition entre les formes monomère et dimère. Les résultats obtenus, y compris l'analyse des mutants, indiquent que la dimérisation ne serait pas requise à l'activité ATPasique et que in vitro cette activité serait régulée à un niveau de fixation de l'ATP. D'autres études ont également indiqué que le domaine ABC de HlyB purifié interagit de manière spécifique avec la région C-termainale 25 kDa de HlyA via le signal de sécrétion. Un modèle a été proposé pour décrire un nouveau mécanisme de régulation de l'activité ATPasique du transporteur-ABC HlyB en relation avec la fonction de transport de la toxine HlyAHlyB, an inner, cytoplasmic membrane protein in E. Coli, forms a complex with HlyD (anchored in the inner membrane but spanning the periplasm) and TolC (anchored in the outer membrane but also spanning the periplasm). This multiprotein complex, traversing the surface layers of E. Coli, with an estimated minimum stoichiometry of HlyB, HlyD, TolC, 2:3:3, provides a transport (secretion) pathway from the cytoplasm to the external medium, for the 107 kDa haemolytic toxin, HlyA. HlyA is targeted to the translocator complex by a specific C-terminal secretion signal sequence of approximately 46 amino-acids. Secretion of HlyA depends upon energy provided by the proton motive force and by the ABC-transporter, HlyB. HlyB, composed of a transmembrane domain and cytoplasmic ABC-ATPase domain, is also essential for the oligomerization of HlyD, which is apparently required for its normal function. At late stages in secretion, HlyD and perhaps TolC are also required for correct folding of HlyA before its release from the cell. For translocation of HlyA across the cytoplasmic membrane, the membrane domain of HlyB is presumed to constitue part of a transport channel, with the energy of hydrolysis of ATP by HlyB required in some way for initiation of the transport process. To address this issue, the NBD (ABC-ATPase) domain of HlyB was purified and crystallized and the crystal structure at 2. 55 A is now been determined. Attempts were also made to elucidate the role of the NBD in HlyB function by detailed analysis of the regulation of its ATPase activity in vitro. Thus, conditions were determined which favour the transition of the NBD between monomer and dimer forms and for reversibly switching, on and off, the ATPase activity. The results, including the analysis of mutants, indicate that dimerization is not required for activity and that in vitro, activity is regulated at the level of ATP binding. Other studies also indicate that the purified NBD specifically interacts with the C-terminal 25 kDa of HlyA which contains the C-terminal, secretion signal, essential for recognition of the translocator. A model will be discussed describing a novel mechanism for regulating ATPase activity in this ABC-transporter and its coupling to the transport of HlyA toxin
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Lorendeau, Doriane. "Eradication ciblée des cellules cancéreuses chimiorésistantes par des activateurs du transporteur de drogues MRP1 : mécanismes moléculaires et cellulaires." Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00993955.
Full textAbstract:
La surexpression de pompes d'efflux par les cellules cancéreuses permet l'élimination d'agents cytotoxiques, induisant alors une résistance à la chimiothérapie. Trois transporteurs ABC sont principalement impliqués dans cette résistance : P-gp/ABCB1, MRP1-ABCC1 et BCRP/ABCG2. La surexpression des ces transporteurs peut également être le "talon d'Achille" des cellules cancéreuses résistantes en les sensibilisant à certains composés. Ce phénomène, appelé sensibilité collatérale, pourrait constituer un nouvel outil thérapeutique conter les les cancers intrinséquement ou rendus résistants en éliminant sélectivement les cellules cancéreuse résistances. Ainsi, le S-vérapamil provoque la mort sélective par apoptose des cellules surexprimant suite à l'extrusion rapide et massive du glutathion 5GSH) intracellulaire par MRP1. Nous avons démontré que le vérapamil est capable de dépléter s"lectivement de leur contenu en GSH les tumeurs de cancer du poumon H69AR, MRP1 positives et résistantes, dès 3 heures d'exposition aiguë. Le vérapamil étant fortemnt carditoxique, nous avons développé de nouveaux agents de sensibilité collatérale, plus sélectif que le vérapamil, comme le xanthone 9, le flavonoïde 36 et le dimère de flavonoïde 4e. Enfin, grâce à l'étude de chimères MRP1/MRP2, nous avons démontré que la région comprenant les boucles L0 et L1-TM12 pourrait constituter les sites modualteurs et substrat du GSH sur MRP1.
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Barrière, Quentin. "Analyse fonctionnelle de BclA, un transporteur de peptides antimicrobiens impliqué dans la différenciation des bactéroïdes au cours de la symbiose Aeschynomene/Bradyrhizobium." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS460.
Full textAbstract:
Les plantes de la famille des légumineuses ont acquis la capacité d’accueillir au sein d’organes symbiotiques, les nodosités, des bactéries fixatrices d’azote appelées bactéroïdes. Cette symbiose permet aux plantes hôtes de satisfaire leurs besoins en azote. Certaines légumineuses produisent au sein des nodosités une grande famille de peptides antimicrobiens particuliers, les NCR (Nodule-specific Cysteine-Rich). Ils permettent à l’hôte de contrôler la population bactérienne intracellulaire via leurs activités antimicrobiennes, mais aussi d’imposer aux rhizobia une différenciation terminale des bactéroïdes. Durant ma thèse, j’ai participé à l’identification et à la caractérisation de la protéine bactérienne BclA. Ce transporteur ABC est nécessaire pour la formation de bactéroïdes différenciés lors de la symbiose Aeschynomene-Bradyrhizobium. Pour mieux comprendre sa fonction symbiotique, j’ai étudié la relation entre BclA et une enzyme de modification du peptidoglycane, la DD-carboxypeptidase 1. J’ai pu montrer que ces deux facteurs agissent de manière indépendante dans la mise en place de bactéroïdes différenciés. Une analyse fonctionnelle de BclA et une expérience d’évolution expérimentale avec le mutant bacA de Sinorhizobium, un orthologue de bclA, apportent une meilleure compréhension du rôle de ces transporteurs in vivo. L’ensemble des résultats obtenus pendant ma thèse suggère que BclA et BacA assurent la résistance bactérienne face aux NCR in planta, comme un prérequis pour la suite du processus, mais ne sont pas nécessaires à la différenciation per se. De plus, leurs activités d’import des NCR ne semblent pas être le mécanisme sous-jacent du processus de résistancePlants of the legume family have acquired the ability to host in specific symbiotic organs, the roots nodules, nitrogen fixing bacteria, called bacteroids. This symbiosis allows plants to fulfill all their nitrogen requirements. Some legume plants produce in their nodules a large family of antimicrobials peptides called the NCRs (Nodule-specific Cysteine-Rich). Their antimicrobial activities allow the host plant to control the intracellular bacterial population. NCRs peptides also govern terminal differentiation of the bacteroids. During my PhD work, I participated in the identification and characterization of BclA. This bacterial ABC transporter is involved in bacteroid differentiation during the Aeschynomene- Bradyrhizobium symbiosis. In order to better understand its symbiotic function, I studied the link between BclA and a peptidoglycan-modifying enzyme, the DD-carboxypeptidase 1. I was able to show that these two factors act in an independent manner in the establishment of bacteroid differentiation. A functional analysis of BclA and an experimental evolution on Sinorhizobium bacA mutant, an orthologue of bclA, conferred a better understanding of the in vivo role of these transporters. The results obtained during my thesis suggest that the BclA and BacA function is to ensure bacterial resistance to NCRs, as a prerequisite for the bacterial differentiation process, but is not needed for differentiation per se. Furthermore, their NCR uptake activities do not seem to be the mechanism underlying the resistance
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Perrotton, Thomas. "Étude du transporteur de multiples drogues MRP1 : caractérisation des NBD, et étude de modulateurs conduisant à la mort des cellules surexprimant le transporteur." Phd thesis, Lyon 1, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/docs/00/34/06/58/PDF/Manuscrit_de_these_-_Thomas_Perrotton_2_.pdf.
Full textAbstract:
L’acquisition du phénotype de résistance des cancers est souvent corrélée à l’expression de transporteurs membranaires appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (« ATP-Binding Cassette »). Un de ces transporteurs, MRP1 (« Multidrug Resistance Protein 1 »), permet l’efflux de nombreux substrats, de type anioniques, conjugués au GSH, glucuronates ou sulfates, ou en co-transport avec le GSH. Dans un premier temps, ce travail a porté sur l’étude des domaines de fixation des nucléotides isolés. Une étude biochimique a montré leur caractère fonctionnel asymétrique concernant les nucléotides, prouvant que seul la séquence primaire de ces NBD est responsable de cette fonctionnalité différentielle. L’étude de la fixation de substrats sur les NBD, a montré que ceux-ci pourraient, de part leur proximité avec les domaines transmembranaires, avoir un rôle dans la fixation des substrats. La deuxième étape de ce travail a concerné la caractérisation de l’activité des énantiomères du vérapamil. Les résultats ont montré que le S-vérapamil est l’isomère responsable de la stimulation du transport du GSH, conduisant à la mort des cellules surexprimant MRP1. Le R-vérapamil est caractérisé comme un inhibiteur de MRP1. Ces résultats ont des répercussions importantes en terme de thérapie. Deux études préliminaires de relation structure/fonction ont été menées en ce qui concerne des dérivés du vérapamil et des dérivés de flavonoïdes, afin de trouver des molécules plus efficaces contre MRP1The acquisition of cancer resistance phenotype is mostly correlated to the expression of membrane transporters belonging to the ABC transporters super family (“ATP-Binding Cassette”). One of these transporters, MRP1 (“Multidrug Resistance Protein1”), is a transmembrane protein which has the ability to efflux many substrates. First, this work has focused on the characterisation of the isolated nucleotide binding domains. A biochemical study has shown their asymmetric behaviour towards nucleotides, and their ability to bind substrates, which could lead to the involvement of NBDs in the substrate binding site. Then, a characterisation of the verapamil enantiomers has been performed, showing that S-verapamil was responsible of glutathione efflux, whereas R-verapamil had an inhibitory effect on MRP1. These results may have great impact in term of therapy. Finally, structure/function relationships of verapamil and flavonoids derivatives has been accessed, in order to find more potent modulators for MRP1
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Kassis, Josiane. "Le transporteur de médicaments anticancéreux, ABCG2, et son implication dans la chimiorésistance : étude structurale et mécanistique." Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1189.
Full textAbstract:
ABCG2 ou BCRP est une protéine membranaire de la famille des transporteurs ABC. Elle utilise l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP pour exporter des composés endogènes et exogènes hors des cellules. Elle participe ainsi à la protection et la détoxication de l’organisme. En revanche, dans le cas des cellules cancéreuses, elle est surexprimée et participe donc au phénotype de résistance à de multiples médicaments (MDR : Multi Drug Resistance). En effet, lors de la surexpression de cette protéine, les agents anti-cancéreux sont exportés hors des cellules tumorales, ce qui diminue leurs concentrations intracellulaires sous leurs seuils de cytotoxicité et les rend inefficaces. De par l’importance d’ABCG2 dans la chimiorésistance, de nombreux efforts sont effectués pour concevoir des inhibiteurs afin de restaurer la sensibilité des cellules cancéreuses. Dans ce contexte, le projet de thèse vise à caractériser ABCG2 sur les plans structural et fonctionnel afin de comprendre son mécanisme d’action. La protéine ABCG2 exprimée chez E. coli, a été purifiée, sous forme stable et homogène et le rendement est de 1,5 mg de protéine par litre de culture. La caractérisation fonctionnelle de celle-ci témoigne de son repliement correct. En effet, il a été démontré qu’elle est capable de fixer différents substrats (naturels et agents anti-cancéreux) avec des affinités différentes. Des essais préliminaires de cristallisation ainsi que des observations par microscopie électronique révèlent des résultats encourageants pour la suite de la caractérisation structuraleABCG2 or BCRP is a membrane protein that belongs to the ABC transporter family. It uses the hydrolysis energy of ATP to export endogenous and exogenous compounds out of cells. It is thus involved in the protection and detoxification of the body. However, it is overexpressed by cancer cells and participates in the multidrug resistance phenotype (MDR); in fact, anti-cancer agents are exported out of the tumor cells, which reduce their concentration below their cytotoxicity threshold and renders them ineffective. Because of its importance in chemoresistance, many efforts are made to design inhibitors to restore the sensitivity of cancer cells. In this context, the PhD project aims to characterize ABCG2 at structural and functional levels in order to understand its mechanism of action. We have succeeded in purifying ABCG2 expressed in E. coli, the protein obtained is stable and homogeneous, with a yield of 1.5 mg of protein per liter of culture. The functional characterization of ABCG2 demonstrates its correct folding. In fact, we have demonstrated that it is able to bind different substrates (natural and anti-cancer agents) with different affinities. Preliminary crystallization assays and electron microscopy observations reveal encouraging results for subsequent structural characterization
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Lacabanne, Denis. "Solid-state NMR studies of the ABC transporter BmrA in its lipid environment." Thesis, Lyon, 2017. http://www.theses.fr/2017LYSE1243/document.
Full textAbstract:
Les transporteurs à ATP binding cassette (ABC) peuvent transporter une grande variété de substrats utilisant l'ATP-Mg2+ comme source d'énergie. Ces transporteurs sont présents dans toutes les formes de vie et sont impliqués dans la résistance aux médicaments, comprenant les anticancéreux et les antibiotiques. Mes travaux de thèse se concentrent sur le transporteur BmrA (130 kDa) de Bacillus subtilis utilisé en tant que système modèle et homologue de la P-glycoprotéine humaine impliquée dans la multirésistance aux anticancéreux. Dans ces travaux nous montrons que la reconstitution de cette protéine dans les lipides de Bacillus subtilis répond aux deux exigences centrales pour RMN: haut rapport signal sur bruit et la stabilité de l'échantillon sur une période de plusieurs années. Les spectres obtenus indiquent une protéine bien repliée et une préparation très homogène, comme en témoignent les lignes de résonance étroites et la dispersion du signal typique de la distribution de structure secondaire attendue de la protéine membranaire. Nous avons adapté la méthode GRecon utilisée dans les études de microscopie électronique pour la reconstitution des protéines membranaires pour la RMN à l'état solide. Nous avons suivi en détail la reconstitution du transporteur ABC BmrA par dialyse comme référence, et établi des conditions optimales de reconstitution en utilisant un gradient combiné de saccharose / cyclodextrine / lipide caractérisant GRecon. Les spectres RMN de l‘échantillon reconstitué par GRecon sont très similaire à ceux obtenus précédemment sur des échantillons reconstitués par dialyse. La préparation d'échantillons par GRecon présente un gain de temps de près d'un ordre de grandeur. Afin d'étudier les états ouvert vers l'intérieur (inward-facing IF) et ouvert vers l'extérieur (outward-facing OF) du transporteur, nous avons développé un protocole reproductible et quantitatif induisant l'état OF. Nous avons enregistré des spectres bidimensionnels RMN à l'état solide avec différents temps de mélange (20 et 200 ms) afin de suivre les changements des déplacements chimiques et d'identifier les résidus par des corrélations séquentielles. L'apparition très apparente de nouveaux signaux concomitants à la grande amplitude des perturbations de déplacement chimique (CSP) met en évidence l'importante flexibilité et les changements conformationnels de la protéine en présence d'ATP: Mg2+. Afin d'identifier les résidus apparaissant dans les spectres, nous avons utilisé le remplacement paramagnétique du co-facteur Mg2+ par du Mn2+. Cette méthode a révélé que les acides aminés apparaissant dans les spectres sont situés à proximité du site de liaison de l'ATP. En outre, les mesures EPR ont confirmé l'état fermé de la protéine en identifiant la distance correspondant à 1,8 nm entre deux atomes de Mn2+. Nous avons étudié les différences conformationnelles entre l'état IF et OF de BmrA. L'observation de nombreux CSP, ainsi que l'apparition de nouveaux signaux sont observés pour un mutant ne pouvant pas hydrolyser l'ATP, indiquant que l'hydrolyse n'est pas nécessaire pour la transition IF à OF dans BmrA. Nous avons également analysé le mécanisme lié au motif X-loop décrit comme étant impliqué dans la communication entre deux domaines de la protéine. Nous avons observé pour une protéine mutante dans laquelle le transport est aboli mais qui reste ATPase active, une transition incomplète puisque seul un sous-ensemble de CSPs est observé, ainsi qu'un manque de rigidification. Ces mesures suggèrent que la flexibilité semble être le point central dans la transmission des changements conformationnels nécessaires de la partie motrice à la partie d'exportation de molécules. Ces observations montrent que ce système serait semblable à un moteur tournant à plein régime qui ne serait pas connecté de manière rigide à un arbre de transmission le reliant au système de transportATP binding cassette (ABC) transporters can translocate a variety of molecules by coupling drug/lipid efflux with an ATP-Mg2+ fuelled engine. They are found in all forms of life and they are involved in a number of drug resistances including anti-cancer drugs and antibiotics. My studies focus on the drug exporter BmrA (130 kDa) from Bacillus subtilis as a model system and homologue of the human P-glycoprotein that is involved in multidrug resistance in cancer. We show that the reconstitution of this protein in lipids from Bacillus subtilis at a lipid-protein ratio of 0.5 m/m allows an optimal protein insertion into lipid bilayer as well as it complies with the two central NMR requirements: high signal-to-noise in the spectra and sample stability over a time period of years. The obtained spectra point to a well-folded protein and a highly homogenous preparation, as witnessed by the narrow resonance lines and the signal dispersion typical of the expected secondary structure distribution of the membrane protein. In the same time, we adapted the GRecon method used in electron microscopy studies for membrane protein reconstitution to the needs of solid-state NMR sample preparation. We followed in detail the reconstitution of the ABC transporter BmrA by dialysis as a reference, and established optimal reconstitution conditions using the combined sucrose/cyclodextrin/lipid gradient characterizing GRecon. NMR spectra recorded on a sample produced by GRecon showed a highly similar fingerprint as those recorded previously on samples reconstituted by dialysis. GRecon sample preparation presents a gain in time of nearly an order of magnitude for reconstitution. In order to study the inward-facing (IF) and the outward-facing (OF) state of the transporter, we developed a reproducible and quantitative protocol of ATP:Mg2+:VO43- addition inducing the OF state. We used selectively labelled samples obtained by the addition of natural abundance residues in the bacterial medium in order to reduce the number of signals in the spectra of this large protein. We recorded solid-state NMR two-dimensional spectra with different mixing times (20 and 200 ms) in order to follow chemical shift changes and identify residues by sequential correlations. The very noticeable apparition of new signals concomitant with the large amplitude of chemical shift perturbations (CSPs) highlight the important flexibility and conformational changes of the protein in presence of ATP:Mg2+:VO43- substrate. In order to identify the residues appearing in the spectra, we use paramagnetic replacement by Mn2+ of the Mg2+ acting as a co-factor in the active site. The paramagnetic relaxation enhancements caused the Mn2+ revealed that the amino acids appearing in the spectra are located in proximity to the ATP binding pocket. Besides, EPR measurements confirmed the closed state of the protein by identifying the corresponding 1.8 nm distances between two Mn2+. We investigate on the conformational differences identified between the IF and OF state in the ABC transporter BmrA reconstituted in its natural lipids. The observation of numerous CSPs, as well as the apparition new signals are observed for a hydrolysis-incompetent mutant on addition of ATP, indicating that hydrolysis is not required for the IF to OF transition in BmrA. We also analyze the mechanistic of the X-loop motif described to be involved in the communication between two domains of the protein. We observe for a mutant protein in which transport is abolished, but which remains ATPase active, an incomplete transition since only a subset of CSPs is observed, as well as lack of rigidification. This suggests that the change in dynamics might be central for transmitting the relevant conformational changes to the part of the protein driving transport, concomitant of an engine which is turning an input shaft, but which fails to connect in a rigid manner, trough adequate gears, with the output shaft driving the pump
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Macalou, Sira. "Le transporteur ABCG2 de multiples drogues : rôle d’une séquence spécifique et recherche d’inhibiteurs sélectifs." Thesis, Lyon 1, 2009. http://www.theses.fr/2009LYO10301.
Full textAbstract:
Au cours de chimiothérapies, les cellules cancéreuses parviennent fréquemment à échapper aux effets toxiques des médicaments en développant des mécanismes de chimiorésistance qui résultent souvent de la présence d’un système d’efflux de ces médicaments. Cette chimiorésistance est corrélée à un phénomène appelé « phénotype MDR » pour (MultiDrug Resistance) et associé à la surexpression d’ATPases membranaires appartenant aux transporteurs ABC (ATP Binding Cassette). Le transporteur ABCG2 fait partie de cette grande famille de protéines. Un alignement de séquence a permis l’identification chez ABCG2 une séquence spécifique (LSGGE) très semblable à la séquence signature (VSGGE) de tous les transporteurs ABC. La mutation ponctuelle des résidus de cette séquence en alanine a produit une perte importante de fonction des mutants L352A et S353A, observée au niveau du transport et de l’activité ATPasique. Des relations structure-activité établies à partir de différents composés de la famille des flavonoïdes ont permis d’identifier MBLI 97, boéravinone G, MHT et ABI comme des composés puissants et spécifiques, capables d’abolir la résistance à de multiples drogues et chimiosensibiliser la croissance cellulaire. Le ciblage de séquences spécifiques et l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de ces transporteurs constituent des stratégies destinées à contrer la chimiorésistance et augmenter l’efficacité des traitements chimiothérapeutiquesDuring chemotherapy, cancer cells frequently succeed to escape the toxic effects of drugs by developing mechanisms of chemoresistance which often result from the presence of an efflux system of these drugs. Such a chemoresistance is correlated to the MDR (MultiDrug Resistance) phenotype and associated to overexpression of membrane ATPases belonging to the ABC (ATP-Binding Cassette) transporters. The ABCG2 transporter belongs to this large family of proteins. Sequence alignment allowed the identification of a specific (LSGGE) sequence in ABCG2, which is quite similar to the canonical sequence signature (VSGGE) of all ABC transporters. Point mutation of these residues into alanine produced a loss of function in L352A and S353A mutants, as observed in transport and on ATPase activity. Structure-activity relationships drawn from some compounds among the family of flavonoids allowed the identification of MBLI 97, boeravinone G, MHT and ABI as potent and ABCG2-specific inhibitors, able to revert multidrug resistance and chemosensitize cell growth. The study of specific sequences and use of specific inhibitors of these transporters constitute strategies to abolish cancer cell chemoresistance and to increase the efficiency of chemotherapeutic treatments
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Rossi, Maria-Silvia. "Etude des mécanismes d'acquisition du fer dépendant de la protéine extracellulaire HasA chez les bactéries à gram négatif Serratia marcescens et Yersinia pestis." Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077224.
Full text
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Ziri, Taissir. "Identification et caractérisation des orthologues du transporteur ABC humain ABBCC10 chez Catharanthus roseus et Arabidopsis thaliana." Thesis, Tours, 2014. http://www.theses.fr/2014TOUR4007/document.
Full textAbstract:
Les transporteurs ABC sont les membres d'une superfamille de protéines qui utilisent l'hydrolyse de l'ATP pour déplacer une large gamme de substrats au travers des membranes biologiques. Les membres de la sous famille ABCC sont généralement caractérisés par un domaine transmembranaire supplémentaire en région N-terminal (TMD0). Dans cette étude, nous avons analysé deux gènes ABCC de plantes : CrABCC1 de Catharanthus roseus et AtABCC13 son orthologue chez Arabidopsis thaliana. L'analyse phylogénétique répartit les ABCC de plantes dans 3 clades distinctes. Les clades I et II sont spécifiques aux plantes tandis que le clade III est le seul associant des ABCC humains et de plantes. Le criblage de la base de données a permis d'identifier 16 séquences ABCC chez Catharanthus roseus parmi lesquelles 2 appartiennent à CrABCCABC transporters are members of a large superfamily of proteins that utilize ATP hydrolysis to translocate a wide range of substrate across biological membranes. Members of C. subfamily (ABCC) are generally structurally characterized by an additional (N-Terminal) transmembrane domain (TMD0). In this study the analysed two plant ABCC : CrABCC1 from Catharanthus roseus and AtABCC13, it's ortholog in Arabidopsis thaliana. Phylogenetic analysis of plant ABCCs separates their protein sequences over three distinct clusters : I and II are plant specific whereas cluster III is the only gathering humain and plant ABCCs. Screening of plant database allowed us to identify 16 different ABCCs sequences in Catharanthus roseus
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Gautherot, Julien. "Maturation et trafic intracellulaire du transporteur biliaire ABCB4 : effet de mutations." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00829392.
Full textAbstract:
ABCB4 est un transporteur ABC spécialisé dans la sécrétion de phosphatidylcholine au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. Des variations du gène ABCB4 sont responsables de la cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3), une maladie rare, létale, qui progresse en cirrhose et insuffisance hépatique avant l'âge adulte. Nous avons étudié l'effet de la mutation I541F décrite chez un patient. Contrairement à la forme sauvage d'ABCB4 localisée à la membrane des canalicules biliaires dans les cellules HepG2 et à la surface apicale dans les cellules MDCK transfectées, le mutant I541F n'est pas replié correctement et s'accumule dans le réticulum endoplasmique (RE). Après transfert à 27°C, le mutant est exprimé à la surface apicale sous forme mature et active. La modulation des chaperonnes cellulaires calnexine et Hsc/Hsp70 ne restaure pas le trafic intracellulaire du mutant. La cyclosporine A augmente la maturation et l'expression à la membrane plasmique d'ABCB4-I541F, ce qui ouvre des perspectives de développer de nouvelles thérapies pour le traitement de la PFIC3. La seconde partie du travail a eu pour objectif de déterminer le rôle du domaine cytoplasmique N-terminal d'ABCB4, qui n'a pas d'homologie avec d'autres transporteurs ABC. Des délétions progressives de ce domaine ont permis d'identifier une séquence de 11 acides aminés nécessaire à la sortie du RE. Des mutations ponctuelles (T34M et R47G) identifiées chez des patients n'affectent pas la maturation ni le trafic, mais diminuent fortement l'activité d'ABCB4. Ces résultats montrent que le domaine N-terminal est nécessaire à la fois pour le trafic et l'activité d'ABCB4
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MAHE, BRUNO. "Etude d'une voie d'assimilation du fer dependante d'un transporteur de type abc chez erwinia chrysanthemi 3937." Paris 6, 1995. http://www.theses.fr/1995PA066661.
Full textAbstract:
La carence en fer provoque, chez la souche 3937 d'erwinia chrysanthemi, la production de deux siderophores, la chrysobactine et l'achromobactine, ainsi que la mise en place des voies de transport de leurs complexes ferriques respectifs. Les mutations cbr qui perturbent la regulation de ces systemes ont ete etudiees. L'analyse de la sequence du locus incrimine a montre qu'il s'agit d'un operon de transport codant un recepteur periplasmique (cbra), deux proteines transmembranaires (cbrb et cbrc), et une atpase (cbrd). L'analyse de ces differentes composantes a permis de mettre en evidence un transporteur de complexe ferrique de type abc. Son implication dans le transport de la ferriachromobactine a ete demontree. En utilisant des fusions transcriptionnelles lacz, une regulation differentielle par le fer a ete mise en evidence. Par mutagenese insertionnelle, un locus implique dans la biosynthese de l'achromobactine a ete identifie en amont des genes cbr. L'analyse d'une sequence de 2 kb a permis d'identifier un gene codant une proteine de 72 kda, qui presente de l'identite avec les aerobactines synthetases iuca et iucc d'e. Coli
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Dalmas, Olivier Grégory. "Caractérisation des changements de conformation de BmrA, un transporteur ABC de multiples drogues chez Bacillus subtilis : exploitation des modèles structuraux." Lyon 1, 2005. http://www.theses.fr/2005LYO10056.
Full textAbstract:
Nous avons récemment caractérisé un nouveau membre de la superfamille des transporteurs ABC, BmrA, issu de Bacillus subtilis, qui est capable de transporter activement différentes drogues en utilisant l'énergie produite par l'hydrolyse de l'ATP. Nous avons entrepris une étude structurale par transfert d'énergie de résonance sur le transporteur reconstitué en protéoliposomes et ainsi pu démontrer que, dans la membrane, BmrA se trouve sous forme homo-dimérique, et adopte majoritairement une conformation fermée, compatible avec les structures où l'ATP se fixe à l'interface des deux domaines de fixation des nucléotides. Grâce à des modèles moléculaires de BmrA, et par une approche de pontage covalent de cystéines néo-introduites, nous avons montré que la première boucle intracellulaire est une zone charnière qui joue vraisemblablement un rôle essentiel dans la transduction de l'énergie qui se propage du site de fixation de l'ATP vers les zones membranaires de fixation des drogues
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Berthier, Joseph. "Transport membranaire des médicaments utilisés en transplantation : étude du transporteur MRP4." Thesis, Limoges, 2020. http://www.theses.fr/2020LIMO0034.
Full textAbstract:
Les transporteurs membranaires sont des déterminants majeurs de la pharmacocinétique des médicaments, au même titre que les enzymes du métabolisme. Parmi eux, rares sont ceux dont les rôles dans l’organisme sont parfaitement définis. Pourtant, de multiples observations cliniques suggèrent que des transporteurs membranaires soient impliqués dans la survenue d’interactions médicamenteuses, et plus largement dans la survenue d’échecs aux traitements par inefficacité ou toxicité.Dans ce contexte, nos travaux avaient pour objectif d’étudier le rôle des transporteurs membranaires dans la pharmacocinétique des immunosuppresseurs prescrits chez le patient transplanté. Il s’agit de médicaments à marge thérapeutique étroite, avec une cinétique très complexe, sujets à de très nombreuses interactions médicamenteuses, et pour lesquels il est connu que la P-gp, les transporteurs de la famille des OATP, ou encore le transporteur BCRP, jouent un rôle très important dans leur pharmacologie.Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux relations entre le transporteur MRP4 et l’acide mycophénolique (MPA). Ces travaux ont fait appel au développement de modèles de transport vésiculaire (approche in vitro) et à de la modélisation moléculaire (approche in silico). Ils ont montré que l’acide mycophénolique β-D glucuronide (MPAG), métabolite majeur du MPA, est transporté par MRP4. Ce phénomène participe très certainement à la variabilité de l’exposition au MPA. Nous avons également mis en évidence que des médicaments fréquemment co-prescrits (anti-infectieux et anti-inflammatoires) peuvent inhiber ce transport. Cet exemple montre tout l’intérêt d’une exploration des mécanismes de transport par des études in vitro et in silico pour mieux comprendre et anticiper des interactions médicamenteusesMembrane transporters are major determinants of the pharmacokinetics of drugs, in the same way as the enzymes of the metabolism. Among them, only a few have roles in the organism which are perfectly defined. However, numerous clinical observations suggest that membrane transporters are involved in the occurrence of drug-drug interactions, and more generally in the occurrence of treatment failures due to inefficiency or toxicity.The aim of our work was to study the role of membrane transporters in the pharmacokinetics of immunosuppressants prescribed in transplanted patients. These are drugs with a narrow therapeutic index and very complex kinetic profiles. They are subject to numerous drug-drug interactions and it is known that the P-gp, the OATP family of transporters, or the BCRP transporter play an important role in their pharmacology.We were particularly interested in the relationship between the MRP4 transporter and mycophenolic acid (MPA). For this, we developed vesicular transport models (in vitro approach) and molecular modelling (in silico approach). They showed that mycophenolic acid β-D glucuronide (MPAG), a major metabolite of MPA, is transported by MRP4. Obviously, this phenomenon contributes to the inter- and intra-individual variability in the exposure to MPA. This work also demonstrated that some frequently co-prescribed drugs (anti-infectious and anti-inflammatory drugs) can inhibit this transport.This example illustrates the value of exploring transport mechanisms through in vitro and in silico studies to better understand and anticipate drug-drug interactions
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Larrède, Sandra. "Caractérisation des rôles du transporteur ATP-Binding cassette G1 (ABCG1) au sein du macrophage humain." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00812087.
Full textAbstract:
Le macrophage joue un rôle clé dans l'athérogenèse, intervenant notamment, dans la captation de cholestérol à l'origine de la formation des stries lipidiques. Sa capacité à éliminer le cholestérol en excès est donc critique pour l'évolution de la pathologie. Il intervient aussi dans la captation des cellules apoptotiques présentes au sein de la lésion, processus déterminant en termes d'inflammation et de stabilité de la plaque. Mes travaux ont consisté à évaluer le rôle du transporteur ATP-Binding-Cassette G1 (ABCG1), dans ces mécanismes clés de l'athérogenèse. Ainsi, nous avons donc montré qu'ABCG1 est à la fois impliqué dans les processus d'efflux au sein des cellules spumeuses chargées en cholestérol libre mais aussi qu'il participe au mécanisme de phagocytose des corps apoptotiques. Ainsi, grâce à ces travaux ABCG1 pourrait être envisagé comme une nouvelle cible thérapeutique de l'athérosclérose.
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Boukherissa, Amira. "Study ot the coevolution between antimicrobial peptides and peptide transporters in legume-rhizobium symbiosis." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASB043.
Full textAbstract:
Les légumineuses présentant une carence en azote peuvent entrer en interaction symbiotique avec des bactéries du sol fixatrices de N₂ appelées rhizobia. Dans cinq clades de légumineuses, une stratégie d’exploitation appelée différenciation terminale des bactéroïdes (TBD) a évolué dans laquelle les rhizobiums subissent une différenciation extrême. Les bactéries terminalement différenciées sont plus grandes, polyploïdes, ont une membrane perméabilisée, et sont meilleures à la fixation de N₂, fournissant un retour sur investissement plus élevé pour la plante. Nous savons que dans deux clades, IRLC (par exemple, Medicago spp.) et Dalbergioïds (par exemple, Aeschynomene spp.), ce processus de différenciation est déclenché par un ensemble de peptides antimicrobiens végétaux apparemment non apparentés avec une activité antimicrobienne à la membrane connue sous le nom de peptides Nodule-spécifiques Cystéine-Riche (NCR). À son tour, les rhizobia exposés au stress provoqué par les NCRs nécessitent un transporteur de peptides ABC de la famille BacA pour faire face à ce stress. Cependant, si des peptides NCR ou des peptides similaires sont également trouvés dans d’autres clades où la TBD se produit et la relation évolutive entre ces peptides reste inconnue. Dans ce projet, nous avons testé l’hypothèse d’une coévolution convergente entre les différents clades de légumineuses et leur rhizobia engagés dans ce programme de différenciation, tant au niveau phénotypique que moléculaire. Pour ce faire, nous avons combiné des analyses d’évolution moléculaire avec des tests fonctionnels, fournissant ainsi des connaissances expérimentales sur la question fondamentale de la contingence et de répétabilité en évolution tout en générant simultanément de nouveaux outils pour concevoir une symbiose plus efficaceLegume plants under nitrogen deficiency can enter a symbiotic interaction with N₂-fixing soil bacteria called rhizobia. In five legume clades, an exploitive strategy called Terminal Bacteroid Differentiation (TBD) has evolved in which rhizobia undergo extreme differentiation. Terminally differentiated bacteria are larger, polyploid, have a permeabilized membrane, and are better at N₂ fixation, providing a higher return on investment for the plant. We know that in several members of the distantly related Inverted Repeat Lacking Clade (IRLC, e.g., Medicago spp.) and the Dalbergioid clade (e.g., Aeschynomene spp.), this differentiation process is triggered by a set of apparently unrelated plant antimicrobial peptides with membrane damaging activity known as Nodule-specific Cysteine-Rich (NCR) peptides. In turn, rhizobia exposed to NCR stress requires an ABC peptide transporter of the BacA family to cope with this stress. However, whether NCR peptides or similar peptides are also found in other clades where this occurs and the evolutionary relation among these peptides remains unknown. In this project, we tested whether NCR peptides and BacA peptide transporters evolved independently in the different legume clades that induce TBD and their rhizobia, implying convergent coevolution, both at phenotypic and molecular levels. We combined molecular evolution analyses with functional assays, thus providing experimentally informed knowledge on the fundamental question of the part of contingency and repeatability in evolution while simultaneously generating new tools to engineer a more efficient symbiosis
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Chartrain, Marine. "Implication des cellules exprimant le transporteur ABCB5 dans la chimiorésistance du mélanome métastatique." Toulouse 3, 2011. http://thesesups.ups-tlse.fr/1397/.
Full textAbstract:
Bien qu'au 8ème rang des cancers les plus fréquents, le mélanome est un problème médical majeur car son incidence double tous les dix ans chez les populations occidentales. Cette pathologie, au stade métastatique, est réfractaire à la chimiothérapie avec moins de 20% de réponses objectives sans amélioration du temps de survie pour le traitement de référence : la dacarbazine. Même si des thérapies ciblées prometteuses sont développées avec l'ipilimumab (inhibiteur de CTL-A4) ou le vemurafenib (inhibiteur de BRAF), la chimiorésistance reste au centre des préoccupations. Récemment, des sous-populations cellulaires présentant des caractéristiques particulières en termes d'agressivité tumorale ont été mises en évidence dans le mélanome. Parmi elles, les cellules exprimant ABCB5 ont été définies comme "Cellules Initiatrices de Mélanome" pour leur capacité à régénérer des tumeurs chez l'animal. ABCB5 appartient à la famille des transporteurs ABC (pour ATP-Binding Cassette) qui permettent l'efflux de nombreux composés de façon ATP-dépendante et qui sont largement impliqués dans la chimiorésistance des cancers. Dans ce contexte, j'ai étudié l'implication d'ABCB5 dans les phénomènes de chimiorésistance du mélanome métastatique. Dans un premier temps, j'ai analysé la résistance globale de plusieurs modèles in vitro de mélanome en relation avec plusieurs transporteurs ABC dont ABCB5. Ces modèles ne permettant pas une modélisation satisfaisante de la chimiorésistance, je me suis intéressée à la résistance de sous-populations cellulaires. J'ai ainsi confirmé que la protéine ABCB5 est exprimée sous forme d'une sous-population minoritaire au sein de plusieurs modèles in vitro de mélanome et j'ai mis en place une technique expérimentale permettant d'évaluer l'impact de substances anti-mélanome sur ces cellules. J'ai montré dans un modèle de xénogreffe WM-266-4 que le traitement par le temozolomide aboutit in vivo à l'enrichissement de la sous-population exprimant ABCB5 et ce, malgré une régression des tumeurs. Par la même approche transposée in vitro, j'ai montré que les cellules exprimant ABCB5 survivent à la dacarbazine, à des doses pharmacologiquement actives. Cette observation a également été étendue à d'autres composés cytotoxiques et notamment aux agents de thérapies ciblées actuellement testés pour le traitement du mélanome. Par ailleurs, mes résultats indiquent que les cellules de mélanome peuvent moduler l'expression de la protéine ABCB5 en réponse à un stress pharmacologique. Cette étude montre l'intérêt de la protéine ABCB5 en tant que marqueur d'une sous-population cellulaire caractérisée par une résistance accrue. Néanmoins, un rôle fonctionnel direct d'ABCB5 dans ce phénotype reste à démontrer. Cette question a été abordée par la mise en place de modèle de surexpression d'ABCB5 au sein de l'équipe ainsi que par des approches d'extinction par siRNA mais les premiers résultats indiquent qu'il est difficile d'étayer l'hypothèse d'un rôle actif pour ABCB5. Il est donc aujourd'hui primordial de statuer sur le rôle de cette protéine et de déterminer son importance dans le processus de chimiorésistance du mélanome. L'ensemble de ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour la recherche de cibles pharmacologiques innovantes dans le contexte du mélanome métastatiqueMelanoma is one of the most aggressive form of skin cancer and its incidence is increasing worldwide. Metastatic melanoma is highly resistant to conventional chemotherapies and dacarbazine, the reference treatment has a very low response rate (<20%) without impact on overall survival. A number of promising targeted therapies have been developed recently such as ipilimumab (an anti-CTL-A4 antibody) or vemurafenib (a specific inhibitor of BRAF) but resistance invariably develops and still remains an unsolved question. Recently, relevant markers have been identified to select a restricted sub-population of melanoma cells with particular stem cell-like properties. Among them, ABCB5 expressing cells have been defined as "Melanoma initiating cells" since they display an enhanced tumorigenicity in mice. As a member of the ABC (ATP-Binding Cassette) transporters family, ABCB5 is thought to participate to the melanoma chemoresistance through a function of efflux. Here, we have studied the participation of ABCB5 expressing cells to chemoresistance in metastatic melanoma. We first investigated in vitro models of melanoma for their ability to mimic global resistance, in relation with thier ABC transporters expression. We then focused our study on the resistance of minor sub-populations. We confirmed that ABCB5 is expressed at the surface of a sub-population and we developed an experimental procedure to monitor this sub-population upon chemoterapeutic treatment. Using the WM-266-4 melanoma xenograft model, we demonstrated in vivo that ABCB5-expressing cells are enriched after a temozolomide treatment despite a significant tumor regression. We then monitored in vitro the evolution of the ABCB5-expressing cell sub-population upon pharmacologically active doses of dacarbazine. This observation has been extended to various chemotherapeutic drugs including the new targeted therapy developed in melanoma. We also demonstrated that melanoma cells are able to modulate ABCB5 expression upon pharmacological treatment. Taken together, our findings show that ABCB5-expressing cells are more resistant to the anti-melanoma chemotherapeutic drugs than cells of the tumor bulk. Nevertheless, a functional property of ABCB5 protein remains unclear in this phenotype. The question was addressed by using cellular model which stably overexpressed ABCB5 and by performing siRNA extinction experiments. Our data failed to show any functional evidence that ABCB5 can confer a selective advantage to melanoma cell. This remains a determining question we need in order to answer to establish the importance of ABCB5 in melanoma chemoresistance. Our results may be of particular importance in determining the clinical outcome of chemotherapeutic treatments and reinforce the interest of ABCB5 and ABCB5-expressing cells as potential therapeutic targets in melanoma
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Do, Cao Minh Trang. "Études des interactions intra et intermoléculaires de BmrA : un transporteur ABC de multiples drogues chez Bacillus subtilis." Lyon 1, 2006. http://www.theses.fr/2006LYO10098.
Full textAbstract:
La protéine BmrA ("Bacillus multidrug resistance ATP") est un transporteur ABC ("ATP-Finding Cassette") identifié au sein de notre laboratoire. Nous avons étudié la conformation adoptée par la protéine entière en analysant la structure secondaire d'une région charnière par Résonance Paramagnétique Electronique, ce qui nous a permis de valider un modèle structural, où la protéine adopte préférentiellement une conformation compacte. Cette approche nous a permis de mettre en évidence une région impliquée dans le transport des drogues. Nous avons également étudié l'organisation quaternaire des domaines de fixation des nucléotides. Après introduction de cystéines par mutagénèse dirigée, nous avons voulu déterminer une interface préférentielle d'interaction en observant la formation de pontage intermoléculaire. Nos résultats suggèrent l'existence d'une grande flexibilité des domaines, qui faciliterait la fixation des nucléotides et favoriserait ainsi le mécanisme d'hydrolyse del'ATP
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Coumes, Stéphanie. "Les modules de "détection / résistance " aux antibiotiques peptidiques chez les firmicutes." Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22062/document.
Full textAbstract:
Les systèmes de transduction du signal et les transporteurs ABC contribuent de façon conjointe à la réponse adaptative des bactéries aux changements d’environnement. Trois modules, associant un phosphorelais et un transporteur ABC, ont été répertoriés chez B. subtilis et sont impliqués dans la réponse à différents antibiotiques: BceRSAB, PsdRSAB et YxdJKLM. Ils sont caractérisés par une histidine kinase possédant une boucle extracytoplasmique courte et appartenant à la famille des Intramembrane Sensing - Histidine Kinase (IM-HK) et par un transporteur ABC possédant une Membrane Spanning Domain (MSD) à boucle extracytoplasmique exceptionnellement longue. En utilisant une approche phylogénomique, il a été établi que ce type de modules était restreint aux Firmicutes, où ils sont apparus et se sont largement répandus. De plus, cette analyse met en lumière une histoire évolutive très dynamique impliquant de nombreux transferts horizontaux, duplications et pertes de gènes, conduisant à un répertoire de modules Bce-like très varié chez ce phylum. Grâce à une analyse phylogénétique fine, il a été proposé une classification de ces modules en six sous-familles bien définies.Des études fonctionnelles ont été réalisées sur des membres de la sous-famille IV comprenant le module de résistance à la bacitracine BceRSAB de B. subtilis, dont l’expression des gènes codant pour le transporteur requiert, en présence de l’antibiotique, le système de transduction du signal aussi bien que le transporteur lui-même. Les résultats de ces études montrent que d’autres membres de la sous-famille IV, YtsCD de B. licheniformis et BceAB de B. halodurans, sont également impliqués dans la résistance à la bacitracine. Ils suggèrent aussi que dans ces modules le transporteur ABC est le premier senseur de la présence de l’antibiotique et qu'il active le système de transduction une interaction entre une sous unité du transporteur et la kinase du module. De plus, en présence de bacitracine, l’expression des gènes codant pour le transporteur BceAB ainsi que la résistance à cet antibiotique requièrent la présence de la boucle de la MSD BceB ce qui démontre l'importance de cette boucle aussi bien au niveau fonctionnel que structural.Par ailleurs, l’étude que nous avons réalisée suggère que le mécanisme original de régulation des gènes du transporteur BceAB de B. subtilis pourrait être généralisé à tous les modules équivalents présents chez les Firmicutes. Ces modules constitueraient ainsi un mécanisme important de résistance aux antibiotiques peptidiques chez les bactéries de ce phylum qui comprend de nombreux pathogènesSignal transduction systems and ABC transporters often contribute jointly to adaptive bacterial responses to environmental changes. In Bacillus subtilis, three such pairs, thereafter called modules, are involved in responses to antibiotics: BceRSAB, PsdRSAB and YxdJKLM. They are characterized by a histidine kinase belonging to the Intramembrane Sensing – Histine Kinase family (IM-HK) and by a Membrane Spanning Domain (MSD) possessing an unusually large extracytoplasmic loop. Using a phylogenomic approach we were able to demonstrate that such modules, associating a phosphorelay and an ABC transporter, are specific but widespread in Firmicutes where they originated. This analyse highlight a highly dynamic evolutionary history involving numerous horizontal gene transfers, duplications and lost events, leading to a great variety of Bce-like module repertories in members of this bacterial phylum. Based on fine phylogenetic analyses, the Bce-like modules were divided into six well-defined subfamilies. Functional studies were performed on some members of subfamily IV comprising the bacitracin resistance module BceRSAB of B. subtilis, the expression of which being found to require, in the presence of bacitracin, the signal transduction system as well as the ABC transporter itself. The present results indicate that two other members of subfamily IV, YtsCD of B. licheniformis and BceAB of B. halodurans, were also found to participate in bacitracin resistance processes. The results also suggest that in these modules the ABC transporter works as the first sensor of the antibiotic and that it then activates the signal transduction system through an interaction between one of the two ABC transporter domains and the module kinase.Bacitracin dependent expression of bceAB and bacitracin resistance processes were shown to require the presence of the BceB translocator loop suggesting a crucial role for this loop as well at a functional level, as at a structural level.This study suggests that the original BceRSAB module regulatory mechanism might be generalised to other modules and would constitute an important common antibiotic resistance mechanism in Firmicutes which comprise many human pathogens
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Steinfels, Emmanuelle. "Caractérisation d'YvcC, transporteur ABC de Bacillus subtilis impliqué dans le transport de multiples drogues et notamment des antibiotiques." Lyon 1, 2001. http://www.theses.fr/2001LYO10164.
Full textAbstract:
L'analyse du génome de Bacillus subtilis a montré que le gène yvcc code un transporteur ABC ("ATP Binding Cassette") fortement homologue aux deux moitiés de la glycoprotéine-P (P-gp) humaine et à LmrA, premier transporteur ABC bactérien responsable d'un phénotype de résistance à de multiples drogues. Une souche yvcc a été construite et le transport du bromure d'éthidium dans cette souche, mesuré en présence ou non d'inhibiteur et analysé comparativement à la souche sauvage, suggère que le transporteur YvcC est majoritairement responsable de l'efflux de bromure d'éthidium dans la souche sauvage. Par ailleurs, YvcC a été surexprimé dans la souche C41 (DE3) d'E. Coli et constitue près de 50 % des protéines membranaires. Des vésicules inversés (IMV) de ces membranes ont permis de visualiser le transport de plusieurs drogues fluorescentes : le Hoeschst 3342, la doxorubicine, la BODIPY-vinblastine et également un analogue d'actinomycine D. Ce transport est empêché par l'addition de réserpine ou d'autres drogues telles que la vinblastine, le vérapamil et des représentants de différentes familles d'antibiotiques. Après solubilisation de YvcC par le dodécylmaltoside, une seule étape de purification a permis d'obtenir la protéine purifiée en grande quantité et l'interaction de YvcC avec les effecteurs de la P-gp a été suivie par modification de fluorescence. La reconstitution de YvcC dans les liposomes permet d'obtenir une activité ATPase du transporteur d'environ 6 micromol/min/mg de protéine à 37 ° C, activité notamment stimulable par certaines drogues et inhibée par l'orthovanadate. L'ensemble des résultats suggère donc que YvcC est un transporteur de multiples drogues chez Bacillus subtilis y compris certains antibiotiques.
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Gally, Fabienne. "Etude structure/fonction d'une proteine ABC : SUR, le récepteur des sulfonylurées." Phd thesis, Grenoble 1, 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011848.
Full textAbstract:
Le canal KATP résulte de l'assemblage d'un canal potassique inhibé par l'ATP intracellulaire (Kir6.2) et d'un transporteurABC, le récepteur des sulfonylurées (SUR) de la famille MRP/ABCC. SUR a un rôle régulateur essentiel : il confère au
canal une sensibilité accrue à l'inhibition par l'ATP, provoque son activation lorsque l'ADP augmente, et est la cible des
activateurs et bloqueurs pharmacologiques du canal.
Nous nous sommes intéressés à divers aspects structure/fonction de SUR en tant que modèle de transporteur ABC
eucaryote. Son couplage naturel à un canal ionique en facilite grandement l'étude grâce à la technique
électrophysiologique du patch-clamp.
La poursuite des travaux pour déterminer la nature moléculaire de la sélectivité des isoformes de SUR aux ouvreurs
pharmacologiques nous a permis de conclure que seul le faible encombrement de la Thr1253 de SUR2A, contre la Met
1290 de SUR1, serait le critère important pour l'activation pharmacologique des canaux KATP.
Nos travaux ont ensuite porté sur un domaine de la sous-unité SUR riche en acides aminés chargés négativement
(succession de 15 résidus glutamates ou aspartates) qui s'est avéré ne pas être impliquée dans la fonction du canal dans
notre système d'expression.
Nous avons étudié l'effet des ions Zn2+ et Cd2+ intracellulaires sur les canaux KATP et montré que ces ions peuvent activer
les canaux via leur liaison à SUR. Ce site de liaison reste encore à déterminer.
Nous avons enfin essayé de comprendre le rôle de chacun des domaines de liaison des nucléotides et nous avons pour cela
conçu des protéines SUR2A possédant des NBD identiques (NBD1-NBD1 et NBD2-NBD2) ou inversés (NBD2-NBD1).
Nos résultats suggèrent que (1) les NBD sont interchangeables (2) l'activation pas le Mg-ADP requiert les deux NBD (3)
l'action des ouvreurs est indépendante du NBD2.
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Pouliot, Benoît. "Abc3, un transporteur vacuolaire exprimé en carence de fer chez la levure à fission." Mémoire, Université de Sherbrooke, 2010. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4028.
Full textAbstract:
De nombreux processus métaboliques nécessitent la présence de fer en tant que cofacteur. Paradoxalement, la surabondance en fer peut contribuer à la formation de dérivés oxygénés hautement réactifs qui sont toxiques pour la cellule. Ceci fait en sorte que sa concentration intracellulaire doit être finement régulée. Chez la levure à fission, Schizosaccharomyces pombe, plusieurs mécanismes participent à l'établissement de l'homéostasie du fer. Parmi ces mécanismes, on y retrouve des protéines de transport du fer à la surface cellulaire, ainsi que d'autres responsables de la séquestration de l'ion à l'intérieur de la vacuole. Un rôle pour la vacuole consiste à emmagasiner le fer afin de détoxifier la cellule s'il est trop abondant. Du même coup, la vacuole sert de réservoir qui pourra redonner le fer plus tard à la cellule si cette dernière croît en condition de rareté pour cet élément. La voie par laquelle le fer peut ressortir de la vacuole n'a cependant pas encore été identifiée. L'objectif de cette étude est d'identifier le transporteur responsable du relâchement du fer de la vacuole vers le compartiment cytosolique. Nos recherches ont permis d'identifier un candidat, un transporteur transmembranaire de type ABC (ATP binding cassette) nommé Abc3, dont l'expression augmente de 16.9 fois en carence de fer selon des études comparatives par biopuces à ADN. Tout d'abord, l'étude de la régulation du gène abc3[indice supérieur +] a été effectuée selon la présence ou non de fer dans le milieu de culture. L'expression du gène abc3[indice supérieur +] a été comparée avec d'autres gènes codant pour d'autres protéines de la même famille. Seul le gène abc3[indice supérieur +] a montré une expression variant selon le statut en fer. Il est réprimé en présence de fer et activé en carence de ce dernier. Par la suite, des éléments en cis du promoteur abc3[indice supérieur +] pouvant être responsables de la régulation selon le statut en fer ont été analysés. Parmi ces derniers, nous avons démontré que seul l'élément de régulation le plus près du cadre de lecture est fonctionnel permettant la répression du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer. Un essai fonctionnel permettant de montrer l'importance de la protéine Abc3 a été mis au point. Ainsi, une souche nulle pour le gène abc3[indice supérieur +] montre une perte de croissance en présence de cérulénine, un antibiotique qui inhibe la biosynthèse des acides gras. La souche abc3[delta] mutante est également sensible à la présence du chélateur de fer, le 2,2-dipyridyl (Dip), lorsque le système de transport de surface constitué de Fio1 et de Fip1 est inactivé. Une protéine Abc3 portant une étiquette fluorescente exprimée sous le contrôle du promoteur endogène abc3[indice supérieur +] a permis de localiser la protéine Abc3-GFP au niveau des vacuoles en carence de fer. Des analyses de profils transcriptionnels ont indiqué que l'expression forcée du gène abc3[indice supérieur +] en présence de fer active le répresseur Fep1. La surexpression du transporteur Abc3 libérerait plus de fer de la vacuole ce qui aurait pour effet d'activer Fep1, résultant en la répression de la transcription des gènes impliqués dans l'acquisition du fer à la surface cellulaire. Les résultats obtenus sur Abc3 suggèrent fortement que cette protéine pourrait être impliquée dans l'exportation du fer de la vacuole vers le cytoplasme de la levure lorsque cette dernière croît en carence de fer.
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Ravaud, Stéphanie. "Études fonctionnelles et structurales d'un transporteur membranaire de multiples drogues et de deux saccharose isomérases bactériennes." Lyon 1, 2005. http://www.theses.fr/2005LYO10235.
Full textAbstract:
La protéine membranaire BmrA de Bacillus subtilis est un transporteur ABC (ATP-binding cassette) impliqué dans les phénomènes de résistance à de multiples drogues. Son protocole de purification a été optimisé afin de l'adapter aux exigences d'une étude cristallographique et une caractérisation détaillée du complexe protéine-détergent-lipides purifié a été réalisée par diverses méthodes biophysiques. Parallèlement, des essais de cristallisation ont été menés sur la protéine sauvage et sur un mutant inactif. Les saccharose isomérases MutB de P. Mesoacidophila MX-45 et SmuA de P. Rubrum catalysent l'isomérisation du saccharose en isomaltulose et tréhalulose, deux édulcorants au fort potentiel nutritionnel et industriel. Les deux enzymes ont été cristallisées et de nombreuses structures de MutB native et de mutants, en complexe avec divers inhibiteurs ou avec le substrat naturel, ont été résolues nous permettant d'analyser les mécanismes et spécificités des réactions catalysées
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Lingeswaran, Abarna. "Rôle clé du transporteur PptAB dans le quorum sensing chez Streptococcus thermophilus." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASB013.
Full textAbstract:
Chez Streptococcus thermophilus, le cycle de vie des signaux peptidiques appelés phéromones contribuant aux mécanismes de communication dit quorum sensing (QS) est divisé en quatre étapes. La synthèse des phéromones est suivie par leur maturation par la protéase Eep et leur sécrétion. Enfin, leur re-internalisation par le transporteur d’oligopeptides Ami est indispensable pour leur détection intracellulaire par les régulateurs transcriptionnels dit Rgg-like contrôlant l’expression des gènes cibles. L’objectif de ma thèse était de valider le rôle du transporteur PptAB dans la sécrétion des phéromones avant d’identifier les gènes dont l’expression est dépendante de ce transporteur chez S. thermophilus.En premier, nous avons confirmé le rôle du transporteur PptAB dans l’activation de trois systèmes de QS impliquant les régulateurs Rgg-like. Pour cela nous avons utilisé des fusions transcriptionnelles entre un gène rapporteur codant la luciférase et le promoteur de trois gènes cibles de ces sytèmes. Nous avons ensuite montré que le transporteur PptAB n’exporte probablement que la forme mature des phéromones par LC-MS/MS. Enfin, nous avons découvert que l’expression d’un ensemble des gènes situé en aval des gènes codant les régulateurs Rgg-like est dépendante du transporteur PptAB mais aussi du transporteur Ami et de la protéase Eep par une approche globale transcriptomique. Ainsi, les transporteurs PptAB et Ami et la protéase Eep contrôlent ces cibles par un même mécanisme.Notre travail a mis en évidence des interférences entre ces systèmes qui devront être élucidéesIn Streptococcus thermophilus, the life cycle of signaling peptides called pheromones contributing to communication mechanisms named quorum sensing (QS) is divided into four steps. The synthesis of pheromones is followed by their maturation by the protease Eep and their secretion. At last, their re-internalisation by the oligopeptide transporter Ami is essential for their intracellular detection by transcriptional regulators called Rgg-like controlling the expression of target genes. The aim of my thesis was to valid the role of the transporter PptAB in the secretion of pheromones before identifying genes whose expression is dependent of this transporter in S. thermophilus.First, we confirmed the role of the transporter PptAB in the activation of three QS systems involving Rgg-like regulators. For that we used transcriptional fusions between a reporter gene coding the luciferase and the promoter of three target genes of these systems. We then showed that the transporter PptAB exports more likely only the mature form of pheromones by LC-MS/MS. Finally, we discovered that the expression of a set of genes located downstream of genes coding Rgg-like regulators is dependant of the transporter PptAB and also of the transporter Ami and the protease Eep by a global transcriptomic approach. Thereby, the transporters PptAB and Ami and the protease Eep regulate these targets by a same mechanism.Our work brought light on cross-talks between these systems which need to be deciphered
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Kilburg, Arnaud. "Cristallisation du transporteur ABC BmrA de Bacillus subtilis : développement d’une nouvelle méthode de dosage des détergents par Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)." Thesis, Lyon 1, 2015. http://www.theses.fr/2015LYO10116/document.
Full textAbstract:
Notre projet vise à déterminer la structure 3D du transporteur BmrA de Bacillus subtilis. La protéine a été purifiée dans six détergents différents. L'utilisation de foscholine 12, a conduit à cristalliser OmpF, une porine de la membrane externe d'E. coli. Nous montrons que les conditions de cristallisation influencent directement l'empilement cristallin d'OmpF. Le protocole de purification de BmrA, optimisé en utilisant du triton X100 à l'extraction puis un mélange β-D-dodecyl maltoside-cholate pour les étapes chromatographiques nous a permis d'obtenir à 4°C des cristaux, pour lesquels nous avons vérifié qu'ils sont constitués de BmrA. Ces cristaux ont permis d'obtenir un jeu complet jusqu'à 7 Å. Ces données de diffraction constituent une avancée significative pour résoudre à court terme la structure 3D de BmrA. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage des détergents qui est basée sur la détermination par spectrométrie de masse de type MALDI du ratio d'isotopes deutérés/ protonés. La méthode a été validée avec la FC12, le DDM, le β-OG, le LMNG, le CHAPS, le cholate et des détergents calix[4]aréniques, en mesurant la concentration de ces détergents dans différentes conditions d'extraction/purification, de concentration, dialyse et gel filtration, de différentes protéines membranaires. Cette méthode nous a permis (i) d'estimer la taille de la ceinture de détergent associée à BmrA et d'autres protéines membranaires (ii) de moduler cette taille en fonction de mélange de détergents et (iii) d'apporter des informations sur le comportement des complexes protéine-détergentOur project aims to determine the 3D structure of BmrA from Bacillus subtilis. The protein was purified in six different detergents. Using foscholine 12, led to crystallize OmpF, an outer membrane porin of E. coli. We show that the crystallization conditions directly influence the crystal packing of OmpF. The BmrA purification protocol optimized by using Triton X100 at the extraction and a mixture β-D-dodecyl-maltoside cholate for chromatographic steps allowed us to get to 4°C crystals, for which we verified they consist of BmrA. These crystals have yielded full data to 7 Å. These diffraction data are a significant advance in the short term to resolve the 3D structure of BmrA. We have developed a new detergents dosage assay which is based on the determination by MALDI-type mass ratio of deuterated isotopes / protonated. The method was validated with the FC12, the DDM, the β-OG, the LMNG, CHAPS, cholate detergents and calix [4] aréniques by measuring the concentration of these detergents in different conditions of extraction/ purification, concentration, dialysis and gel filtration, of different membrane proteins. This method allowed us (i) to estimate the size of the detergent belt associated to BmrA and other membrane proteins (ii) to modulate this size in terms of the detergent mixture and (iii) to provide information on the behavior of complex protein-detergent
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Trompier, Doriane. "Étude du transporteur MRP1 humain responsable de la résistance de cellules cancéreuses à la chimiothérapie et recherche d'inhibiteurs spécifiques." Lyon 1, 2003. http://www.theses.fr/2003LYO1T115.
Full textAbstract:
La 4e de couverture indique : "L'émergence du phénotype MDR (" MultiDrug Resistance ") des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de deux ATPases membranaires, appartenant à la superfamille des transporteurs ABC (" ATP-Binding Cassette "), la glycoprotéine-P et MRP1 (" Multidrug Resistance Protein "), qui utilisent l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP pour expulser les agents antitumoraux hors des cellules. Nos objectifs ont concerné d'une part l'étude fondamentale du mécanisme moléculaire d'efflux des drogues par le transporteur MRP1, dont la spécificité de substrat est différente de celle de la glycoprotéine-P, et d'autre part la recherche rationnelle de modulateurs spécifiques de MRP1, capables d'inhiber l'activité d'efflux des drogues. Les principaux résultats ont permis de mettre en évidence deux modulateurs; l'un de la famille des flavonoi͏̈des qui abolit le phénotype MDR et l'autre, dérivé iodé du vérapamil, qui induit spécifiquement la mort par apoptose des cellules surexprimant MRP1. "
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Bruneau, Alix. "Régulation de l'expression membranaire du transporteur de phospholipides biliaires ABCB4 : effet de mutations Functional Defect of Variants in the Adenosine Triphosphate–Binding Sites of ABCB4 and Their Rescue by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Potentiator, Ivacaftor (VX-770) Structural analogues of roscovitine rescue the intracellular traffic and the function of ER-retained ABCB4 variants in cell models." Thesis, Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS048.
Full textAbstract:
ABCB4 est exprimé à la membrane canaliculaire des hépatocytes où il sécrète un composant majeur de la bile : la phosphatidylcholine. Plus de 500 mutations d’ABCB4 sont associées à des maladies biliaires. La pathologie la plus sévère est la PFIC3, qui se développe tôt dans l’enfance et progresse rapidement vers l’insuffisance hépatique. La transplantation hépatique reste la seule thérapie efficace. Le développement d’alternatives représente donc un enjeu majeur. Cette thèse s’intéresse à l’effet de cinq mutations décrites chez des patients et situées dans les sites de liaison à l’ATP d’ABCB4. En combinant la modélisation 3D avec des études in vitro, nous avons montré que ces mutations sont responsables d’un défaut d’activité d’ABCB4. Nous avons mis en évidence que le VX-770, un médicament approuvé en clinique pour traiter les patients atteints de mucoviscidose, restaure l’activité des cinq mutants. Ces travaux ouvrent des perspectives de repositionnement du VX-770 pour le traitement ciblé de patients atteints de pathologies biliaires liées à ABCB4. La seconde partie de cette thèse consiste à étudier le rôle de l’interaction du domaine N-terminal d’ABCB4 avec la kinase MRCKalpha. L’inhibition ou l’extinction de cette kinase montrent que MRCKalpha joue un rôle dans la régulation de l’expression membranaire d’ABCB4 en contrôlant son internalisation depuis la membrane plasmique. En inhibant la protéine MLC2, effecteur de MRCKa, nous avons ensuite montré que l’effet de MRCKalpha sur l’expression d’ABCB4 passe par MLC2, qui est un partenaire du domaine linker d’ABCB4. Notre travail montre un rôle commun de ces deux partenaires dans la régulation de l’internalisation d’ABCB4ABCB4 is exclusively expressed at the canalicular membrane of hepatocytes where its function is to translocate phosphatidylcholine (PC) into bile. Variations in ABCB4 gene sequence are associated with several chronic and progressive liver diseases. The most severe is PFIC3 which develops early in childhood and most often requires liver transplantation. Less severe diseases are the intrahepatic cholestasis of pregnancy and the low phospholipid- associated cholelithiasis syndrome which occur in young adults. Up to now, about 500 disease-causing ABCB4 variants have been reported. A challenge is to find pharmacological treatments for the severe forms of the diseases. We have studied the effect of five disease-causing variations that reside in the highly conserved motifs of ABC transporters, involved in ATP binding. Using three-dimension structural modeling and in vitro studies, we showed that the five mutants were normally processed and targeted to the plasma membrane, whereas their PC secretion activity was dramatically decreased. PC secretion activity of the mutants was rescued by the clinically approved CFTR potentiator ivacaftor (VX-770). These results pave the way for personalized therapy in ABCB4-related diseases.The second part of my project was aimed at investigating the potential role of two ABCB4 partners, the kinase MRCKalpha and its effector the myosin light chain II (MLCII) in the expression and function of ABCB4. We found that downregulation of both partners didn’t affect the canalicular localization of ABCB4 but led to a reduction of its endocytosis. Our results open new insights into the mechanisms underlying the regulation of ABCB4 expression and function
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Mareux, Elodie. "Pharmacothérapie ciblée des déficits en ABCB11." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL083.
Full textAbstract:
ABCB11/BSEP (Bile Salt Export Pump) est exprimé à la membrane canaliculaire des hépatocytes. Sa fonction de transport d’acides biliaires dans la bile est essentielle à la sécrétion biliaire. Près de 400 variations du gène ABCB11 ont été identifiées et sont associées à des maladies hépatobiliaires rares, la plus sévère étant la cholestase intrahépatique progressive familiale de type 2 (PFIC2). L’efficacité des traitements médicaux est limitée. Par conséquent, une transplantation hépatique est indiquée avant l’âge adulte pour près de deux tiers des patients. Dans ce contexte, l’identification de thérapies alternatives est un enjeu capital.Cette thèse s’intéresse à la recherche de stratégies thérapeutiques personnalisées permettant de corriger les conséquences pathologiques de certaines variations d’ABCB11 identifiées chez des patients. Dans le cadre d’une stratégie de traitement par des molécules potentiatrices, nous avons étudié les variations A257V, G562D et T463I d’ABCB11 par modélisation moléculaire 3D. L’étude de l’expression et de la fonction de ces variants dans différents modèles cellulaires a confirmé que ces variations étaient responsables d’un défaut de fonction du transporteur Abcb11. L’ivacaftor (VX 770, Kalydeco®), approuvé cliniquement pour le traitement de la mucoviscidose, corrigeait le défaut d’activité de ces trois variants.Des effets similaires ont été observés avec les molécules GLPG1837, SBC040 et SBC219, connues comme potentiateurs de CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Dans une optique de thérapie combinatoire, nous avons également mis en évidence la capacité de ces potentiateurs à corriger le défaut de fonction des variants R1090C et R1090W, produits potentiels de la translecture du variant non-sens R1090X. Nous avons également évalué les molécules correctrices elexacaftor (VX-445) et tezacaftor (VX-661). Ces correcteurs, en monothérapie ou en combinaison, permettaient de restaurer l’adressage du variant R1128C, s’accompagnant d’une augmentation significative du transport de taurocholate. De façon intéressante, l’addition de molécules potentiatrices réduisait ces effets.L’ensemble de ces travaux constitue une preuve de concept que les défauts de certains variants d’ABCB11 peuvent être corrigés par ces molécules potentiatrices à haut potentiel thérapeutique. Ce type de traitements pourrait être envisagé pour les patients atteints de déficit en ABCB11 et permettrait ainsi d’augmenter la pharmacopée disponible pour traiter ce genre de pathologies et ainsi repousser voir palier à la transplantation hépatique pour les cas les plus sévèresABCB11/BSEP (Bile Salt Export Pump) is expressed at the canalicular membrane of hepatocytes. It ensures bile acids secretion into bile which is essential for biliary secretion. Nearly 400 variations of the ABCB11 gene have been identified and are associated with rare hepatobiliary diseases, the most severe being progressive familial intrahepatic cholestasis type 2 (PFIC2). The effectiveness of medical treatments is limited. Consequently, liver transplantation is required before adulthood for almost 2/3 of PFIC2 patients. In this context, the identification of alternative therapies is a major challenge.This thesis focuses on personalized therapeutic strategies to correct the pathological consequences of some ABCB11 variations identified in patients. The A257V, G562D and T463I variations of ABCB11 were studied by 3D molecular modelling. These variations were responsible for a defect in Abcb11 transport function. Ivacaftor (VX-770, Kalydeco®), a clinically approved cystic fibrosis treatment, corrects the activity defect of the three variants.Similar effects were observed with GLPG1837, SBC040 and SBC219, known as potentiators of CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator).From a combinatory therapy perspective, we also demonstrated the ability of these potentiators to correct the transport defect of the R1090C and R1090W variants, potential readthrough products of the R1090X nonsense variant. We also evaluated the ability of Elexacaftor (VX-445) and Tezacaftor (VX 661) correctors of CFTR. These correctors, alone or in combination, restored trafficking of the R1128C missense variant, leading to a significant increase in the transport function. Interestingly, the addition of potentiators abolishes this effect.Altogether, this thesis constitutes a proof of concept that molecules with high therapeutic potential can correct the molecular defects of ABCB11 variants. These treatments could increase the pharmacopoeia available for patients with ABCB11 deficiency and thus delay or even suppress the need for liver transplantation
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Garrigues, Alexia. "Mécanismes fonctionnels de la P-glycoprotéine : reconnaissance de composés cytotoxiques hydrophobes et interaction spécifique avec la membrane." Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA112056.
Full textAbstract:
La P-glycoprotéine (P-gp) est un transporteur membranaire qui assure la détoxication cellulaire dans différents tissus, en expulsant hors des cellules une grande variété de molécules cytotoxiques hydrophobes. La surexpression de la P-gp dans la membrane plasmique de certaines cellules tumorales est responsable du phénotype MDR (pour " MultiDrug Résistance "). Cette résistance cellulaire due à la P-gp est une des principales causes de l'échec clinique de la chimiothérapie anticancéreuse, ce qui justifie les efforts qui ont été déployés ces dix dernières années pour analyser le fonctionnement de la P-gp. Dans le cadre de ma thèse, j'ai analysé la spécificité de reconnaissance de la P-gp, remarquable par sa capacité à transporter des molécules de différentes structures chimiques. .P-glycoprotein (P-gp) is an active plasma membrane transporter involved in cellular, detoxification in several tissues. It actively expels out of cell a number of cytotoxic molecules, all amphiphilic but chemically unrelated. When P-gp is overexpressed in some cancer cells, it is responsible for the multidrug resistance (MDR) phenotype which reduces the effectiveness of various cytotoxic drugs used in anticancer chemotherapy. In order to identify molecular properties responsible for the binding selectivity of P-gp we combined a molecular modelling approach of several substrates and an enzymatic study. We determined the molecular characteristics of two different pharmacophores in the drug binding pocket of P-gp. This new model shows that the binding on P-gp is governed by the size of the substrates and overall by the intramolecular organisation of the hydrophobic/hydrophilic domains rather than by specific chemical motifs. .
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Marchand, Laurène. "Etude fonctionnelle et structurale d'un transporteur d'ATP/ADP chloroplastique." Thesis, Grenoble, 2014. http://www.theses.fr/2014GRENV020/document.
Full textAbstract:
L'hydrolyse de l'ATP en ADP constitue la principale source d'énergie de la cellule. Le transport de ce nucléotide depuis son lieu de synthèse vers le cytosol est essentiel pour la plupart des réactions métaboliques et nécessite un passage à travers les membranes. Ainsi, un grand nombre de transporteurs d'ATP/ADP sont présents dans les différents organites tels que les mitochondries, les chloroplastes, et autres types de plastides mais aussi chez les bactéries pathogènes (Rickettsia prowazekii, Protoclamydiae amoebophila) (Trentmann et al, 2007).L'équipe s'intéresse principalement à 2 types de transporteurs d'ADP et d'ATP, la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) et la famille des NTT (plastes et bactéries). Malgré des fonctions similaires, ces 2 familles de transporteurs possèdent des propriétés biochimiques et structurales différentes. De nos jours, il n'existe aucune information structurale disponible sur la famille des NTTs. La détermination de cette structure pourrait permettre de comprendre le mécanisme de transport de ces transporteurs mais plus généralement comprendre le transport de l'ATP et ADP dans les cellules.Une étude a été initiée sur la structure et la fonction de la famille des NTT plus particulièrement des transporteurs chloroplastiques d'Arabidopsis thaliana mais aussi des transporteurs bactériens. Toutefois, ma thèse concerne principalement les transporteurs chloroplastiques NTT1 et NTT2. Ces 2 isoformes sont localisées dans la membrane interne des chloroplastes et permettent de pourvoir le stroma en ATP lorsque la photosynthèse ne peut pas avoir lieu par manque de lumière.Nous avons déterminé et optimisé les conditions de surexpression des 2 isoformes dans un système hétérologue puis de purification en détergent). Nous avons mis au point des méthodes permettant de caractériser le transporteur en solution et de mesurer son activité dans le but d'aboutir à une étude structurale. Des pistes de cristallisation ont également étaient obtenuesATP is the main energy currency in the cell and its transport across membranes is essential for most of the metabolic reactions. A large number of ATP/ADP transporters are present in the different cell organelles such as mitochondria, chloroplasts, other types of plastids and some are also found in bacteria (Rickettsia prowazekii, Protoclamydiae amoebophila) (Trentmann et al, 2007). The team is mainly interested in two distinct transporters families, the mitochondrial carrier family (MCF) and the NTT family. Despite similar function, mitochondrial ADP/ATP transporters (Pebay-Peyroula et al, 2003) and NTT proteins exhibit different structural and biochemical properties. To date no structural information is available on the NTT family. The determination of a structure would help for understanding the transport mechanism of these carriers and more generally the different mechanisms of the transport of ADP and ATP within the cell.We initiated a structure-function study on the NTT family focusing on chloroplast transporters from Arabidopsis thaliana and also from bacteria. My thesis is focused on chloroplast NTT1 and NTT2. These isoforms are localized in the inner membrane of chloroplast. They transport ATP inside the chloroplast in order to supply the different reactions occurring in the stroma when the photosynthesis does not occur.We have determined and optimized conditions to overexpress these 2 isoforms in heterologous systems and to purify the protein in detergents. We have also set up tools to characterize the carrier in solution and to measure its transport activity opening the way to functional and structural studies. We obtained promising crystallization hits
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Gauthier, Charlotte. "Identification et mécanisme d'action de modulateurs sélectifs du transporteur ABCG2 responsable de la chimiorésistance de cellules cancéreuses." Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2014. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00995077.
Full textAbstract:
ABCB1 (ou P-gp pour "glycoprotéine-P"), ABCC1 (ou MRP1 pour "Multidrug Resistance Protein 1") et ABCG2 (ou BCRP pour "Breast Cancer Resistance Protein") sont les trois transporteurs ABC humains les plus impliqués dans la chimiorésistance de certaines cellules cancéreuses. Deux stratégies sont possibles pour éradiquer cette résistance : 1) l'élimination ciblée des cellules surexprimant ces transporteurs, grâce au talon d'Achille qu'elles ont développé comme conséquence de leur chimiorésistance : la sensibilité collatérale (ou hypersensibilité), et 2) l'identification et l'optimisation d'inhibiteurs spécifiques. Lors de ce projet, nous nous sommes particulièrement intéressés au transporteur ABCG2. Dans un premier temps, comme la sensibilité collatérale avait été décrite dans le cas de la surexpression d'ABCB1 ou d'ABCC1, nous voulions vérifier son implication éventuelle dans le cas de la surexpression d'ABCG2. Sans pouvoir finalement conclure sur son existence, nous avons démontré que le mécanisme d'action ne pouvait pas impliquer un efflux massif de glutathion par la protéine, comme c'est le cas pour ABCC1, contrairement à certaines données de la littérature. Dans le cadre de la seconde approche, nous avons criblé différentes séries de composés, apparentés aux flavonoïdes, pour identifier des inhibiteurs spécifiques d'ABCG2. Nous avons ainsi pu mettre en évidence des relations structure-activité démontrant l'importance de certains substituants, notamment des groupements méthoxy, non seulement pour l'inhibition de l'activité du transporteur mais aussi pour la cytotoxicité des molécules. Ces études nous ont également permis de classer les inhibiteurs identifiés en 4 familles distinctes, quant à leur mécanisme d'action à la fois sur l'efflux de drogues comme la mitoxantrone et l'activité ATPasique d'ABCG2. Enfin, le meilleur inhibiteur spécifique d'ABCG2 décrit à ce jour, la chromone 6g (ou MBL-II-141) a été caractérisé plus en détails. Son efficacité in vivo pour empêcher la croissance de tumeurs humaines xénogreffées chez la souris nous incite à être optimistes sur la possibilité de proposer un inhibiteur d'ABCG2 comme candidat médicament pour de futures études précliniques
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Lhermusier, Thibault. "Régulation plaquettaire : ciblage de la protéine kinase Syk dans les HIT et rôle du transporteur lipidique ABCA1 dans les fonctions plaquettaires." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/1698/.
Full textAbstract:
Les plaquettes sanguines jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité vasculaire. Outre leur rôle physiologique conduisant à la formation du clou hémostatique en cas de brèche vasculaire, elles sont impliquées dans des pathologies thrombotiques comme l'athérothrombose ou les thrombopénies induites par l'héparine (TIH), ce qui en fait des cibles pharmacologiques de choix dans ces situations. Nous avons étudié les mécanismes mis en jeux par les plaquettes dans deux situations pathologiques ; les TIH avec la tyrosine kinase Syk comme acteur majeur et la maladie de Tangier résultant d'une mutation perte de fonction du transporteur de lipide ABCA1. Les TIH sont des complications rares mais graves des traitements à l'héparine dues au développement d'anticorps dirigés contre le complexe héparine-facteur 4 plaquettaire (PF4). Ces anticorps induisent la clairance des plaquettes (thrombopénie) et activent les récepteurs Fc à la surface des plaquettes (FcgRIIA) et des monocytes (FcgRI et FcgRII) conduisant à l'agrégation plaquettaire et l'expression du facteur tissulaire par les monocytes responsable des complications thrombotiques. Nous montrons que Syk est une kinase essentielle à l'activation des plaquettes (signalisation, sécrétion, agrégation, microparticules) par les anticorps dirigés contre le complexe héparine-PF4 présents dans le sérum de patients atteints de TIH. Parallèlement, l'inhibition de Syk bloque fortement l'expression du facteur tissulaire et l'activité procoagulante des monocytes induites par les anticorps TIH. Les inhibiteurs de Syk, en développement clinique avancé en immunothérapie, apparaissent donc prometteurs dans le traitement des TIH. ABCA1 est impliqué dans le transport réverse du cholestérol et de phospholipides vers les lipoprotéines de haute densité. Son déficit est associé à de profondes anomalies du bilan lipidique mais aussi à un phénotype hémorragique. Grâce à un modèle de souris déficientes en ABCA1, nous avons caractérisé son rôle dans l'activation plaquettaire. Contrairement à ce que l'on aurait pu penser, ABCA1 n'est pas impliqué dans l'exposition des phosphatidylsérines et l'activité procoagulante des plaquettes activées, et ne régule pas le contenu en cholestérol des membranes plaquettaires. Par contre, un défaut de taille des plaquettes et de leurs réponses fonctionnelles sont observés en son absence. ABCA1 apparaît comme un régulateur des mécanismes de signalisation pouvant expliquer le phénotype hémorragique rapporté dans la maladie de Tangier. L'ensemble de ces travaux a permis de caractériser des acteurs moléculaires de l'activation plaquettaire dans des situations pathologiques et de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiquesPlatelet activation at sites of vascular injury is essential for haemostasis. Next to this critical role in bleeding arrest, platelets are involved in thrombotic diseases such atherothrombosis or heparin-induced thrombocytopenia (HIT). Therefore, they are targets of antithrombotic therapies. We have studied the mechanisms of platelet activation in two pathological situations; HIT with the tyrosine kinase Syk as a key player and Tangier disease resulting of a loss of function of the ABCA1 lipid transporter. HIT is a prothrombotic and potentially devastating complication of heparin therapy due to formation of platelet-activating antibodies directed against complexes of platelet factor 4 (PF4) and heparin. These antibodies contribute to clear platelet from the circulation and activate, by their Fc fragment, Fc?RIIA receptors on platelet surface or FcgRI and FcgRII receptors on monocyte, leading to platelet aggregation and tissue factor expression by monocytes. We have shown that Syk activation is crucial for platelet activation (signalization, secretion, aggregation, microparticle generation) initiated by anti-PF4/heparin antibodies from sera of patients suffering from HIT. Interestingly, Syk inhibition also prevented tissue factor expression and procoagulant activity of moncytic cells induced by these antibodies. We propose that Syk inhibitors, initially developed as a potential treatment of autoimmune disease, may be of therapeutic interest in the treatment of HIT. ABCA1 has been demonstrated to be crucial in the reverse cholesterol transport pathway by loading cholesterol and phospholipids into ApoA-I to generate high density lipoproteins. Its defect is associated to circulating lipid disturbance but also to hemorrhagic diathesis. Surprisingly, using ABCA1 knock-out mice, we have demonstrated that this transporter is neither implicated in phosphatidyserine exposure, a mechanism leading to the procoagulant activity of activated platelets, nor in the control of platelet membranes cholesterol content. However, mouse platelets deficient for ABCA1 have an increased size and a defect in response to low doses of agonists such as thrombin and collagen. Our data indicate that ABCA1 is involved in the efficiency of platelet signal transduction, particularly in the activation of Akt. These studies have characterized key players of platelet activation and suggest new strategies in the development of antithrombotic therapies
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David, Marion. "Identification and functional characterization of an ABC transporter of Haemonchus contortus, the P-glycoprotein 13." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30206/document.
Full textAbstract:
Les lactones macrocycliques (LM) sont des anthelminthiques (AH) à effet paralysant très utilisés chez les animaux et les humains contre les nématodes parasites. Cependant, leur succès thérapeutique est compromis par la résistance croissante aux LM, qui pourrait être en partie dû aux ABC transporteurs P-glycoprotéines (Pgps) sélectionnés et surexprimés chez les nématodes résistants aux LM. Dans ce travail, nous avons étudié plus précisément la P-glycoprotéine 13 du parasite de petits ruminants, Haemonchus contortus. Son orthologue chez le modèle nématode C. elegans, Cel-Pgp-13, est exprimé dans les amphides, structures qui ont été associées à la sensibilité aux AH chez C. elegans et H. contortus. Pour prédire la capacité des Pgps de nematode à transporter des drogues, incluant des LM et autres AH, nous avons développé un modèle de docking in silico. Nous avons utilisé la structure cristallographique de C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1), et nous avons montré la liaison avec une forte affinité de plusieurs ligands décrits comme activateurs de sa fonction ATPasique. Nous avons aussi décrit une forte affinité des LM, et un site spécifique de liaison de ces composés à Cel-Pgp-1. Cette approche représente un outil important pour prédire les interactions entre AH, et pour concevoir rationnellement de nouveaux inhibiteurs compétitifs des Pgps de nématode, dans le but d'améliorer les stratégies thérapeutiques. Sur la base de cette approche, nous avons prédit la structure 3D de Hco-Pgp-13 à partir du cristal de Cel-Pgp-1 afin d'étudier son intéraction avec des substrats potentiels, en particulier les LM. Nous avons trouvé des affinités similaires pour différents composés précédemment testés sur Cel-Pgp-1. In vitro, la mesure de l'activité ATPasique montre que l'actinomycine D est un substrat de Hco-Pgp-13. Nos données démontrent la présence possible d'un domaine de reconnaissance multispécifique sur ce transporteur de parasite. La détermination par immunofluorescence de l'expression de Hco-Pgp-13 a montré une distribution tissulaire large indiquant que Hco-Pgp-13 pourrait jouer un role important dans le transport de substrats endogènes et/ou exogènes. En conclusion, ce travail permet de mieux comprendre le rôle des Pgps de nématodes dans le transport de médicaments AH, tant au niveau de l'organisme modèle C. elegans que du nématode parasite H. contortus. Cette étude suggère la conservation de la fonction de tranporteur ABC multidrogue dans ces espèces. La localisation de Hco-Pgp-13 sur les structures amphidiales, et son éventuelle implication dans la résistance aux médicaments et à la survie de H. contortus à l'exposition à des composés AH, restent à préciserMacrocyclic lactones (ML) are paralyzing anthelmintics used in animals and humans against parasite nematodes. However, their therapeutic success is compromised by the spread of ML resistance. This might be at least partly due to P-glycoproteins (Pgps) ABC transporters that are selected and overexpressed in ML-resistant nematodes. Deciphering the role of the 10 Pgps expressed in the parasite of small ruminants Haemonchus contortus is thus of major importance to guaranty anthelmintic (AH) efficacy of various drugs. Here we focused on Hco-Pgp-13 due to the expression in the amphids of its closest ortholog in the model nematode C. elegans. Indeed, the amphids represent a putative entry route of drugs to reach AH targets in the nervous system and have been linked to AH susceptibility in C. elegans and H. contortus. In order to predict the capacity of nematode Pgps to transport drugs, including ML and otherAH, we have developed an in silico drug docking model. We have used C. elegans Pgp-1 (Cel-Pgp-1) crystal structure and have showed a high affinity binding of several ligands that have been shown to be activators of its ATPase function. ML were also found to bind with high affinity to Cel-Pgp-1, on a specific binding site. This approach provides a valuable tool to predict drug-drug interactions and to rationally design new competitive inhibitors of nematode Pgps, in order to improve anthelmintic therapeutics. We then predicted a putative 3D structure of Hco-Pgp-13 based on the recently released crystal of Cel-Pgp-1, with which it presented a high homology. This allowed the study of the interaction of Hco-Pgp-13 with potential substrates, in particular ML. We found similar affinities for various drugs previously tested on Cel-Pgp-1, supporting the good homology of these two proteins. Together with in vitro ATPase assay experiments that confirmed the substrate status of actinomycin D, this indicates a possible multispecifc recognition capacity of this parasitic transporter. The determination of Hco-Pgp-13 localization using immunohistochemistry showed a wide tissue expression consistent with a critical role for Hco-Pgp-13 in endogenous and/or exogenous substrate transport. In conclusion, this work provides insights into the role of nematode Pgps in transporting AH drugs, both at the level of the model organism C. elegans and of the parasitic nematode H. contortus. This suggests a high homology of function conserved between ABC tranporters in these species. The localization of such protein on amphidial structures and its possible involvement in drug resistance and survival of H. contortus to exposure to AH compounds remain to be precised
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Marty, Loic. "Structures et spécificités de Protéines Périplasmiques de Fixation pour les mannityl-opines chez Agrobacterium tumefaciens." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS238/document.
Full textAbstract:
L’agent pathogène Agrobacterium tumefaciens induit, chez les plantes, le développement de tumeurs dans lesquelles il prolifère, en intégrant un fragment de son plasmide Ti de virulence dans le génome de son hôte. Les tissus transformés synthétisent des composés originaux, appelés opines, qui sont utilisés comme nutriments spécifiques par la bactérie. Une vingtaine d’opines sont connues à ce jour, et chacune d’elle peut être métabolisée par des souches d’Agrobacterium tumefaciens possédant les gènes de transport et de catabolisme qui lui sont associés, ce qui apparait comme un avantage compétitif dans la colonisation de la tumeur. La présence de ces gènes dépend du type de plasmide Ti que la souche pathogène possède.Agrobacterium tumefaciens B6 possède un pTi de type octopine, qui porte les gènes de métabolisme des mannityl-opines, qui sont la mannopine, l’acide mannopinique, l’agropine et l’acide agropinique. La mannopine et l’acide mannopinique sont synthétisés par la même enzyme, et ont pour précurseurs respectivement la désoxy-fructosyl-glutamine (DFG) et le désoxy-fructosyl-glutamate (DFGA), tous deux opines de la famille de la chrysopine. La DFG est aussi un composé d’Amadori répandu et assimilable par de nombreux organismes. La mannopine sert de précurseur pour la synthèse de l’agropine. Enfin, la mannopine, l’acide mannopinique et l’agropine peuvent toutes trois se lactamiser spontanément en acide agropinique.Malgré la similarité chimique de ces quatre opines, chacune est transportée par une protéine périplasmique de fixation (PBP) associée à un transporteur ATP-binding Cassette (ABC) différent. La PBP sélectionne et fixe une opine pour l’apporter au transporteur ABC, qui permet le passage de l’opine dans le cytoplasme grâce à l’hydrolyse de deux molécules d’ATP. La spécificité du transporteur entier est déterminée par la PBP.Des études génétiques chez des souches possédant un pTi de type octopine ont montré que le système PBP-transporteur ABC AgaABCD est spécifique de l’acide agropinique, AgtABCD spécifique de l’agropine, MoaABCD spécifique de l’acide mannopinique et que MotABCD transporte la mannopine et également l’acide mannopinique. Chez la souche C58, qui ne possède pas un pTi de type octopine, le système de transport SocAB, codé par des gènes situés sur le plasmide cryptique At, transporte la DFG comme nutriment, et semble aussi capable d’importer la mannopine.Mon travail de thèse a permis, dans un premier temps, de caractériser les fortes affinités et la spécificité des PBP AgaA et AgtB pour l’acide agropinique, de la PBP MoaA pour l’acide mannopinique et de la PBP SocA pour la DFG, mais aussi la non spécificité de MotA pour la mannopine, l’acide mannopinique et la DFG, ce qui remet en question les affinités précédemment décrites pour AgtB et SocA. Dans un deuxième temps, ce travail a apporté les bases moléculaires et structurales des complexes PBP-mannityl-opines, complexes jamais caractérisés auparavant. Enfin, dans un troisième temps, la structure de la PBP AttC chez la souche C58, annotée comme mannopine-like, a été déterminée, et les expériences d’interaction ont montré qu’elle n’interagit avec aucune mannityl-opine, ce qui conduit à une révision de son annotation.Mes travaux apportent un éclairage nouveau sur l’import des mannityl-opines chez Agrobacterium tumefaciens. Le fait qu’aucun des transporteurs étudié ne permette l’import de l’agropine laisse penser qu’il existe une autre PBP ou un autre système de transport encore inconnu assurant cette fonction, ouvrant la voie vers de nouvelles études sur les pTi de type octopine et agropineAgrobacterium tumefaciens pathogenic agent confers the development of tumors in plants, in which it proliferates, integrating a fragment of its virulence Ti plasmid into its host genome. Transformed tissues synthesize original compounds, called opines, used as specific nutrients by the bacterium. More than twenty opines are known so far, and each one of them can be metabolized by A. tumefaciens strains possessing its associated transport and catabolism genes, which appears as a competitive advantage in the tumor colonization. The presence of these genes relies on the Ti plasmid type a pathogenic strain possesses. A. tumefaciens B6 possesses an octopine-type pTi, which harbors the metabolism genes of the mannityl-opines, which are mannopine, mannopinic acid, agropine and agropinic acid. Mannopine and mannopinic acid are synthesized by the same enzyme, and their precursors are deoxy-fructosyl-glutamine (DFG) and deoxy-fructosyl-glutamate (DFGA) respectively, both opines of the chrysopine family. DFG is also a wide-spread Amadori compound which can be uptaken by numerous organisms. Mannopine is a precursor for agropine synthesis. Finally, mannopine, mannopinic acid and agropine can spontaneously lactamize into agropinic acid.Despite the chemical similarity of these four opines, each one is transported by a different periplasmic binding protein (PBP) associated with an ATP-binding cassette (ABC) transporter. The PBP selects and binds one opine to bring it to the ABC transporter, which allows the passage of the opine to the cytoplasm due to two ATP molecules hydrolysis. The whole transporter specificity is determined by the PBP.Genetic studies in strains possessing an octopine-type pTi showed that AgaABCD PBP-ABC transporter system is specific to agropinic acid, AgtABCD to agropine, MoaABCD to mannopinic acid and that MotABCD transports mannopine and also mannopinic acid. In C58 strain, which do not possess an octopine-type pTi, SocAB transport system, coded by genes located on the cryptic pAt plasmid, allows the transport of DFG as a nutrient, and seems able to import mannopine too.My thesis work allowed, first, to characterize the strong affinities and the specificity of PBPs AgaA and AgtB to agropinic acid, PBP MoaA to mannopinic acid and PBP SocA to DFG, and also MotA unspecificity toward mannopine, mannopinique acid and DFG, which leads to a revision of the previously described affinities of AgtB and SocA. Secondly, this work brought molecular and structural basis of PBP-mannityl-opine complexes, never described before. Finally, the structure of PBP AttC, annotated as a mannopine binding-like protein in C58, was determined, and interactions experiments showed that it binds no mannityl-opines, leading to a revision of its annotation.My work sheds light on the mannityl-opines importation in Agrobacterium tumefaciens. The fact that none of the studied transport system allows agropine import lets think that there is another unknown PBP or another unknown whole transport system assuming this role, opening new ways to new studies about octopine- and agropine-type pTis
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Colombo, Tristan. "Algorithmes pour la recherche de classes de gènes en relations fonctionnelles par analyse de proximités et de similarités de séquences." Phd thesis, Université de la Méditerranée - Aix-Marseille II, 2004. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00008447.
Full textAbstract:
Notre étude porte sur les transporteurs ABC dans les génomes bactériens complets. L'analyse bioinformatique du répertoire de ces systèmes comprend l'identification des partenaires, l'assemblage, la reconstruction des systèmes incomplets, la classification en sous-familles, et l'identification du substrat transporté. Cette thèse propose des outils permettant l'étude de ces problèmes par l'utilisation de méthodes informatiques. Les hypothèses biologiques employées sont que : (i) des gènes voisins sur le chromosome peuvent être impliqués dans un même processus métabolique s'ils ont été conservés au cours de l'évolution, et (ii) des gènes présentant des similarités de séquence peuvent permettre la synthèse de protéines de même fonction. Trois études ont été menées sur le répertoire des transporteurs ABC : * L'exploration du voisinage chromosomique. D'après l'hypothèse selon laquelle plus les gènes conservés dans le voisinage d'un transporteur sont proches, plus leur lien fonctionnel avec le transporteur est fort, on essaye d'identifier le substrat transporté ou des associations de gènes. Ce problème est traité par une méthode de résolution issue des problèmes de satisfaction de contraintes. * La classification. Les transporteurs ABC sont classés par grandes catégories en fonction des molécules qu'ils transportent (sucres, ...). Pour chaque domaine, en représentant les relations d'homologie par un graphe, la recherche des zones de forte densité permet de déterminer des sous-classes de substrat. * La reconstitution des systèmes incomplets. Les transporteurs ABC sont assemblés en utilisant la proximité chromosomique des gènes codant pour les domaines et la compatibilité des sous-familles de domaines. Lorsque la proximité n'est pas respectée, on utilise une stratégie développée à partir d'une méthode d'analyse de graphes pour assembler les domaines et prédire des systèmes actifs. Ces méthodes, en complément de l'identification des partenaires et de l'assemblage, permettent une étude fonctionnelle des transporteurs ABC. Elles pourraient être appliquées à d'autres systèmes biologiques.