Academic literature on the topic 'Transformation d'ADN'

Une souche sans paroi de l'algue verte unicellulaire chlamydomonas reinhardtii auxotrophe pour l'arginine a été transformée par le plasmide parg 7. 8 par agitation en présence de billes de verre. Les cellules ayant intégré une copie fonctionnelle du plasmide ont été sélectionnées par leur capacité à croître sur un milieu dépourvu d'arginine, le plasmide portant le gène de l'argino-succinate lyase sauvage complémentant l'auxotrophie. Des souches déficientes pour la biosynthèse de l'amidon ont été sélectionnées parmi les transformants. Parmi les 16 souches présentant un phénotype mutant pour la synthèse d'amidon, 10 accumulent de très faibles quantités du polysaccharide (inferieure à 5% de la quantité mesurée chez la souche sauvage). Deux souches sont mutées pour la synthèse de l'amylose et 4 autres accumulent une amylopectine modifiée. Une analyse génétique de la souche BAF R1 a permis de mettre en évidence l'intégration d'un plasmide parg 7. 8 fonctionnel au locus ST-2, conduisant à la délétion du gène de structure de la GBSS (Granule Bound Starch Synthase). Ceci nous a permis de prouver que la synthèse de longs glucanes n'est pas un prérequis pour la synthèse de l'amylopectine. L'un des mutants pauvres en amidon ne présente pas d'activité ADP-GLC pyrophosphorylase détectable. Cette délétion complémente la mutation ST-1-1 précédemment caractérisée comme défectueuse pour la même activité enzymatique. Ceci suggère que la transformation a conduit à la mutation du deuxième gène de structure de l'ADP-GLC pyrophosphorylase. La présence d'un polysaccharide soluble fortement branché, de type phytoglycogène, a été détectée chez un autre des mutants pauvres en amidon. 50 souches ont également été sélectionnées suite à un maintien de l'amidon dans des conditions qui induisent sa dégradation chez le sauvage.

La résistance aux antibiotiques, évidente chez des souches telles que Neisseria gonorrhoeae, est une crise sanitaire mondiale. Il est vital de comprendre son mécanisme, en particulier la transformation naturelle par les Pili de type IV de ces bactéries. Bien qu'elle ait été découverte en 1928, la transformation naturelle n'a toujours pas été élucidée. La dépendance de Neisseria gonorrhoeae à l'égard des Pili de type IV en fait un modèle idéal pour l'étude de ce processus.Cette thèse se lance dans une exploration intensive des processus complexes de transformation de l'ADN au sein de Neisseria gonorrhoeae, répondant ainsi à l'urgence de ce problème critique. Le rôle central de cette étude approfondie est attribué aux pili de type IV, un acteur multifonctionnel et essentiel dans l'orchestration de la transformation de l'ADN.Cette recherche pose méticuleusement les bases, en introduisant des techniques de biologie moléculaire essentielles pour le génie génétique chez N. gonorrhoeae. Nous explorons le développement d'outils, en particulier l'optimisation des milieux et les outils de microscopie adaptés à l'étude de l'absorption et de la transformation de l'ADN. En outre, nos recherches ont mis en évidence une corrélation intrigante entre l'amidon et les acides gras, qui a un impact significatif sur la croissance des gonocoques. Pour comprendre la dynamique des pili de type IV pendant l'absorption de l'ADN, nous avons mis au point des outils et un flux de travail rationalisé capables de visualiser et de quantifier à la fois les pili et les molécules d'ADN. En outre, nous avons automatisé l'analyse des micropiliers d'hydrogel afin d'étudier les propriétés mécaniques des rétractions des pili. En outre, des adaptations des revêtements des micropiliers nous ont permis d'étudier les rétractions des pili en interaction avec l'ADN.Cette étude approfondie comprend également l'examen du comportement des mutants ΔPilV, ΔPilC, et ΔPilD, dévoilant ainsi de profondes connaissances sur les mécanismes de régulation des pili de type IV et leur impact sur la dynamique de l'absorption de l'ADN. Il est particulièrement intéressant de noter que les mutations ΔPilV induisent des altérations dans la translocation de PilE, ce qui entraîne l'émergence de pili plus courts mais efficaces. Cette découverte souligne la nature adaptative de N. gonorrhoeae dans la manipulation de la diversité des pili de type IV pour optimiser les processus d'absorption de l'ADN, une révélation qui revêt une importance considérable dans la lutte contre la résistance aux antibiotiques.En outre, nos études sur d'autres pilines mineures mettent en lumière les altérations du phénotype sans entraver le mécanisme de rétraction des pili. Nos études sur les mutants PilV et PilD mettent en évidence l'influence des modifications post-traductionnelles sur PilE, accentuant ainsi la composition hétérogène des pili de type IV et leur fonctionnalité robuste en tant que polymère.Nous incluons également une courte étude examinant l'interaction entre les espèces de Neisseria commensales et pathogènes dans le contexte de l'absorption de l'ADN, ce qui élargit le champ des implications, invitant à une enquête plus approfondie et élargissant les horizons de ce domaine captivant.Bien que cette expédition laisse certaines questions sans réponse, sa profondeur et son ampleur permettent de mieux comprendre les mécanismes complexes de transformation de l'ADN et le rôle dynamique joué par les pili de type IV dans la remarquable adaptabilité de Neisseria gonorrhoeae. Non seulement cette thèse apporte des solutions aux questions existantes, mais elle ouvre également de nouvelles voies pour la recherche future, suscitant la curiosité et la fascination pour l'élucidation des complexités fonctionnelles des structures pili et leurs implications profondes dans la transformation de l'ADN
Antibiotic resistance, evident in strains like Neisseria gonorrhoeae, is a global health crisis. Understanding its mechanism, particularly natural transformation through Type IV Pili in these bacteria, remains vital. Despite discovery in 1928, the specifics of natural transformation remain elusive. Neisseria gonorrhoeae's dependence on Type IV Pili makes it an ideal model for studying this process.This thesis embarks on an intensive exploration into the intricate processes of DNA transformation within Neisseria gonorrhoeae, responding to the urgency of this critical concern. Central to this comprehensive study is the pivotal role attributed to Type IV Pili, a multifunctional and essential player in orchestrating DNA transformation.This research meticulously lays the groundwork, introducing molecular biology techniques essential for genetic engineering within N. gonorrhoeae. We explores tool development, particularly in medium optimization and microscopy tools tailored to study DNA uptake and transformation. Moreover, our investigations uncovered an intriguing correlation between starch and fatty acid, significantly impacting gonococcal growth. To understand Type IV pili dynamics during DNA uptake, we engineered tools and a streamlined workflow capable of visualizing and quantifying both pili and DNA molecules. Additionally, we automated the analysis of hydrogel micropillars to delve into the mechanical properties of pili retractions. Furthermore, adaptations to the micropillar coatings enabled us to study pili retractions interacting with DNA.This in-depth investigation also involves scrutinizing the behaviour of ΔPilV, ΔPilC, and ΔPilD mutants, unveiling profound insights into the regulatory mechanisms of Type IV Pili and their consequential impact on the dynamics of DNA uptake. Particularly noteworthy is the revelation that ΔPilV mutations induce alterations in PilE translocation, resulting in the emergence of shorter yet efficient pili. This discovery underscores the adaptive nature of N. gonorrhoeae in manipulating the diversity of Type IV Pili to optimize DNA uptake processes, a revelation that holds immense significance in combating antibiotic resistance.Furthermore, our studies on other minor pilins sheds light on phenotype alterations without impeding the mechanics of pili retraction. Our studies on PilV and PilD mutants, highlight the influence of posttranslational modifications on PilE, thereby accentuating the heterogeneous composition of Type IV Pili and their robust functionality as a polymer.We also include a short study examining the interplay between commensal and pathogenic Neisseria species within the context of DNA uptake broadens the scope of implications, inviting further inquiry and expanding the horizons of this captivating field.While this expedition leaves certain questions unanswered, its depth and breadth offer extensive insights into the intricate mechanisms of DNA transformation and the dynamic role played by Type IV Pili in the remarkable adaptability of Neisseria gonorrhoeae. Not only does this thesis provide solutions to existing queries, but it also illuminates novel pathways for future research, sparking curiosity and fascination in unravelling the functional intricacies of pili structures and their profound implications in DNA transformation

Cette thèse porte sur des expériences d'évolution de bactéries, avec le but d'explorer expérimentalement comment des transferts horizontaux d'ADN au sein d'une population de bactéries peuvent ou non modifier l'évolution de cette population. La méthode utilisée pour permettre des échanges d'ADN à l'intérieur de la population repose sur la propriété de transformation naturelle de la bactérie Acinetobacter baylyi. Une expérience pilote sans brassage de génomes a été faite sur 3000 générations et nous avons analysé par séquençage les mutations et la diversité apparues pendant cette expérience. On observe une structure en multiples sous-populations compatible avec un régime d'interférence clonale. Une expérience d'évolution avec échange d'ADN ainsi qu'une expérience contrôle avec une bactérie non compétente ont été réalisées dans les mêmes conditions sur 1300 générations. Des séquençages de génomes ont été effectués sur des populations et des clones à différents temps de chaque expérience d'évolution afin de mettre en évidence les mutations apparues ainsi que leur fréquence dans la population. La diversité dans l'expérience d'évolution avec brassage est nettement plus élevée jusqu'à 970 générations et est due à différents types de mutations alors que dans l'expérience sans brassage, la diversité est essentiellement due à des SNP. Cependant dans l'expérience avec brassage, on observe à 1300 générations une baisse de la diversité qui est liée à la fixation d'une mutation dans un gène essentiel pour la transformation. Ces résultats préliminaires laissent penser que le brassage a un avantage à court terme mais qu'à long terme l'avantage lié à l'échange s'amenuise

LAH4 est un peptide antibactérien de 26 acides aminés capable de se complexer à l’ADN et de permettre son transfert dans les cellules eucaryotes. Nous avons développé une stratégie d’expression chez E. Coli qui permet la production de 10mg de peptide P-LAH4 purifiés et marqués en 15N par litre de culture. Malgré l’addition d’une proline, le peptide P-LAH4 conserve son caractère antibactérien et transfectant d’ADN. La structure, la topologie du peptide associé aux membranes, ainsi que ses interactions avec l’ADN ont été étudiées par RMN. L’étude de sa structure dans des micelles de DPC à pH=5,5 a permis l’attribution des résonances des noyaux NH, HN, Cα, Cβ et Hα pour 90 % des résidus. Le peptide adopte une conformation en hélice αdes résidus A4 à A23. Les études par RMN 15N du peptide reconstitué dans les bicouches orientées de POPC à pH=5,5 et 6,9, indique qu’il est orienté parallèlement à la membrane à pH=5,5 et incliné d’environ 10° par rapport à la normale à la bicouche à pH=6,9. De plus, il adopte également une structure en hélice α dans les bicouches aux deux pH. La technique REDOR appliquée sur les complexes P-LAH4/ADN à pH=5 montre que les résidus lysines sont proches des noyaux 31P de l’ADN, contrairement aux résidus histidines, ce qui suggère un modèle d’interaction dans lequel le peptide agirait avec l’ADN par l’intermédiaire d’interactions électrostatiques via ces extrémités. Le marquage sélectif en 13C/15N sur chacune des quatre lysines séparément révèle que les lysines 2 et 25 sont les résidus « moteurs » dans l’interaction avec l’ADN
LAH4 is a 26 amino acids antimicrobial peptide which has the ability to complex with DNA and to transfect eukaryotic cells. Here, we have described a procedure that allows rapid expression and purification of P-LAH4. The final yield obtained is 10mg of P-LAH4 uniformly 15N labeled per liter of culture. We have also shown that in spite of the proline’s addition in the N-terminus of the peptide, P-LAH4 maintains its antibacterial activity against E. Coli and is able to transfect DNA in a manner comparable with LAH4. The structure, topology of the peptide in interaction with model membranes and with DNA was investigated using NMR spectroscopy. Firstly, the NH, HN, Cα, Cβ and Hαchemicals shift of 90% of the peptide residues was determined when the peptide interacts with DPC micelles at pH=5. 5 and consequently we have shown that the peptide adopts an alpha-helical conformation from A4 to A23. Secondly, we have reconstituted the peptide in oriented POPC membranes at pH=5. 5 and 6. 9. The results indicate that the peptide is oriented parallel to the membrane at pH=5. 5 and that at pH=6. 9 it is 10° tilted to magnetic field. It also adopts an alpha helical structure at both conditions. Thirdly, application of REDOR NMR in DNA/LAH4 complexes at pH=5 reveals that the lysine side chains are close to 31P of the DNA in contrast to the histidine side chains which are not involved in significant dipolar coupling with 31P. The data suggest that the peptide interacts with DNA by electrostatic interactions via its extremities. The peptide was finally labeled at only one lysine site and the results indicate that the lysine 2 and 25 act as “driving residues” during the formation of complexes

Jusqu'aux annees vingt, les ait-mouli profitaient de l'opposition et de la complementarite des donnees naturelles de leur territoire pour entretenir le semi-nomadisme. Sous l'effet social, ces derniers ont abandonne ce mode de vie ancestral. Actuellement, la totalite des populatioins est devenue sedentaire et les cultures concernent l'ensemble des terres cultivables a l'exception des terres collectives, situees sur le jbel. Sedentaires, les ait-mouli sont confrontes a une nouvelle reconversion sociale et economique due a la croissance demographique et a l'ouverture totale sur le marche. De ce fait, de profondes transformations se sont declenchees et les populations locales cherchent sans cesse a ameliorer leur niveau de vie mais dans le cadre d'une societe toujours microfundiaire et collective. L'actuelle reconversion des ait-mouli met en cause l'ancien systeme de production et les relations de complementarite qu'entretenaient les differentes parties du secteur entre elles. La cerealiculture et l'elevage traditionnel se montrent
Up to the twenties, the ait-mouli availed themselves of both the opposition and the complementarity of their territory's natural data in order to maintain sem-nomadism. As a result of influence of several factors - administrative, economic and social- the semi-nomads have abandoned that ancestral way of life. At the present time, the whole of the tillable lands with the exception of the collective lands in the jbel which are intended for paturage. Once settled, the ait-mouli are confronted with a new economic and social adaptation due to the increase in population and to a free opening to the market. As result, deep transformations have been set off and the local populations constanthy try to improve their standard of living, but within a society which is still microfundium and collective. The ait-mouli's present readaptation questions the old system of production and the relationships of complementarity that the different parts of the sector entertained with one another