Dissertations / Theses: 'Trafic de vésicules membranaires'

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Huang, Xiao Hang. "Etude du trafic membranaire chez les algues marines : les vesicules mantelees de laminaria digitata et ulva lactuca." Paris 5, 1988. http://www.theses.fr/1988PA05S006.

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Abstract:

Nous avons, pour la premiere fois, isole et caracterise les vesicules mantelees a partir d'algues marines: laminaria digitata et ulva lactuca representantes des algues brunes et des algues vertes respectivement. Les fractions enrichies en vesicules mantelees ont ete preparees par gradient discontinu de saccharose. Les polypeptides de 170-175 kda correspondent aux chaines lourdes de la clathrine de buf et un des polypeptides de 70 kda est semblable au composant de la clathrine de carotte. Tous ces polypeptides montrent une reponse positive a l'anticorps anticlathrine de buf obtenu chez la chevre ou chez le lapin. Chez u. Lactuca, la proportion de la clathrine varie pendant les etapes de croissance de la plante. Les images de microscopie electronique revelent une structure reguliere du manteau vesiculaire. L'analyse lipidique montre la presence des phospholipides dans les vm de ces algues. L'analyse des glucides montre une proportion elevee de galnac et glcnac dans les vm, alors qu'ils ne sont pas detectables dans les extraits totaux de ces algues. La composition chimique des vesicules mantelees, quantitativement specifique pour chaque type d'algue etudie, suggere l'implication des vesicules mantelees dans l'edification des parois cellulaires ainsi que dans le transport des glycoproteines et glycolipides vers les differentes membranes cellulaires

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Al-Qatabi, Noha. "Caractérisation de protéines atypiques à domaine BAR codées par Toxoplasma gondii." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur, 2024. http://www.theses.fr/2024COAZ6006.

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Abstract:

Toxoplasma gondii, l'agent pathogène causant la toxoplasmose, infecte et se réplique à l'intérieur de cellules hôtes grâce à sa capacité à sécréter des facteurs stockés dans des organites sécrétoires uniques (rhoptries, micronèmes, granules denses). Ces facteurs permettent au parasite de moduler le système immunitaire de l'hôte et d'en capturer certains éléments. La formation de ces organites uniques et les processus de sécrétion et de capture dépendent d'événements de trafic vésiculaire dont les bases moléculaires restent peu connues. Notamment, il n'existe pratiquement aucune caractérisation des protéines à domaine BAR, exprimées chez T. gondii et d'autres apicomplexes, malgré leur rôle connu dans le trafic vésiculaire chez d'autres eucaryotes. Ici, en combinant des analyses structurales avec des tests in vitro et des observations cellulaires, j'ai caractérisé TgREMIND (REgulators of Membrane INteracting Domains), protéine impliquée dans la génération des rhoptries et granules denses, ainsi que TgBAR2, localisée à la périphérie du parasite. J'ai établi que TgREMIND possède un domaine F-BAR pour cibler préférentiellement des membranes neutres et potentiellement les perturber. De plus, je montre que la protéine possède un nouveau type de domaine structural appelé REMIND, qui semble capable d'inhiber l'activité de TgREMIND. En parallèle, je montre que TgBAR2 contient un domaine BAR avec l'interface de liaison à la membrane la plus basique décrite pour ce type de domaine, capable de déformer puissamment des membranes anioniques pour former notamment des tubules micellaires. Ceci suggère que ce domaine représente un nouveau type de domaine BAR. Mes données suggèrent que T. gondii code pour des protéines atypiques à domaine BAR avec des propriétés de liaison membranaire très contrastées pour cibler des régions distinctes de son système de trafic vésiculaire
Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, infects and replicates within host cells through its ability to secrete factors stored in unique secretory organelles (rhoptries, micronemes, dense granules). These factors allow the parasite to modulate the host's immune system and capture certain elements. The formation of these unique organelles and the secretion and capture processes depend on trafficking events whose molecular bases remain poorly understood. Notably, there is virtually no characterization of BAR domain proteins, expressed in T. gondii and other apicomplexans, despite their known role in vesicular trafficking in other eukaryotes. Here, by combining structural analyses with in vitro tests and cellular observations, I characterized TgREMIND (REgulators of Membrane INter-acting Do-mains), a protein involved in the generation of rhoptries and dense granules, as well as TgBAR2, located at the periphery of the parasite. I established that TgREMIND has an F-BAR domain to preferentially target neutral membranes and potentially disrupt them. Additionally, I show that the protein has a new type of structural domain called REMIND, which appears capable of inhibiting TgREMIND activity. In parallel, I show that TgBAR2 contains a BAR domain with the most basic membrane-binding interface described for this type of domain, capable of powerfully deforming anionic membranes to form micellar tubules. This suggests that this domain represents a new type of BAR domain. My data indicate that T. gondii encodes two atypical BAR domain proteins with highly contrasting membrane binding properties to target distinct regions of its vesicular trafficking system

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Borghi, Nicolas. "Nanotubes membranaires : extrusion hydrodynamique." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066556.

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Kremer, Sébastien. "Extrusion de nanotubes membranaires : de la vésicule à la cellule vivante." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066066.

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Abstract:

Les tubes membranaires sont des structures rencontrées dans le monde vivant et notamment dans l'environnement cellulaire. L'extrusion artificielle de tubes représente un outil idéal pour sonder les propriétés de la membrane et ses interactions avec la matrice sous-jacente. Notre technique d'extrusion hydrodynamique a permis d'extraire des tubes membranaires à partir de vésicules géantes ou de cellules ancrées ponctuellement à une micro-pointe et soumises à un écoulement. On s'est intéressé tout d'abord à caractériser la dynamique d'extrusion de tubes extraits de vésicules rendues poreuses par l'action de la streptolysine O. La comparaison avec les dynamiques d'extrusions sur des vésicules classiques a permis de mieux définir le comportement singulier des vésicules poreuses. La multitude de pores présents au sein de la membrane des vésicules entraîne une perte de ses propriétés élastiques. D'autres expériences ont été menées sur des vésicules encapsulant un gel de Poly(Nipam), permettant ainsi de se rapprocher d'un système plus réaliste de la cellule. L'extrusion de tubes sur des vésicules décorées par un polyélectrolyte, le chitosane, a également été étudié. On a poursuivi notre étude sur une lignée de cellules endocrines, les cellules BON. Les relations entre la force et la vitesse d'extrusion obtenue expérimentalement ont été confrontées à notre modèle théorique. Plusieurs paramètres membranaires tels que la viscosité membranaire, l'énergie d'adhésion membrane-cytosquelette ont pu être estimés. Enfin, on s'est intéressé à étudier l'effet d'un apport massif de membrane, provoqué par le déclenchement volontaire de l'exocytose, sur la dynamique d'extrusion de tubes.

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Levy, Aurore. "Palmitoylation et trafic des protéines neuronales apparentées à la stathmine." Paris 6, 2010. http://www.theses.fr/2010PA066300.

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Abstract:

A travers leur capacité à réguler la dynamique des microtubules, les phosphoprotéines apparentées à la stathmine (les stathmines membranaires) tiennent des rôles spécifiques dans la formation et la maturation du système nerveux, en particulier la stathmine 2 (SCG10) dans la croissance axonale et la stathmine 3 (SCLIP) dans le branchement neuritique. L’ensemble de ces protéines est localisé au Golgi et à des vésicules qui sont accumulées au cône de croissance. La palmitoylation de deux cystéines conservées présentes dans leur domaine d’adressage N-terminal est responsable de cette localisation membranaire. Avec l’objectif de mieux comprendre l’interconnexion entre la localisation et les fonctions des stathmines membranaires, nous avons disséqué les mécanismes impliqués dans leur palmitoylation et leur trafic. Ainsi, nous avons montré, par des approches biochimiques et de biologie cellulaire sur des neurones en culture, que la palmitoylation des stathmines membranaires a lieu au Golgi et tient une place centrale dans leur localisation et leur trafic au sein des voies d’exocytose. Nous avons également identifié les enzymes (DHHC2, 3, 7, 15, et 21) potentiellement responsables de cette palmitoylation et montré qu’elles étaient capables de stabiliser l’ancrage membranaire préalablement établi probablement par liaisons électrostatiques. Ainsi, à travers son caractère réversible et régulable, la palmitoylation permet aux stathmines de cycler entre le cytosol et leurs membranes spécifiques en réponse à des signaux extracellulaires. Cette régulation permet le transport de leurs partenaires vers des lieux qui nécessitent une régulation de la dynamique des microtubules, notamment lors de la différenciation neuronale

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Gaudin, Marie. "Etude des vésicules membranaires produites par les Archées hyperthermophiles marines de l'ordre des Thermococcales." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00716699.

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Abstract:

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n'ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d'Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l'enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d'une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l'ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d'ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L'un d'eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d'adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l'apparition des virus.En plus d'être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces " thermococcines " nécessitent d'être caractérisées, il s'agit de la première mise en évidence d'une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales.

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Gaudin, Marie. "Etude des vésicules membranaires produites par les Archées hyperthermophiles marines de l’ordre des Thermococcales." Thesis, Paris 11, 2012. http://www.theses.fr/2012PA112093/document.

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Abstract:

La sécrétion de vésicules membranaires (VMs) constitue un processus physiologique important qui a particulièrement été étudié chez les Bactéries et les Eucaryotes. La récente découverte de la production de VMs chez les Archées souligne cependant que ce phénomène est universel et suggère que le dernier ancêtre commun aux trois domaines, LUCA (Last Universal Common Ancestor), produisait certainement des VMs. Les VMs des Archées n’ayant pour le moment été étudiées que chez certaines Crénarchées (ex : G/ Sulfolobus), nous avons entrepris de caractériser les VMs produites par un groupe d’Euryarchées hyperthermophiles anaérobies, les Thermococcales. Dans la première partie de cette étude, nous avons examiné le mécanisme de production ainsi que la composition en lipides et en protéines des VMs de trois espèces de Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans et Thermocococus sp. 5-4. Nous avons observé que les VMs sont sécrétées par un processus de bourgeonnement à partir de l’enveloppe cellulaire similaire à la formation des ectosomes par les cellules eucaryotes. De plus, les VMs sont fréquemment libérées en groupes, formant de grosses protubérances ou des filaments ressemblant aux nanopodes récemment décrits chez les Bactéries. Des différences de structure et de composition protéique sont observées entre les VMs des trois souches étudiées. Cependant, les VMs et les membranes cellulaires d’une même souche ont des compositions protéique et lipidique très proches, confirmant que les VMs sont produites à partir des membranes des cellules. Les VMs et les membranes cellulaires des trois souches comportent notamment un récepteur de peptides de la famille OppA (Oligopeptide-binding protein A) et des homologues de cette protéine ont été identifiés dans les VMs de certaines souches de Sulfolobus.Les VMs sécrétées par les Thermococcales sont associées à de l’ADN et cette association les protègent contre la thermodégradation. Nous montrons dans notre étude que les cellules de T. kodakaraensis transformées avec le plasmide navette plC70 relâchent des VMs comportant ce plasmide. De façon intéressante, ces VMs peuvent être utilisées pour transférer pLC70 à des cellules dénuées de plasmides, suggérant que les VMs pourraient être impliquées dans le transfert d’ADN entre cellules à haute température.Dans la seconde partie de cette étude, nous nous sommes particulièrement intéressés à la souche Thermococcus nautilus, une Thermococcale produisant des VMs associées de manière sélective à deux plasmides contenus dans la cellule. L’un d’eux correspond notamment à un génome viral défectueux de la lignée d’adenovirus PRD1. Ceci indique que les VMs peuvent être un moyen de transport pour des génomes viraux et suggère que la production de VMs par des cellules ancestrales pourraient avoir joué un rôle dans l’apparition des virus.En plus d’être impliquées dans le transport de plasmides/virus, les VMs produites par T. nautilus exercent un effet toxique sur certaines souches de Thermococcales, probablement dû au convoyage de toxines. Même si ces « thermococcines » nécessitent d’être caractérisées, il s’agit de la première mise en évidence d’une activité toxique liée aux VMs chez les Thermococcales
Secretion of membrane vesicles (MVs) is an important physiological process that has been extensively studied in Bacteria and Eukarya. The recent discovery that Archaea produce MVs shows that this process is universal and suggests that the Last Universal Common Ancestor, LUCA, certainly produced MVs. As these archaeal MVs have been only studied in some Crenarchaeota (ex: G/ Sulfolobus), we started characterizing MVs produced by Thermococcales, a group of hyperthermophilic anaerobic Euryarchaeota.In the first part of this study we examined the mechanism of production as well as the protein and lipid composition of MVs produced by three strains of Thermococcales: Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gammatolerans and Thermocococus sp. 5-4. We observed that MVs are released by a budding process from the cell envelope that is similar to ectosome formation in eukaryotic cells. Moreover, clusters of MVs often form filamentous structures and protuberances on cell surfaces, resembling recently described bacterial nanopods. Differences in structure are observable between MVs of the three species, as well as in their protein composition. However, MVs and cell membranes from the same species have a quite similar protein and lipid composition, confirming that MVs are produced from cell membranes. A major protein present in cell membranes and MVs from the three strains is the oligopeptide-binding proteins (OppA), which has homologues in MVs from Sulfolobus species. Thermococcales MVs harbor DNA and protect this DNA against thermodegradation. Here, we show that T. kodakaraensis cells transformed with the shuttle plasmid pLC70 release MVs harboring this plasmid. Interestingly, these MVs can be used to transfer pLC70 into plasmid-free cells, suggesting that MVs could be involved in DNA transfer between cells at high temperature. In the second part of this study, we were specially interested in the strain Thermococcus nautilus, a Thermococcale that produces MVs selectively enriched in two plasmids from the cell. Notably, one of them corresponds to the genome of a defective virus from PRD1-adenovirus lineage. This indicates that MVs can be used as vehicles for the transport of viral genomes and suggests that production of MVs by ancestral cells could have played a role in the origin of viruses.In addition to be involved in transport of plasmids/viruses, MVs from T. nautilus display a toxic effect on some strains of Thermococcales, maybe due to the delivery of toxins. Even if these “thermococcins” remain to be characterized, this is the first time that a toxic activity associated with MVs has been shown in Thermococcales

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Payet, Laurie-Anne. "Effets des acides gras saturés sur la voie de sécrétion. Relation avec la mucoviscidose." Thesis, Poitiers, 2013. http://www.theses.fr/2013POIT2299/document.

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Abstract:

Les acides gras saturés (AGS) altèrent la fonctionnalité des organites dans de nombreux types cellulaires. Il a été proposé que ce processus, également nommé lipointoxication, puisse être responsable de plusieurs pathologies humaines telles que le diabète de Type 2.Au niveau cellulaire, l'accumulation d'AGS est associée à une augmentation du taux de saturation des phospholipides (PL) membranaires, les composants majoritaires des membranes des organites, mais également du taux de céramides, impliqués dans l'induction de l'apoptose.Dans une première partie de ce travail, nous avons étudié, chez le modèle cellulaire simple Saccharomyces cerevisiae, la contribution relative des PL saturés et des céramides à la cytotoxicité des AGS. Nous avons pu démontrer que les céramides agissaient à des étapes précoces de la voie de sécrétion, alors que les PL saturés impactaient des étapes plus tardives en altérant en particulier la formation de vésicules de sécrétion.Parallèlement, nous avons également constaté que le taux d'AGS était significativement augmenté dans les PL membranaires des patients atteints d'une maladie génétique, la mucoviscidose. La mutation la plus fréquente responsable de cette maladie, résulte en la rétention de la protéine correspondante dans le réticulum endoplasmique. Des molécules pharmacologiques, capables de corriger le trafic de la protéine à sa destination finale ont été isolées in vitro, mais des limitations importantes ont pu être observées lors des tests cliniques. Nous proposons dans le présent manuscrit que la lipointoxication liée aux AGS pourrait être un écueil important à l'utilisation des correcteurs actuels pour le traitement de la mucoviscidose
Saturated fatty acids (SFA) have been reported to alter organelle integrity in many cell types. This process, also known as lipotoxicity, has been proposed to be responsible for several human pathologies such as type 2 diabetes.At the cellular level, SFA accumulation is associated with an increase of the saturation rate of membrane phospholipids (PL), the major components of organelle membranes, and an increase of ceramides levels, implicated in apoptosis induction.In the first part of this work, we took advantage of a simple yeast-based model to study the relative contributions of saturated PL and ceramides to SFA cytotoxicity. We demonstrated that ceramides act early in the secretory pathway, while saturated PL impact the later steps, and particularly the formation of secretory vesicles.In parallel, we observed that SFA amounts were significantly increased in the membrane PL of cystic fibrosis (CF) patient cells. The most common mutation responsible for this genetic disease results in the retention of the corresponding protein in the endoplasmic reticulum. Pharmacological agents, which correct the mistrafficking of the protein, have been isolated in vitro, but they did not show significant improvements in clinical trials. We propose in the present manuscript, that SFA-related lipointoxication could be an important bottleneck for the use of these pharmacological agents in clinical trials

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Cailler, Françoise. "Étude du trafic intracellulaire de protéines membranaires de la famille de la néprilysine." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1999. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk2/ftp02/NQ47601.pdf.

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CAILLER, FRANCOISE. "Etude du trafic intracellulaire de proteines membranaires de la famille de la neprilysine." Toulouse, INSA, 1999. http://www.theses.fr/1999ISAT0028.

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Abstract:

Nous avons construit diverses formes chimeriques de la neprilysine (e. C. 3. 4. 24. 11, endopeptidase neutre, nep) pour etudier les determinants moleculaires du ciblage entre le reseau trans-golgi et la surface cellulaire, dans les cellules de la lignee madin-darby canine kidney (mdck). Nous avons etudie l'effet de l'addition d'un glycosyl-phosphatidylinositol (gpi) sur l'incorporation des proteines dans les glycolipid rafts. Dans ce but, nous avons utilise la nep de type sauvage (wt-nep), une proteine membranaire de type ii, ainsi que la gpi-nep, constituee du domaine extracellulaire de la nep ancre a la membrane plasmique par un gpi en c-terminal, et la da-nep, qui contient une ancre gpi c-terminale en plus de l'ancre peptidique originale de la wt-nep. Nous avons pu montrer que seules la da-nep et la gpi-nep s'associent aux glycolipid rafts au niveau du golgi. Le signal porte par l'ancre gpi semble donc dominant sur celui present dans la wt-nep pour le choix d'une vesicule de transport entre le golgi et la membrane apicale des cellules mdck. La deuxieme partie de nos travaux concerne l'etude du mecanisme de retention intracellulaire de l'isoforme 1b de l'enzyme de conversion de l'endotheline (ece-1). Cette proteine membranaire existe sous trois isoformes (ece-1a, 1b, et 1c) qui different uniquement par la nature de leur domaine intracellulaire n-terminal. Seule l'ece-1b est intracellulaire. En observant la localisation intracellulaire d'une chimere comprenant les 17 acides amines n-terminaux de ece-1b fusionnes a la wt-nep, nous avons pu conclure que cette portion de l'ece-1b contient un signal de ciblage intracellulaire. La diminution du taux de retention intracellulaire subsequente a la mutation des residus leu 1 2 et leu 1 3 en ala dans la chimere ece/nep nous a permis d'identifier ces deux residus comme faisant partie de ce signal. Ces resultats suggerent qu'un signal de type di-leu serait responsable de la retention intracellulaire de l'ece-1b.

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Gortat, Anna. "Etude des propriétés moléculaires du domaine BAR et de leur implication sur la fonction des endophilines dans la dynamique des comportements intracellulaires." Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066074.

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Abstract:

Ce travail de thèse a été centré sur l’étude des propriétés fonctionnelles d’un domaine capable de déformer les membranes biologiques appelé domaine BAR (Bin/Amphiphysine/Rvs). Nous nous sommes essentiellement centré sur le rôle des propriétés moléculaires du domaine BAR d’une famille de protéines à domaine SH3 appelées endophilines. L’ensemble de ce travail de thèse aura principalement conduit à (1) montrer l’importance de la dimérisation des séquences BAR dans la fonction des endophilines A sur les membranes cibles, (2) identifier une nouvelle cible membranaire des endophilines, la mitochondrie, compartiment sur lequel elles exercent une action dans le contrôle de la morphologie et de la dynamique, dans des contextes physiologiques normaux et/ou pathologiques, (3) identifier les endophilines A2 et B1 comme les cibles (par modification post-traductionnelle dont la nature reste encore à déterminer) d’une nouvelle voie de signalisation entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique.

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Dilda, Pierre. "Caractérisation de CFTR dans des vésicules membranaires purifiées a partir d'épithélium de trachée bovine : approche pharmacologique." Paris 5, 1995. http://www.theses.fr/1994PA05CD08.

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Abstract:

CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) est le produit du gène impliqué dans la mucoviscidose. Lorsque ce gène est muté, CFTR contenu dans les membranes plasmiques des épithélia sécréteurs n'assure plus convenablement sa fonction de canal chlore sensible à l'AMP cyclique. Il en résulte tous les dysfonctionnement épithéliaux liés à la maladie. Dans le but de créer un outil biochimique afin de tester des effecteurs pharmacologiques de CFTR, nous avons utilisé l'épithélium de trachée bovine. Ce modèle animal est d'un grand intérêt puisqu'il existe une très grande homologie entre CFTR humain et bovin. A partir de ce tissu, disponible en grande quantité, nous avons purifié des vésicules membranaires d'origine apicale orientées à l'envers. Des études d'immunoempreintes nous ont permis de détecter CFTR mature (170 kDa) dans les vésicules membranaires apicales et de déterminer sa distribution au niveau de la membrane plasmique des cellules épithéliales de trachée bovine. Les mesures de flux de chlore radioactif dans ces vésicules, les immunoprécipitations suivies de phosphorylations ont démontrées que ce CFTR isolé est fonctionnel. La pharmacologie du canal chlore CFTR, que nous observons, confirme et complète les résultats antérieurs obtenus en électrophysiologie. Nous avons mis en évidence une forte activité ATPasique présente dans les vésicules membranaires apicales ne correspondent à aucune ATPase connue. Le parallélisme évident entre l'inhibition par une nouvelle molécule à la fois de la fonction canal de CFTR et l'activité ATPasique détectée est un nouvel argument en faveur d'une hydrolyse d'ATP par CFTR.

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Da, Costa Grégory. "RMN des petites vésicules unilamellaires lipidiques (SUV) : une approche adaptée à l'étude des interactions périphériques membranaires." Rennes 1, 2007. http://www.theses.fr/2007REN1B106.

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Abstract:

Les SUVs (Small Unilamellar Vesicles),petites vésicules formées d'une seule bicouche lipidique, constituent un modèle membranaire jusqu'à présent relativement peu utilisé en RMN du proton. Nous montrons, à partir de dérivés de porphyrines métallés ou non, diamagnétiques ou paramagnétiques, que la cinétique d'association-dissociation peut permettre d'annuler en moyenne les interactions anisotropes et d'obtenir des signaux fins pour les molécules associées. A partir de l'étude de systèmes SUVs-stérols, nous démontrons que la mobilité intrinsèque des molécules insérées dans la bicouche peut permettre de moyenner efficacement les interactions anisotropes. Ces résultats permettent de rationaliser les conditions de visibilité de molécules en interaction avec des SUVs et de déterminer les conditions nécessaires pour l'étude par RMN de médicaments, peptides et protéines en interaction périphérique avec les SUVs
SUV (Small Unilamellar Vesicles) are constituted of one lipidic bilayer. They have beeb so far only poorly used as model membrane for proton NMR studeis. Based on this work, on porphyrins, free of metallated, diamagnetic of paramgnetic, we show that the kinetic dissociation rate constant is able to cancel the anisotropic interactions, thus allowing the recording of sharp signal even for the molecule bound to the SUV. Using various sterol derivatives, we demonstrated the intinsic mobility of incorporated molecules is able to induce a good averaging of anisotropic interaction. Overall, these results have permit to rationalize the required conditions for recording NMR spectra of drugs, peptides in interaction with SUV

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Martin, Solenne. "La P-glycoprotéine : analyse des différents sites de liaison de ses substrats et de sa fonction de transport." Paris 11, 2006. http://www.theses.fr/2006PA112106.

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Coste, Virginie. "Formation de domaines de type "rafts" dans des vésicules unilamellaires et mécanismes physico-chimiques de l'extraction de domaines membranaires." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116250.

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Abstract:

Les membranes modèles représentent un outil indispensable pour l'étude des membranes biologiques, elles ont en effet grandement contribué à leur description. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l'étude de la coexistence de phases liquide-ordonnée (lo) et liquide-désordonnée (ld) au sein de membranes modèles de type LUV (« Large Unilamellar Vesicle »). Nous avons cherché en premier lieu à mettre au point une méthodologie permettant de détecter la formation de la phase lo et d'estimer quantitativement la fraction membranaire Φo en phase lo dans des LUVs de composition ternaire PC/SM/Chol (phosphatidylcholine / sphingomyéline / cholestérol), capable d'induire une coexistence de phase. Pour cela, les propriétés d'auto-extinction de fluorescence et de distribution sélective en fonction de la phase lipidique d'une sonde fluorescente unique (C12NBD-PC) ont été mises à profit. La deuxième partie de notre travail a été consacrée à l'étude de la solubilisation par le détergent Triton X-100 des membranes de LUVs présentant une coexistence de phase lo/ld. Nous avons cherché à démontrer qu'il était possible d'extraire la fraction membranaire se trouvant strictement en phase lo. Pour cela, les transitions de structure induites par l'interaction du Triton X-100 avec des LUVs à 4°C ont été étudiées par une procédure de séparation par gradient de densité. Nous avons tenté d'évaluer le rapport effectif approprié détergent/lipides nous permettant d'isoler les fractions résistantes correspondant aux domaines en phase lo existant au niveau de la membrane des LUVs avant l'addition de détergent.

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Coste, Virginie. "Formation de domaines de types "rafts" dans des vésicules unilamellaires et mécanismes physico-chimiques de l'extraction de domaines membranaires." Paris 6, 2006. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116250.

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Abstract:

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’étude de la coexistence de phases liquide-ordonnée (lo) et liquide-désordonnée (ld) au sein de membranes modèles de type LUV (« Large Unilamellar Vesicle »). Nous avons cherché en premier lieu à mettre au point une méthodologie permettant de détecter la formation de la phase lo et d’estimer quantitativement la fraction membranaire Φo en phase lo dans des LUVs de composition ternaire PC/SM/Chol (phosphatidylcholine/sphingomyéline/cholestérol). Pour cela, les propriétés d’auto-extinction de fluorescence et de distribution sélective en fonction de la phase lipidique d’une sonde fluorescente unique (C12NBD-PC) ont été mises à profit. La deuxième partie de notre travail a été consacrée à l’étude de la solubilisation par le détergent Triton X-100 des membranes de LUVs présentant une coexistence de phase lo/ld. Nous avons cherché à démontrer qu’il était possible d’extraire la fraction membranaire se trouvant strictement en phase lo par l’étude des transitions de structure induites par l’interaction du Triton X-100 avec des LUVs à 4°C
In this work, we have been interesting in the study of the liquid-ordered/liquid-disordered (lo/ld) phase coexistence within LUV (Large Unilamellar Vesicle) membranes model. First, we have attempted to develop a methodology both allowing the detection of lo phase formation and the quantitative estimation of membrane fraction Φo occupied by lo phase in LUV of ternary composition: PC/SM/Chol (phosphatidylcholine /sphingomyeline /cholesterol). For this purpose, the properties of fluorescence self-quenching and selective partitioning between lipid phases of a unique fluorescent probe (C12NBD-PC) were used. The second part of our work has been dedicated to the study of the solubilization of LUVs showing lo/ld phase coexistence by Triton X-100 detergent. Our aim was to demonstrate the possibility to extract strictly lo phase membrane fraction, by the study of structural transitions induced by Triton X-100 interactions with LUVs at 4°C

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Boeuf, Julien. "Caractérisation des GASP, une nouvelle famille de protéines impliquées dans le trafic intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2008. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2008/BOEUF_Julien_2008.pdf.

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Abstract:

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent une vaste famille de protéines située à la surface de la cellule et assurent la communication entre les cellules de notre organisme. Ce sont des cibles thérapeutiques privilégiées, mais leur stimulation prolongée conduit à des adaptations, en particulier le développement de la tolérance. La tolérance, qui peut se définir comme une baisse de l’efficacité d’un composé au cours du temps, est bien connue des cliniciens dans le cas de traitements prolongés de nombreuses pathologies avec des médicaments ayant pour cibles les RCPG. La compréhension des mécanismes impliqués dans ces phénomènes adaptatifs constitue ainsi un défi majeur qui pourrait conduire au développement de nouveau traitement visant à limiter la tolérance. C’est dans ce contexte que nous avons récemment identifié une nouvelle famille de protéines interagissant avec les RCPG. Cette famille, appelée GASP, aurait une fonction importante dans la dégradation des RCPG, phénomène considéré comme un élément clé du développement de la tolérance in vivo. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux régions des GASP et des RCPG cruciales pour l’interaction de ces deux types de protéines, identifiant ainsi un nouveau motif d’interaction protéine-protéine et développant un petit peptide capable d’inhiber cette interaction. Je me suis également intéressé à l’interaction de GASP-1 et -2 avec le récepteur muscarinique M1 à l’acétylcholine, et ses conséquences sur la dégradation de ce récepteur, montrant ainsi pour la première fois l’implication des GASP dans la régulation du trafic intracellulaire des RCPG à recyclage rapide. Finalement, j’ai exploré le rôle physiologique de GASP-1 à l’aide d’un modèle animal déficient en cette protéine. Dans un premier temps, les mécanismes adaptatifs, comportementaux et biochimiques, liés à la consommation de cocaïne ont été étudiés, montrant une diminution de l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne chez les animaux mutants. Ces animaux présentent également une difficulté à acquérir un comportement d’autoadministration de la cocaïne qui s’accompagne d’une baisse de la densité en récepteurs dopaminergiques et muscariniques dans le striatum. Dans un deuxième temps, la régulation des rythmes circadiens a été étudiée et bien qu’aucune différence en terme de régulation du rythme de veille-éveil n’ait été décelée entre les animaux sauvages et mutants, une interaction entre les GASP et les protéines horloges Period conduisant à la modification de leur profil de localisation subcellulaire a pu être mise en évidence
G protein-coupled receptors (GPCRs), one of the most important family of proteins, are distributed at the plasma membrane and are implicated in cell communication. They represent major targets for pharmaceutical drugs and their function is tightly regulated. Recently, we identified a novel family of proteins interacting with GPCRs. This family, called GASP, could have an important function in the proteolysis of the GPCRs, which is considered as a key feature of the regulation of GPCR activity. My PhD work focused on the domains of GASPs and GPCRs that are critical for the interaction between these two kinds of proteins, identifying a novel protein-protein interaction motif and designing and developing a small peptide capable of preventing this interaction. I also focused on the interaction between GASP-1 and -2 and the acetylcholine muscarinic M1 receptor, and the consequences of this interaction on the proteolysis of this receptor, showing for the first time the implication of GASPs in the intracellular trafficking of fast recycling GPCR. Finally, I studied the physiological role of GASP-1 using transgenic animals deficient in this protein. These mice showed notably alteration in behavioral and biochemical adaptive mechanisms related to acute and prolonged administration of cocaine. The regulation of the circadian rhythms was also assessed. Despite the lack of difference in terms of sleep-activity rhythm between wild-type and mutant mice, an interaction between the GASPs and the PER clock proteins, that leads to the modification of their subcellular distribution, was observed

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Boeuf, Julien Simonin Frédéric. "Caractérisation des GASP, une nouvelle famille de protéines impliquées dans le trafic intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G." Strasbourg : Université Louis Pasteur, 2008. http://eprints-scd-ulp.u-strasbg.fr:8080/989/01/BOEUF_Julien_2008.pdf.

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Perbet, Romain. "Rôle des vésicules extracellulaires dans la propagation de la protéine Tau." Thesis, Lille 2, 2020. http://www.theses.fr/2020LIL2S023.

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Abstract:

L’agrégation de tau intra-neuronale est une caractéristique commune d’un groupe hétérogène de maladies neurodégénératives appelées tauopathies. Dans certaines d’entre elles, la pathologie affecte une région cérébrale avant de se propager à d’autres régions.Cette évolution stéréotypée dans le temps et dans l’espace est probablement liée à une propagation de type prion d’espèces de tau ayant des propriétés de recrutement. Ces espèces pathologiques de tau identifiées dans le liquide interstitiel cérébral (ISF) de souris transgéniques et dans le liquide céphalorachidien humain (LCR) peuvent être internalisées par des cellules et induire une agrégation intracellulaire de tau (Takeda et al., 2016). Ces espèces pathologiques sont encore mal caractérisées mais plusieurs mécanismes potentiellement impliqués dans leur propagation ont été démontrés. Parmi eux nous avons démontré que tau est sécrétée dans les vésicules extracellulaires (EV) (Dujardin et al., 2014).Dans ce contexte nous avons voulu : 1/ vérifier l’hypothèse selon laquelle la protéine Tau pathologique est présente dans les VE extraites de tissus de patients atteints de différentes Tauopathies et que ces dernières peuvent induire de la pathologie chez l’animal. 2/ détecter des espèces pathologiques de Tau dans les VE contenues dans le plasma et le LCR, potentiels biomarqueurs de Tauopathies. 3/déterminer si de la protéine Tau peut être transférée d’un neurone à un astrocyte et dans le cas échéant, de déterminer la/les voies de transfert.Afin de tester la présence de tau avec potentiel de recrutement dans les EV extraites d’ISF de patients atteints de tauopathie set de souris transgéniques nous avons utilisé un biosenseur biologique sensible et spécifique. Nos résultats démontrent que des EV extraites d’ISF de patients atteints de maladie d’Alzheimer, de paralysie supranucléaire progressive (PSP) et de souris Tau30 contiennent de la tau pro-nucléantes. Ces capacités de recrutement sont corrélées à la sévérité de la pathologie pour la MA (préfrontal>occipital>cervelet) et induisent de la pathologie chez la souris transgénique. La présence de tau dans ces VE supporte l’idée que les EV pourraient avoir un rôle dans la propagation de tau.Nous avons également démontré par différentes approches in-vitro que la protéine Tau peut être transférée de neurone à astrocyte. Ce transfert se fait principalement par les vésicules extracellulaires
Intra-neuronal accumulation of tau protein aggregates is one of the common feature of a group of heterogeneous neurodegenerative diseases called tauopathies. In some of them, the pathology will first affect a region before spreading to other regions.This staging could be linked to the prion-like propagation of pathological seed-competent tau species. These seeds, identified in transgenic mice interstitial fluid (ISF) and in human cerebrospinal fluid (CSF) are uptaken by cells and induce subsequent intracellular tau aggregation (Takeda et al., 2016). The pathological species of tau which are spreading are not yet well characterized but several mechanisms mediating their transfer (secretion and capture) have been highlighted. Among them, we demonstrated that tau is secreted in extracellular vesicles (EV´s) (Dujardin et al., 2014). We also know that neurons are implicated in this transfer but the role of glial cells is unknown.In this context, we wanted to: 1 / demonstrate that pathological Tau protein is present in EVs extracted from brain of patients suffering from different Tauopathy and that those EVS induce pathology in animals. 2 / detect pathological Tau species in EVs extracted from plasma and CSF, potential biomarkers of Tauopathies. 3 / demonstrate that Tau protein can be transferred from neuron to astrocyte and, if so, to determine the transfer pathway.To test the seeding potential of EV’s containing in ISF derived from human brain of patient presenting tauopathies, and Tau 30 mouse brain we have used a sensitive and specific tau biosensor assay. Our results demonstrate that EVs isolated from ISF of AD patient, PSP patient and Tau 30 mouse contain seed prion-like properties. The ability of these seeds to recruit tau seems to be correlated to the severity of tau pathology (prefrontal>occipital>cerebellum) for AD. This might reflect the slight presence of neurofibrillary degeneration as well as extracellular tau in this pathology in comparison to AD. Finally, the presence of seeds-containing EV’s in the extracellular space supports the idea that these shuttles might be implied in the prion-like propagation of tau pathology in Humans. Additionally, tau pathology spreading is driven by EV’s rather than by free-floating tau species.We also demonstrated that tau can be transferred from neuron to astrocyte; this transfer is more efficient with EV’s than with free floating tau.These data open new avenues for therapeutic interventions that might targets the toxic and propagative species

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Gerbeaud, Claire. "Effet de l'insertion de protéines et de peptides membranaires sur les propriétés mécaniques et les changements morphologiques de vésicules géantes." Bordeaux 1, 1998. http://www.theses.fr/1998BOR10649.

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Abstract:

Certains processus cellulaires sont gouvernés par les propriétés mécaniques intrinsèques des membranes biologiques. L'une d'elles, l'élasticité de courbure, peut être mesurée sur des membranes modèles par analyse des fluctuations thermiques de vésicules géantes. Dans un premier temps, on étudie l'influence du cholestérol sur l'évolution du module d'élasticité de courbure, kc, de membranes lipidiques. La dépendance de kc avec la nature, la concentration et le mode d'insertion de divers peptides et protéines membranaires est ensuite démontrée. Finalement, l'élaboration d'un montage de micromanipulation sous microscope de vésicules géantes a permis d'étudier les perturbations morphologiques induites par l'action d'un peptide lytique, la mélittine.

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De, rezende rodovalho Vinicius. "Caractérisation du contenu protéomique et des propriétés immunomodulatrices des vésicules extracellulaires secrétées par la bactérie probiotique Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA129." Thesis, Rennes, Agrocampus Ouest, 2021. http://www.theses.fr/2021NSARI082.

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Abstract:

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanoparticules sphériques impliquées dans la communication intercellulaire et l'échange de molécules, telles que les protéines. Plusieurs organismes produisent des VEs, y compris les bactéries probiotiques. Propionibacterium freudenreichii est une bactérie à Gram positif qui a émergé comme probiotique en raison de propriëtës bënëfiques comme l'immunomodulation. Certaines de ces ont été attribuées à des facteurs exposés à la surface ou sécrétés par la bactérie. Par conséquent, nous avons cherché à savoir si P. freudenreichii produisait des VEs qui pourraient médier ses propriétés bénéfiques. La bactérie a été cultivée dans un milieu ultrafiltrat de lait ou extrait de levure-lactate,et les surnageants de culture concentrés ont ensuite été purifiés par chromatographie d'exclusion de taille ou ultracentrifugation en gradient de et densité. Des nanoparticules sphériques ont été obtenues, confirmant la production de VEs. L'analyse du contenu protéique des VEs et de l’interactomique a indiqué des rôles immunomodulateurs potentiels, qui ont été confirmés par des modèles cellulaires en mesurant la libération d'IL-8 et l’activité du facteur NF-xB. De plus, les propriétés et l’acti\lité propriétés des VEs variaient selon le milieu de culture et la méthode de purification. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à la compréhension des mécanismes de l’effet probiotique chez P. freudenreichii et montrent le potentiel de développement de nouveaux systèmes de livraison nanotechnologiques, avec un impact potentiellement important en santé humaine
Extracellular vesicles (EVs) are spherical nanoparticles involved in the intercellular exchange of molecules, such as proteins. Several organisms produce EVs, including probiotic bacteria. Propionibacterium freudenreichii is a Gram-positive bacterium that emerged as a probiotic due to notable beneficial properties, including immunomodulation. Some of these properties have been attributed to factors exposed on the surface or secreted by the bacterium. Therefore, we investigated wether P. freudenreichii produced EVs that could mediate its beneficial properties. The bacteria were cultured in milk ultrafiltrate or yeast extract-lactate medium,and the concentrated culture supernatants were then purified by size exclusion chromatography or density gradient ultracentrifugation. Spherical nanoparticles were obtained, confirming the production of EVs by the bacterium. Analysis of the EVs protein content and interactomics indicated potential immunomodulatory roles, which was confirmed by cell culture assays measuring IL-8 release and NF-KB activity. Additionally, the properties and activity of EVs varied depending on the culture medium and the purification method. Overall, these results contribute to the understanding of the mechanisms of the probiotic effect in P. freudenreichii and show the potential for the development of novel nanotechnological delivery systems, with a potentially significant impact on human health

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Jemaiel, Aymen. "Etude du trafic membranaire vésiculaire et non-vésiculaire chez la levure." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112348/document.

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Abstract:

Les cellules eucaryotes sont caractérisées par le cloisonnement des organelles par des membranes. La communication entre les différents compartiments cellulaires est assurée par deux voies de transport : le transport vésiculaire et transport non-vésiculaire. Le transport vésiculaire permet à la fois le trafic des protéines et des lipides d'un compartiment à un autre, alors que le transport non-vésiculaire permet uniquement le trafic des lipides. En effet, les lipides jouent un rôle essentiel dans l'organisation cellulaire. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au rôle des lipides dans le trafic intracellulaire, en utilisant la levure comme organisme modèle. Dans une première partie de ma thèse, j'ai étudié les hélices amphipathiques qui permettent le ciblage des protéines vers des compartiments cellulaires spécifiques. Dans une étude précédente, réalisé au laboratoire a montré que ces hélices amphipathiques interagissaient directement avec les lipides membranaires, ce qui permet un adressage spécifique des protéines en fonction des environnements lipidiques dans la cellule. Deux hélices amphipatiques ont fait l’objet de cette étude : le motif ALPS qui cible les vésicules de la voie sécrétoire précoce, et alpha-synucléine qui reconnaît et fixe les vésicules du compartiment trans-Golgi-membrane plasmique. Dans cette première partie de la thèse j’ai cherché à identifier des motifs similaires à celui d’alpha-synucléine dans les protéines de levure, et de déterminer leurs rôles dans la cellule. Dans une seconde partie de ma thèse, en collaboration avec le laboratoire du Dr Thierry Galli, j'ai étudié de nouveaux composants impliqués dans le métabolisme lipidique aux sites de contact entre le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Les sites de contact membranaires sont des régions de proches appositions (de l'ordre de 10 à 30 nm) entre deux membranes, généralement entre la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et une autre organelle. Ce sont principalement des sites de transfert des lipides et d'ions. Maja Petkovic dans le laboratoire de Thierry Galli a fait la découverte que la protéine SNARE du RE, Sec22, interagit avec une syntaxine (Stx1) de la membrane plasmique dans les neurones, ce qui permet un nouveau mécanisme de contact entre ces deux membranes. J’ai donc essayé de voir si ce mécanisme est conservé chez la levure. Les résultats que j'ai obtenus ont confirmé que la levure Sec22 est capable d'interagir avec une protéine SNARE SSO1 localisée à la membrane plasmatique et homologue de Stx1. J'ai trouvé par co-immunoprecipitation que Sec22 et SSO1 deux interagissent avec les protéines de transfert des lipides localisées aux sites de contact. L'utilisation d'une sonde spécifique au Phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P), nous a permis de montrer que Sec22 est impliquée dans la régulation du niveau de PI4P à la membrane plasmique. Pour disséquer les deux fonctions de Sec22, dans la voie sécrétoire et aux sites de contact, nous avons utilisé l'approche des suppresseurs multicopies dans la levure. Parmi les suppresseurs identifiés, nous avons trouvé le Sfh1, une protéine qui a un rôle potentiel dans le transfert des lipides. Ces résultats confirment bien ceux obtenus par l’équipe de Thierry Galli, montrant que Sec22 a un nouveau rôle aux sites de contact entre le RE et la membrane plasmique et suggèrent que ce complexe SNARE pourrait être impliqué dans transfert de lipides chez la levure
Eukaryotic cells are characterized by their internal membrane compartmentalization, with the various specialized organelles of the cell bounded by lipid membranes. Communication between different cellular compartments occurs via two transport pathways: vesicular transport and non-vesicular transport. Vesicular transport carries both proteins and lipids from one compartment to another in cells, whereas non-vesicular transport carries only lipids. An emerging idea is the important role that lipids play in cellular organization. Lipid binding amphipathic helices such as the ALPS (amphipathic lipid packing sensor) motif are targeted to membranes of a specific lipid composition, and hence act to transfer information encoded in membrane lipids to the vesicle trafficking machinery. The lipid composition of the membranes of different organelles is therefore of great importance. One mechanism that cells use to maintain the distinct lipid compositions of organelles is lipid transport, which occurs preferentially at membrane contact sites (MCS). MCS are regions of close appositions, on the order of 10 to 30 nm, between two membranes, generally between the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) and another organelle. In my thesis, I addressed two aspects of how lipids and their transport function in intracellular trafficking, using yeast as a model system. First, I studied amphipathic motifs that mediate targeting of proteins to specific compartments in cells. Lipid binding amphipathic helices were shown in a previous study in the laboratory to mediate specific targeting to distinct lipid environments via direct protein-lipid interactions, both in vitro and in cells. One of these, the ALPS motif, targets vesicles of the early secretory pathway. The other, alpha-synuclein, targets vesicles travelling between the late Golgi, the plasma membrane and endosomes. I studied new potential alpha-synuclein-like motifs in yeast proteins, and their roles in cells. In a second project, in collaboration with the laboratory of Dr. Thierry Galli, I studied new compenents involved in lipid metabolism at contact sites between the endoplasmic reticulum and the plasma membrane. Maja Petkovic in the laboratory of Thierry Galli made the important discovery that the ER-localized SNARE protein Sec22 interacts with a plasma membrane syntaxin in neurons, thus providing a novel mechanism for mediating close contact between these two membranes. I addressed the question of whether this mechanism is conserved in yeast. The results I obtained confirmed that yeast Sec22 is able to interact with a SNARE protein localized to the plasma membrane, Sso1. I found by co-immunoprecitation that Sec22 and Sso1 both interact with lipid transfer proteins localized to ER-plasma membrane contact sites. Using a specific probe for phosphatidylinositol-4 phosphate (PI4P), we showed that Sec22 was involved in regulating the level of PI4P at the plasma membrane. These results extend to yeast those obtained by Maja Petkovic, Thierry Galli and colleauges showing that Sec22 has a novel role at ER-plasma membrane contact sites, and suggest that this SNARE complex might be implicated in lipid transfer at these sites in yeast

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Lenoir, Sophie. "Trafic neuronal de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA)." Thesis, Normandie, 2018. http://www.theses.fr/2018NORMC409/document.

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Abstract:

L’activateur tissulaire du plasminogène est une sérine protéase initialement découverte dans le compartiment vasculaire et qui joue un rôle prépondérant dans le processus de fibrinolyse. De manière intéressante, le tPA est également présent dans le parenchyme cérébral, où il est notamment exprimé par les neurones. Le tPA est impliqué dans de nombreuses fonctions cérébrales dont la plasticité synaptique, les processus de mémoire et d’apprentissage ainsi que dans la survie et la mort neuronales. Le tPA est capable d’augmenter la signalisation calcique induite par une activation des récepteurs N-Méthyl-D-Aspartate (NMDAR) : un mécanisme à la base de la plasticité synaptique mais également de la mort neuronale excitotoxique. Cependant, il peut également activer les récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR) pour induire un effet anti-apoptotique sur les neurones. Afin de mieux comprendre les différentes fonctions du tPA sur les neurones, nous nous sommes intéressés à la distribution et au trafic intracellulaire du tPA. Pour cela, nous avons créé un nouvel outil afin d’imager le tPA dans les neurones en temps réel: un plasmide codant pour une protéine fusion, le tPA-HaloTag®.Premièrement, nos résultats montrent que le tPA est présent dans les axones et les dendrites des neurones corticaux matures en culture et qu’il est majoritairement présent dans le compartiment post-synaptique. Cette étude a également permis de voir que le tPA est stocké et libéré par des vésicules d’exocytose VAMP2, qu’il peut être endocyté par des vésicules Rab5, recyclé par des vésicules Rab11 et dégradé par des vésicules Rab7. Deuxièmement, nous avons montré que le tPA est présent dans les mêmes vésicules synaptiques que le facteur neurotrophique issu du cerveau (BDNF) : une neurotrophine importante pour le bon fonctionnement cérébral et dont la maturation dépend de l’activité protéolytique du tPA. Ce travail fournit une meilleure compréhension du rôle et de la distribution du tPA dans les neurones et ouvre de nouvelles voies de recherche dans l’implication de du tPA et du BDNF dans la survie neuronale
Tissue-type Plasminogen Activator (tPA) is a serine protease, firstly discovered for its fibrinolytic role in the vascular compartment. Interestingly, tPA is also present in the brain parenchyma, being notably expressed by neurons. tPA displays important roles in synaptic plasticity(Danny Baranes et al., 1998; Melchor and Strickland, 2006), learning, memory processes(R Madani et al., 1999; R Pawlak et al., 2002), neuronal survival and death. tPA is able to promote N-Methyl-D-Aspartate Receptors (NMDAR)-induced calcium influx, promoting synaptic plasticity or excitotoxic neuronal death. tPA is also able to activate Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR), a mechanism mediating its anti-apoptotic effect. To better understand the different functions of tPA on neurons, we studied the pattern of distribution and trafficking of neuronal tPA. For that, we designed a new tool to image tPA in living neurons: a plasmid encoding for a tPA-HaloTag® fusion protein. We first found that tPA is present in both axons and dendrites of mature cultured cortical neurons and preferentially at the post-synaptic part. Our results also showed that tPA is stored and released by VAMP2 exocytotic vesicles, and can be endocytosed by Rab5 vesicles, recycled by Rab11 vesicles and degraded by Rab7 vesicles. Furthermore, tPA is localized and sorted in the same vesicles than Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), one of the most important neurotrophins, Interestingly, BDNF maturation is dependent of tPA proteolytic activity. This work provides a better understanding of the role and distribution of tPA in living neurons and opens new avenues into the involvement of tPA and BDNF in neuronal survival

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Habib, Lamice. "Étude des propriétés membranaires des vésicules lipidiques incorporant des triterpènes oxygénés bioactifs d'origine végétale : application à la cucurbitacine E et à l'érythrodiol." Thesis, Lyon 1, 2014. http://www.theses.fr/2014LYO10022/document.

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Abstract:

La cucurbitacine E et l'érythrodiol sont des triterpènes naturels oxygénés ayant respectivement un squelette tétra et pentacyclique. Ils sont reconnus pour leurs diverses propriétés biologiques. Dans ce travail de thèse, nous étudions leur interaction avec les membranes des vésicules lipidiques dans le but de mieux comprendre leur pharmacodynamie. Nous avons préparé des liposomes en absence et en présence de la cucurbitacine E et de l'érythrodiol par les techniques d'évaporation en phase inverse suivie d'une extrusion, d'hydratation du film lipidique et d'injection d'éthanol. Les caractéristiques physicochimiques des vésicules lipidiques incorporant ou non la molécule triterpénique ont été étudiées par des techniques adéquates. Les analyses de la cucurbitacine E et de l'érythrodiol par la chromatographie liquide à haute performance ont montré que leurs taux d'incorporation dans les liposomes sont élevés. Les mesures de taille obtenues par la diffusion dynamique de la lumière ont démontré que les liposomes incorporant les triterpènes présentent une taille moyenne inférieure à celle des liposomes témoins. Les images obtenues par la microscopie électronique à transmission ont confirmé la formation de vésicules sphériques. Les mesures des dimensions des vésicules observées par la microscopie à force atomique (AFM), ont révélé que les liposomes incorporant la cucurbitacine E sont plus hauts et résistent mieux à la force exercée par la pointe AFM que les liposomes témoins. Par ailleurs, les liposomes incorporant l'érythrodiol sont plus fragiles que les liposomes témoins et ont tendance à éclater en bicouches lipidiques à la surface du support. Les courbes thermiques obtenues par la calorimétrie différentielle à balayage ont permis de conclure que la cucurbitacine E est localisée à l'interface polaire-apolaire de la membrane liposomiale alors que l'érythrodiol s'insère entre les chaînes acyles des phospholipides et aboutit à la formation des domaines hétérogènes au niveau de la membrane. La cinétique de libération de la sulforhodamine B, mesurée par la spectroscopie de fluorescence, a révélé que la membrane liposomiale devient, en présence de la cucurbitacine E, plus perméable à la sulforhodamine B incorporée dans la phase aqueuse interne. L'ensemble des résultats suggère que la cucurbitacine E et l'érythrodiol interagissent avec la membrane lipidique et affectent ses propriétés physico-chimiques. Leur effet sur la membrane ne semble pas être similaire. Des études ultérieures impliquant d'autres triterpènes sont envisagées pour identifier le (s) motif (s) structural (aux) et les paramètres physico-chimiques régissant leur interaction et localisation membranaire
Cucurbitacin E and erythrodiol are natural oxygenated triterpenes having respectively, a tetra and pentacyclic skeleton. They are known for their numerous biological properties. In this thesis, we studied their interaction with the membranes of lipid vesicles to better understand their pharmacodynamics. We have prepared liposomes in the absence and presence of cucurbitacin E and erythrodiol using the reverse phase evaporation technique followed by extrusion, the hydration of lipid film and the ethanol injection techniques. The physicochemical characteristics of lipid vesicles incorporating or not the triterpenic molecules were investigated by appropriate techniques. The determination of cucurbitacin E and erythrodiol in the vesicles by high performance liquid chromatography showed high incorporation efficiencies of both triterpenes. Size measurements obtained by dynamic light scattering showed that liposomes incorporating triterpenes were smaller than empty liposomes. The images obtained by transmission electron microscopy confirmed the formation of spherical vesicles. Measurements of vesicles dimensions by atomic force microscopy (AFM) demonstrated that liposomes incorporating cucurbitacin E were higher and more resistant to the force exerted by the AFM tip than the blank liposomes. Liposomes incorporating erythrodiol were more fragile and tend to break up into lipid bilayers on the mica surface. Results obtained by differential scanning calorimetry suggested that cucurbitacin E is localized at the polar-apolar interface of the liposomal membrane while erythrodiol is inserted between the acyl chains of the phospholipids leading to the formation of heterogeneous lipid domains. The release kinetics of the sulforhodamin B encapsulated into the aqueous phase and measured by fluorescence spectroscopy revealed that the liposomal membrane becomes in the presence of cucurbitacin E, more permeable to this probe. The overall results suggest that cucurbitacin E and erythrodiol affect differently

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Morvan, Joëlle. "Rôle de l' ubiquitine et des lipides dans le tri des protéines membranaires au cours de leur trafic intracellulaire chez Saccharomyces cerevisiae." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066338.

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Youssefian, Tayebeh. "Trafic intracellulaire dans la lignée mégacaryocyto-plaquettaire : biogenèse des granules denses et interaction avec le virus de l'immunodéficience humaine." Paris 11, 2000. http://www.theses.fr/2000PA11T041.

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Perrot, Nahuel. "Production dans Escherichia coli de vésicules enrichies en cavéoline-1(32-178) canine ou son fragment (76-178)." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLS067.

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Abstract:

La cavéoline-1, une petite protéine membranaire de 21 kDa, est la protéinemembranaire majoritaire d'invaginations de la membrane cytoplasmique appeléescavéoles. Enrichis en cholestérol et sphingolipides, ces domaines ont un rôleimportant dans de nombreux aspects de la vie cellulaire et constituent une véritableplateforme d'interactions protéiques et lipidiques. Ces dernières années, malgré lenombre important de travaux concluant à l'implication de la cavéoline-1, ou descavéoles, dans de nombreux processus cellulaires ou pathologiques, les donnéesquant à l'organisation de cette protéine au sein de la membrane plasmique restent trèséparses. Aussi, l'objectif principal de ce travail est de contribuer à l'acquisition dedonnées structurales sur cette protéine. Ce travail se base sur les expressionshétérologues d'une isoforme de la cavéoline-1 canineou de l'un de ses fragments, dans un hôte bactérien, sous la forme de protéines defusion associées à la Maltose Binding Protein. Ces expressions induisent laformation de vésicules intracytosoliques composées majoritairement de la protéineexprimée. Aussi, la première partie du travail est consacré à la mise en place d'unprotocole de purification de ces vésicules dans des conditions natives, répondant aucritère de réaliser une étude structurale de cette protéine n'impliquant pas l'usage dedétergent. La deuxième partie porte sur une application potentielle de ces vésicules, eten particulier pour des essais de caractérisation d'une enzyme membranaire,la glutathion-S-transférase microsomale de rat. Enfin une troisième partie est dédiée àl'analyse de simulations de dynamique moléculaire dans le cadre d'étudesd'interactions au sein de systèmes membranaires
Caveolin-1, a 21 kDa membrane protein, is the principal membrane protein ofcytoplasmic membrane domains named caveolae. Specifically enriched incholesterol and sphingolipids those domains are important in many aspect of the cell's life and make up a proteins and lipids interaction platform. In the past years, despite a large number of publications stating the implication of caveolin-1 or caveolae in many cell processes and pathologies, very few is known about theway this protein is organized at the cell membrane. Hence, the main purpose of thiswork is to contribute to the acquisition of structural data on this protein. At the base of this work is the heterologous expression within a bacterial host, and as a fusion protein, of the canin beta isoform of cavéolin-1 or one of its fragment. These expressions lead to the formation of cytoplasmic vesicles composed mainly ofthe expressed protein. Thence, the first part of this work focus on developping a method to purify those vesicles that does not rely on using any kind of detergent which could enable structural studies in a native environnment. The second part present a potentiel application of those vesicles and inparticular the use of those vesicles to characterize a membrane enzyme, namelythe murin microsomal glutathion-Stransferase. The last part will be a contribution to data analysis within the context of molecular dynamics simulationof membraneous systems

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Ruffiot, Pauline. "Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii : intéractions des protéines de granules denses (protéines GRA) avec des vésicules unilamellaires." Phd thesis, Grenoble 1, 2007. http://www.theses.fr/2007GRE10104.

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Abstract:

Les protéines GRA sont sécrétées par le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii dans la vacuole parasitophore, où elles interagissent pour la plupart avec deux systèmes de membranes tubulaires: les tubules séquestrant des organites de l'hôte (HaSTs) et le réseau de nanotubes membranaires (RNM). Bien que la plupart des protéines GRA contiennent des domaines transmembranaires potentiels, elles sont sécrétées sous des formes solubles et ne s'associent à des membranes qu'une fois qu'elles ont atteint leurs membranes-cibles dans la vacuole. Cette propriété inhabituelle nous a amenés à les considérer comme des modèles intéressants pour l'étude d'interactions protéine-membrane. J'ai développé deux approches expérimentales pour étudier les interactions des protéines GRA, extraites du parasite ou de la vacuole, avec des membranesmodèles. Premièrement, des approches biochimiques m'ont amenée à caractériser les formes de solubilisation des protéines GRA et leur association avec les membranes des petites vésicules unilamellaires (SUVs). Deuxièmement, j'ai développé une approche par spectroscopie de fluorescence, de protéines GRA associées aux membranes de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Les résultats fournissent des éléments de réponse qui (1) aident à décrypter le trafic des protéines dans le parasite et dans la vacuole et (2) ouvrent la voie pour la mise en place d'un système in vitro pour l'étude de la maturation de la vacuole parasitophore et de ses membranes tubulaires internes
GRA proteins are secreted by the intracellular parasite Toxoplasma gondii into the parasitophorous vacuole, where most of them interact with two systems of tubular membranes: the Host Organelle Sequestering Tubules (HaSTs) and the Membrane Nanotubules Network (RNM). Although most of the GRA proteins contain potential transmembrane domains, they are secreted as soluble forms and become membrane-associated only when they reach their target membranes. This unusual property led to consider them as attractive models of protein-membrane interactions. 1 developed two experimental approaches to study the interactions of GRA proteins, extracted trom the parasite or trom the vacuole, with model membranes. Firstly, biochemical approaches using Small Unilamellar Vesic1es (SUVs) led to characterize the solubilisation forms of GRA proteins and their association with SUVs membranes. Secondly, 1 developed a Giant Unilamellar Vesic1es (GUVs) model to study the interactions of GRA proteins with membranes by fluorescence spectroscopy methods. The results provide elements 1) which help to decipher the traffic of GRA proteins within the parasite and the PV, and 2) which open the way to set up an in vitro minimal system to study the building up of the parasitophorous vacuole and of its associated tubular membranes

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Fagla-Amoussou, Akouavi Balbine. "Etude des interactions polluants aromatiques polycycliques (HAP)-récepteurs adrénergiques-phospholipides membranaires dans le tissu adipeux." Thesis, Vandoeuvre-les-Nancy, INPL, 2010. http://www.theses.fr/2010INPL080N/document.

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Abstract:

L'obésité est une maladie définie par une accumulation de masse grasse dans le tissu adipeux ayant des conséquences néfastes pour la santé. Les causes de l’obésité sont multiples. Dans un travail récent, il y a été démontré le rôle de la pollution environnementale dans la prise de poids. Dans ce travail, les hypothèses selon lesquelles les récepteurs adrénergiques situés à la surface des cellules adipeuses seraient le siège de l’action des polluants aromatiques polycycliques ont été vérifiées par le dosage de plusieurs agonistes et antagonistes spécifiques et non spécifiques en présence ou non du benzo[a]pyrène sur des récepteurs humains et de cellules d’hamster chinois (CHO). Les quantités d’AMPc obtenues montrent que les HAP ne se déposent pas sur les récepteurs β1, β2, β3 adrénergiques.Cette accumulation se fait au niveau des phospholipides de la membrane cytoplasmique des cellules. Ce qui cause une rigidité des membranes.Cette observation tend à renforcer l'hypothèse selon laquelle le benzo[a]pyrène induirait une inhibition de la lipolyse par l'accumulation au niveau de la bicouche de phospholipides et des changements de conformation de la bicouche de phospholipides dans les environs des récepteurs à sept domaines transmembranaires qui sont β-adrénergiques.La liaison de la bicouche phospholipidique avec les HAP utilisés est une réaction exothermi-que avec un faible dégagement de chaleur
Obesity is a disease defined by an accumulation of fat in adipose tissue with adverse consequences for health. The causes of obesity are many.In recent work, there was demonstrated the role of environmental pollution in weight gain.In this work, the assumptions that the adrenergic receptors on the surface of fat cells would home to the accumulation of polycyclic aromatic pollutants have been verified by measurement of several agonists and antagonists specific and non-specific in the presence or absence of benzo[a]pyrene receptors on human cells and Chinese hamster (CHO). The amounts of cAMP obtained showed that PAHs are not deposited on β-receptors, β1, β2, β3 adrenergic receptors.This accumulation occurs at the cytoplasmic membrane phospholipids of the cells. What cau-ses stiffness of the membranes. This observation tends to reinforce the hypothesis that benzo [a]pyrene induce an inhibition of lipolysis by the accumulation in the phospholipid bilayer and conformational changes of the bilayer phospholipids in the vicinity of receptors seven transmembrane domains which are β-adrenergic receptors

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Marconi, Séverine. "Dosage de l'activité endoprotéolytique de neurotoxines clostridiales." Aix-Marseille 2, 2008. http://www.theses.fr/2008AIX20690.

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Abstract:

L’utilisation croissante des neurotoxines botuliques comme agents thérapeutiques et cosmétiques mais aussi le risque qu’elles constituent en tant qu’armes biologiques potentielles nécessitent l’élaboration de nouveaux tests de détection de leur activité protéolytique in vitro, pour remplacer à terme le test de référence de létalité in vivo chez la souris. Un dosage in vitro de l’activité des BoNT/B par résonance plasmonique de surface (SPR, mis au point par Ferracci et al. En 2005, est basé sur la quantification directe de la VAMP2, protéine des vésicules synaptiques, par son immuno-capture sur des anticorps spécifiques immobilisés sur la sensor chip. Ce test est 200 fois plus sensible et jusqu’à 25 fois plus rapide que le test de référence in vivo. Le clivage de la VAMP2 des vésicules synaptiques par la BoNT/B a été estimé par SPR, ELISA et cytométrie de flux. Les EC50 déterminés sont similaires entre les trois méthodes alors que l’analyse SPR est beaucoup plus rapide et économique. D’autre part, les VS constituent un substrat très robuste, lyophilisable, permettant de détecter l’activité enzymatique de la BoNT/B dans des milieux complexes. L’utilisation d’un protocole d’immunoisolation de la BoNT/B dans le sérum rend le test 30 fois plus sensible que la méthode in vivo. Nous avons développé une méthode SPR permettant la quantification de protéines de la membrane plasmique et le dosage de l’activité de la BoNT/A. Des antigènes membranaires intracytoplasmiques, dont la SNAP-25 (cible de la BoNT/A), ont été dosés sans solubilisation avec une sensibilité de l’ordre du picogramme. En utilisant un anticorps reconnaissant spécifiquement la SNAP-25 clivée par la BoNT/A, nous avons établi une méthode de dosage rapide et sensible de ce sérotype. La méthode a été appliquée au dosage de l’activité de la BoNT/A dans des cultures cellulaires en 24 ou 96 puits
Neurotransmitter-filled synaptic vesicles fuse in a calcium-dependent manner with the plasma membrane to release their content into the synaptic cleft. VAMP2, a synaptic vesicle membrane protein, interacts with SNAP-25 and syntaxin1 localized on the plasma membrane. These proteins, called SNAREs, assemble into a heterotrimeric complex that brings the vesicle and the plasma membranes into close apposition. Botulinum neurotoxins (BoNTs), the most toxic biological substances known, inhibit synaptic neurotransmission by cleaving SNAREs. There are seven BoNT serotypes named A to G of which BoNT/ B and F cleave VAMP2 and BoNT/A and E cleave SNAP-25. The increasing use of BoNTs as therapeutic and cosmetic agents, but also the threat they constitute as potential bioweapons, highlight the need for development of in vitro assays to detect their endoproteolytic activity. These alternative methods should replace the mouse bioassay which is the current reference method. An in vitro assay for the detection of the catalytic activity of BoNT/B and F has been developed by Ferracci et al. In 2005. It is based on the direct quantification of synaptic vesicle proteins, in particular VAMP2, by their immuno-capture on specific antibodies immobilized on the sensor chip surface. For BoNT/B, this test was shown to be 200 times more sensitive and up to 25 times faster than the reference in vivo toxicity test in mice. Using synaptic vesicles as a substrate, a comparison of the EC50s for BoNT/B obtained by SPR, ELISA or flow cytometry indicated similar sensitivity although SPR assays were more rapid and economical. We also showed that synaptic vesicles are a robust substrate, that can be lyophilized, allowing the detection of BoNT/B activity in complex media. With an immunoisolation step of BoNT/B from serum, the assay was shown to be 30 times more sensitive than the mouse bioassay. We developed an SPR-based method allowing the quantification of plasma membrane proteins and the detection of BoNT/A activity. Sonication of brain or neuronal cultures generated plasma membrane fragments with accessible intra-cellular epitopes adapted to analysis by SPR. SPR responses were proportional to antigen concentration permitting detection of as little as 4 pM SNAP-25 in crude lysates. BoNT/A activity was assayed using monoclonal antibodies that specifically recognize a SNAP-25 epitope generated by the proteolytic action of the toxin. The SPR biosensor method was sensitive enough to monitor BoNT/A and B activity in cells cultured in a 96-well format and could favourably replace time-consuming techniques for the measurement of toxin activity

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Castro, Cruz Monica del Carmen. "The impact of the syndecan-PDZ interactome on endosomal trafficking and extracellular vesicle composition." Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0302.

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Abstract:

Les syndécans forment une famille de quatre protéines transmembranaires qui sont substituées par l'héparane sulfate. Grâce à ces chaînes glucidiques extracellulaires, les syndécans contrôlent la signalisation d'une pléthore de facteurs de croissance et de molécules d'adhésion. Une autre caractéristique remarquable des syndécans est la conservation de leur domaine intracellulaire au cours de l'évolution. Ce domaine contient un motif C-terminal qui peut induire une interaction avec les protéines dites «PDZ». Les interactions PDZ sont promiscues et les protéines PDZ contrôlent divers aspects de la signalisation cellulaire et de la communication cellule-cellule. Quatre interactions syndecan-PDZ ont été décrites à ce jour et toutes ces interactions ont des effets drastiques sur le comportement des cellules. En particulier, il a été documenté que l'interaction syndécan-synténine a un impact sur le trafic intracellulaire de molécules de signalisation liant l’héparan sulfate. De plus, les syndécans et la synténine coopèrent dans le contrôle la biogenèse des exosomes, organites extracellulaires fonctionnant comme des médiateurs importants de la communication cellule-cellule (y compris dans différentes maladies systémiques comme le cancer). Le protéome humain compte 150 protéines PDZ qui contiennent 266 domaines PDZ. Dans ce travail, nous avons mis à jour la complexité de l'interactome syndecan-PDZ et testé son impact sur le trafic membranaire et sur la composition des vésicules extracellulaires. Notre travail ouvre la voie à une meilleure compréhension des réseaux moléculaires contrôlant la communication cellule-cellule en physio-pathologie
Syndecans form a family of four transmembrane proteins that are substituted with heparan sulfate. By virtue of these extracellular carbohydrate chains, syndecans control the signaling of a plethora of growth factors and adhesion molecules. Another remarkable feature of syndecans is the conservation of their intracellular domain through evolution. This domain contains a C-terminal motif that can mediate interaction with PDZ proteins. PDZ interactions are promiscuous and PDZ proteins control various aspects of cell signaling and cell-cell communication. Four syndecan-PDZ interactions have been described so far and all these interactions have broad effects on cell behavior. In particular, it was documented that syndecan-syntenin interaction has impact on the intracellular trafficking of heparan sulfate cargo. Moreover syndecan-syntenin controls the biogenesis of exosomes, extracellular organelles emerging as important mediators of cell-cell communication in health and diseases. The human proteome contains 150 PDZ proteins and 266 PDZ domains. Here we started addressing the complexity of the syndecan-PDZ interactome and tested for its impact on membrane trafficking and on the composition of extracellular vesicles. Our work paves the way for a better understanding of the molecular mechanisms and networks controlling cell-cell communication in health and disease

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Gaspard, Cindy Jeanty. "Particularités immunobiochimiques et trafic intracellulaire de la protéine HLA-B27, molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I impliquée dans les spondylarthrites." Thesis, Paris 5, 2012. http://www.theses.fr/2012PA05T001.

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Abstract:

La spondylarthrite ankylosante (SA), la forme la plus commune des spondylarthrites (SpA), est fortement associée à la molécule du CMH de classe I HLA-B27 mais le rôle de cet antigène d'histocompatibilité dans le développement de ces pathologies reste encore inexpliqué. L’étude des rats transgéniques HLA-B27, développant une pathologie inflammatoire spontanée ressemblant aux SpA, a permis de confirmer l’implication directe du HLA-B27 et de corréler l’apparition des symptômes avec une forte expression de cette molécule. De plus, il a été montré que l’HLA-B27 présentait une propension particulière au mauvais repliement et à la formation d’oligomères de chaînes lourdes. L’objectif de mon travail de thèse était de déterminer si le trafic et/ou la formation d’oligomères du HLA-B27 étaient corrélés à sa surexpression. Pour cela, notre équipe a développé des protéines de fusion (HLA-BYFP et HLA-BRLuc) ainsi que la technique BRET afin d’étudier les interactions HLA-B/HLA-B. Au moyen de ce système expérimental, nous avons montré la formation de vésicules intracellulaires riches en protéines HLA-B mal repliées lorsqu’elles étaient fortement exprimées, qu'il s'agisse d'allèles associés à la SA (HLA-B*2702, -05, et -07) ou non (HLA-B*2706, et -09, HLA-B*0702). Cependant, ce phénomène était significativement plus prononcé pour les sous-types associés à la SA. Dans les conditions de forte expression, nous avons également observé que les sous-types associés à la SA formaient des oligomères qui se comportent différemment de ceux formés par la protéine HLA-B7. Ce phénomène ne semble pas être dû au déclenchement de la réponse cellulaire « Unfolded Protein Response » (UPR) et n’est pas abrogé par l’inhibition du protéasome
Ankylosing spondylitis (AS), the most common form of spondyloarthritis (SpA), is strongly associated with the MHC class I HLA-B27 molecule. Although this association has been largely studied, mechanisms of pathology remain unclear. Development of a spontaneous inflammatory disease resembling human SpA in HLA-B27 transgenic rats confirmed the direct involvement of HLA-B27 and allowed to associate disease development with high expression levels of this molecule. Moreover, the HLA-B27 protein has an enhanced propensity to misfold and form aberrant disulfide linked heavy chain oligomers in the endoplasmic reticulum and at the cell surface. The goal of my thesis work was to determine if the HLA-B27 traffic and/or its ability to form oligomers are involved in this requirement of overexpression. For that, our team has developed fusion proteins ((HLA-BYFP and HLA-BRLuc) and the BRET technique to study, in vitro, the HLA-B/HLA-B interactions. Using this experimental system, we have shown the formation of intracellular vesicles, in which misfolded/unfolded HLA-B proteins accumulated when they were highly expressed, for both AS-associated alleles (HLA-B*2702, -05, et -07) or not (HLA-B*2706, et -09, HLA-B*0702). This phenomenon is strongly pronounced for AS-associated subtypes. For high-level expression, we also observed that the AS-associated subtypes form oligomers that behave differently from those formed by the HLA-B7 control protein. This phenomenon doesn’t appear to be due to unfolded protein response (UPR) triggering and is not abrogated by proteasome inhibition

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Neyraud, Vincent. "L'ubiquitination des GTPases Ral : Un nouveau mécanisme de régulation diu trafic intracellulaire de Ral et des micro-domaines menmbranaires lipidiques." Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA11T085.

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Couesnon, Aurélie. "Passage de la neurotoxine botulique à travers la barrière intestinale." Phd thesis, AgroParisTech, 2007. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00003461.

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Abstract:

flasque, est produite par des bactéries anaérobies du genre Clostridium. Les BoNTs, classifiées en 7 types (A à G), forment divers complexes avec des protéines non toxiques, dont le composant non toxique non hémagglutinant (NTNH) et les hémagglutinines (HAs). Les gènes sont organisés, au sein du locus botulique, selon deux opérons divergents, ntnhbont/ A et ha34-ha17-ha70 pour le type A, dont l'expression est positivement régulée par le facteur sigma alternatif BotR. Un pic d'expression synchrone de tous les gènes du locus de type A est mesuré par RT-PCR en temps réel lors de la transition entre les phases exponentielle et stationnaire de croissance, en parallèle avec l'augmentation du titre en toxine du surnageant de culture. Dans un modèle d'épithélium intestinal, BoNT/A purifiée est transcytosée après liaison via le domaine Hc/A à des récepteurs apicaux comprenant des gangliosides et des protéines potentiellement apparentées à SV2. L'intensité de liaison et l'efficacité de transport de la toxine sont supérieures dans les cellules intestinales de type crypte plutôt qu'entérocyte. Injectés dans la lumière d'une anse iléale ligaturée, BoNT/A inhibe les contractions des muscles lisses et le domaine Hc/A fluorescent progresse de la muqueuse, via certaines cellules des cryptes, vers la sous-muqueuse et la musculeuse où il cible certaines terminaisons nerveuses, majoritairement cholinergiques. Hc/A entre par des voies distinctes dans les cellules neuronales (voie clathrine dépendante de la dynamine) et les cellules intestinales (voie non-clathrine, dépendante de Cdc42 et de la dynamine).

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Salim, Cláudio. "Expression de la protéine géante AHNAK après lésion de la moelle épinière et dans le système nerveux périphérique : études fonctionnelles sur les cellules de Schwann in vitro." Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066507.

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Abstract:

Le gène ahnak de rat a été identifié lors d’un criblage différentiel visant à déterminer les protéines impliquées dans les lésions de la moelle épinière. Après la lésion chez le rat, AHNAK est produite en quantité accrue de 48h à 6 mois. AHNAK est présente dans la composante fibrotique de la cicatrice, exprimée par des types cellulaires variés. Sa localisation en bordure des cavités suggère une participation dans la formation d’une barrière protégeant le parenchyme sain après lésion. Dans le système nerveux périphérique, AHNAK est constitutivement exprimée par les neurones sensoriels de petits et de moyens diamètres, ainsi que par les cellules satellites, et les cellules de Schwann du nerf. Pendant la myélinisation la protéine AHNAK est redistribuée d’un compartiment péri-myélinique du cytoplasme externe, à une distribution diffuse et associée à des vésicules au niveau de la membrane abaxonale. In vitro AHNAK et dystroglycan sont associés aux filopodes de cellules de Schwann non confluentes. L’interférence de l’expression de ahnak, induit la rétraction des processus et le détachement du substrat, s’accompagnant d’une chûte du taux de bêta- dystroglycan et la délocalisation de son partenaire Dp116. AHNAK pourrait participer à la stabilisation du complexe d’attache contenant le dystroglycan et contribuer ainsi au maintien de la myéline
Ahnak gene in rat has been first identified by a differential screening that aimed in identifying proteins overexpressed in a spinal cord injury. After a spinal injury in rat, AHNAK is expressed by different types of cells invading the lesion epicenter as soon as 48h after injury. Those cells constitute the fibrotic component of the glial scar, and produce ahank at least until 6 months after injury. AHNAK expressing cells delineate the inner border of cystic cavities in the lesion epicenter, suggesting that AHNAK may participate in the formation of a tissue-protective barrier. In the peripheral nervous system, AHNAK is constitutively expressed by sensory neurons of the dorsal root ganglia, satellite cells, and Schwann cells from the nerve. During myelination in rat, AHNAK is redistributed from a strictly perimyelinic compartment of the external cytoplasm, to a more diffuse distribution associated with the outer surface of vesicles, and with the abaxonal plasma membrane. In non confluent Schwann cells in vitro, AHNAK and the laminin-receptor dystroglycan are associated with filopodia-like cell extensions. Ahnak interference in Schwann cells induces retraction of cell processes and detachment from laminin coated surfaces, associated with a reduction of the Schwann cell content in beta-dystroglycan and a nuclear translocation of Schwann cell specific dystrophin Dp116 which normally binds beta dystroglycan with the actin cytoskeleton. . We suggest AHNAK to be implicated in targeting and/or scaffolding of the dystroglycan-associated complex to the abaxonal membrane. Thus, similarly to periaxin with which it shares certain features, AHNAK may contribute to SC-basal lamina interaction, and myelin formation and/or maintenance

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Saint-Jean, Bruno. "Etude de la voie de transport assurée par le récepteur d’adressage vacuolaire BP80." Rouen, 2006. http://www.theses.fr/2006ROUES037.

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Abstract:

Le récepteur d’adressage vacuolaire BP80 assure le transport des préprotéases solubles à destination de la vacuole lytique. BP80 reconnaît son ligand au niveau du TGN. Le complexe formé est empaqueté dans des vésicules de transport puis transporté jusqu’au compartiment prévacuolaire (PVC). Le ligand transite jusqu’à la vacuole lytique alors que le récepteur recycle jusqu’au TGN. Nous avons initié une approche de microscopie confocale pour étudier BP80. Nous avons créé une chimère correspondant à la fusion entre la GFP et les domaines transmembranaire et cytosolique de BP80 nommée GFP-PS1. Cette chimère GFP-PS1 reproduit parfaitement le trafic de BP80. Nous avons réalisé différentes protéines chimériques dérivant toutes du reporter GFP-PS1 et portant une ou deux mutation(s ) sur des signaux de tri potentiels présents sur la portion cytosolique de BP80. Par cette approche, nous avons identifié deux signaux importants qui participent à des événements de recyclage et d’endocytose de BP80
BP80 is a vacuolar receptor responsible for sorting proaleurain from the trans-Golgi network. The complex receptor-ligand is packed into shuttle vesicles that are directed and fused to a prevacuolar compartment where the lower pH induces the dissociation between the receptor and the proaleurain. This latter matured and released in the lytic vacuole. Beside the fact that BP80 uses clathrin coated vesicles for its traffic, we have no other indication on the signals in the cytoplasmic tail used by BP80 traffic. In an attempt to identify trafficking signals, we fused the GFP to the transmembrane and the cytosolic domains of BP80 and called the resulting fusion protein GFP-PS1. Like the native vacuolar receptor, GFP-PS1 accumulates and cycles in the same cell compartment. We then introduced single or two mutation(s) in the cytosolic portion of GFP-PS1. Using this approach, we identify two important sorting signals, which participates to recycling and endocytic events of BP80

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Claudinon, Julie. "Identification de mécanismes de régulation des fonctions des interférons: Rôle de la palmitoylation du récepteur de l'interféron de type I." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00354695.

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Abstract:

Les interférons (IFNs) de type I sont des cytokines qui jouent un rôle capital dans les défenses immunes, antivirales et antiprolifératives de l'organisme. En se liant à leur récepteur de surface, composé des deux sous-unités IFNAR1 et IFNAR2, ils induisent la cascade de signalisation JAK/STAT qui aboutit à leur effets biologiques. L'objectif de ma thèse était d'identifier des mécanismes de régulation de la signalisation des IFNs. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés à la palmitoylation du récepteur de l'IFN de type I, une modification lipidique souvent impliquée dans le trafic et la signalisation des protéines. Par marquage métabolique au palmitate tritié, nous avons montré qu'IFNAR1 et IFNAR2 sont palmitoylées. Le domaine cytoplasmique d'IFNAR1 contient deux cystéines, Cys463 et Cys502, qui sont des sites potentiels de palmitoylation. A l'aide de mutants sur chacune de ces cystéines, nous avons montré qu'IFNAR1 est palmitoylée uniquement sur sa cystéine la plus proche de la membrane plasmique, la Cys463. Un mutant non palmitoylé dans lequel cette cystéine a été remplacée par une alanine nous a permis de constater que la palmitoylation d'IFNAR1 n'est pas impliquée dans son trafic intracellulaire, dans son endocytose ni dans sa stabilité, mais qu'en revanche elle joue un rôle crucial dans l'activation de la voie de signalisation JAK/STAT. De façon concordante, la palmitoylation d'IFNAR1 est requise pour l'activation transcriptionnelle des gènes induits spécifiquement par l'IFN-a. Par contre, un défaut de palmitoylation n'influence nullement l'activité antiproliférative de l'IFN-a, en dépit du rôle de cette modification dans la signalisation.

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Breton, Victor. "Elucider le rôle de VAMP7 dans les remodelages membranaires au cours des phénomènes d'apprentissages et de la mémoire." Electronic Thesis or Diss., Université Paris Cité, 2023. http://www.theses.fr/2023UNIP7048.

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Abstract:

Pour transmettre une information d'un neurone à un autre, les neurones utilisent des jonctions communicantes spécialisées : les synapses. Dans l'hippocampe, une bonne proportion des synapses excitatrices se situent dans de petites protrusions membranaires : les épines dendritiques. La dynamique et la morphologie des épines évoluent au cours du temps de façon dépendante de l'activité synaptique. Les zones synaptiques, pré et post, sont sujettes à un trafic intracellulaire dense et actif. Parmi les protéines qui régulent ce trafic, on trouve les protéines SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor) qui assurent la fusion de vésicules avec la membrane cible et permettent la libération de neurotransmetteurs (pré-synaptique) ou de récepteurs synaptiques (post-synaptique). Les protéines SNAREs se regroupent en deux grandes catégories, les v-SNAREs que l'on trouve à la membrane des vésicules et les t-SNAREs que l'on trouve sur la membrane cible. v- et t-SNAREs interagissent entre elles pour rapprocher les deux membranes et déclencher la fusion membranaire. L'objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du trafic intracellulaire dans le remodelage membranaire des zones synaptiques dendritiques au cours de l'apprentissage et de la mémoire. Mon travail s'est focalisé sur la v-SNARE VAMP7 qui s'exprime dans les neurones, des stades développementaux aux stades matures bien que son rôle reste peu connu dans les dendrites. Précédemment au laboratoire, il a été montré que les souris VAMP7 KO présentent de meilleures performances mnésiques lors de tests comportementaux impliquant la mémoire et l'apprentissage. Dans un premier temps, j'ai montré que VAMP7 se localise préférentiellement dans les dendrites et que les souris VAMP7 KO présentent une augmentation des épines dendritiques matures, confirmant un rôle de VAMP7 dans les phénomènes d'apprentissage et de mémoire. Avec une approche de microscopie, j'ai montré que VAMP7 se localise à une très forte proximité des synapses et que VAMP7 se trouvait dans une grande majorité des épines dendritiques, plus particulièrement dans la tête de celles-ci. Afin de déterminer sa fonction, j'ai évalué la distribution de VAMP7 et de compartiments intracellulaires classiques (endosomes précoces et de recyclage, endolysosomes, etc...) dans les dendrites. Mes résultats indiquent que VAMP7 n'est pas majoritairement localisé dans ces compartiments suggérant l'existence d'un compartiment encore non caractérisé dans les dendrites. Grâce à l'imagerie vivante et super-résolutive, STED et STORM, j'ai montré que VAMP7 se localise dans des extensions golgiennes dans les dendritiques (Golgi sattelite). Finalement, mes résultats montrent que VAMP7 et certains récepteurs au glutamate de type NMDA sont dans les mêmes compartiments dans le tronc et les épines dendritiques. En complément de l'étude du rôle de VAMP7 dans les processus de remodelage membranaire j'ai, en collaboration avec des chimistes spécialisés dans la synthèse de sondes fluorescentes, mis au point l'utilisation de sondes organiques photoconvertibles en microscopie conventionnelle et super-résolutive. Plus précisément, nous avons découvert des propriétés physico-chimiques de sondes fluorescentes photoconvertibles que j'ai utilisées pour reconstruire la membrane plasmique en imagerie STORM sur cellules vivantes. Ceci permettra à l'avenir de suivre la dynamique des épines lors de la plasticité synaptique en imagerie STORM. Mes résultats suggèrent qu'il existerait des compartiments dendritiques VAMP7-positif, encore non caractérisés, qui agirait comme une station de stockage de récepteurs synaptiques. Il serait intéressant d'investiguer si l'activité et le trafic des récepteurs synaptiques se ferait alors sous le contrôle de VAMP7 et dépendrait du niveau d'activité synaptique. Ainsi à l'avenir on pourrait étudier l'exocytose de VAMP7 et comment son activité est modulée pendant la plasticité synaptique (LTD et LTP)
To transmit information from one neuron to another, neuronal cells use specialized communicating junctions called synapses. In the hippocampus, a large proportion of excitatory synapses are located in tiny membrane protrusions called dendritic spines. The dynamics and morphology of the spines change over time, depending on the activity to which the synapse is subjected. The pre- and post-synaptic zones are subject to a dense and active intracellular traffic. Among the proteins that regulate this traffic, we can find SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor) which are mediating membrane fusion. This process allows vesicles to fuse with targeted membrane and enable the release of: neurotransmitters (pre-synaptic) or synaptic receptors (post-synaptic). SNARE proteins are classified into two main categories: v-SNAREs, found on the vesicle membrane, and t-SNAREs, found on targeted membrane. v- and t-SNAREs interact with each other to bring the two membranes together and trigger membrane fusion. The aim of my thesis was to determinate the role of intracellular trafficking in the membrane remodeling during learning and memory. My work focused on the v-SNARE VAMP7, which is expressed in neurons from developmental to mature stages, although little is known about its role in dendrites. Previously in the laboratory, it has been shown that VAMP7 KO mice show improved memory performance in behavioral tests involving learning and memory. First, I showed that VAMP7 is localized preferentially in dendrites. Then, I quantified on electron microscopy that VAMP7 KO mice show an increase in mature dendritic spines, confirming a role for VAMP7 in learning and memory processes. Using microscopy, I showed that VAMP7 is localized in close proximity to synapses and that VAMP7 is found in a large majority of dendritic spines, particularly in the head of these. To determinate its function, I assessed the distribution of VAMP7 and classical intracellular compartments (early and recycling endosomes, endolysosomes, etc.) in dendrites. My results indicate that VAMP7 is not predominantly localized in these compartments, suggesting the existence of an uncharacterized dendritic compartment. Using live imaging and super-resolution imaging, STED and STORM, I show that VAMP7 is localized in dendritic golgi extensions (Golgi sattelite). Finally, my results show that VAMP7 and some type of NMDA receptors are in the same compartments in both dendritic shaft and spines. In addition to studying the role of VAMP7 in membrane remodeling processes, I have, in collaboration with chemists specializing in the synthesis of fluorescent probes, discovered and developed the use of photoconvertible organic probes in conventional and super-resolution microscopy. More specifically, we discovered the physico-chemical properties of photoconvertible fluorescent probes, which I used to reconstruct the plasma membrane in STORM imaging on living cells. In the future, this will make it possible to follow the dynamics of spines during synaptic plasticity in STORM imaging. My results suggest the existence of an uncharacterized VAMP7-positive dendritic compartments, whose function would be to act as a storage station for synaptic proteins and receptors. It would be interesting to investigate whether the activity and trafficking of synaptic receptors would then be under the control of VAMP7 which could also be dependent on the level of synaptic activity. In this way, we could study VAMP7 exocytosis and how its activity is modulated during synaptic plasticity (LTP - LTD)

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Gubar, Olga. "Rôle de l'intersectin-1 au cours du trafic membranaire : identification de nouveaux partenaires moléculaires." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ010/document.

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Abstract:

L’homéostasie cellulaire est intimement liée au trafic membranaire, processus dynamique qui permet les échanges de lipides et de protéines entre les compartiments cellulaires mais aussi entre la cellule et le milieu extracellulaire. L’intersectin-1 (ITSN1) est une protéine d’échafaudage multifonctionnelle, impliquée dans les processus d’endocytose, d’exocytose, diverses voies de signalisation ainsi que dans la survie cellulaire. L’ensemble de mes travaux de doctorat a permis d’identifier deux nouveaux partenaires de l’ITSN1, RhoU et l’OPHN1, et de montrer leur implication dans le trafic membranaire. De plus je démontre que les variants d’épissage de l’ITSN1 pourraient avoir une spécificité d’interactiondifférente vis-à-vis de ses partenaires. Nous montrons aussi que l’ITSN1 est capable de former des complexes entre ses différentes isoformes. Ainsi, l'ensemble de ces données apportent de nouvelles connaissances sur l’interactôme d’ITSN1
The cellular homeostasis is tightly linked to the membrane trafficking, a dynamic process which allows lipid and protein exchange between the cellular compartments as well as the cell and the environment. Intersectin1 (ITSN1) is a multifunctional scaffold protein implicated in the processes of endocytosis and exocytosis, different signaling pathways and cell survival. In present study I have identified two new partners of ITSN1, RhoU and OPHN1, and demonstrated their implication in membrane trafficking. Surprisingly, I have also found that the alternative splicing of ITSN1-L can lead to the change of the specificity of its interaction with binding partners. In addition, I have shown that different ITSN1 isoforms are capable to form complexes with each other. All together these data add new knowledge to ITSN1 interactome

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Allain, Jean-Marc. "Instabilités des membranes lipidiques inhomogènes : implications biologiques." Phd thesis, Université Paris-Diderot - Paris VII, 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011333.

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Abstract:

Cette thèse est consacrée à l'étude analytique et numérique d'instabilités de forme de vésicules lipidiques à deux phases. Les vésicules sont un système modèle de choix pour étudier les propriétés mécaniques et physico-chimiques de la membrane cellulaire. Aussi, elles ont été largement étudiées depuis une trentaine d'années et, dans le cas d'une bicouche homogène, leurs propriétés sont désormais bien comprises. On sait maintenant réaliser des vésicules formées d'un mélange de lipides. Il peut alors se produire une séparation de phase conduisant à la formation de domaines de composition différente. Des structures similaires de très
petite taille, appelées 'rafts', existeraient dans les membranes cellulaires. Différentes expériences sur des vésicules multiphasiques montrent que cette inhomogénéïté latérale favorise des instabilités de forme. Nous avons modélisé trois instabilités différentes, observées expérimentalement, pour mieux comprendre comment les propriétés mécaniques des vésicules sont affectées par l'existence d'un domaine. Deux instabilités concernent des déformations hors du plan de la bicouche : la rupture d'un tube de membrane, provoquée par les contraintes mécaniques internes, et l'éjection d'un domaine d'une vésicule tendue, soit par l'absorption de molécules soit par un changement de pression osmotique. Enfin, nous avons modélisé une instabilité illustrant le comportement hydrodynamique de la bicouche, qui justifie le concept de viscosité associé à celle-ci tout en soulignant son caractère bidimensionnel.

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Dornier, Emmanuel. "Régulation de la métalloprotéase ADAM10/Kuzbanian par les tétraspanines à 8 cystéines et conséquences sur l'activation de la voie Notch chez les mammifères et la Drosophile." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00788362.

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Abstract:

L'importance des activités protéolytiques associées à la membrane plasmique dans divers processus biologiques fondamentaux est de mieux en mieux définie. Les protéases de la famille ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), et ADAM10 en particulier, ont suscité un intérêt tout particulier du fait de l'importance de leurs substrats (récepteur de l'EGF, TNFα, Notch, APP...). Néanmoins, peu d'études se sont intéressées aux mécanismes régulant le trafic d'ADAM10.Les tétraspanines sont une super-famille de protéines de surface impliquées dans de nombreux processus biologiques fondamentaux parmi lesquels la migration, les interactions intercellulaires, la réponse immunitaire, la fusion des gamètes... L'une des caractéristiques majeure des tétraspanines est leur capacité à organiser un réseau d'interactions moléculaires appelé le " tetraspanin web ". De précédentes études menées dans le laboratoire ont montré qu'ADAM10 est associé au " tetraspanin web ". Néanmoins, la tétraspanine en interaction directe avec ADAM10 permettant son association au réseau n'est pas encore connue. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la régulation d'ADAM10 par les tétraspanines. Nous avons ainsi pu identifier une sous-famille de tétraspanines à 8 cystéines, les TspanC8 (Tspan5, Tspan10, Tspan14, Tspan15, Tspan17 et Tspan33), comme étant capables d'interagir directement avec ADAM10 et de réguler sa sortie du réticulum endoplasmique. Nous avons montré que Tspan5, Tspan14, Tspan15 et Tspan33 sont capables de réguler l'expression de surface d'ADAM10 et que Tspan10 et Tspan17 entrainent l'accumulation d'ADAM10 dans un compartiment endosomal tardif. Les TspanC8 pourraient également contribuer à la régulation de la spécificité de substrat d'ADAM10 puisque nous avons montré que l'expression des TspanC8 humaines Tspan5 et Tspan14 augmente l'activation de la voie Notch alors que Tspan15 n'a pas d'effet. Par ailleurs, les TspanC8 de Drosophile sont capables d'interagir directement avec Kuzbanian (l'orthologue d'ADAM10), permettent son accumulation à la surface cellulaire et régulent l'activation de la voie Notch dans différents contextes développementaux. Nous proposons que les TspanC8 soient une nouvelle famille de protéines ayant une fonction très conservée dans la régulation de l'activité et du trafic d'ADAM10, capables de réguler l'activation de la voie Notch.

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Élias, Salah. "Contribution à la caractérisation des mécanismes moléculaires impliquant la chromogranine A dans l'établissement de la voie de sécrétion régulée dans les cellules neuroendocrines." Rouen, 2010. http://www.theses.fr/2010ROUES004.

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Abstract:

Des études récentes d'invalidation du gène codant la chromogranine A (CgA) ont suggéré que cette protéine jouerait un rôle clé dans la biogenèse des granules de sécrétion (GS) au sein des cellules neuroendocrines. Néanmoins, les mécanismes moléculaires impliqués au cours de ce processus demeurent mal connus. Récemment, nous avons montré que l'expression de la CgA dans les cellules non-endocrines COS-7 induit la biogenèse de structures granulaires apparentées aux GS, capables de stocker et de sécréter la CgA et des hormones co-exprimées (NPY, GH), de manière calcium-dépendante. Les analyses des cellules COS-7 exprimant la CgA en microscope confocale et en vidéomicroscopie, associées à des approches biochimiques, ont permis d'établir des interactions entre les granules contenant la CgA, les microtubules et les filaments d'actine. Ces deux éléments du cytosquelette exercent des fonctions régulatrices sur le trafic intracellulaire et l'exocytose calcium-dépendante des granules contenant la CgA. Ces résultats suggèrent que la CgA est suffisante pour induire la biogenèse de GS et instaurer ainsi une voie de sécrétion régulée dans des cellules non-endocrines. Le clonage de la CgA de grenouille ayant révélé la conservation des régions N- et C-terminales au cours de l'évolution des vertébrés, nous avons émis l'hypothèse de leur implication en tant que déterminants fonctionnels de la CgA. Ainsi, nos résultats démontrent que les peptides conservés confèrent à la CgA sa capacité à former des GS et dirigent l'adressage et la libération régulée des hormones exogènes co-exprimées avec la CgA dans les cellules COS-7, ainsi que la POMC endogène dans les cellules corticotropes AtT20
The nature of the sorting signals for entry of proteins into the dense-core secretory granules (SG) and the molecular machinery required to generate SG remain unclear. Recent studies revealed that chromogranin A (CgA) deficiency is associated with hormone storage impairment, suggesting that CgA plays a major role in the formation of SG in neuroendocrine cells. The cloning of frog CgA revealed high conservation though evolution of the global acidity and of the terminal regions of the protein, suggesting that these features are essential for the biological activity of CgA. Expression of CgA in the non-endocrine COS-7 cells induced the formation of dense-core vesicles containing CgA. As SG in neuroendocrine cells, trafficking and exocytosis of CgA-containing granules required interactions with microtubules and actin filaments. These SG-like organelles were able to store hormones that could be released in a calcium-dependent manner. Deletion of the terminal regions of CgA resulted in a reorientation of the proteins from the regulated to the constitutive secretory pathway, indicating that these domains were essential for the formation of functional SG-like structures in COS-7 cells. Expression of CgA in the corticotrope AtT20 cells increased POMC levels in SG, whereas the expression of terminal deletion-mutants provoked retention of the hormone in the Golgi area. Thus, CgA, but not its truncated forms, promoted POMC sorting to the regulated secretory pathway. Our results demonstrate that CgA, through its conserved terminal domains, directs the formation of SG and the sorting and release of hormones

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Lauwers, Elsa. "Role of sphingolipids and polyubiquitin chains in intracellular trafficking of the yeast GAP1 permease." Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2007. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210648.

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Abstract:

In the past fifteen years, ubiquitin has emerged as a central regulator of membrane protein trafficking. In this context, covalent attachment of this small protein to lysine residues of cargo proteins, a reversible modification termed ubiquitylation, provides a signal for their targeting to the vacuolar/lysosomal lumen where they are degraded, both in yeast and higher eukaryotes. Ubiquitylation is also used as a means of controlling the function of specific proteins in several trafficking machineries. The role of lipids - and in particular of membrane domains named lipid rafts - in controlling the intracellular trafficking of membrane proteins has also been the subject of intense investigation in recent years.

One of the membrane proteins of the yeast Saccharomyces cerevisiae whose intracellular trafficking has been extensively studied is the general amino acid permease Gap1. Yet some aspects of the function of ubiquitin in the nitrogen-dependent control of this protein remain controversial. Moreover, the potential role of lipid rafts in regulating the functional properties and traffic of the Gap1 permease had not been investigated before this thesis work.

The first part of our work readdresses the role of Gap1 ubiquitylation, and more precisely of the modification of the permease with polyubiquitin chains linked through the lysine 63 of ubiquitin, in controlling the fate of this protein in the secretory pathway. Our observations indicate that nitrogen-induced ubiquitylation of newly synthesised Gap1 occurs in the trans-Golgi complex. However, contrary to the generally accepted view, this modification is not necessary for the permease to exit this compartment en route to the endosome but only for its subsequent targeting to the vacuolar lumen via the multivesicular body (MVB) pathway. Our results also provide evidence that K63-linked polyubiquitylation is important mostly at the late endosomal level, for proper sorting of Gap1 into the MVB pathway, whether the permease comes from the cell surface by endocytosis or directly from the secretory pathway.

In the second part of this work, we present a set of data providing novel insights into the controversial question of the exact nature of lipid rafts in yeast. We first showed that the Gap1 permease is associated with detergent-resistant membranes (DRMs) - the proposed biochemical equivalent of lipid rafts - when it is located at the cell surface. Our data further suggest that this may be true for most if not all yeast plasma membrane proteins. Moreover, we found that Gap1 production must be coupled to de novo synthesis of sphingolipids (SLs), major constituents of rafts, in order for the newly synthesised permease to be correctly folded, active, associated with DRMs, and stable at the cell surface. We propose a model where Gap1 would associate with newly synthesised SLs during its biogenesis and/or secretion, this association shaping the permease into its native conformation and ensuring its incorporation and stabilisation in specific lipid domains at the plasma membrane. Failure of Gap1 to acquire this lipidic microenvironment in turns leads to its ubiquitin-dependent degradation by a quality-control mechanism. This model might be valid for many other plasma membrane proteins and might account for their lateral distribution between distinct membrane domains.

Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Del, Río Iñiguez Iratxe. "Intracellular vesicle traffic, immunological synapse and T cell activation. Modulation by Human Immunodeficiency Virus type 1 Rac1-Rab11-FIP3 regulatory hub coordinates vesicle traffic with actin remodeling and T cell activation Rab11-FIP3 regulation of Lck endosomal traffic controls TCR signal transduction." Thesis, Sorbonne université, 2018. http://www.theses.fr/2018SORUS561.

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Abstract:

La formation et les fonctions de la synapse immunologique sont le résultat d’un processus de polarisation cellulaire du lymphocyte T. Ce processus dépend de l’action coordonnée du cytosquelette d’actine et de microtubules, et du trafic vésiculaire intracellulaire. Le récepteur T ainsi que des protéines impliquées dans sa signalisation intracellulaire sont associés à la membrane plasmique et à des compartiments vésiculaires endosomiaux, et circulent en continu entre ces deux localisations. Je montre dans cette thèse que la tyrosine kinase Lck et la GTPase Rac1 sont associés aux endosomes exprimant Rab11. Leur localisation intracellulaire et leurs fonctions dans la formation de la synapse immune, l’activation des lymphocytes T et les remaniements du cytosquelette d’actine dépendent de Rab11 et de son effecteur FIP3. Je me suis intéressée également à la protéine Nef du VIH-1, importante pour la réplication du virus et pour la pathogénèse associée au SIDA. Nef affecte le trafic endosomial, l’activation et le cytosquelette des lymphocytes T infectés. Nous avons mis en évidence que Nef concentre de façon spécifique des formes actives des protéines de signalisation dans le compartiment endosomial Rab11. Ceci conduit à une activation de certains gènes associés aux réponses précoces et tardives des lymphocytes T. Ce processus est contrecarré par la déplétion de FIP3, qui disperse le compartiment concentrant ces protéines. En conclusion, nos données révèlent de nouveaux mécanismes impliquant le trafic vésiculaire intracellulaire dans le contrôle de l’activation et du cytosquelette des lymphocytes T et leur détournement par le virus du SIDA
The immunological synapse is the result of a T cell polarization process that depends on the orchestrated action of the actin and microtubule cytoskeleton and of intracellular vesicle traffic. The T cell antigen receptor (TCR) and various components of its proximal signaling machinery are associated with the plasma membrane and vesicular endosomal compartments, continuously trafficking between the two locations. I show in this thesis that the subcellular localization and function of the tyrosine kinase Lck and the actin cytoskeleton regulator Rac1, depend on the Rab11 recycling endosomal compartment, and more in particular, on the Rab11 effector FIP3. Importantly, FIP3-dependent Lck and Rac1 localization controls early TCR signaling, intracellular calcium concentration, IL-2 gene expression and morphological events, like T cell spreading and synapse symmetry. Moreover, I investigated how the HIV-1 accessory protein Nef, which is crucial for virus replication in vivo and AIDS pathogenesis, specifically hijacks several active signaling molecules, concentrating them in the Rab11 endosomal compartment, and concomitantly inducing the upregulation of some early and late T cell activation genes. Interestingly, dispersion of this concentration by depleting Rab11-FIP3, counteracted Nef-induced gene expression upregulation. Therefore, by modifying their endosomal traffic, Nef hijacks signaling and actin cytoskeleton regulators to dually modulate their functional outputs. In conclusion, our data shed new light into the molecular mechanisms orchestrating endosomal traffic with T cell activation and cytoskeletal rearrangements, and their subversion during HIV-1 infection

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Martinez, Denis. "Rôles des phosphoinositides dans l'intéraction membranaire de la protéine Rgd1 et la croissance polarisée des levures : étude structurale et interaction par RMN et cristallographie." Thesis, Bordeaux, 2014. http://www.theses.fr/2014BORD0369/document.

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Abstract:

Les phosphoinositides sont des molécules régulatrices présentes à l'interface membrane-cytosol, impliquées dans la transduction du signal, le trafic membranaire ainsi que l'organisation du cytosquelette. Ces lipides recrutent non seulement diverses protéines vers des compartiments spécifiques, mais régulent aussi leur activité enzymatique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ils interagissent directement avec le domaine RhoGAP de la protéine Rgd1, identifiée comme un activateur commun aux GTPases Rho3 et Rho4. Ces 2 protéines, respectivement impliquées dans la croissance polarisée et la cytocinèse, voient leur activité GTPasique exacerbée en présence de Rgd1pet des PIPs. L'objectif de cette thèse était comprendre à l'échelle moléculaire le processus unique d'activation de RhoGAP par les PIPs. Pour ce faire, nous avons réalisé l'étude structurale de RhoGAP par cristallographie couplée à la RMN en solution. Nos résultats montrent que le domaine possède les éléments essentiels à l'activation des protéines Rho. L'interaction avec les PIPs a été suivie par RMN en présence de PI(4)P et de PI(4,5)P2, respectivement localisés dans les vésicules de sécrétion et à la membrane plasmique. Nos résultats révèlent un site de liaison commun aux PIPs dans une région non conservée chez les domaines RhoGAP. L'affinité des complexes, de l'ordre de la centaine de micromolaires suggèrent qu'in vivo l'interaction soit transitoire et réversible avec les PIPs. La sélectivité de l'interaction se ferait donc de façon spatio-temporelle, au niveau des vésicules de sécrétion pour la croissance polarisée et de la membrane plasmique pour la cytocinèse
Phosphoinositides act as regulatory and signalling molecules at the membrane-cytosol interface in signal transduction, membrane traffic and cytoskeleton organization. These lipids recruit several proteins to specific compartments, but also regulate their activity. In the yeast Saccharomycescerevisiae, they directly bind the Rgd1-RhoGAP domain, that stimulates the GTPase activity of bothRho3p and Rho4p. The GTPase activity of these two Rho proteins, respectively involved in the polarized growth and cytokinesis of the yeast, is enhanced with the presence of Rgd1p and PIPs. The main objective of this thesis is to understand the PIP-RhoGAP interaction at the molecular level. In order to do that, we coupled X-ray structure determination to solution NMR spectroscopy on the isolated RhoGAP domain. Our results show that the domain contains the conserved elements that would usually confer the catalytic GTPase activation. We us e liquid-state NMR spectroscopy to follow the interaction with PI(4)P and PI(4,5)P2, respectively found in secretion vesicles and the plasma membrane. Our study reveals a common binding site for both PIPs in a non-conserved region in the RhoGAP domain family. We measured sub-millimolar binding affinity for PIPs. Such moderate binding affinities are consistent with the biological requirement for reversible complex formation. The selectivity of the interaction could be made in a spatio temporal way, on the secretion vesicles during polarized growth and at the plasma membrane during cytokinesis

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Liu, Yi. "Calcium-related fungal genes implicated in arbuscular mycorrhiza." Phd thesis, Université de Bourgogne, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00985826.

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Abstract:

Fluctuations in intracellular (Ca2+) calcium levels generate signaling events and regulate different cellular processes. Whilst the implication of Ca2+ in plant cell responses during arbuscular mycorrhiza (AM) interactions is well documented, nothing is known about the regulation or role of this secondary meesenger in the fungal symbiont. The molecular basis of fungal calcium homeostasis in the AM symbiosis was analyzed by investigating the expression of Ca2+-related fungal genes. In a first study, G. mosseae genes putatively encoding a MAP3k-like protein kinase (Gm2) and a P-type ATPase (Gm152) were investigated. Both Ca2+-related genes were up-regulated by A. sinicum root exudates, suggesting a role in early interactions prior to symbiosis establishment. The full-length cDNA sequence of Gm152 obtained from germinating spores of G. mosseae confirmed its identity. The role of Ca2+ in fungal processes leading to establishment of an AM symbiosis was investigated in more detail in G. intraradices-M. truncatula interactions. Enhanced expression of genes encoding six membrane transport proteins and one nuclear protein kinase, selected from the G. intraradices transcriptome database, was related to colonization of wild-type M. truncatula (line J5) roots and not observed with the mycorrhiza-resistant mutant dmi3/Mtsym13. Laser microdissection mapping of transcripts indicated that the Ca2+-related G. intraradices genes were differentially up-regulated in arbuscules and/or in intercellular hyphae. The tempo-spatial variations in fungal gene expression suggest different roles in the development or functioning of the AM symbiosis. Full-length cDNA of three G. intraradices genes putatively encoding a PMR-like endoplasmic reticulum P-type ATPase, a VCX1-like vacuolar Ca2+ ion transporter and a nuclear CCaMK were obtained for functional analyses in yeast mutants to gain insight into their role in the mycorrhizal symbiosis. Possible mechanisms are discussed in which Ca2+-related proteins of G. intraradices may play a role in the mobilization and perception of the intracellular messenger by the AM fungus during symbiotic interactions with host roots

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Beillevaire, Déborah. "Rôle de l’autophagie dans la biogenèse des vésicules membranaires apoptotiques." Thèse, 2019. http://hdl.handle.net/1866/23509.

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Abstract:

L’ischémie/reperfusion (I/R) occurrente à toutes transplantations d’organe solide, constitue un stimulus pro-autophagique/pro-apoptotique pour les cellules endothéliales. Nous avons récemment démontré que les cellules endothéliales apoptotiques (CEapo) sécrètent des vésicules apoptotiques exosome like (ApoExo) qui induisent une réponse auto-immune et accélèrent le rejet vasculaire dans un modèle de greffe aortique chez la souris. Ces ApoExo qui diffèrent des corps apoptotiques classiques par leur structure et leur contenu protéique contiennent le fragment C-terminal du perlécan, LG3. Le LG3, un auto-antigène d’importance en transplantation, favorise le remodelage vasculaire et est augmenté en circulation chez les patients greffés rénaux atteints d’un rejet vasculaire. De plus, la présence d’anticorps anti-LG3 avant la transplantation est associée à un risque plus élevé de développer un rejet vasculaire chez des patients greffés du rein et à la perte du greffon à long terme. Il est connu que la génération du fragment LG3 implique la protéolyse du perlécan par la cathepsine L, une protéase lysosomiale, mais le mécanisme de transport de ce fragment au sein des ApoExo est encore inconnu. Nous avons émis l’hypothèse que l’activité lysosomiale et l’autophagie jouent un rôle important dans la maturation et le chargement du LG3 dans les vésicules ApoExo sécrétées par les CEapo. Une étude longitudinale de microscopie électronique chez les cellules endothéliales humaines carencées en sérum pendant 1h, 2h et 3h, nous a révélé la présence du perlécan / fragment LG3 au sein de compartiments autophagiques (autophagosomes et autophagolysosomes) à différentes étapes du processus autophagique. Après 3 heures de carence en sérum, nous avons identifié le fragment LG3 dans des vésicules membranaires situées au sein de grands réseaux vacuolaires s’apparentant à des autophagolysosomes. L’inhibition de la cathepsine L, de l’acidification du lysosome et de l’autophagie diminuent la présence du fragment LG3 dans les vésicules ApoExo sans affecter la sécrétion de vésicules démontrant donc le rôle de l’autophagie dans l’intégration du fragment LG3 au sein des ApoExo. Toutefois, l’injection de vésicules ApoExo LG3-, provenant de cellules murines aortiques traitées à la bafilomycine, dans un modèle murin de greffe aortique induit une réponse auto-immune anti-LG3 ainsi qu’un remodelage vasculaire à des niveaux similaires aux souris ayant reçu des ApoExo véhicule. Une analyse protéomique de ces vésicules ApoExo LG3-, nous a révélé que la bafilomycine modifie le contenu protéique des ApoExo en induisant une augmentation de la présence de protéines lysosomiales et de la matrice extracellulaire dont le perlécan. Ceci suggère que la présence du motif LG3 au sein du perlécan natif non clivé dans les ApoExo LG3- pourrait être responsable de la mise en place de la réponse anti-LG3 observées chez les souris. Les travaux de ce doctorat ont permis de mettre en évidence que l’autophagie dans les cellules endothéliales productrices d’ApoExo ne régule pas l’immunogénicité des ApoExo. Cependant, elle régule au sein des cellules endothéliales apoptotiques le transport et le clivage du perlécan qui lui est immunogène. En effet, l’autophagie module les différentes formes de perlécan natif et clivé sécrétées dans les ApoExo. L’étude chez la souris greffée nous a donc permis de considérer non plus l’implication du fragment LG3 mais l’implication du motif LG3 présent au sein du perlécan natif non clivé et de ses différentes formes intermédiaires dans la réponse auto-immune anti-LG3 et le rejet vasculaire. La modulation de la sécrétion du perlécan et du LG3 dans les ApoExo constitue une cible thérapeutique potentielle afin de diminuer la réponse auto-immune pouvant augmenter le dommage vasculaire après la greffe
Ischemia/reperfusion (I/R) occurring in all solid organ transplantation, constitute a proautophagic / pro-apoptotic stimulus on endothelial cells. We recently demonstrated that apoptotic endothelial cells (CEapo) secrete apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) that induce autoimmune response and accelerate vascular rejection in a mouse aortic transplant model. These ApoExo, that differ from classical apoptotic bodies in structure and protein content, contain the C-terminal fragment of perlecan, LG3. LG3, an autoantigen of importance in transplantation, promotes vascular remodeling and is increased in circulation in renal transplant patients undergoing vascular rejection. In addition, the presence of anti-LG3 antibodies prior to transplantation is associated with a higher risk of developing vascular rejection in kidney transplant patients and long-term graft loss. It is known that the generation of LG3 fragment involves the proteolysis of perlecan by cathepsin-L, a lysosomal protease, but the mechanism of export of this fragment within ApoExo is still unknown. We hypothesized that lysosomal activity and autophagy play an important role in the maturation and the secretion of LG3 in ApoExo vesicles secreted by CEapo. Longitudinal electron microscopy study after 1h, 2h and 3h in serum starved endothelial human cells revealed the presence of perlecan / LG3 fragment within autophagic compartments (autophagosomes and autophagolysosomes) at different stages of the autophagic process. After 3 hours of serum starvation, we identified LG3 fragment in membrane vesicles located within large vacuolar networks reminiscent of autophagolysosomes. Inhibition of cathepsin-L, of lysosomal acidification and of autophagy decrease the presence of LG3 fragment in ApoExo vesicles without affecting vesicle secretion thus demonstrating the role of autophagy in the secretion of LG3 fragment within ApoExo. However, Injection of ApoExo LG3- vesicles from bafilomycin-treated aortic murine cells into a murine aortic transplant model induces autoimmune anti-LG3 response and vascular remodeling at levels similar to the ApoExo vehicle mice control group. Proteomic analysis of ApoExo from bafilomycin-treated aortic murine cells has demonstrated that bafilomycin modifies ApoExo protein content by inducing an increase of the presence of lysosomal proteins and the extracellular matrix, including perlecan. This suggests that the presence of LG3 motif in uncleaved native perlecan in ApoExo LG3- could be responsible for the establishment of the anti-LG3 response as well as the vascular remodeling observed in mice. Collectively, these results demonstrate that autophagy in endothelial cells producing ApoExo does not regulate the immuogenicity of ApoExo. However, it regulates within apoptotic endothelial cells the processing and cleavage of perlecan who is immunogenic. Indeed, autophagy modulates the different forms of native and cleaved perlecan secreted in ApoExo. Grafted mice study thus allowed us to consider neither the involvement of the LG3 fragment but the implication of the LG3 motif present in the uncleaved native perlecan and its intermediate forms in the anti-LG3 autoimmune response and vascular rejection. Modulating perlecan and LG3 secretion in ApoExo vesicles is a potential therapeutic target to reduce the autoimmune response that can increase vascular damage after transplantation.

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Schmidt, Maxime. "Développement d’une méthode de production de vésicules membranaires permettant l’étude du mode d’action des toxines insecticides de Bacillus thuringiensis." Thèse, 2016. http://hdl.handle.net/1866/19119.

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Abstract:

La plupart des toxines de Bacillus thuringiensis perméabilisent la membrane intestinale des insectes sensibles en formant des pores qui abolissent le potentiel électrique et les gradients ioniques. Plusieurs toxines ont été étudiées avec des vésicules purifiées de la bordure en brosse intestinale des insectes. Malheureusement, la membrane intestinale de beaucoup d’insectes ne forme pas des vésicules suffisamment étanches pour les expériences de perméabilisation. Une nouvelle technique utilisant des liposomes géants et une sonde de perméabilité membranaire a été développée pour caractériser deux nouvelles toxines particulièrement prometteuses pour le biocontrôle d’un des principaux ravageurs du maïs, la chrysomèle des racines du maïs (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 et la toxine binaire DS10/DS11. Les deux toxines perméabilisent efficacement les liposomes. La toxine binaire forme des pores qui sont légèrement sélectifs pour les cations, comme la plupart des toxines de B. thuringiensis. Bien que la Cry6Aa1 puisse former des pores sélectifs pour les anions, les résultats suggèrent aussi qu’elle pourrait, contrairement aux autres toxines de cette bactérie, ne former des pores qu’en présence d’une force ionique élevée. La formation des pores par ces deux toxines semble être sensible à la courbure de la membrane cible étant donné qu’elle est beaucoup plus efficace dans des liposomes géants que dans des liposomes de même composition, mais plus petits. Ce travail jette les bases de la mise au point d’une technique qui permettrait l’étude des toxines dans des liposomes géants enrichis avec des protéines et des lipides provenant de la membrane intestinale des insectes cibles.
Most Bacillus thuringiensis toxins permeabilize the intestinal membrane of susceptible insects by forming pores that abolish transmembrane electrical potentials and ionic gradients. Several toxins have been studied using brush border membrane vesicles purified from the insect midgut. Unfortunately, the intestinal membrane from many insects does not form vesicles that are tight enough to be used in permeabilisation experiments. A new technique using giant liposomes and a membrane permeability probe was developed to evaluate the pore-forming ability of two particularly promising toxins for the biocontrol of a major corn pest, the Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), Cry6Aa1 and the binary toxin DS10/DS11. Both toxins permeabilized the liposomes efficiently. However, analysis of the permeabilisation rates under different experimental conditions indicates that these toxins differ in their biophysical properties. The binary toxin forms pores which are slightly selective for cations, like most B. thuringiensis toxins. On the other hand, although the results suggest that Cry6Aa1 could form anion-selective pores, they could also indicate that, in contrast with other toxins produced by this bacterium, it could form pores only under high ionic strength conditions. Pore formation by both toxins appears to be sensitive to membrane curvature since it is much more efficient in giant liposomes than in liposomes with identical composition, but smaller in size. This study sets the bases for the development of a technique that would allow the toxins to be studied in giant liposomes enriched with proteins and lipids from the intestinal membrane of target insects.

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Bouvier, David. "Distribution intracellulaire et trafic des récepteurs à tyrosine kinase EphA4 et EphB2 à la synapse mature dans le système nerveux central murin." Thèse, 2008. http://hdl.handle.net/1866/6703.

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Ruffiot, Pauline. "Développement de systèmes membranaires modèles pour la vacuole parasitophore de Toxoplasma gondii :Interactions des protéines de granules denses (protéines GRA) avec des vésicules unilamellaires." Phd thesis, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00177965.

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Abstract:

Les protéines GRA sont sécrétées par le parasite intracellulaire Toxoplasma gondii dans la vacuole parasitophore, où elles interagissent pour la plupart avec deux systèmes de membranes tubulaires : les tubules séquestrant des organites de l'hôte (HOSTs) et le réseau de nanotubes membranaires (RNM). Bien que la plupart des protéines GRA contiennent des domaines transmembranaires potentiels, elles sont sécrétées sous des formes solubles et ne s'associent à des membranes qu'une fois qu'elles ont atteint leurs membranes-cibles dans la vacuole. Cette propriété inhabituelle nous a amenés à les considérer comme des modèles intéressants pour l'étude d'interactions protéinemembrane. J'ai développé deux approches expérimentales pour étudier les interactions des protéines GRA, extraites du parasite ou de la vacuole, avec des membranes-modèles. Premièrement, des approches biochimiques m'ont amenée à caractériser les formes de solubilisation des protéines GRA et leur association avec les membranes des petites vésicules unilamellaires (SUVs). Deuxièmement, j'ai développé une approche par spectroscopie de fluorescence, de protéines GRA associées aux membranes de vésicules unilamellaires géantes (GUVs). Les résultats fournissent des éléments de réponse qui (1) aident à décrypter le trafic des protéines dans le parasite et dans la vacuole et (2) ouvrent la voie pour la mise en place d'un système in vitro pour l'étude de la maturation de la vacuole parasitophore et de ses membranes tubulaires internes.

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Dissertations / Theses on the topic 'Trafic de vésicules membranaires'

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