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Dissertations / Theses on the topic 'TET protease'
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1
Marty, Vincent. "Adaptation de l'Archaea halophile halobacterium salinarum aux stress environnementaux : mécanismes de survie et rôle de la protéolyse intracellulaire." Thesis, Grenoble, 2011. http://www.theses.fr/2011GRENV087/document.
Full textAbstract:
Les systèmes moléculaires décrits chez les Archaea mettent en évidence un caractère primitif et une simplicité, comparativement à leurs homologues eucaryotes. Par ailleurs, leur caractère extrêmophile a pour conséquence une hyper-robustesse qui rend leur manipulation in vitro et les études structurales beaucoup plus aisées. Ainsi les Archaea représentent de bons modèles pour comprendre les fonctions cellulaires complexes, particulièrement celles qui mettent en jeu de grandes machineries moléculaires, comme celles impliquées dans la protéolyse. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les mécanismes de résistance et l'importance des systèmes de protéolyse dans l'adaptation des Archaea halophiles aux stress environnementaux. Les Archaea halophiles accumulent des concentrations multi-molaires de KCl/NaCl dans leur cytosol (3.4M KCl / 1.1M NaCl chez Halobacterium salinarum). Ainsi, les protéines de ces organismes sont elles-mêmes halophiles et ne sont solubles et repliées que dans des conditions de salinité extrêmes (de 2 à 5M).Nous avons étudié la réponse de l'Archaea halophile stricte H. salinarum à des stress, dont les stress à basse salinité, en se focalisant en particulier sur les modifications de la dynamique moléculaire du protéome in vivo (diffusion neutronique). Au cours de ce travail, il a été mis en évidence un phénomène de survie à la basse salinité associé à des modifications morphologiques.Un autre objectif de ma thèse a été de contribuer à la compréhension du rôle dans la protéolyse intracellulaire du complexe aminopeptidasique TET, dans les conditions de stress mises en place dans les études précédentesMolecular systems described for Archaea show primitive and simple characteristics, compared to their homologous eukaryotes. In addition, extremophilic characteristic results in an hyper-robust which makes in vitro manipulation and structural studies much easier. Thus, Archaea represent good models for understanding complex cellular functions, particularly those that involve large molecular machines, such as those involved in proteolysis. My thesis consisted in understanding the resistance mechanisms and the importance of proteolytic systems in the adaptation of halophilic Archaea to environmental stresses. Halophilic Archaea accumulate multi-molar concentrations of KCl / NaCl in their cytosol (3.4M KCl / NaCl 1.1M for Halobacterium Salinarum). This requires a very special biochemistry that allows operation in solvents where free water is scarce. Thus, the proteins of these organisms are themselves halophilic and are soluble and folded only in extreme salinity conditions (2 to 5 M). This particular biochemistry partly explain the extraordinary ability of halophilic Archaea to resist physical and chemical stress (temperature, radiation, dehydration). We study the response of the halophilic Archaea strict H. salinarum at low-salinity stress. Indeed, beyond the osmotic shock, the fall of the environment salt concentration causes a decrease in the intracellular KCl concentration, which should have a direct effect on the folding state of intracellular protein, as in case of heat stress. In the first part of this thesis, a study was conduct to determine viability limits and cytosolic modifications, associated with a salinity decrease. These studies involve intracellular salt dosages, viability studies (microscopic counts, color live / dead), induction of chaperone proteins linked to stress response and biophysical neutron experiments, to evaluate the effect of stress on proteins folding. In this work, a phenomenon of survival at low salinity linked to morphological changes was revealed. To describe this phenomenon, this second study involves confocal microscopy experiences, fluorescence microscopy, viability tests, counting on box, scanning electron microscopy, electron microscopy by negative staining, salt intracellular dosages and proteins separation experiments, to study the overall proteome composition during low salinity stress. In this study, a fall of the intracellular K $^+$ concentration and the proteome clarification during stress was revealed. Low salt concentrations causes halophiles proteins denaturation, the accumulation of misfolded proteins in the cytoplasm involves chaperones systems and intracellular proteolysis machinery. In this context, another objective of my thesis was to contribute to the understanding of the intracellular proteolysis role in the PAN-proteasome system and in the aminopeptidase TET complex, in stress conditions established in previous studies. This part of the thesis involves experiments of endopeptidase activity assay, aminopeptidase activity assay, quantification of mRNA genic expression by Northern blot, immunoprecipitation, proteins separation by sucrose gradient and proteasome chemical inhibition (drug). We show the role of the PAN-proteasome system in stress response and we deepen our understanding of the aminopeptidase TET role in vivo. This protease appears to have an independent role of the proteasome complex. The protease TET seems to participate at the amino acids treatment in cells to maintain the metabolic activities in nutritional deficiencies
2
Tonnaire, Thierry. "Conception et synthese d'inhibiteurs contraints de la protease du vih-1 (doctorat : pharmacochimie)." Paris 11, 1999. http://www.theses.fr/1999PA114843.
Full text
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Chan, Ka-ho John, and 陳家豪. "Effects of Chinese green tea on cigarette smoke-induced oxidative stress, inflammation and proteases/anti-proteases in rat lung in vivo." Thesis, The University of Hong Kong (Pokfulam, Hong Kong), 2010. http://hub.hku.hk/bib/B45199334.
Full textAbstract:
The Best PhD Thesis in the Faculties of Architecture, Arts, Business &Economics, Education, Law and Social Sciences (University of HongKong), Li Ka Shing Prize, 2008-2009published_or_final_version
Medicine
Doctoral
Doctor of Philosophy
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CARRON, CLEMENCE. "Etude fonctionnelle de la proteine tel et des onco-proteines derivees tel-pdgfr et tel-jak2." Paris 6, 1999. http://www.theses.fr/1999PA066554.
Full textAbstract:
Les regulateurs transcriptionnels de la famille ets participent a divers processus oncogeniques chez l'homme. Ils sont impliques sous forme de proteines de fusion issues de translocations chromosomiques specifiques. Tel appartient a la famille ets. Tel est remanie dans plusieurs leucemies humaines. Dans ces remaniements chromosomiques, tel est fusionne a differents partenaires (pdgfr, abl, jak2, tkc, aml1). Le plus souvent, c'est la partie 5 de tel qui est fusionnee a la portion 3 des genes partenaires. Cette region de tel code, notamment, un domaine conserve entre certaines proteines ets, le domaine b. Les proprietes biochimiques et fonctionnelles du domaine b n'etaient pas connues au moment ou nous avons debute nos travaux. Nous avons etudie le role du domaine b de tel dans la fonction de la proteine tel sauvage ainsi que dans les proteines de fusion tel-pdgfr et tel-jak2. Nous avons montre que le domaine b de tel est un domaine d'interaction proteique homotypique. Cette propriete est specifique du domaine b de tel car le domaine b d'autres proteines ets ne presente pas cette capacite d'auto-association. Nous avons montre que tel-pdgfr forme des homo-oligomeres in vivo. Cette auto-association permet l'activation constitutive de l'activite tyrosine kinase intrinseque de tel-pdgfr. Les proprietes mitogeniques de tel-pdgfr reposent sur la capacite du domaine b de tel a induire son auto-association. Par ailleurs, nous avons montre que, contrairement a la majorite des proteines ets qui sont des activateurs transcriptionnels, tel est un represseur. Cette propriete repose en partie sur la capacite de tel a s'auto-associer. Enfin, nous avons teste les proprietes oncogeniques de tel-jak2 in vivo en generant et en etudiant des souris transgeniques exprimant cette proteine dans le lignage lymphoide. Ces animaux developpent des leucemies t fatales. Ces resultats ont permis de definir l'implication du domaine b de tel dans le fonctionnement de tel sauvage et dans les proprietes transformantes des proteines derivees tel-pdgfr et tel-jak2. Les animaux transgeniques que nous avons generes seront utiles pour analyser in vivo l'importance des voies de signalisation de jak2 dans les processus oncogeniques. Ces animaux ouvrent aussi la perspective d'un developpement d'experimentations a but therapeutique.
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Bengtsson, Martin. "PURIFICATION AND CLEAVAGE OF FUSION PROTEIN CONTAINING THE PHOTOSYSTEM I SUBUNIT PSI-N USING AFFINITY CHROMATOGRAPHY AND TEV PROTEASE." Thesis, Halmstad University, School of Business and Engineering (SET), 2009. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:hh:diva-1749.
Full textAbstract:
A method describing the expression and purification of PSI-N together with fusion protein, using affinity chromatography and TEV protease. Although the method proved successful, optimization is still needed due to partial degradation of PSI-N.
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DE, VUYST Guillaume. "LA PROTEINE MC1 D'ARCHAEABACTERIE : RECONNAISSANCE DE SEQUENCES PARTICULIERES." Phd thesis, Université d'Orléans, 2004. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00009918.
Full textAbstract:
La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l?ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l?ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L?oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l?ADN.
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Malnoë, Alizée. "A genetic suppressor approach to the biogenesis, quality control and function of photosynthetic complexes in Chlamydomonas reinhardtii." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01057821.
Full textAbstract:
Central in oxygenic photosynthesis, the cytochrome b6f complex, couples electron transfer to proton translocation across the thylakoid membrane via its quinol:plastocyanin oxidoreductase activity, contributing to ATP formation. Cytochrome b6f complex differs from its respiratory homolog, the bc1 complex, by the presence of an additional heme, heme ci located within the quinone reduction site Qi and attached by a unique thioether bond. Mutants lacking heme ci show low accumulation of partially functional b6f complex and, hence, cannot grow phototrophically. This grounded a screen for suppressor mutations that would restore higher accumulation of b6f complexes whose function, even if compromised, would sustain phototrophic growth.The genetic suppressor approach undertook in Chlamydomonas reinhardtii during this PhD thesis led to the isolation and characterisation of the ftsh1-1 protease mutant (mutation R420C which should affect ATP hydrolysis). The mutant ftsh1-1 proved to be a versatile tool for the functional study of otherwise degraded proteins. The combination of genetic, biochemical, physiological and biophysical experiments demonstrated notably that: (i) a QiKO mutant, whose b6f complexes are devoid of both bh and ci hemes, can grow phototrophically despite a broken Q-cycle, (ii) the absence of covalently bound heme ci, in the Rccb2 mutant, triggers photosensivity enhanced in the presence of O2 supporting a role for heme ci in oxygen rich environment, (iii) FtsH is involved in the maintenance of the main photosynthetic complexes.
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Gummel, Jérémie. "STRUCTURES ET MECANISMES DE FORMATION DE COMPLEXES POLYELECTROLYTE-PROTEINE." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2006. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00120315.
Full textAbstract:
Les mécanismes régissant la formation de complexes constitués de chaînes polymères chargées (polyélectrolytes) et de protéines, rencontrés dans l'agro-alimentaire, la pharmacologie ou la biologie, mènent à des structures mal connues jusqu'ici. Nous les avons étudiées par Diffusion de Neutrons aux Petits Angles (DNPA), associée au marquage par deutériation du polymère et à la variation de contraste dans des mélanges eau lourde - eau légère. La protéine est le lysozyme (chargé positivement à pH < 11) et le polyélectrolyte le polystyrène sulfonate (PSS, toujours chargé négativement) ; le rapport des charges apportées([-]/[+]) est un paramètre essentiel. Lorsqu'il est proche de 1, on obtient soit un gel de PSS réticulé par les protéines, qui contractent partiellement les chaînes de PSS, tout en les laissant en régime interpénétré (semi dilué), soit des globules denses (rayon ~10 nm) avec agrégation fractale à plus grande échelle lorsque, après contraction, les chaînes sont trop courtes et passent en régime désinterpénétré (dilué). Cette structure très bien définie a permis une étude fouillée: nous avons montré que le coeur des globules possède une charge nulle, que les espèces introduites en excès du point de vue électrostatique restent en solution, éventuellement dans des couronnes pour le PSS, et que leur taille finie est fixée par la force ionique. Une mesure spécifique de la localisation des contre-ions a prouvé qu'ils sont expulsés du coeur des complexes lors de leur formation. La conformation des chaînes au sein des complexes a été mesurée par marquage adapté. Enfin lorsque [-]/[+]>>1, un réseau transitoire fluide et limpide de protéines dénaturées par le PSS est obtenu.
9
Jimenez, Clément. "Caracterisation de proteines synthetisees et secretees dans la tete de l'epididyme de souris dont l'expression est regulee par les androgenes." Clermont-Ferrand 1, 1989. http://www.theses.fr/1989CLF13824.
Full text
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Agez, Morgane. "ETUDE STRUCTURALE ET FONCTIONNELLE DE LA PROTEINE CHAPERON D'HISTONES ASF1." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00268886.
Full textAbstract:
Au sein des cellules eucaryotes, l'ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l'ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d'histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d'une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d'autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d'étude des mécanismes moléculaires d'assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1.
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Medeiros, Melissa Soares. "Genotyping and antiretroviral resistance profile test from HIV-1 samples in patients with therapeutic failure from CearÃ." Universidade Federal do CearÃ, 2006. http://www.teses.ufc.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=39.
Full textAbstract:
Faculdade ChristusIntroduction: Genotypic testing for HIV-1 drug resistance is useful for selecting antiretroviral drugs for patients developing treatment failure. O melhor entendimento da sua interpretaÃÃo facilitarà sua utilizaÃÃo como ferramenta mÃdica na terapÃutica do HIV. The optimal understanding of its interpretation will give an important tool for HIV treatment. Objective: To identify common combinations of resistance mutations and antiretroviral resistance profile. Methods: Between April 2002 and March 2004, 101 protease and reverse transcriptase (RT) sequences were determined for HIV-1 isolates from patients who were failing antiretroviral therapy. Resistance profile was obtained by Stanford program. Results: male were 76.2%, median age 38 years, CD4 media was 279.21 cells/mm3 and Viral load 4.49 log. Total of 31 mutational patterns were detected to protease inhibitor (IP), 49 to nucleoside RT inhibitor (NRTI), and 17 to nonnucleoside RT inhibitor (NNRTI). K65R was detected in 5.9% isolates. The most frequent mutations were L90M, M184V and K103N to IP, NRTI and NNRTI respectively. The main mutational patterns accounted for 49% of mutant sequences to IP, 38.5% to ITRN accounted and 40,9% to NNRTI. Patients with three or more therapeutic failure had worst resistance profile to all IP except for Lopinavir, and NRTI except for Tenofovir. High resistance to Lamivudine and NNRTI were independent of failure quantity. Conclusion: The best susceptibility was found to Lopinavir at IPâs class and to Tenofovir at ITRNâs. The main mutational patterns to IP, ITRN and NNRTI represented almost half of all patterns found.
A Genotipagem està sendo usada como mÃtodo para guiar a seleÃÃo de antiretrovirais em pacientes com falha terapÃutica. O melhor entendimento da sua interpretaÃÃo facilitarà sua utilizaÃÃo como ferramenta mÃdica na terapÃutica do HIV. Objetivo: Avaliar o perfil de resistÃncia aos antiretrovirais e identificar padrÃes mutacionais das seqÃÃncias de protease e TR do HIV-1. MÃtodos: Foram estudadas as sequÃncias de genes da protease e TR isoladas de 101 amostras de pacientes com HIV-1 em falha terapÃutica, entre abril/2002 a marÃo/2004, atravÃs de Genotipagem realizadas no CearÃ. O Banco de dados de Stanford foi utilizado para avaliaÃÃo de resistÃncia e SPSS versÃo 11 e Epi Info versÃo 6 para anÃlise estatÃstica. Resultados: Sexo masculino 76,2%, mediana de idade 38 anos, CD4 mÃdio de 279,21 cells/mm3 e Carga Viral 4.49 log. Na classe de Inibidores de Protease (IP) 31 padrÃes mutacionais foram encontrados, nos inibidores da transcriptase reversa anÃlogos de nucleosÃdeos (ITRN) 49 e para inibidores da transcriptase reversa nÃo anÃlogos de nucleosÃdeos (ITRNN) 17. As mutaÃÃes mais frequentes foram L90M, M184V e K103N para IP, ITRN e ITRNN espectivamente. A K65R foi detectada em 5,9% dos isolados. TrÃs ou mais falhas terapÃuticas apresentaram maior perfil de resistÃncia para todos os IPs exceto para Lopinavir, e para todos os ITRNs exceto para Tenofovir. Os seis principais padrÃes mutacionais para IPs equivaleram a 49% das sequÃncias, para ITRNs a 38,5%, e para ITRNNs os dois principais padrÃes corresponderam a 40,9%. Foram encontrados altos Ãndices de resistÃncia para ITRNNs independente da quantidade de falhas terapÃuticas. ConclusÃo: Nos IPs a menor resistÃncia encontrada foi ao Lopinavir e nos ITRNs ao Tenofovir. Os principais padrÃes mutacionais para IPs, ITRNs e ITRNNs representaram quase metade de todos os padrÃes de resistÃncia encontrados.
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Jullien, Denis. "Psoriasis et infection par le vih : a propos de cinq cas ; place de la proteine tat dans la pathogenie." Lyon 1, 1994. http://www.theses.fr/1994LYO1M131.
Full text
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Kostallas, George. "Intracellular systems for characterization and engineering of proteases and their substrates." Doctoral thesis, KTH, Molekylär Bioteknologi, 2011. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-33549.
Full textAbstract:
Over the years, the view on proteases as relatively non-specific protein degradation enzymes, mainly involved in food digestion and intracellular protein turnover, has shifted and they are now recognized as key regulators of many biological processes that determine the fate of a cell. Besides their biological role, proteases have emerged as important tools in various biotechnical, industrial and medical applications. At present, there are worldwide efforts made that aim at deciphering the biological role of proteases and understanding their mechanism of action in greater detail. In addition, with the growing demand of novel protease variants adapted to specific applications, protease engineering is attracting a lot of attention. With the vision of contributing to the field of protein science, we have developed a platform for the identification of site-specific proteolysis, consisting of two intracellular genetic assays; one fluorescence-based (Paper I) and one antibiotic resistance-based (Paper IV). More specifically, the assays take advantage of genetically encoded short-lived reporter substrates that upon cleavage by a coexpressed protease confer either increased whole-cell fluorescence or antibiotic resistance to the cells in proportion to the efficiency with which the substrates are processed. Thus, the fluorescence-based assay is highly suitable for high-throughput analysis of substrate processing efficiency by flow cytometry analysis and cell sorting, while the antibiotic resistance assay can be used to monitor and identify proteolysis through (competitive) growth in selective media. By using the highly sequence specific tobacco etch virus protease (TEVp) as a model in our systems, we could show that both allowed for (i) discrimination among closely related substrate peptides (Paper I & IV) and (ii) enrichment and identification of the best performing substrate-protease combination from a background of suboptimal variants (Paper I & IV). In addition, the fluorescence-based assay was used successfully to determine the substrate specificity of TEVp by flow cytometric screening of large combinatorial substrate libraries (Paper II), and in a separate study also used as one of several methods for the characterization of different TEVp mutants engineered for improved solubility (Paper III). We believe that our assays present a new and promising path forward for high-throughput substrate profiling of proteases, directed evolution of proteases and identification of protease inhibitors, which all are areas of great biological, biotechnical and medical interest.QC 20110516
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Engel, Elodie. "Identification des "Ubiquitin Specific proteases" impliquées dans la régulation des voies de l'immunité chez la drosophile." Phd thesis, Université Joseph Fourier (Grenoble), 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00403268.
Full textAbstract:
La dérégulation des facteurs NF-κB, impliqués dans la survie cellulaire et l'inflammation, peut entraîner des pathologies inflammatoires chroniques et des cancers. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse était d'identifier des régulateurs négatifs des voies NF-κB conservées au cours de l'évolution, Toll et Imd, chez la drosophile. De nombreux éléments de ces voies sont régulés par ubiquitination. Les « Ubiquitine Specific Proteases » (USPs) constituent ainsi un nouveau champ d'investigation pour rechercher des régulateurs de ces voies. J'ai réalisé le crible d'une collection d'ARN interférents permettant l'inactivation des 21 USPs de drosophile en cellules S2. Ce crible a mis en évidence trois régulateurs négatifs de la voie Imd, dont un montre également une activité sur la voie Toll. Parmi ces candidats, dUSP36, un homologue de la protéine humaine USP36, avait été préalablement sélectionné par un crible génétique au laboratoire. Des études de l'équipe auxquelles j'ai contribué, montrent son rôle in vivo dans la régulation négative de la protéine adaptatrice Imd via son activité catalytique. Afin de caractériser la fonction des deux autres USPs, j'ai mené des expériences de transgénèse chez la drosophile qui prouvent que ces deux USPs répriment la voie Imd en cas d'infection et qu'elles sont requises pour maintenir l'état inactif de la voie Imd en l'absence d'infection. J'ai également entrepris de caractériser l'activité catalytique des deux USPs in vitro. L'originalité de mon travail a consisté à limiter le crible à une famille de gènes, ce qui a permis de détecter de nouveaux régulateurs qui n'avaient pas été mis en évidence dans des cribles antérieurs.
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Gally, Fabienne. "Etude structure/fonction d'une proteine ABC : SUR, le récepteur des sulfonylurées." Phd thesis, Grenoble 1, 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011848.
Full textAbstract:
Le canal KATP résulte de l'assemblage d'un canal potassique inhibé par l'ATP intracellulaire (Kir6.2) et d'un transporteurABC, le récepteur des sulfonylurées (SUR) de la famille MRP/ABCC. SUR a un rôle régulateur essentiel : il confère au
canal une sensibilité accrue à l'inhibition par l'ATP, provoque son activation lorsque l'ADP augmente, et est la cible des
activateurs et bloqueurs pharmacologiques du canal.
Nous nous sommes intéressés à divers aspects structure/fonction de SUR en tant que modèle de transporteur ABC
eucaryote. Son couplage naturel à un canal ionique en facilite grandement l'étude grâce à la technique
électrophysiologique du patch-clamp.
La poursuite des travaux pour déterminer la nature moléculaire de la sélectivité des isoformes de SUR aux ouvreurs
pharmacologiques nous a permis de conclure que seul le faible encombrement de la Thr1253 de SUR2A, contre la Met
1290 de SUR1, serait le critère important pour l'activation pharmacologique des canaux KATP.
Nos travaux ont ensuite porté sur un domaine de la sous-unité SUR riche en acides aminés chargés négativement
(succession de 15 résidus glutamates ou aspartates) qui s'est avéré ne pas être impliquée dans la fonction du canal dans
notre système d'expression.
Nous avons étudié l'effet des ions Zn2+ et Cd2+ intracellulaires sur les canaux KATP et montré que ces ions peuvent activer
les canaux via leur liaison à SUR. Ce site de liaison reste encore à déterminer.
Nous avons enfin essayé de comprendre le rôle de chacun des domaines de liaison des nucléotides et nous avons pour cela
conçu des protéines SUR2A possédant des NBD identiques (NBD1-NBD1 et NBD2-NBD2) ou inversés (NBD2-NBD1).
Nos résultats suggèrent que (1) les NBD sont interchangeables (2) l'activation pas le Mg-ADP requiert les deux NBD (3)
l'action des ouvreurs est indépendante du NBD2.
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PAROLIN, DEBORA. "MESSA A PUNTO DI TEST ALTERNATIVI PER LO SCREENING DI POTENZIALI INIBITORI DELLA PROTEASI DI HIV-1." Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2014. http://hdl.handle.net/2434/231147.
Full textAbstract:
Current AIDS therapies are mainly based on the use of inhibitors targeting the active site of enzymes which are crucial for the HIV-1 replication cycle. However, due to the HIV-1 high mutation frequency and the small target size, escape mutants emerge in the long term which show resistance to such inhibitors. In the attempt to overcome this problem, it is therefore desirable to switch the attention to target enzymes which are crucial for HIV-1 survival. My attention was drawn in particular to the HIV-1 protease precursor maturation process as a possible pharmacological target.
The currently available tests for the screening of putative inhibitors of enzyme activity are based on the use of HIV-1-infected cell cultures which make use of live virus and therefore are cumbersome and expensive. I therefore decided to try to set up alternative methods based on the inhibition of specific target functions by developing in vitro as well as in vivo assays based on both prokaryotic and eukaryotic cells, thus avoiding the use of live virus. These assays might be proposed as a first-line screening test which might subsequently be confirmed by performing the live-virus assay only on pre-selected promising candidates.
In order to meet the objectives it was necessary to clone and to express the HIV-1 protease precursor, a molecule endowed with intrinsic folding and self-processing features, with the aim of studying its properties in vitro on isolated molecules, as well an in vivo, inside bacterial as well as eukaryotic cells.
The first aim was the production and purification of the HIV-1 protease precursor in a prokaryotic cell. The purified protein would be used in immuno-enzyme assays for a detailed study of its folding process, thus gaining access to the possibility of checking the activity of putative folding inhibitors. The precursor was in fact purified making use of the His tag. However, the extraction procedures required to stabilize such a hydrophobic and maturation-prone molecule turned out to be too harsh and led to the loss of maturation capacity. Therefore, I decided to postpone this part of the project and to concentrate on the in vivo assay, which looked more promising in the short term. The second target was more quickly met: the aim was to develop a quick and reliable microbiological assay suitable to screen for folding inhibitors and for inhibitors of HIV-1 protease activity. The bacterial strain carrying the precursor gene can be induced to express the precursor which quickly maturates into protease, thus being toxic for the bacterial host. This growth arrest can be released by treatment with inhibitors of the folding process, which limit the amount of mature enzyme produced, and by inhibitors of the enzyme activity, thus resulting in bacterial cell survival. This test can be modified for large-scale application and has been used as the starting point for the development of a similar test making use of a human lymphoblastoid cell line expressing the protease precursor.
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Empel, Jutta van. "Untersuchungen der regulatorischen Eigenschaften der HIV-1 Proteine Rev und Tat in humanen Astrozyten." Diss., lmu, 2000. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-1819.
Full text
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DUPLAN, CHANUT HELENE. "La proteine tat du virus vih-1 : expression chez escherichia coli, purification et activite." Toulouse, INSA, 1995. http://www.theses.fr/1995ISAT0039.
Full textAbstract:
La proteine tat du virus vih-1 est un trans-activateur puissant permettant la surexpression de tous les genes viraux, par l'intermediaire de sa cible arn, tar, situee dans le ltr 3' du virus. L'objectif premier de ce travail a ete de purifier la proteine tat sous forme native correctement repliee afin de tester son activite biologique. Differents systemes d'expression et schemas de purification ont ete etudies, dans lesquels l'usage d'agents denaturants a ete proscrit, car la renaturation d'une telle proteine genere le plus souvent un melange en partie inactif. Le gene tat a ete clone et exprime chez e. Coli, seul ou en fusion avec les genes de la glutathione s-transferase (gst) ou de la beta-galactosidase. Seule la fraction de proteine tat soluble, non agregee est utilisee dans les procedures de purification. Par rapport a tat, les niveaux d'expression et de solubilite de la fusion gst-tat sont significativement ameliores (7-8% des proteines totales, dont 80% solubles). Toutefois, l'utilisation de la beta-galactosidase en tant qu'etiquette de purification par affinite s'est averee plus efficace et specifique que la gst. La mise au point de la chromatographie d'immunoaffinite a finalement permis d'isoler tat, non fusionnee ou issue du clivage de la fusion beta-gal-tat par la thrombine, a plus de 90% de purete. Les differents echantillons de tat ont ete testees in vitro pour determiner leur capacite, d'une part a interagir avec tar, et d'autre part a trans-activer l'expression du gene rapporteur cat dans des cellules hela en culture. Les differentes voies de production de tat ne sont pas strictement equivalentes en terme d'activite biologique. Toutes les formes presentent une certaine activite trans-activatrice mais les resultats les plus coherents entre les deux tests sont obtenus avec la proteine non fusionnee. Ceci indique que le repliement de tat, implique dans son activite biologique, est probablement modifie par son partenaire de fusion. Des etudes preliminaires montrent par ailleurs que la proteine tat purifiee exogene est capable d'activer des cellules endotheliales, en provoquant leur adhesion a une lignee de macrophages en synergie avec le tnf-alpha. Tat pourrait ainsi jouer un role indirect dans l'inflammation et eventuellement dans la dissemination des tumeurs, associees a l'infection par le virus
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BELLON, HELENE. "Dosage des proteines glycosylees (par chromatographie d'affinite et test fructosamine roche) chez des enfants diabetiques et controles." Nice, 1988. http://www.theses.fr/1988NICE6019.
Full text
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Mustafa, Mohammad Zahid. "Autoantibody signatures defined by serological proteome analysis in sera of patients with cholangiocarcinoma." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2014. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01058149.
Full textAbstract:
Cholangiocarcinoma (CC) is a rare but fatal primary liver cancer and accounts for an estimated 15% of primary liver cancer worldwide. It is associated with high mortality due to the lack of established diagnostic approaches. Autoantibodies can be used clinically as diagnostic markers for early cancer detection of cholangiocarcinoma. Studies, indicating the presence of auto-antibodies (AAbs) in CC have not been reported yet. No immunological biomarker, correlated to the disease, has been identified. The objective of our study was to identify cellular proteins from liver tissues (tumoral and non tumoral) and cholangiocarcinoma cell lines which could be recognized by antibody of CC patients. We used serological proteome analysis (SERPA) technique which leads us to suggest some molecules as potential biomarkers for the early diagnosis of CC. Proteins from different origins were 2DE separated: CCSW1 and CCLP1 tumor cell lines, five different samples of hepatectomies for CC with respect to their tumoral and non-tumoral counterparts and a normal liver from amyloid neuropathy. Sera from 13 CC patients and a pool of 10 healthy subjects were probed on immunoblot performed with these different separations. Comparison of immunoblotting patterns given by patient's sera compared to patterns given by controls allowed to define immunoreactive spots of interest and those reacting with more than one-third of sera were identified by orbitrap type mass spectrometry. In this way we identified 10, 11, 9, 14 and 16 proteins from CCSW1, CCLP1, tumor part, non-tumor counterpart and normal liver antigenic extracts respectively. Different patterns of reactivity were observed according to sera on the same antigenic extract, and for a same serum, according to the antigenic extract, even though few common patterns were also observed. This widespread of reactivity is not unusual and reported earlier in several studies of this sort. It is indicated that a single AAb have an ability to identify only a small proportion of patient. For this reason, several antibodies in combination must be used to ensure sensitivity and specificity of assays used in the daily clinic.Identified proteins were then categorized by gene ontology analysis by which they fall into three main groups; biological process and molecular functions, protein class and molecular pathway and cellular component, according to the Panther classification. By Gene Ontology classification, two different patterns of targeted antigens were observed. The vast majority of targeted-proteins with catalytic activity were found in normal liver or non-tumor specimens. The second pattern was mainly represented by targeted proteins categorized as structural proteins extracted from CC cell lines and tumor tissues. Proteins identified with catalytic activity were: alpha-enolase, fructose biphosphate aldolase B and glyceraldedyde 3-phosphate dehydrogenase; which were reactive with more than 50% of CC sera. Proteins identified with structural activity, and detected with high rates by using cell lines and tumor tissues, were: vimentin, prelamine A/C, annexin A2 and actin; reactivity of each protein was higher than 62% with CC sera. Serotranferrin, identified under the category of transfer/carrier proteins, recognized by 100% of CC sera by using tumor tissues.High sensitivity and specificity is a prime requisite of AAbs that might be used as CC biomarkers for CC diagnosis. Most of the AAbs detected in this study had previously been reported in other cancers and auto-immune disorders. Hence it is essential to prove the specificity of antigenic proteins, a combination of various antigens therefore needs to be tested to enable the development of new biomarkers for the diagnosis and prognosis of CC.In conclusion, the proposed potential biomarkers need to be tested in a variety of different combinations with a panel of significant number of patients and using the most appropriate substrate defined during this study.
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Huang, Xiaohua. "Der Einfluss des HIV-1 Tat-Proteins auf das Proteasom-System und die Folgen für die zelluläre Immunabwehr." Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité, 2002. http://dx.doi.org/10.18452/14733.
Full textAbstract:
Das HIV-1 Tat-Protein hemmt die Peptidase-Aktivität des 20S Proteasoms durch Konkurrenz mit dem 11S Regulator/PA28 um die Bindungsstelle am Proteasom. Aus den kinetischen Daten und durch Strukturvergleiche geht hervor, dass die Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 des Tat-Proteins für den Effekt auf das 20S Proteasom verantwortlich sind und die REG/Tat-Proteasom-Bindungsstelle bilden. Eine in der 11S Regulator alpha-Untereinheit (REG alpha) identifizierte vergleichbare Struktur wird von den Aminosäuren Glu235, Lys236 und Lys239 gebildet. Durch eine Mutation der REG alpha Aminosäuren Glu235 und Lys236 zu Ala geht die Fähigkeit des REG alpha die Peptidase-Aktivität des 20S Proteasoms zu stimulieren verloren, während die Bindungsfähigkeit an den 20S Komplex erhalten bleibt. Die Bindungsstelle in REG alpha ist für die verstärkte Präsentation eines Epitops des Cytomegalovirus pp89 durch MHC Klasse I essentiell. Das Tat-Protein und das Tat-Peptid 37-72 unterdrücken die 11S-Regulator vermittelte Antigenpräsentation des pp89 Epitops. Im Gegensatz dazu weist das Tat-Peptid mit Mutation der Aminosäuren Lys51, Arg52 und Asp67 zu Ala keine Reduktion der Antigenpräsentation auf.The HIV-1 Tat protein inhibits the peptidase activity of the 20S proteasome and competes with the 11S regulator/PA28. Kinetic assays and structural comparison found amino acids Lys51, Arg52 and Asp67 of Tat to be responsible for the effects on proteasomes, forming the REG/Tat-proteasome-binding site. A similar site identified in the 11S regulator alpha subunit (REG alpha) consists of the residues Glu235, Lys236 and Lys239. Mutation of the REG alpha amino acids Glu235 and Lys236 to Ala resulted in a REG alpha mutant that lost the ability to activate the 20S proteasome even though it still binds to the 20S complex. The site in REG alpha is needed to enhance the presentation of a cytomegalovirus pp89 protein-derived epitope by MHC class I molecules. Full-length Tat and the Tat peptide 37-72 suppressed 11S regulator-mediated presentation of the pp89 epitope. In contrast, a Tat peptide with mutation of amino acids Lys51, Arg52 and Asp67 to Ala was not able to reduce antigen presentation.
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Nussbaum, Alexander Konrad. "From the test tube to the World Wide Web the cleavage specificity of the proteasome /." [S.l. : s.n.], 2001. http://www.bsz-bw.de/cgi-bin/xvms.cgi?SWB9193907.
Full text
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Bensaid, Ahmed. "ROLE DE L'AVERSION GUSTATIVE CONDITIONNEE ET DE LA SATIETE DANS LA DEPRESSION DE LA PRISE ENERGETIQUE INDUITE PAR LES REGIMES HYPERPROTEIQUES CHEZ LE RAT." Phd thesis, INAPG (AgroParisTech), 2003. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00005716.
Full textAbstract:
LES REGIMES HYPERPROTEIQUES INDUISENT UNE DEPRESSION DE LA PRISE ENERGETIQUE CHEZ LE RAT. LES MECANISMES SOUS-TENDANT CETTE DEPRESSION SONT MAL CONNUS. L'OBJET DE CETTE THESE EST D'ANALYSER LES ROLES RESPECTIFS DE LA PALATABILITE, DE LA SATIETE, ET DE L'AVERSION GUSTATIVE CONDITIONNEE DANS CE PHENOMENE. LAPPLICATION DE LA METHODE DENREGISTREMENT DE LA PRISE ALIMENTAIRE ET DE VIDEO ANALYSE A DES RATS, LORS DE LA TRANSITION DUN REGIME NORMOPROTEIQUE (14%) VERS UN REGIME HYPERPROTEIQUE (>50%), MONTRE DES MODIFICATIONS TRANSITOIRES DU COMPORTEMENT DE LANIMAL LORS DU PREMIER JOUR : REDUCTION DE LA TAILLE DU REPAS, DIMINUTION DE LA VITESSE DINGESTION ET MODIFICATION DE LA SEQUENCE COMPORTEMENTALE DE SATIETE. APRES ADAPTATION AU REGIME HYPERPROTEIQUE, LA QUANTITE DENERGIE INGEREE AVEC LE REGIME HYPERPROTEIQUE RESTE NEANMOINS EN DEÇA DE CELLE INGEREE EN REGIME NORMOPROTEIQUE ET LE POIDS DES ANIMAUX RECEVANT UN REGIME HYPERPROTEIQUE EST PLUS FAIBLE. DES LE SECOND OU TROISIEME JOUR, SELON LA PROTEINE ALIMENTAIRE UTILISEE, LA SEQUENCE COMPORTEMENTALE DE SATIETE N'EST PLUS DIFFERENTE DE CELLE INDUITE PAR UN REPAS NORMOPROTEIQUE. L'ABSENCE D'AVERSION GUSTATIVE CONDITIONNEE ET LA PRESENCE D'UN EFFET SATIETOGENE DES PROTEINES A ETE CONFIRMEE QUAND LES RATS, ELEVES SUR UN REGIME NORMOPROTEIQUE, ET RECEVANT TROIS REPAS PAR JOUR, INGERENT UN EN-CAS PROTEINE. LES PROTEINES DEPRIMENT PLUS LA PRISE ALIMENTAIRE LORS DU REPAS SUIVANT QUE LES GLUCIDES. LANALYSE DE LA SEQUENCE ALIMENTAIRE MONTRE QUE LA DIMINUTION DE LA TAILLE DU REPAS INDUITE PAR LES CHARGES PROTEIQUES 35% ET 50% EST DU A UN EFFET SATIETOGENE ET NON A UNE AVERSION GUSTATIVE CONDITIONNEE. NOTRE ETUDE A AUSSI MONTRE QUE PLUSIEURS PARAMETRES BIOCHIMIQUES (AMINOACIDEMIE TOTALE, ACIDES AMINES BRANCHES ) OU HORMONAUX (LEPTINEMIE) SONT SUSCEPTIBLES DETRE A LA BASE DES SIGNAUX ENVOYES AU CERVEAU POUR INITIER LA BAISSE DE PRISE ALIMENTAIRE. EN RESUME, LES RATS NE DEVELOPPENT PAS UNE AVERSION GUSTATIVE CONDITIONNEE VIS A VIS DU REGIME HYPERPROTEIQUE. LES MODIFICATIONS DE LA PRISE ALIMENTAIRE ET DU COMPORTEMENT, CORRESPONDENT PLUS A UN EFFET SUR-SATIETOGENE DU REGIME HYPERPROTEIQUE COMBINE A SA FAIBLE PALATABILITE ET A UNE NECESSAIRE ADAPTATION METABOLIQUE DE L'ANIMAL A CE REGIME. NOS RESULTATS, QUE CE SOIT DANS LE CADRE DE L'INGESTION D'UN REGIME HYPERPROTEIQUE OU, PLUS SIMPLEMENT LORS D'UN REPAS, MONTRE QUE L'INGESTION DE PROTEINES S'ACCOMPAGNE D'UN EFFET SATIETOGENE QUI RESTE A EXPLIQUER
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Mangeol, Pierre. "Interaction entre la proteine ribosomique L20 et l'ARN 23S : sondage direct par piege optique." Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00873738.
Full textAbstract:
La thèse présentée est centrée sur des mesures de force appliquées à des ARN seuls ou en interaction avec une protéine. L'un des plus grands défis posé par l'ARN provient de sa structure, notamment parce que les interactions de ses bases ne se limitent pas aux paires de type Watson-Crick et que les interactions tertiaires sont courantes. Les mesures de force donnent des informations complémentaires aux mesures classiques, car elles permettent de sonder directement les interactions complexes de l'ARN et fournissent des paramètres thermodynamiques inaccessibles autrement. L'étude de l'interaction protéine-ARN par mesure de force permet également d'accéder à des caractéristiques que les autres techniques ne peuvent pas offrir. Néanmoins avant d'atteindre les promesses de ce type de mesure, il faut concevoir un montage adapté et optimisé. Une première partie de la thèse a été dédiée à la conception d'une double pince optique permettant l'étude des ARN avec une résolution proche de la paire de base, en implantant notamment des améliorations techniques jusque là absentes de la littérature. La suite de la thèse s'est attachée à des études biologiques. Nous avons commencé par sonder l'interaction de la protéine ribosomique L20 avec son ARN cible dans le ribosome. Nous avons montré que cette protéine très importante dans les premiers stades de la formation du ribosome, stabilise fortement son ARN cible. Nous avons également déterminé son site de fixation à trois bases près. Nous avons ensuite débuté une étude sur des ARN synthétisés pour l'étude d'une hélicase à motif DEAD en caractérisant leurs réponses à une sollicitation mécanique.
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Philippon, Valérie. "Etude in vivo du role de la proteine tat dans la pathogenese associee aux infections lentivirales." Paris 7, 1994. http://www.theses.fr/1994PA077177.
Full textAbstract:
Les lentivirus visna et vih-1 infectent respectivement le mouton et l'homme et induisent des maladies a evolution lente. Nous avons etudie a l'aide de modeles animaux murins, le role de la proteine tat dans la pathogenese associee a l'infection par ces virus. Dans la premiere partie du travail, nous avons montre apres injection dans le cerveau de rongeurs, l'effet neurotoxique de peptides correspondant au domaine basique des proteines tat des virus visna et vih-1. Les lesions observees sont caracterisees par la perte de cellules ependymales et neuronales et par l'activation des cellules macrophagiques/microgliales et des astrocytes. La neurotoxicite implique la production de no et la presence des recepteurs nmda. Les cellules microphagiques/microgliales, presentes des 24h apres l'injection, jouent un role preponderant dans l'apparition des lesions. L'injection des peptides toxiques induit l'expression du tnf, de l'il-1, de l'il-6, et de inos. La diminution de l'expression du tnf apres le traitement des animaux a la pentoxifylline induit la chute de l'expression de l'il-1 et de inos et est associee a la reduction de la taille des lesions. La neurotoxicite des peptides tat semble donc faire intervenir la production du tnf. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons recherche chez des souris transgeniques l'apparition de lesions associees a l'expression du gene tat des virus visna et vih-1. L'analyse des tissus des animaux a montre que l'expression, meme a bas bruit, du gene tat est correlee a la presence de desordres lymphoproliferatifs. Les organes touches sont la rate, les ganglions lymphatiques, et les poumons. De plus, les souris exprimant le gene tat du virus visna presentent des lesions cutanees. La proteine tat semble donc etre directement pathogene et pourrait contribuer in vivo a la pathogenese associee aux infections lentivirales
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Nilsson, Therese. "Uttryck av cysteineproteaser HRV 3C, sortase A och TEV på ytan av prokaryota värdceller." Thesis, KTH, Skolan för bioteknologi (BIO), 2015. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:kth:diva-172784.
Full textAbstract:
Proteases are important enzymes in the biotechnology due to their specific cleavage of substrates. HRV 3C, sortase A and TEV are some examples of cysteine proteases which become more of use lately in applications as removal of affinity tags (3C/TEV) and labelling of proteins (sortase). Here an investigation was made on the proteases by displaying them on two different prokaryotic hosts; E. coli and S. carnosus and to use these to cleave away affinity proteins (Affibody molecule) from other cells with an incorporated cleavage site. Constructs were cloned and incorporated into expressing strains which were then cultivated and induced. Analysis of surface expression was done by flow cytometer. Cleavage was made by cultivating combinations with cleavable bacteria and bacteria displaying proteases. A functional protease would lead to the presence of Affibody molecules in the supernatant. Flow cytomtery analysis was first made to inevstigate signal difference in Affibody binding by the addition of flurophores. Secondly SDS-PAGE was made on the centrifuged supernatant to investigate the presence of a product. Finally analysis of the bacteria was made by examining the reaction with soluble substrate and comparing activity with soluble enzyme. All of the enzymes were able to be displayed on the surface of bacteria with a clear separation from control. The cleavage analysis showed however varying results yet no clear evidence of product. Best flow cytometer results were seen for 3C but SDS-PAGE/MS did not show any cleaved product. For Sortase SDS-PAGE showed positive result but analysis with MS showed no product. TEV was concluded not to be funcional at all hence the failing to cleave soluble substrate when condition seemed near optimal and faulty flow cytometer data. Even though the lack of success there is still many further studies that can be done on the proteases in order to prove its absence/presence of activity.
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Miladi, Baligh. "Développement d’outils moléculaires de production et de purification de protéines recombinantes par suivi en temps réel." Thesis, Cergy-Pontoise, 2011. http://www.theses.fr/2011CERG0533/document.
Full textAbstract:
Les besoins en protéines recombinantes dans les diverses activités des bio-industries a considérablement augmenté ces dernières années. Cependant, les procédés de leur production sont encore limités par le manque de marqueurs permettant de suivre l'expression et la purification des protéines d'intérêt, la formation des corps d'inclusion et les faibles degrés de pureté.Afin de pallier à ces difficultés, nous avons développé et mis en œuvre un nouveau procédé de production et de purification de protéines recombinantes chez Escherichia coli. Ce procédé est basé sur l'utilisation d'une cassette d'expression appelée Multitags et sur le clivage par une TEV protéase immobilisée sur une matrice de streptavidine. Le Multitags comporte, à partir de son extrémité N-terminale, un double tag d'affinité (10xHis et SBP), le domaine de fixation de l'hème du cytochrome b5 et le site de clivage de la TEV protéase. En utilisant deux modèles différents de protéine d'intérêt (MyRIP et la Pfu DNA polymérase), nous avons montré l'efficacité du cytochrome b5 dans le suivi visuel et quantitatif par mesure d'absorbance des différentes étapes de production et de purification. Nous avons obtenu plus de 90% de chacune des deux protéines de fusion dans la phase soluble. L'application d'une chromatographie double via les deux tags d'affinité 10xHis et SBP a permis d'atteindre un degré de pureté du Multitags-MyRIP et du Multitag-Pfu de 99%. Nous avons construit des colonnes protéolytiques en produisant la TEV protéase sauvage et sa version mutée (S219V) en fusion avec le Streptag II et en immobilisant ces enzymes par affinité sur colonne de streptavidine-agarose. La caractérisation des colonnes protéolytiques et leur application aux protéines recombinantes d'intérêt modèles ont montré l'avantage de cette méthode d'immobilisation en termes d'activité protéase retenue, de stabilité des enzymes, de leur réutilisation et de simplification du schéma de purification et de récupération des protéines d'intérêt à haut degré de pureté. En conclusion, ces travaux de thèse ont permis de développer et de valider des outils innovants pour l'expression et la purification de protéines recombinantesIn recent years, the need for recombinant proteins has substantially increased in various bio-industry activities. However, actual recombinant processes are still limited by the lack of markers allowing real-time expression and purification monitoring of target proteins, by inclusion bodies formation and by low quality of purity of the products. To overcome these difficulties, we have developed a new process for production and purification of recombinant proteins in Escherichia coli. The method combines the use of a multifunctional expression cassette, termed Multitags and an immobilized modified TEV protease on a streptavidin matrix. The Multitags contains, its N-terminus, two affinity purification tags (10xHis and SBP) and as a marker tag, the heme-binding domain of cytochrome b5 followed by the TEV cleavage site. Using two model proteins (MyRIP and Pfu DNA polymerase), we have demonstrated the visual and the quantitative monitoring capability of the cytochrome b5 during the expression and purification steps. When expressed in E. coli KRX more than 90% of both fusion proteins were produced in a soluble form. In addition, high purity (99%) of Multitags-MyRIP and Multitags-Pfu was achieved after two consecutive affinity purification steps using the dual affinity tag. We also produced the wild-type and the S219V mutant TEV proteases fused to the Streptag II affinity sequence and realized their affinity immobilization on a streptavidin-agarose matrix. The characterization of the proteolytic columns and their application to the recombinant model proteins demonstrated the advantage of this immobilization method in terms of retaining activities, enzyme stabilities, possibility of reuse and simplification of the cleavage downstream steps.In conclusion, this study allowed the development and the validation of innovative tools for expression and purification of recombinant proteins
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Guillon, Christophe. "Rôle du gène de régulation tat dans la détermination du phénotype biologique des variants SI/lymphotropes et NSI/monocytotropes du VIH-1." Lyon 1, 1997. http://www.theses.fr/1997LYO1T241.
Full text
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Yang, Yong. "Characterization of antigenic properties of a serine protease of Trichinella spiralis involved in the invasive stage of the parasite and application to a serological test." Paris 6, 2013. http://www.theses.fr/2013PA066197.
Full textAbstract:
Trichinellosis is a major worlwide zoonose, due to the food habits. The pork remains the main source of transmission of the parasite to human at the world level. At present, the only serological test available for detection in pigs is an indirect ELISA based on the use of Excretion / secretion antigens from muscle larvae stage. This ELISA offers a sensibility > 98 % but does not allow the detection of animals presenting a recent infestation (< 1 month), and led thus the existence of a " blind window " of detection during which the animal presents a risk of infection for the consumer. Previously, a serine protease, NBL1, was identified in the newborn stage and showed an antigenicity allowing development of tools for an early detection. The objective of this thesis was to characterize the antigenic properties of the NBL1 C-terminal domain (NBL1-C) to develop a competitive ELISA using a monoclonal antibody (mAb) anti-NBL1-C. Five mAbs were obtained and allowed to show that NBL1 was specifically localized at the level of the cuticle of embryos. Furthermore, an epitope mapping was established by using peptides of 15 amino acids covering the NBL1-C and allowed to identify the sequence recognized by mAbs. This sequence is about 10 amino acids repeated four times in NBL1-C. This epitopes mapping also allowed to identify epitopes recognized by various samples of serum resulting from animals (mouse, pork(pig), wild boar) infested by Trichinella. Finally, first tests for the development of the competition ELISA were madeLa trichinellose est une zoonose majeure de répartition mondiale, liée aux habitudes alimentaires. Le porc demeure la principale source de transmission du parasite à l’Homme au niveau mondial. Actuellement, le seul test sérologique disponible pour le porc est un ELISA indirect basé sur l’utilisation des antigènes Excrétion/Sécrétion du stade L1 musculaire. Cet ELISA offre une sensibilité > 98 % mais ne permet pas la détection d’animaux présentant une infestation récente (< 1 mois), et induit donc l’existence d’une « fenêtre aveugle » de détection pendant laquelle l’animal présente un risque d’infection pour le consommateur. Précédemment, une protéase à sérine, NBL1, a été identifiée au stade L1 nouveau-né et a montré une antigénicité permettant le développent d’outils de détection précoce. L’objectif de cette thèse était de caractériser les propriétés antigéniques du domaine C-terminal de NBL1 (NBL1-C) afin de développer un ELISA compétitif en utilisant un anticorps monoclonal anti-NBL1-C. Cinq anticorps monoclonaux ont été obtenus et ont permis de montrer que NBL1 était spécifiquement localisé au niveau de la cuticule des embryons. De plus, une cartographie d’épitopes constituée de peptides de 15 acides aminés couvrant le domaine C-terminal de NBL1 a permis d’identifier la séquence reconnue par les anticorps monoclonaux. Il s’agit d’une séquence de 10 acides aminés répétée quatre fois dans NBL1-C. Cette cartographie d’épitopes a également permis d’identifier les épitopes reconnus par différents échantillons de serum provenant d’animaux (souris, porc, sanglier) infestés par Trichinella. Enfin, des premiers essais de développement de l’ELISA compétition ont été effectués
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Bonnet, Richard. "Beta-lactamases de classe a chez les enterobacteriaceae : caracterisation de variants de tem et de deux nouveaux types enzymatiques ctx-m-8 et bes-1 (doctorat : microbiologie)." Clermont-Ferrand 1, 2000. http://www.theses.fr/2000CLF1MM12.
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Ajebbar, Samira. "Synthèse de ligands à la proteine CARM1 pour l'étude de son activité enzymatique et la synthèse d'inhibiteurs sélectifs." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00769956.
Full textAbstract:
Les protéines arginine méthyl transférases ("PRMTs") sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires essentiels. La protéine CARMI ("Coactivator-associated arginine methyltransferase 1", appelée aussi "PRMT4") a été initialement identifiée par sa fonction co-activatrice de la transcription impliquantplusieurs récepteurs nucléaires des hormones. CARMI est une enzyme qui catalyse la réaction de méthylation sur les histones via un donneur de méthyl naturel, la S-adénosY-L -méthionine (SAM). De nombreux travaux ont montré que CARMI est surexprimée dans les cancers du sein et de la prostate. L' objectif de ce travail est la compréhension à l'échelle moléculaire du mode d'action de CARMI et l'étude du mécanisme de reconnaissances moléculaires et de transferts d' informations gouvernés par la protéine CARMI. La structure cristallographique obtenue de cette enzyme en présence de cofacteur, la S-AdénosyhHomocystéine ou la Sinefungine a eu un effet stabilisant. Ainsi, notre stratégie a été de créer des molécules hameçons basées sur le motif de la SAM capables d' ancrer un peptide mimant la séquence de l' histone H3, pour ensuite les tester en co-cristallisation avec CARMI. Ainsi, grâce à la diffraction aux rayons X, les interactions mises en jeu dans le complexe CARMlImolécules hameçons/peptide pourront être déterminées. Cette stratégie s'est effectuée en trois étapes : la première étape, décrite dans le chapitre 2, a consisté en la synthèse d'analogues de la SAM obtenus grâce à des modifications réalisées autour de l'atome de soufre. Ces composés nous ont permis d' explorer la " poche du sulfonium ". Puis la seconde étape, décrite dans le chapitre 3, a été la synthèse * d'analogues de bisubstrats nécessaires pour l'exploration de la " poche de l'arginine ". Dans une dernière étape, décrite dans les chapitres 4 et 5, nous avons abordé la synthèse d'adduits SAM-peptide pouf pouvoir étudier le " domaine de fixation du peptide ". Dans le quatrième chapitre, la méthode de choix est la création d'un lien covalent entre une molécule hameçon électrophile etun peptide par chimie de click in-situ : par réaction de cycloaddition de Huisgen; par réaction entre des molécules hameçons électrophiles capables de piéger un peptide cystéine ou un peptide arginine. Ces essais se sont révélés infructueux et une nouvelle stratégie a été employée en utilisant des molécules ancres. Dansle cinquième chapitre des molécules ancres ont donc été préformés pour ensuite être testés en cocristallisation dans CARMl.
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Huang, Xiaohua. "Der Einfluss des HIV-1-Tat-Proteins auf das Proteasom-System und die Folgen für die zelluläre Immunabwehr." [S.l.] : [s.n.], 2002. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=964825589.
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Beghin, Anne. "IMPLICATIONS DE LA PROTEINE ARL2 DANS LE PHENOTYPE TUMORAL ET LES MECANISMES DE CHIMIORESISTANCE DANS LE CANCER DU SEIN." Phd thesis, Université Claude Bernard - Lyon I, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00147954.
Full textAbstract:
La forme native des hétérodimères de tubulines, indispensable à leur incorporation aux microtubules, est obtenue après prise en charge des tubulines par différentes protéines chaperonnes. Arl2 (ADP Ribosylation Factor-like Protein 2) est une protéine qui régule l'action de certaines protéines chaperonnes des tubulines. En utilisant des modèles de cancer du sein, nous avons montré dans ce travail que des modifications de l'expression d'Arl2 induisaient (1) des perturbations importantes de la dynamique microtubulaire et de la mitose ; (2) une chimiorésistance à différents agents anticancéreux par un mécanisme dépendant de la phosphatase PP2A et associé au facteur de transcription p53 ; (3) des modifications de la croissance tumorale. Les résultats obtenus ont permis d'établir, pour la première fois, un lien entre des événements régulant la production de tubulines fonctionnelles et des perturbations au niveau des phénotypes microtubulaires et cellulaires de cellules cancéreuses humaines. Ce travail ouvre des perspectives nouvelles dans l'identification de facteurs influençant à la fois la chimiorésistance et le développement tumoral de cellules cancéreuses mammaires.
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Serbielle, Céline. "Rôle et évolution de facteurs de virulence impliqués dans une interaction hôte-parasitoïde." Phd thesis, Université François Rabelais - Tours, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00402832.
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Les associations mutualistes, en permettant l'acquisition de nouvelles fonctions, ont joué un rôle majeur dans l'évolution des espèces. Pour comprendre en quoi ces associations sont impliquées dans l'adaptation des espèces nous avons étudié un cas unique de mutualisme associant un virus de type polydnavirus et une guêpe parasitoïde. Dans cette association, le virus est injecté dans l'hôte lépidoptère lors de l'oviposition et joue un rôle majeur dans le succès parasitaire en induisant une altération des fonctions physiologiques de l'hôte. En regard du nombre d'espèces de guêpes caractérisées par cette association, le virus doit constituer une innovation adaptative majeure et jouer un rôle déterminant dans l'évolution et la diversification des espèces de guêpes. En quoi cette association joue t-elle un rôle déterminant dans l'évolution et l'adaptation des guêpes ? Quelles sont les fonctions physiologiques ciblées chez l'hôte ? Pour répondre à ces questions nous avons étudié l'évolution de deux familles de gènes codant pour des facteurs de virulence potentiels et nous avons exploré les fonctions physiologiques d'une protéine potentiellement ciblée lors du parasitisme. Nous avons mis en évidence le rôle important de la sélection naturelle dans l'évolution des familles de gènes viraux. Par modélisation de la structure tridimensionnelle d'un facteur de virulence codant pour des cystatines, nous avons montré que cette sélection agissait préférentiellement au niveau des sites d'interaction avec les protéines cibles. De plus, cette étude souligne le caractère dynamique de l'évolution des facteurs de virulence incluant de multiples évènements de duplication, caractérisés par des processus de perte et d'acquisition au cours de l'évolution de l'association. Le caractère adaptatif et dynamique de l'évolution des gènes viraux a aussi été étudié en regard de l'évolution des espèces de guêpes et de leur spectre d'hôte. Par une approche fonctionnelle, nous avons étudié le rôle physiologique de protéases à cystéine qui constituent des cibles potentielles des cystatines virales. Nous avons montré que ces protéases sont régulées spécifiquement au cours du parasitisme au niveau protéique et transcriptionnel. Nous avons également montré que l'activité de ces protéases est modifiée après parasitisme. L'évolution adaptative et dynamique des facteurs de virulence reflètent leur rôle important dans le parasitisme. Il reste maintenant à montrer comment ces facteurs interagissent sur la physiologie de l'hôte lépidoptère. Des protéases à cystéine sont spécifiquement ciblées par le parasitisme, en étudiant les mécanismes d'interaction de ces protéases avec les cystatines virales et les processus coévolutifs mis en jeu, nous
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Trussardi, Aurélie. "Caracterisation des mecanismes de chimioresistance et de radioresistance : application clinique aux cancers broncho-pulmonaires (doctorat : biologie cellulaire et moleculaire)." Reims, 1999. http://www.theses.fr/1999REIMP205.
Full text
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Moutard, Isabelle. "Les macrolides et la reaction inflammatoire : leurs activites sur les metabolismes oxydatif et proteolytique des granulocytes neutrophiles humains et sur la production de cytokines par les cellules mononucleees humaines (doctorat : pharmacologie)." Lille 2, 1999. http://www.theses.fr/1999LIL2P009.
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BEAUFRERE, LAURENT. "Pathologie moleculaire de la choroideremie : implications dans la definition d'une strategie diagnostique genotypique." Montpellier 1, 1998. http://www.theses.fr/1998MON1T009.
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Leruez-Ville, Marianne. "La proteine non structurale du parvovirus humain b19 : role dans l'infection semi-permissive, production par un clone cellulaire stable et interaction avec le promoteur (doctorat : microbiologie)." Paris 11, 1998. http://www.theses.fr/1998PA114832.
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Placquet, Karine. "'The Authority of the Written Word' : ecriture et transgressions dans The Cider House Rules, A Prayer for Owen Meany et A Widow for One Year de John Irving." Phd thesis, Université Toulouse le Mirail - Toulouse II, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00639587.
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Romans de l'écrivain américain contemporain, John Irving, The Cider House Rules, A Prayer for Owen Meany et A Widow for One Year proposent des univers fictionnels distincts mais dirigés par une question identique : le processus de création, qu'il soit identitaire ou littéraire. Construits autour de la représentation des relations entre les personnages et leur environnement, les trois récits accordent une importance particulière à la transgression, toujours envisagée comme un acte de rébellion mais prenant également une connotation positive lorsqu'elle est entendue comme étape primordiale de la création identitaire. Cette double acception ressurgit dès lors que l'on considère le narrateur ou les techniques narratives, eux aussi caractérisés par une alliance de respect et d'écart par rapport aux normes ou conventions. La combinaison des forces antagonistes identifiées à l'échelle de l'histoire et au niveau narratif produit des romans singuliers alliant tradition et modernité, gravité et ironie. En fin de compte, les romans poursuivent un même but : divertir et contester tout à la fois.
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Millet, Arnaud. "Rôle pro-inflammatoire et immunomodulateur de la proteinase 3 membranaire exprimée au cours de l'apoptose : implications dans la granulomatose avec polyangéite." Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2014. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00940917.
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La granulomatose avec polyangéite est une vascularite systémique associée à une réaction auto-immune dirigée contre la protéinase 3, une serine protéase du neutrophile. Cette protéine présente un profil particulier d'expression dans le neutrophile, caractérisé notamment par une expression membranaire au cours de l'apoptose. Cette capacité de la protéinase 3 à se lier aux membranes repose sur l'existence de quatre acides amines formant un patch hydrophobe. Cette expression membranaire au cours de l'apoptose, qui dépend de l'existence de ce patch hydrophobe, conduit la protéinase 3 à interagir avec la calréticuline qui est une molécule impliquée dans la reconnaissance des cellules apopotiques par les macrophages. Nous avons démontré que cette interaction conduit la protéinase 3 à modifier le phénotype pro-résolutif des macrophages consécutif à la phagocytose de cellules apoptotiques. Le phénotype pro-inflammatoire résultant de cette expression de la protéinase 3 dépend de la voie de signalisation MyD88 mimant un signal danger. Cette activation des macrophages conduit à la sécrétion de chimiokines (MCP-1, KC, MIP-1α et MIP-1β) impliquées dans le recrutement de cellules exprimant la protéinase 3 participant ainsi au maintient de l'inflammation. Ce microenvironnement induit par les macrophages modifie le rôle immuno-modulateur de la clairance des cellules apoptotiques, influençant notamment l'interaction des cellules T naïves avec les cellules dendritiques plasmacytoïdes. La polarisation T résultante présente une distribution déséquilibrée vers les lymphocytes Th2/Th9 et une diminution de la génération de lymphocytes T régulateurs. La protéinase 3, qui est encodée par un gène de réponse au G-CSF, est de plus capable d'induire le recrutement de cellules sur-exprimant cette protéase capable à son tour de stimuler la sécrétion de G-CSF. La protéinase 3 apparait donc, par sa capacité à corrompre les mécanismes de résolution de l'inflammation et d'amplifier sa propre expression dans les cellules recrutées sur le site inflammatoire, comme un élément clé de la physiopathologie de la granulomatose avec polyangéite.
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Fournet, Vincent. "Caractérisations biochimique anatomique et comportementale des souris dépourvues de la protéines STOP : un modèle expérimental pour l'étude de symptômes psycho-affectifs." Phd thesis, Université de Grenoble, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00656067.
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La protéine STOP (MAP6) associée aux microtubules joue un rôle clé dans l'architecture neuronale et la plasticité synaptique, dont les dysfonctionnements sont considérés comme étant impliqués dans la physiopathologie des maladies psychiatriques. En accord avec cette hypothèse, la délétion de la protéine STOP chez la souris, conduit à des altérations neuroanatomiques, biochimiques et comportementales, en partie atténuées par des traitements antipsychotiques. Dans cette étude, nous avons tout d'abord examiné les possibles altérations des systèmes monoaminergiques chez les souris STOP KO. Chez les souris mutantes, les marqueurs sérotoninergiques et noradrénergiques sont accumulés dans le mésencéphale et, au contraire fortement diminués dans toutes les régions de projections du cerveau antérieur. De plus, ces déséquilibres monoaminergiques sont associés à une augmentation du statut dépressif, une diminution du statut anxieux et des déficits dans des tâches d'apprentissage et de mémorisation. Les effets d'un traitement chronique par la fluoxétine ou par l'épothilone D, un composé analogue du taxol stabilisant les microtubules, sur l'humeur et les performances cognitives des souris STOP KO ont aussi été évalués. Le traitement chronique par la fluoxétine induit des effets paradoxaux sur le statut dépressif et le statut anxieux des souris STOP KO suivant les tests effectués, probablement à cause d'une hypersensibilité au stress. En revanche, les traitements chroniques à la fluoxétine et à l'épothilone D ont amélioré la mémoire à court terme des souris STOP KO. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que la délétion de la protéine STOP chez la souris induit de fortes altérations de l'humeur et des performances cognitives et que la protéine STOP pourrait avoir un rôle crucial dans le développement des systèmes monoaminergiques.
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Panaro, Giuseppe. "Studio numerico e sperimentale su una placca cranica impiantabile realizzata mediante manifattura additiva." Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2021.
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Nell'ambito del progetto "PEEK/PEKK/CRF PEEK for Patient Specific Implants", questo lavoro di tesi nasce dalla collaborazione fra il laboratorio di bioingegneria eDIMES del Policlinico Sant'Orsola Malpighi e l'Università di Bologna. L’obiettivo dei ricercatori è valutare i metodi produttivi e i materiali ideali per la realizzazione della singola PSI.
In particolare, questa tesi si inserisce nelle fasi introduttive di generazione di un modello CAD e dell'analisi del comportamento della placca soggetta a condizioni operative reali.
In questo studio è stata efficacemente prodotta una geometria computazionale solida della protesi, in grado di fornire un modello robusto e abbastanza accurato per la realizzazione di campioni stampati con tecnologia Arburg Freeforming in PEKK e PCU per i test futuri.
Tale modello è stato anche inserito efficacemente in una simulazione FEM parametrica avvalorata da test sperimentali (di compressione e ad impatto) in cui, una volta ottenute maggiori informazioni sulle proprietà dei materiali, sarà possibile studiare la protesi in qualsiasi condizione operativa.
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Kwasiborski, Anthony. "PROTEOME ET TRANSCRIPTOME DU MUSCLE LONGISSIMUS LUMBORUM DE PORC : INFLUENCE DU MODE D'ELEVAGE, DE L'ORIGINE GENETIQUE ET DU SEXE. RELATIONS AVEC LES QUALITES DES VIANDES ANTHONY KWASIBORSKI." Phd thesis, Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00728366.
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Avec une consommation de 19600 milliers de tonnes équivalent carcasses en 2005, la viande de porc est la plus consommée en Europe. Elle montre, toutefois, une forte variabilité, en partie due à des variations dans le métabolisme énergétique musculaire post-mortem. Celui-ci est défini comme l'ensemble des réactions biochimiques et leurs interactions survenant dans le muscle au cours de la période allant de la mort de l'animal jusqu'à la préparation de la viande avant consommation. De nombreux facteurs, dépendant de l'animal (génétique, mode d'élevage, alimentation, réactivité au stress d'abattage...) ou de la technologie (mode d'étourdissement...), peuvent influencer le métabolisme post-mortem et par conséquent, les qualités de viande. Un plan expérimental 2x2x2 comparait le protéome et l'expression de certains gènes d'intérêt chez des porcs femelles ou mâles castrés, de 2 origines génétiques différentes (pères Large White ou Duroc, mères Large White x Landrace), élevés dans 2 conditions différentes (conventionnelle en intérieur ou alternative en extérieur). Les résultats obtenus mettent en évidence l'important effet des facteurs de variation sur les quantités de protéines ainsi que sur les voies biochimiques impliquées dans le déterminisme des qualités des viandes. Ils ont également permis l'identification des marqueurs protéiques caractéristiques de l'origine génétique ou environnementale de l'animal. Les facteurs de variations n'influence pas l'expression des gènes étudiés. Le déterminisme des qualités des viandes n'est probablement pas une conséquence des modifications dans le niveau d'expression des gènes, mais plutôt dans la régulation des processus traductionnels.
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Micoud, Julien. "Rôles des interactions interdomaines dans le comportement cellulaire de la protéine CFTR." Phd thesis, Université Joseph Fourier (Grenoble), 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00363323.
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CFTR est un canal chlorure appartenant à la superfamille des transporteurs ABC. Cette protéine est composée de 5 domaines : 2 domaines de liaison aux nucléotides (NBDs), 2 domaines transmembranaires (TMD) et un domaine de régulation. Les interactions entre ces différents domaines sont essentielles pour de nombreux processus, tels que le repliement, la maturation et la fonction de CFTR. Cependant, les rôles de ces domaines de manière individuelle dans la biogenèse, le repliement, la maturation, la fonction et la stabilité membranaire de CFTR restent inconnus.Dans le but de préciser ceux-ci, nous avons étudié le comportement intracellulaire de protéines CFTR génétiquement modifiées. Nos résultats ont confirmé que contrairement à NBD2, NBD1 est essentiel pour la maturation et le trafic de CFTR vers la membrane plasmique. Bien que NBD2 ne soit pas important pour le repliement de la protéine, nous avons montré pour la première fois que celui-ci était nécessaire pour la stabilité de CFTR à la membrane plasmique. Nous avons montré que le 6ème segment transmembranaire de TMD1 n'est pas stable dans la membrane plasmique et doit être important pour le repliement de la protéine, sans doute par son implication dans l'interaction entre les TMDs.
L'ensemble de ces résultats confirme aussi l'importance des interactions interdomaines dans le comportement cellulaire de la protéine CFTR.
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Zinser, William J. Jr. "Framing Protest: News Coverage of the Tea Party and Occupy Wall Street Movements." University of Cincinnati / OhioLINK, 2014. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=ucin1394725789.
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Robin, Charlotte. "Etude structurale de protéines virales impliquées dans la réplication et régulation du cycle de multiplication d'un virus de plante." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00661702.
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Le virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) est un excellent modèle pour la réplication des virus à ARN simple brin de polarité positive. Ce petit virus de plante code l'ensemble desprotéines nécessaires à sa réplication sous forme d'un précurseur polyprotéine (206K). Du NauC-terminus, celui-ci porte une activité méthyltransférase, protéase à cystéine (PRO),hélicase et ARN-polymérase ARN dépendante (POL). Comme tous les virus à ARN(+)connus, son complexe de réplication est étroitement lié à des membranes cellulaires. Dans lecas du TYMV, c'est l'enveloppe des chloroplastes qui est impliquée. Un des acteurs clés de laréplication est la polymérase qui permet la synthèse de nouveaux génomes. La régulation de son activité implique dans un premier temps son clivage de la 206K par PRO. Ainsi libérée,elle est recrutée aux chloroplastes par une interaction directe avec le domaine PRO du produit de clivage 140K, afin de former le complexe de réplication. Un second clivage par PRO contenu dans 140K, à la jonction PRO-hélicase, permet de poursuivre le cycle de réplication.Récemment, il a également été montré que l'activité POL était régulée par la voie ubiquitine-protéasome durant le cycle viral. Ubiquitinilée par la cellule hôte, elle est adressée au protéasome où elle sera dégradée. Cependant, PRO, grâce à sa seconde fonction ubiquitine hydrolase, est capable de la protéger de cette dégradation. Afin de caractériser d'un point de vue structural ce mécanisme de régulation de la réplication, nous avons cristallisé, à l'aide d'un contaminant, PRO et avons résolu sa structure. L'empilement cristallin est tel que le Cterminus d'un domaine PRO est inséré dans la crevasse catalytique du domaine PRO suivant,nous fournissant ainsi des informations structurales sur son activité endopeptidase. Dans un second temps, afin d'avoir des informations sur sa seconde activité, nous avons réalisé un complexe stable entre PRO et une molécule d'ubiquitine afin de le cristalliser et résoudre sa structure. Enfin, nous avons initié l'étude cristallographique de la polymérase.
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Le, Guillou-Guillemette Hélène. "Étude de la duplication du domaine V3 de la région NS5A du virus de l'hépatite C de génotype 1b : épidémiologie clinique et moléculaire et aspects fonctionnels." Angers, 2014. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01784327/document.
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L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) est responsable d'hépatite chronique, de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire. La protéine NS5A du VHC participe à la réplication et l'assemblage viral, et à l'oncogenèse. Notre étude a caractérisé un polymorphisme du domaine V3-NS5A du VI-IC de génotype 1b, découvert au laboratoire. Nous avons identifié une duplication en tandem sans rupture d'ORF du domaine V3 avec une prévalence de 3,050/0. La prévalence de cette souche augmentait avec la sévérité de la pathologie hépatique (de 3. 0% groupe sans cirrhose jusqu'à 9. 4% groupe cirrhose et CHC, p de tendance=0. 045). L'analyse des polymorphismes des séquences directes et clonales a montré que les souches dupliquées constituaient la totalité de la quasi-espèce et persistaient au moins 10 ans. Le mécanisme de duplication serait une recombinaison non-homologue entre souches de 2 populations sauvages. Nos résultats fonctionnels préliminaires ont suggéré des protéines partenaires spécifiques des protéines NS5A dupliquées par un crible en système double-hybride levure. Nous avons réalisé la production des protéines NS5A dupliquées en systèmes cellulaire et bactérien, avec une optimisation en système bactérien. Les premiers tests de pull down n'ont pas encore permis de valider les interactions. Nous avons identifié une duplication partielle V3-NS5A chez le VHC1b (i) potentiellement impliquée dans la carcinogenèse, (ii) présente durant l'intégralité de l'infection, (iii) issue d'une recombinaison non-homologue, évènement encore jamais décrit chez le VHC in vivo. Nos travaux ont aussi permis l'identification de partenaires cellulaires et la production des protéines NS5A dupliquéesThe hepatitis C virus (HCV) infection leads to chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The HCV NS5A protein has been shown to be involved in viral replication and assembly and in the liver carcinogenesis. We investigated a V3-NS5A polymorphism in HCV 1b identified in our laboratory. We found two \/3 domains tandemly duplicated without ORF disruption in 3. 05% of the HCV sequences. The prevalence of this duplication increased with liver disease severity (from 3. 0% in patients without cirrhosis to 9. 4% in patients with both cirrhosis and I-ICC, p for trend=O. 045). Direct sequencing and clonal analyzes showed that quasispecies were entirely composed by mutants strains that persisted at least for 10 years. These V3 duplications were likely resulting from a non-homologous recombination that occurred between two wild-type strains. Our preliminary functional results identified potential specific interactions between host-cell proteins and the V3-NS5A duplicated proteins using a yeast two-hybrid system. We expressed recombinant duplicated NS5A proteins in cell and bacterial cultures and developed an optimized protocol for bacterial cultures. A validation of the interactions has not been reached with the first pulldown assays. We identified a V3-NS5A duplication in HCV 1b for the first time (i) associated with unfavorable evolution of liver disease including a possible involvement in liver carcinogenesis (ii) always present during the HCV infection (iii) resulting from a non-homologous recombination, mechanism that has never been described in vivo in HCV. We also suggested potential specific protein-protein interactions and performed recombinant NS5A protein production
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Rey, Martial. "Transporteur mitochondrial d'ADP/ATP : étude par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse et caractérisation de mutations pathogènes." Phd thesis, Université de Grenoble, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00586115.
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Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.
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Schmitt, Christophe. "Etude de la coacervation complexe entre la beta-lactoglobuline et la gomme d'acacia en solution aqueuse." Phd thesis, Institut National Polytechnique de Lorraine - INPL, 2000. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00007723.
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L'influence de la concentration totale en biopolymères et de la polydispersité de la protéine sur la formation et la stabilité de coacervats a été étudiée dans un mélange b-lactoglobuline/gomme d'acacia/eau. Les mélanges de b-lactoglobuline (b-lg) native ou agrégée (56% d'agrégats insolubles à pH 4,75) et de gomme d'acacia à des pH compris entre 3,6 et 5,0 sont caractérisés par une séparation de phase par coacervation complexe. Une concentration totale élevée en biopolymères limite l'influence du pH et du ratio de mélange protéine : polysaccharide sur la formation des coacervats dans les deux systèmes. En revanche, une forte polydispersité de la b-lg permet d'étendre l'aire de la zone biphasique des diagrammes de phases ternaires obtenus à pH 4,2. Des coacervats et des précipités sont obtenus en présence d'agrégats de b-lg. Seuls des coacervats sont visibles avec la b-lg native. Leur taille est contrôlée par les agrégats protéiques qui interagissent spécifiquement avec une fraction de la gomme d'acacia. La structure des coacervats est caractérisée par une vacuolisation issue d'une coalescence partielle des plus petits coacervats. Après interaction avec la gomme d'acacia, des mesures de dichroïsme circulaire indiquent une modification de la structure en hélice a de la b-lg, caractérisée par une densité de charge positive. La stabilité et la structuration des coacervats formés résultent d'un équilibre entre des phénomènes de floculation, coalescence et sédimentation des coacervats comme indiqué par des mesure de diffusion de la lumière en milieu turbide et microscopie confocale à balayage laser. Enfin, l'étude de la cinétique de structuration des mélanges b-lg/gomme d'acacia/eau par diffusion de la lumière aux petits angles, révèle des phénomènes de diffusionnels et hydrodynamiques responsables de la croissance des domaines structuraux. Dans certains cas, la cinétique de coacervation complexe peut être décrite par le modèle théorique de décomposition spinodale.
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Beaupère, Carine. "Capacité des protéines du VIH Tat et Nef et des inhibiteurs de la protéase virale à induire une sénescence des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse et à inhiber leur différenciation ostéoblastique." Thesis, Paris 6, 2014. http://www.theses.fr/2014PA066386/document.
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Les patients infectés par le VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine) traités par les antirétroviraux (ARV) ont aujourd'hui une espérance de vie quasi normale. Cependant, ils présentent une augmentation de la prévalence de pathologies classiquement associées au vieillissement, dont l'ostéoporose, suggérant un vieillissement prématuré ou accentué. Les facteurs impliqués sont, entre autres, l'infection par le VIH, les ARV et un état d'inflammation chronique. L'ostéoporose correspond à une déminéralisation, suite à un déséquilibre entre formation (ostéoblastes) et résorption osseuse (ostéoclastes). L'infection par le VIH et les ARV, en particulier les inhibiteurs de protéase (PI), augmentent la prévalence de l'ostéoporose. Dans ce contexte, je me suis intéressée à l'effet de certaines protéines du VIH et PI sur les précurseurs ostéoblastiques, les cellules souches mésenchymateuses (MSC). Nous montrons que deux protéines du VIH, Tat et Nef, induisent une sénescence prématurée des MSC, associée à un stress oxydant et in fine à un défaut de différenciation en ostéoblastes. Les effets de Tat sont médiés par le facteur pro-inflammatoire et pro-sénescent NF-?B, et ceux de Nef sont liés à une inhibition de l'autophagie. Nous montrons également que les PI atazanavir et lopinavir associés au ritonavir induisent une sénescence et un stress oxydant du fait de l'accumulation de prélamine A farnésylée toxique conduisant à un déficit de la différentiation ostéoblastique. Ces travaux montrent que le VIH et certains PI peuvent jouer un rôle délétère sur les MSC, et mettent en lumière certains des mécanismes impliqués dans le vieillissement des patients infectés par le VIH et traitésThe efficacy of highly active antiretroviral treatment (ARV) has resulted in a considerable improvement in the life expectancy of HIV (Human Immunodeficiency Virus)-infected patients. However, many patients encounter the early occurrence of several common age-related comorbidities, such as osteoporosis, stressing for a premature or accentuated aging process. Proposed pathogenic mechanisms include HIV infection, ARV treatment and chronic inflammation. Osteoporosis is defined by a decrease in bone mineral density, resulting from the alteration of the balance between bone formation (osteoblasts) and resorption (osteoclasts). HIV infection, through the bystander effect of HIV secreted proteins, and ARV, particularly protease inhibitors (PI) increase the prevalence of osteoporosis.Our studies focused on the capacity of some HIV proteins, and of some PI to alter osteoblast precursors, namely mesenchymal stem cells (MSC). We showed that two HIV proteins, Tat and Nef, induced premature senescence of MSC, associated with an oxidative stress and a decreased osteoblastic differentiation potential. Tat triggered senescence via NF-κB activation, whereas the effect of Nef was linked to the inhibition of autophagy. We also showed that the PI, atazanavir and lopinavir boosted with ritonavir, induced senescence and oxidative stress through the accumulation of toxic farnesylated prelamin A, thus leading to a decreased osteoblastic differentiation.Overall, these data show that some HIV proteins and some PI can exert deleterious effects on MSC, resulting in senescence, and highlight several mechanisms which could be involved in the aging process of ART-controlled HIV infected patients