Academic literature on the topic 'Streptocoques – Génétique'

Streptococcus gallolyticus est une bactérie à Gram-positif retrouvée en portage intestinal dans 5 à 10% de la population humaine qui est responsable de septicémies et d'endocardites infectieuses chez les personnes âgées. Plusieurs études épidémiologiques indiquent une forte incidence de pathologies gastro-intestinales chez des patients infectés par S. Gallolyticus. Ainsi, la présence de cette bactérie est fortement associée au cancer colorectal (CCR). Cependant, les raisons de cette association ne sont toujours pas élucidées, à savoir si S. Gallolyticus est une cause ou une conséquence du développement du CCR. L'objectif principal de cette thèse était d'explorer les interactions entre S. Gallolyticus et les cellules intestinales du colon, afin d'ouvrir des pistes permettant de comprendre la forte association de cette bactérie avec le CCR. Dans la première partie de ce travail, nous avons caractérisé le rôle du pilus Pil3 dans l'attachement aux mucines intestinales MUC5AC et MUC2, l'adhérence aux cellules HT29-MTX produisant du mucus et pour la colonisation du colon chez la souris. Dans une deuxième partie de ce travail, grâce à l'utilisation de supports perméables (transwell) permettant de mimer une barrière intestinale, polarisée, nous avons pu montrer la capacité de S. Gallolyticus UCN34 à traverser activement une monocouche de cellules intestinales par la voie paracellulaire. Le mécanisme moléculaire mis en jeu dépend du pilus Pil3 et plus particulièrement de l'adhésine Pil3A ainsi que de son expression hétérogène au sein de la population bactérienne. En effet, dans la souche de S. Gallolyticus UCN34, Pil3 est exprimé de façon hétérogène : 10% des bactéries expriment fortement Pi13 et 90% des bactéries l'expriment faiblement. Les résultats obtenus indiquent que cette hétérogénéité est cruciale car elle permet aux bactéries exprimant fortement Pi13 d'interagir avec un ou plusieurs récepteurs cellulaires pour provoquer l'ouverture transitoire des jonctions cellulaires afin de permettre le passage des bactéries faiblement adhérentes. En effet, les variants isogéniques de S. Gallolyticus surexprimant Pil3 (Pil3+) ou n'exprimant pas Pil3 (Δpil3) s'avèrent incapables de traverser la barrière intestinale. En conclusion, ce travail de thèse a permis la caractérisation fonctionnelle du pilus Pil3 de S. Gallolyticus et de son rôle majeur dans la colonisation du côlon et dans la translocation de la barrière intestinale
The Gram-positive bacterium Streptococcus gallolyticus is an emerging cause of bacteremia and infective endocarditis in the elderly. Several epidemiological studies point to a high incidence of gastrointestinal pathologies in patients infected with S. Gallolyticus. Thus, the presence of this bacterium is strongly associated with colorectal cancer (CRC). However, it remains unknown whether S. Gallolyticus infection is a cause or consequence of CRC development. The main goal of this PhD project was to explore the interactions of S. Gallolyticus with human colonic cells, in order to get molecular insights explaining the association of this bacterium with CRC. In the first part of this work, we have characterized the role of S. Gallolyticus Pil3 pilus in binding to intestinal mucins MUCSAC and MUC2, adhesion to human colonic cells producing mucus HT29-MTX and colonization of the murine colon. In the second part, we took advantage of permeable support systems (transwell), which mimic a polarized epithelial barrier, to demonstrate the capacity of S. Gallolyticus UCN34 to actively translocate across colonic barriers, a critical trait for the establishment of invasive infection. Interestingly, we found that the PiI3 pilus, in particular the Pil3A adhesin, expressed heterogeneously at the single tell level (90% of Pil3low and 10% of Pil3high) in S. Gallolyticus UCN34 was crucial for bacterial translocation across the epithelium. Pil3high bacteria probably interact with an unknown host receptor, allowing the transient opening of the tight junctions and the passage of Pil3low bacteria. Indeed, PiI3 overexpressing bacteria or Δpil3 bacteria were unable to translocate intestinal monolayers in vitro. Altogether, our work provided novel insights on the key role of the S. Gallolyticus PiI3 pilus in host colon colonization via interaction with mucins. In addition, the heterogeneous expression of PiI3 was shown to be crucial for the paracellular passage of S. Gallolyticus between adjaçent cells

L’utilisation des antibiotiques du groupe des macrolides et apparentés (MLS) en médecine humaine et vétérinaire a conduit à l’émergence de bactéries résistantes. Cette émergence est préoccupante chez les streptocoques. Les travaux réalisés ont permis de mettre en évidence l’émergence de résistances par inactivation des MLS chez deux espèces du genre Streptococcus : Streptococcus agalactiae et Streptococcus uberis. La première concerne une résistance aux lincosamides chez S. Agalactiae et S. Uberis, et la seconde une résistance à la spiramycine (macrolide à 16 atomes) chez S. Uberis. La résistance aux lincosamides est due à la présence d’une nucléotidyltransférase codée par le gène lnu(C). Ce gène est porté par un transposon mobilisable, MTnLnu, chez la souche clinique S. Agalactiae UCN36 et par un plasmide transférable chez la souche vétérinaire S. Uberis 88. MTnLnu est le premier transposon mobilisable rapporté chez les streptocoques et est mobilisé par le transposon conjugatif Tn916. L’origine de transfert a été localisée dans le gène lnu(C). La résistance à la spiramycine de la souche vétérinaire S. Uberis 74 est liée à la présence des gènes rdmC-like et mph(B). Ces deux gènes codent respectivement une enzyme apparentée à la famille des alpha/bêta hydrolases et une phosphotransférase connue pour inactiver les macrolides à 14, 15, et 16 atomes chez E. Coli. Des résultats préliminaires laissent présager une action combinée des deux enzymes sur la spiramycine
The therapeutic use of macrolides and related antibiotics (MLS ) has led to the emergence of resistant bacteria. Resistance of streptococci to these antibiotics is alarming, because of their wide use in human and veterinary environments. In this study, we report the emergence of MLS resistance by inactivation in two species of Streptococcus: Streptococcus agalactiae and Streptococcus uberis. A human isolate of S. Agalactiae was shown to inactivate lincosamide whereas an animal isolate of S. Uberis, inactivated spiramycin (a 16- membered ring macrolide). The lincosamide resistance was due to a nucleotidyltransferase encoded by a new lnu(C) gene. The gene was localized on a mobilizable transposon, MTnLnu in S. Agalactiae UCN36, and on a transferable plasmid in the veterinary strain S. Uberis 88. MTnLnu is the first mobilizable transposon reported in streptococci and could be mobilized by the conjugative transposon Tn916. The spiramycin resistance of the veterinary strain S. Uberis 74 was related to the presence of a rdmC-like and the mph(B) genes. These genes encoded an enzyme belonging to the alpha/beta hydrolases family and a phosphotransferase known to inactivate 14, 15 and 16-membered macrolides in E. Coli, respectively. Preliminary results suggested a combined action of these two enzymes on spiramycin

Afin de faire face à différents types de stress et s'adapter à de nouveaux environnements, les bactéries ont développé de nombreux mécanismes génétiquement régulés. La compétence pour la transformation naturelle est un processus qui favorise le transfert horizontal de gènes. Si les espèces phylogénétiquement éloignées partagent des mécanismes conservés d'intégration et de remaniement de l'ADN, les circuits de régulation de la compétence ne sont toutefois pas universels mais adaptés au mode de vie de chaque espèce. Chez les bactéries Gram-positives, les cascades de régulation de Streptococcus pneumoniae et Bacillus subtilis sont les mieux documentées. Si de nombreux modèles mathématiques ont été établis pour étudier différents aspects de la régulation des compétences chez B. subtilis, un seul modèle à échelle de population a été développé pour S. pneumoniae, il y a plus de dix ans, sur la base d'hypothèses contestées par de nouvelles données expérimentales. Nous avons développé, chez S. pneumoniae, un modèle fondé sur la connaissance de la régulation de la compétence qui intègre les éléments biologiques essentiels connus à ce jour. La cohérence structurelle de la topologie du réseau est confirmée par le formalisme des réseaux de Petri. Le réseau est ensuite transformé en un ensemble d'équations différentielles ordinaires pour étudier son comportement dynamique. La cinétique des protéines a été estimée en utilisant des données de luminescence et l'estimation des paramètres a été contrainte à partir des connaissances disponibles. Après avoir testé des modèles alternatifs, nous avons proposé l'existence d'un produit de gène tardif supplémentaire pouvant inhiber l'action de ComW, l'activateur du facteur sx. Nous apportons également un nouvel éclairage sur cette cascade de régulation en prédisant la cinétique de composantes du système qui pourraient être impliquées dans des comportements spécifiques. Ce modèle consolide les connaissances expérimentales acquises sur la régulation de la compétence chez S. pneumoniae. De plus, il peut être appliqué aux autres espèces de streptocoques appartenant aux groupes mitis et anginosus puisqu'ils partagent le même circuit régulateur. À l'échelle populationnelle, la transition vers l'état de compétence se produit d'abord dans une sous-population de cellules et se propage ensuite dans toute la population par contact physique cellule à cellule. En permettant la simulation du comportement d'une cellule individuelle, le modèle pourra servir de module dans la conception d'un modèle d'une population bactérienne composée de cellules hétérogènes
Bacteria have evolved many types of genetically induced mechanisms to face different types of stresses and to adapt to new environments. Competence for natural transformation is one such process that promotes horizontal gene transfer. If phylogenetically distant species share conserved uptake and processing apparatus, competence regulatory circuits are not universal but adapted to every species' lifestyle. In Gram-positive bacteria, Streptococcus pneumoniae and Bacillus subtilis regulatory cascades are the best documented. If many mathematical models have been established to study different aspects of competence regulation in B. subtilis, only one population-scaled model has been developed for S. pneumoniae, a decade ago, based on hypotheses that are challenged by new experimental data. We develop, in S. pneumoniae, a knowledge-based model of the competence regulation at cell level that integrates the enriched biological knowledge acquired to date. The structural consistency of the network topology is confirmed using Petri net formalism. The network is further turned into a set of ordinary differential equations to study its dynamics behavior. Protein kinetics are estimated using time-series luminescence data and other parameter estimations are constrained according to available knowledge. We point out some gap in competence shut-off knowledge, and, after testing alternative models, we predict the requirement of a yet unknown late com gene product inhibiting the action of ComW, the ?x factor activator. We also bring new insights into this regulatory cascade by predicting the system components that might be involved in specific experimental behavior. Our model consolidates the experimental knowledge acquired on competence regulation in S. pneumoniae. Moreover, it can be applied to the other streptococci species belonging to the mitis and anginosus groups since they shared the same regulatory circuit. In the population, the competence shift happens first in a subpopulation of cells and spreads into the whole population through cell to cell contact. Allowing simulation of individual cell behavior, our model will provide a brick for the design of a population-scale model composed of heterogeneous cells

Les éléments génétiques mobiles contribuent grandement à la diversité et à l’évolution des génomes bactériens par le biais du transfert horizontal. Parmi eux, les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) codent leur propre excision, leur transfert par conjugaison et leur intégration. En revanche, les éléments intégratifs et mobilisables (IME) ne sont autonomes que pour leur excision et intégration et ne codent seulement que certaines des protéines/fonctions (oriT) dont ils ont besoin pour leur transfert conjugatif. Par conséquent, les IME ont besoin d’un élément conjugatif « helper » pour se transférer. Malgré leur impact sur le flux des gènes et l’évolution des génomes, la prévalence des ICE reste peu étudiée et seulement très peu d’IME avaient été identifiés au début de cette étude. De plus, bien que plusieurs méthodes de détection des ilots génomiques existent, aucune d’elles n’est dédiée aux ICE ou aux IME. Ce qui ne facilite pas l’analyse exhaustive de ces éléments. Le genre Streptococcus appartient au phylum des firmicutes. La quasi-totalité des streptocoques sont des bactéries commensales ou pathogènes de l’homme et d’autres animaux. Aussi, 2 espèces de streptocoques sont utilisées en tant que ferments lactiques lors la production de laits fermentés et divers fromages. Globalement, le genre streptocoques représente un groupe d’intérêt pour l’homme, l’étude du flux de gènes au sein de ces organismes et l’impact qu’il peut avoir sur leur mode vie est primordiale. Au cours de cette thèse, nous avons recherché les ICE et les IME dans 124 souches de streptocoques appartenant à 27 espèces en utilisant une base de données de référence comportant des protéines dites « signatures » d’IME et d’ICE (de leurs modules de conjugaison/mobilisation et d’integration/excision). Cette analyse exhaustive a permis l’identification et la délimitation de 131 ICE ou ICE légèrement dégénérés et 144 IME. Tous ces éléments ont été délimités, ce qui nous a permis de déterminer leur spécificité d’intégration dans les génomes. Au total, 17 spécificités d’intégration ont été identifiées pour les ICE dont 8 encore jamais décrites (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC) et 18 spécificités pour les IME dont seulement 5 étaient connues chez les firmicutes. Les modules d’intégration des ICE codent soit une intégrase à tyrosine pouvant avoir une faible spécificité (1 famille d’intégrase) ou une forte spécificité (13 spécificités différentes), soit des intégrases à sérine seule ou en triplet (4 spécificités différentes), soit une transposase à DDE. Les IME codent soit des intégrases à tyrosine (10 spécificités différentes) soit des intégrases à serine seule (8 spécificités différentes). Les ICE ont été groupés en 7 familles distinctes selon les protéines codées par leur module de conjugaison. Les IME présentaient une très forte diversité au sein de leur module de mobilisation, empêchant ainsi leur regroupement en famille selon les gènes portés par ce module. Les analyses phylogénétiques des protéines signature codées par tous les ICE et les IME ont montré des échanges de modules d’intégration entre les ICE et les IME et de nombreux échanges entre les modules de mobilisation des IME. L’ensemble de ces résultats révèle la forte prévalence et l’extrême diversité des ICE et des IME au sein des génomes de streptocoques. Une meilleure connaissance et compréhension de ces éléments nous a incité à construire un outil informatique semi-automatisé de détection des ICE et des IME de Streptocoques ainsi que leurs sites d’insertion
Mobile genetic elements largely contribute to the evolution and diversity of bacterial genomes through horizontal gene transfer. Among them, the integrative and conjugative elements (ICEs) encode their own excision, conjugative transfer and integration. On the other hand, integrative mobilizable elements (IMEs) are autonomous for excision and integration but encode only some of the proteins needed for their conjugative transfer. IMEs therefore need a “helper” conjugative element to transfer. Despite their impact on gene flow and genome dynamics, the prevalence of ICEs remains largely underscored and very few IMEs were identified at the beginning of this study. Furthermore, although several in silico methods exist to detect genomic islands, none are dedicated to ICEs or IMEs, thus complicating exhaustive examination of these mobile elements. The Streptococcus genus belongs to the firmicutes’ phylum. Almost all streptococci are commensal bacteria or pathogenes to men and animals. Two species of Streptococcus are also used in the dairy industry as lactic ferments in order to produce fermented milk and different types of cheese. Studying the gene flux of the Steptococci genus and the impact it can have on the lifestyle of these organisms is essential, as it has a lot of interest for human health and activities. In this work, we searched for ICEs and IMEs in 124 strains of streptococci belonging to 27 species using a reference database of ICE and IME signature proteins (from their conjugation, mobilization and integration/excision modules). This exhaustive analysis led to the identification and delimitation of 131 ICEs or slightly decayed ICEs and 144 IMEs. All these elements were delimited, which allowed us to identify their integration specificities in the genomes. In total, 17 ICE integration specificities were identified. Among them, 8 had never been described before (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC). 18 specificities were also identified for IMEs, among which only 5 were known for the firmicutes. ICEs encode high or low-specificity tyrosine integrases (13 different specificities), single serine intégrases (1 specificity), triplet of serine integrases (3 different specificities), or DDE transposases while IMEs encode either tyrosine integrases (10 different specificities) or single serine integrases (8 different specificities). ICE were grouped in 7 distinct families according to the proteins encoded by their conjugation module whereas the mobilization modules of IMEs were highly diverse, preventing them from grouping into families according to their mobilization modules. The phylogenetic analysis of the signature proteins encoded by all ICEs and IMEs showed integration module exchanges between ICEs and IMEs and several mobilization module exchanges between IMEs. The overall results reveal a strong prevalence and extreme diversity of these elements among Streptococci genomes. Better understanding and knowledge of ICEs and IMEs prompted us to build a semi-automated command-line tool to identify streptococcal ICEs and IMEs as well as to determine their insertion site

L'augmentation de la résistance bactérienne aux antibiotiques (Ab) est un enjeu majeur de santé publique. Ce phénomène s'inscrit dans l'approche « One Health » qui interconnecte les santés humaine, animale et environnementale. Dans ce cadre, l'étude de Streptococcus suis, une bactérie pathogène et zoonotique avec un fort taux de résistance à certains Ab est particulièrement pertinente. En effet, certains sérotypes sont régulièrement responsables d'épidémies mortelles pour l'Homme en Asie. En Europe, S. suis cause d'importantes pertes économiques dans les élevages porcins et des infections humaines sporadiques. L'analyse de souches d'Amérique du Nord et d'Asie ont mis en évidence une localisation des gènes impliqués dans l'antibiorésistance (AbR) sur des éléments génétiques mobiles (EGM), particulièrement sur des ICE et IME, éléments qui sont intégrés au génome bactérien hôte mais, après excision, transférables via un pore de conjugaison. Les ICE sont autonomes et peuvent jouer le rôle d'élément "helper" en transférant des éléments non autonomes : les IME. La présence de gènes d'AbR sur de tels éléments constitue un risque important de propagation, mais ces EGM sont encore très peu étudiés en raison de leur identification complexe. En France, la surveillance de l'AbR des bactéries isolées chez les animaux malades (dont S. suis chez le porc) est assurée par le réseau Résapath. En complément de ces données, l'objectif de ma thèse était de déterminer le niveau de résistance aux Ab au sein d'une collection plus diversifiée de souches de S. suis, d'étudier la localisation génomique des gènes responsables de ces résistances et d'évaluer ainsi le risque de dissémination. Notre approche a été de : (1) constituer une collection de 200 souches représentatives de celles présentes en France métropolitaine selon leurs : sérotypes, sites d'isolement permettant de définir trois pathotypes (pathogène, non-clinique et respiratoire), période d'isolement (antérieure ou postérieure au plan EcoAntibio), hôte (porcs, Homme, sanglier) et régions géographiques d'isolement (la moitié en Bretagne, région de forte densité d'élevages) ; (2) réaliser les antibiogrammes des souches vis-à-vis de 22 Ab, utilisés en médecine vétérinaire et/ou humaine ; (3) séquencer 102 souches sélectionnées en fonction de leurs profils de résistance ; (4) assembler, annoter les génomes puis localiser les gènes d'AbR, de virulence et de compétence ainsi que les ICE et les IME. Nos analyses ont montré que 86% des souches étaient résistantes à au moins un Ab avec un faible taux de résistance aux fluoroquinolones, aux pénicillines, à la pleuromutiline et aux diaminopyrimidine-sulfamides, et un taux très élevé pour les macrolides-lincosamides et la tétracycline. Des profils de multirésistance ont été observés dans 138 souches, en cohérence avec les données européennes. La recherche des gènes d'AbR dans les génomes de S. suis a mis en évidence une diminution de leurs fréquences chez les souches isolées post-Plan EcoAntibio et un nombre statistiquement plus élevé de gènes d'AbR chez les souches non-cliniques. De plus ces gènes (n=217) sont majoritairement localisés sur des ICE/IME. Plus de la moitié des souches porte un IME, contenant des gènes de résistance à la tétracycline et aux macrolides-lincosamides, inséré dans un ICE de la famille Tn5252. Ainsi, S. suis possède probablement un potentiel élevé de propagation des gènes d'AbR. La résistance aux pénicillines concernait 5% de la collection analysée. Une éventuelle diffusion de cette résistance serait préoccupante en raison de l'importance des β-lactamines dans le traitement des infections à S. suis, tant en médecine vétérinaire qu'en médecine humaine. Nos résultats sont complémentaires de ceux du réseau Résapath et démontrent l'intérêt d'étudier des souches de sérotypes moins fréquemment impliqués dans des cas pathologiques ou des souches de portage afin d'améliorer le suivi de l'antibiorésistance en France
The increase in bacterial resistance to antibiotics is a major public health issue. This phenomenon is part of the "One Health" approach, which interconnects human, animal and environmental health. In this context, the study of Streptococcus suis, an animal pathogenic and zoonotic bacterium with a high rate of resistance to certain antibiotics, is particularly relevant. Indeed, certain serotypes are regularly responsible for fatal epidemics in Asia. In Europe, S. suis causes major economic losses on pig farms and sporadic human infections. Analysis of North American and Asian strains has revealed that the genes involved in antibiotic resistance are located on mobile genetic elements (MGEs), particularly on ICEs and IMEs, which are integrated into the host bacterial genome but, after excision, can be transferred via a conjugation pore. ICEs are autonomous and can act as "helper" elements by transferring non-autonomous elements: IME. The presence of antibiotic resistance genes on such elements represents a major risk of propagation, but these EGMs are still under-researched due to their complex identification. In France, antibiotic resistance in bacteria isolated from sick animals (including S. suis in pigs) is monitored by the Résapath network. To complement these data, the aim of my thesis was to determine the level of antibiotic resistance within a more diversified collection of S. suis strains, to study the genomic location of the genes responsible for this resistance and thus assess the risk of dissemination. Our approach was to: (1) compile a collection of 200 strains representative of those present in mainland France, according to their : serotypes, sites of isolation, enabling us to define three pathotypes (pathogenic, non-clinical and respiratory), period of isolation (before or after the EcoAntibio plan), host (pigs, humans, wild boar) and geographical regions of isolation (half in Brittany, a region with a high density of livestock); (2) perform antibiograms of strains against 22 antibiotics used in veterinary and/or human medicine; (3) sequence 102 selected strains according to their resistance profiles; (4) assemble and annotate genomes, then locate antibiotic resistance, virulence and competence genes, as well as ICEs and IMEs. Our analyses showed that 86% of strains were resistant to at least one antibiotic, with a low rate of resistance to fluoroquinolones, penicillins, pleuromutilin and diaminopyrimidine-sulfonamides, and a very high rate for macrolides-lincosamides and tetracycline. Multidrug resistance profiles were observed in 138 strains, in line with European data. The search for antibiotic resistance genes in S. suis genomes revealed a decrease in their frequency in strains isolated after the EcoAntibio Plan, and a statistically higher number of antibiotic resistance genes in non-clinical strains. What's more, most of these genes (n=217) are located on ICE/IMEs. More than half the strains carry an EMI containing tetracycline and macrolide-lincosamide resistance genes, inserted in a Tn5252 ICE family. Thus, S. suis probably has a high potential for spreading antibiotic resistance genes. Penicillin resistance accounted for 5% of the collection analyzed. Any spread of this resistance would be a cause for concern, given the importance of β-lactamines in the treatment of S. suis infections in both veterinary and human medicine. Our results are complementary to those of the Résapath network, and demonstrate the value of studying strains of serotypes less frequently implicated in pathological cases or carriage strains, in order to improve monitoring of antibiotic resistance in France

Streptococcus agalactiae (Streptocoque du Groupe B, SGB) est une bactérie pathogène opportuniste à Gram-positif responsable principalement d’infections néonatales. Les études épidémiologiques ont montré que les souches appartenant au complexe clonal 17 (ST-17) sont responsables de 80% des cas de méningites tardives. La génomique comparative a permis de mettre en évidence des gènes codant pour des protéines de surface spécifiques au clone ST-17 comme les adhésines Srr2 et HvgA. On y trouve également un locus codant pour un pilus spécifique appelé PI-2b, qui constitua l’objet principal de cette thèse. Ce locus PI-2b est ubiquitaire dans les souches ST-17, mais on le retrouve également dans quelques souches humaines non-ST-17 comme la souche A909 ainsi que dans les souches bovines. Dans la première partie de ce travail, nous avons comparé l’expression du pilus PI-2b dans les souches ST-17 versus non-ST-17. L’expression du locus PI-2b, bien que variable au sein du complexe ST-17, est plus faible que dans les souches non-ST-17. Dans la souche représentative du ST-17 BM110, l’expression du gène spb1codant pour la piline majeure est 4-6 fois plus faible que dans la souche A909. Nous avons montré que cet effet est dû à la présence d’une séquence de 43 paires de base en amont du locus PI-2b, formant une structure de type tige-boucle, qui empêche la transcription provenant du locus situé en amont codant pour l’antigène B. Grâce à des expériences de fusion transcriptionnelle avec un gène rapporteur codant pour la GFP, nous avons montré qu’une région étendue du promoteur ainsi que des facteurs spécifiques à S. agalactiae sont nécessaires pour l’expression maximale du locus PI-2b. Le niveau maximal de transcription du pilus PI-2b est observé à 37 °C. L’ensemble de nos résultats suggère une régulation complexe de l’expression du locus PI-2b, dont l’expression plus faible dans les souches ST-17, pourrait conférer aux bactéries la capacité d’échapper au système immunitaire de l’hôte et de disséminer plus efficacement. La deuxième partie de ce travail a porté sur le rôle des gènes orf, lep et san1519 dont la fonction sur la biosynthèse du pilus n’était pas connue. Nous avons montré que les gènes orf et lep sont importants pour l’expression et la polymérisation du pilus PI-2b. Nous avons montré que lep code pour une signal peptidase fonctionnelle qui participe à la maturation de la piline majeure. Quant à orf, nos autres résultats ainsi le chevauchement traductionnel entre ce gène et lep, conservé dans d’autres espèces de streptocoques, suggèrent un rôle dans la stabilisation des ARNm
Streptococcus agalactiae (also known as Group B Streptococcus, GBS) is an opportunistic Gram-positive pathogen responsible for severe invasive infections, especially in neonates. GBS strains belonging to the ST-17 sequence type are responsible for 80% of late-onset neonatal meningitis. Genomic comparison of ST-17 strains to non-ST-17 GBS isolates revealed a few surface proteins that are characteristic of ST-17 clone, such as HvgA and Srr2, which contribute to colonization and dissemination. Similarly, the PI-2b type pilus is conserved in ST-17 strains and the main goal of this PhD project was to decipher the role of this pilus in the physiopathology of ST-17 strains. In the first part of this work, we compared the expression of the PI-2b pilus in our ST-17 representative strain BM110, and a non-ST-17 human clinical isolate, A909. We showed that PI-2b expression, although variable, was lower in ST-17 isolates as compared to non ST17 isolates. In the representative strain BM110, we demonstrated that the lower expression was be due to the presence of a 43-base pair (bp) hairpin-like structure in the upstream region of PI-2b, preventing read-through transcription from upstream antigen B (AgB) operon. Furthermore, gene reporter assays to characterize the Ppi-2b promoter region revealed the requirement of an extended 5’ region and of GBS-specific regulatory factors to drive PI-2b transcription. PI-2b transcription was shown to be maximal at 37 °C. Collectively our results suggest a complex regulation of PI-2b expression in ST-17 clinical isolates, that may confer a selective advantage in the human host either by reducing host immune responses and/or increasing their dissemination potential.In the second part of this work, we sought to investigate the role of the putative adhesin AP1-2b, and the two accessory genes lep and orf in the biosynthesis of PI-2b pilus. We showed that both orf and lep are important for PI-2b expression. Our results suggest that Lep is a functional signal peptidase involved in the optimal processing of the major PI-2b pilin. The role of orf remains to be uncovered

La découverte d'un contexte génétique chez les streptocoques - codant un petit peptide hydrophobe (SHP) et un régulateur transcriptionnel appartenant à la famille Rgg -, suivi de l'étude d'un de ces loci chez S. thermophilus LMD-9, a conduit à l'hypothèse que les protéines régulatrices Rgg en association avec une phéromone putative SHP pourraient intervenir dans un mécanisme de type quorum-sensing (QS) chez les bactéries à Gram positif. La première partie de ma thèse a consisté à confirmer cette hypothèse sur le locus shp/rgg1358 de S. thermophilus LMD-9, espèce contenant le plus grand nombre de systèmes SHP/Rgg dans son génome. Pour ceci, les étapes impliquées dans un mécanisme de QS ont été étudiées : la sécrétion, la maturation et la détection à une concentration seuil de la phéromone, sa réimportation à l'intérieur de la cellule, son interaction avec un régulateur transcriptionnel et enfin l'interaction de la protéine régulatrice à l'ADN. Par l'utilisation d'approches génétiques et biochimiques, nous avons démontré l'existence d'un nouveau mécanisme de QS impliquant pour la première fois un régulateur transcriptionnel Rgg et une phéromone SHP, importée à l'intérieur de la cellule par le transporteur d'oligopeptides AmiCDEF. Le rôle de la protéase membranaire, Eep, a également été démontré dans la maturation de la phéromone, dont la forme mature a été déterminée par spectrométrie de masse et validée in vivo. Dans un second temps, nous avons exploré la fonctionnalité de ce nouveau mécanisme sur d'autres loci shp/rgg, dans le but d'étudier l'existence d'éventuels phénomènes de cross-talk entre les bactéries. L'étude de nouveaux loci, en système hétérologue chez S. thermophilus LMD-9, a permis d'étendre la fonctionnalité du mécanisme à deux systèmes SHP/Rgg de streptocoques pathogènes, à savoir S. agalactiae et S. mutans. En parallèle à ce travail de caractérisation, l'identification des régulons des systèmes SHP/Rgg a été entreprise. La construction d'un arbre phylogénétique des protéines Rgg-like a permis d'identifier 68 systèmes SHP/Rgg, que nous avons classés en trois groupes. L'analyse des régions promotrices des gènes shp a conduit à l'identification d'un site putatif de liaison des protéines Rgg à l'ADN spécifiques de chaque groupe SHP/Rgg. Une approche in silico a ensuite été menée afin de rechercher, dans les génomes séquencés de streptocoques, les gènes cibles putatifs. Alors que des cibles proximales ont été détectées pour les groupes II et III, des cibles distales ont été identifiées dans les groupes I et II. Actuellement, la validation de certaines cibles est en cours au laboratoire. A l'avenir, ce travail pourrait permettre le développement de petits peptides permettant d'optimiser l'utilisation de S. thermophilus en industries laitières et de réduire la virulence des streptocoques pathogènes.

Nous avons étudié l’intérêt du locus CRISPR1 (associé au système CRISPR-Cas de type II-A), comme marqueur épidémiologique pour le typage et l’analyse phylogénétique des souches de Streptococcus agalactiae, le streptocoque du groupe B (SGB). Par ce travail de thèse, nous avons pu mettre en évidence i) l’activité du système CRISPR-Cas in vivo ainsi que sa faible vitesse d’évolution ii) une conservation des marqueurs ancestraux, permettant d’obtenir des informations sur les lignées phylogénétiques (congruence entre le typage CRISPR et le MLST), iii) un polymorphisme du locus CRISPR1 (notamment des spacers d’acquisition récente), offrant une méthode de typage très discriminante (séparation des isolats au sein d’un même ST définit par MLST). L’analyse de ces spacers nous donne également des informations sur l’évolution récente des isolats, notamment de leurs contacts avec les EGMs. Nous avons montré l’intérêt de cet outil pour le suivi de souches de portage ou l’étude d’une population. Ainsi, à l’issu de ce travail de thèse nous proposons le typage CRISPR comme méthode de référence pour le typage et l’analyse phylogénétique des souches de SGB
We studied the relevance of the CRISPR1 array (associated to a CRISPR-Cas II-A type) as an epidemiological marker for genotyping and phylogenetic analyses of Streptococcus agalactiae (or Group B Streptococcus (GBS)) isolates. We demonstrate that i) spacer acquisition events occurred in vivo which strongly suggest that the CRISPR1-Cas system is functionally active for adaptation ii) ancestral markers (TDR and ancestral spacers) are highly conserved and reflect the phylogenetic structure of the GBS population (in congruence with MLST) iii) CRISPR1 array shared a high degree of polymorphism (especially for leader end spacers) offering a highly discriminatory typing method (allow to separate isolates within a same ST defined by MLST). Leader end analysis also provides specific evidence on isolates recent evolution, especially encounters with MGEs. CRISPR1 array appears as a useful genetic feature to follow vaginal carriage of GBS in women and for evaluate the diversity of GBS vaginal carriage population. On the basis of these data, we assume that this method could pretend to be a reference method for phylogenetic GBS typing