Academic literature on the topic 'Stabilté des protéines'

La présentation sur ribosome (en anglais, ribosome display) est une méthode d’évolution moléculaire et de sélection de banques peptidiques et protéiques. Le ribosome display est réalisé in vitro dans un milieu acellulaire et repose sur la formation d’un complexe ternaire ribonucléoprotéique entre l’ARN, le ribosome et la protéine. Le ribosome display est devenu de nos jours l’une des méthodes de présentation les plus utilisées. Elle a notamment permis le criblage et la sélection de peptides, de protéines, d’échafaudages moléculaires afin d’améliorer leur affinité, leur spécificité, leur activité catalytique ou même leur stabilité. Cette revue présente la mise en œuvre du ribosome display et les applications qui découlent de l’utilisation de cette technologie.

<p style="text-align: justify;">Les protéines ou glycoprotéines de poids moléculaire compris entre 20.000 et 35.000 Da sont responsables de la casse protéique des vins blancs.</p><p style="text-align: justify;">Leur séparation par électrophorèse capillaire permet de montrer que ce sont les fractions protéiques les moins thermostables qui sont les plus difficiles à éliminer par la bentonite.</p><p style="text-align: justify;">D'autre part, il est montré que, lors de l'élevage sur lies des vins blancs, on assiste à une amélioration de la stabilité protéique. Cette amélioration n'est pas dûe à une activité protéolytique des levures au cours de leur autolyse puisque les teneurs en protéines varient peu et que l'addition d'un autolysat à activité protéolytique a peu d'effet sur la stabilité protéique. En fait, l'amélioration de la stabilité protéique des vins blancs au cours de l'élevage sur lies apparaÎt essentiellement due à l'effet protecteur de macromolécules libérées à partir des parois levuriennes. En effet, l'addition de mannoprotéines à un vin permet d'augmenter sa stabilité protéique et par la même de diminuer la dose de bentonite nécessaire à sa stabilisation.</p>

Le passage de la forme non pathogène de la protéine prion normalement présente chez l’individu sain (PrPC) vers la forme pathogène (PrPSc) se traduit par une augmentation de la proportion de feuillet bêta dans la protéine, favorisant son agrégation, la formation de fibrilles et la résistance à la protéinase K. La structure tridimensionnelle de PrPC, déterminée pour quatre espèces, est extrêmement conservée. Elle comporte un segment désordonné et très flexible à l’extrémité N-terminale et une partie globulaire, constituée de deux brins bêta (S1, S2) et de trois hélices alpha (H1 à H3) associés par des boucles (L1 à L5). Le fragment de la protéine correspondant à l’hélice H1 se structure en hélice de façon autonome. En revanche, le peptide comportant la région H1-L3- S2 (PrPH1-L3-S2) montre, comme la protéine, une capacité à adopter différentes conformations. Ces résultats contribuent à proposer l’hélice H1 comme l’un des motifs structuraux de la protéine capables d’initier la transconformation, c’est-à-dire la transformation de la protéine prion normale en protéine prion pathogène. Le rôle clé de l’hélice H1 dans la transconformation a été étayé par une série d’études physicochimiques, détaillées dans l’article, réalisées à l’aide d’une série de peptides de tailles variées (9 à 33 résidus, séquence ovine) ciblés sur la région [133-165] qui comporte la succession des motifs structuraux L2-H1-L3-S2. Les principaux résultats de cette étude montrent la grande stabilité de l’hélice H1, en particulier en présence de la boucle L2 ou des deux boucles L2 et L3. L’absence de la boucle L2 et la présence du brin bêta S2 sont en revanche des facteurs de déstabilisation de l’hélice H1. La boucle L2 pourrait d’ailleurs jouer un rôle tout particulier comme le suggère l’observation d’une interaction entre cette boucle et la protéine PrPC. Une telle interaction pourrait être mise en jeu dans les mécanismes intervenant dans l’interaction protéine prion saine/protéine prion pathogène impliquée dans la propagation de la maladie. Ces résultats, qui devront être confirmés et développés, conduisent à proposer la boucle L2 et le feuillet S2 comme deux régions assurant la «régulation» de la stabilité de l’hélice H1, qui apparaît comme une région clef dans les processus de conversion pathogène.

A Madagascar, la production halieutique annuelle est estimée à 150 000 tonnes. La crevette occupe une place importante dans l’économie malgache et constitue 73 p. 100 des exporta­tions de produits halieutiques (2). Cependant, une grande par­tie des produits entiers n’est pas destinée à la consommation humaine, étant constituée essentiellement par les carapaces et les têtes dont l’élimination peut poser un problème pour l’envi­ronnement. Pourtant, ces déchets contiennent des composants valorisables, notamment des protéines, des lipides et des miné­raux, pour l’amélioration de l’alimentation humaine. L’objectif de cette étude a été d’extraire par hydrolyse enzymatique les composés contenus dans les coproduits de crevettes, de les caractériser et de déterminer les propriétés fonctionnelles des fractions obtenues après hydrolyse.Pour l’hydrolyse, le processus décrit dans une étude antérieure (3) a été adopté avec quelques modifications : les carapaces et les têtes de crevettes ont été hydrolysées en présence de 2 p. 100 de pepsine pendant 2 h à 37 °C et à pH 2. Cette hydrolyse a permis d’obtenir trois fractions : le surnageant, l’eau de lavage du culot, et les résidus de lavage après inactivation de l’enzyme par neu­tralisation du milieu, centrifugation et lavage. Ces fractions ont été caractérisées (matières sèches, protéines, lipides et cendres brutes) et les propriétés fonctionnelles (propriété moussante, pro­priété d’absorption de lipides et propriété d’adsorption d’eau) du surnageant et de l’eau de lavage du culot ont été déterminées.Pour la détermination de la propriété moussante, 20 ml de la solu­tion préparée à 1 p. 100 de l’échantillon ont été homogénéisés à 9 500 tr/min pendant 1 min. Le volume de la mousse formée a été mesuré à 0, 30 s, et à 5, 10, 40 et 60 min. La capacité moussante a été exprimée par le pourcentage de l’augmenta­tion du volume de la mousse à 0 min tandis que la stabilité de la mousse a été exprimée par l’expansion de la mousse durant 60 min (1, 5). La propriété d’absorption de lipides a été obtenue par la détermination du volume d’huile absorbé par gramme de protéine après homogénéisation de 500 mg d’échantillon et 10 ml d’huile, avec agitation toutes les 10 min pendant 30 min et centrifugation à 2 500 tr/min pendant 25 min (1, 4). La pro­priété d’adsorption d’eau a été obtenue par la détermination du volume d’eau absorbé par gramme de protéine après homogé­néisation de 500 mg d’échantillon et 10 ml d’eau avec agitation toutes les 10 min pendant 30 min et centrifugation à 2 500 tr/min pendant 25 min (4).Les têtes de crevettes sont riches en protéines et les carapaces contiennent une quantité considérable de cendres brutes. Après hydrolyse pepsique, le taux d’hydrolyse des carapaces (57 p. 100) a été plus élevé que celui des têtes de crevettes (48 p. 100) (figure 1). Les résultats de la caractérisation des fractions obtenues ont montré que le surnageant contenait une quantité importante de protéines et présentait une propriété moussante intéressante (figures 2 et 3). En effet, l’hydrolyse enzymatique a donné lieu à des protéines de plus petite taille, augmentant leur solubilité et donc leur passage dans la phase soluble. Les résidus de lavage ont représenté une fraction chitineuse pauvre en cendres (tableau I). Le culot a montré une propriété d’absorption de lipides et d’adsorption d’eau non négligeable qui mérite d’être valorisée (figures 3 et 4).L’hydrolyse des coproduits de crevettes avec la pepsine a per­mis de séparer diverses molécules dans plusieurs fractions dont certaines possèdent des propriétés fonctionnelles intéressantes. Elle peut ainsi constituer une voie de valorisation permettant de récupérer différentes molécules d’intérêt.Actuellement, des études sur la toxicité des produits sont effec­tuées et leur utilisation en alimentation est envisagée. En outre, des études sur la composition des acides aminés des protéines du surnageant des carapaces et des têtes de crevettes, ainsi que sur la composition des acides gras contenus dans les lipides du culot sont envisagées pour la valorisation de chaque fraction issue de l’hydrolyse.

Le polymorphisme génétique de la protéine prion ovine associé à des degrés divers de résistance ou de sensibilité à la tremblante ouvre une voie féconde pour comprendre le lien entre les propriétés structurales de la protéine et le mécanisme du développement de la pathologie. Les travaux menés par les équipes de l’INRA, en collaboration avec d’autres équipes nationales, ont apporté des renseignements inattendus sur la stabilité et la convertibilité des variants naturellement rencontrés dans les troupeaux européens. Les mécanismes, au niveau atomique, sous-tendant ces caractéristiques ont pu être explicités par la détermination cristallographique de la structure tri-dimensionnelle de la protéine ovine, apportant en même temps une première information expérimentale sur la structure de la protéine pathologique. Des formes intermédiaires de repliement, sous forme d’oligomères solubles, ont pu être isolées in vitro, et se sont révélées neurotoxiques, ouvrant de nouvelles pistes de recherche vers les déterminants respectifs de la mort neuronale et de la réplication du prion.

RésuméLa distribution intracellulaire des micronutriments ainsi que leur absorption sont importantes pour les fonctions cellulaires. Dans certains cas la distribution des micronutriments ou des protéines associées est déterminée par des mécanismes liés à l'expression des gènes. La région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm de la métallothioneine-1 détermine la localisation de ce message et, par conséquent, la localisation intracellulaire de la protéine qu'il code. En utilisant des cellules transfectées nous avons montré que la métallothioneine-1 est transportée vers le noyau ou elle exerce un rôle dans la protection contre le stress oxydant et les dommages causés à l'ADN. Quand l'apport nutritionnel en Se est limité, l'expression des sélénoproteines est altérée. Toutefois celle-ci n'est pas affectée de fac¸on identique pour toutes les sélénoproteines; le Se disponible étant utilisé de fac¸on prioritaire pour la synthèse de certaines d'entre elles. Cet ordre de priorité met en jeu des différences dans la traduction et la stabilité de leur ARNm qui sont sous le controle de séquences dans la région 3' non traduite. Potentiellement, des variations génétiques affectant ces mécanismes régulateurs peuvent moduler les besoins en nutriments. Des polymorphismes génétiques ont été décrits dans le 3'UTR des ARNm de deux sélénoproteines; l'un d'entre eux affectant la synthèse de la sélénoproteine correspondante. Ces exemples illustrent comment des approches moléculaires peuvent contribuer à accroître notre compréhension du métabolisme et des besoins en nutriments à différents niveaux. Premièrement, elles permettent d'étudier les effets régulateurs des gènes et de leurs produits. Ensuite, la compréhension de ces effets peut fournir un modèle pour étudier le métabolisme des nutriments au niveau cellulaire. Ainsi, lorsque des effets essentiels sont identifiés, la connaissance du génome humain et les bases de données sur les polymorphismes génétiques constituent des outils complémentaires pour définir l'étendue de la variation génétique des gènes revêtant une importance nutritionnelle. Enfin, la fonctionnalité de ces variations peut être définie et des sous-groupes de la population, possédant des besoins nutritionnels différents, peuvent etre identifiés.

<p style="text-align: justify;">Différents essais de laboratoire sont utilisés depuis longtemps pour évaluer le risque d'apparition d'un trouble protéique. Les auteurs comparent ces différents tests en utilisant les méthodes récentes de mesure de la limpidité (néphelométrie) et de dosage des protéines (CLHP).</p><p style="text-align: justify;">Les résultats obtenus montrent que le test à la chaleur (80° C-30 mn) reste l'essai de laboratoire le plus fiable, car il est simple à mettre en oeuvre et il se rapproche le plus des conditions d'apparition des troubles protéiques dans la pratique.</p><p style="text-align: justify;">+++</p><p style="text-align: justify;">Various laboratory stability tests have been used for a long time to check the risks of protein turbidity. The authors have been comparing those different tests with the help of more modern methods of measuring out cloudiness (nephelometry) and protein (HPLC).</p><p style="text-align: justify;">Six tests were examined :</p><p style="text-align: justify;">- The test consisting in heating for 5 minutes at 80° C in a double-boiler.</p><p style="text-align: justify;">- The test consisting in heating for 30 minutes at 80° C in a double-boiler.</p><p style="text-align: justify;">- The test consisting in heating for 10 days at 35° C in an oven.</p><p style="text-align: justify;">- The adding of 0.5 9 of tannin per litre.</p><p style="text-align: justify;">- The adding of a reagent to phosphomolybdic acid (bentotest).</p><p style="text-align: justify;">- The adding of trichloracetic acid.</p><p style="text-align: justify;">The results are as follows :</p><p style="text-align: justify;">- For the tests involving heat, the longer the heating at 80° C, the higher the measures of the turbidity are; the cloudiness observed for the test consisting in heating at 35° C for 10 days is quite important. If the results obtained with these heating tests are to be compared to the real protein values, the most efficient test consists in heating 30 minutes at 80° C.</p><p style="text-align: justify;">- For the tests consisting in adding tannins, a high variation of turbidity values must be related to the results obtained through high performance liquid chromatography. Moreover, the important cloudiness observed when the tannins were added does not correspond to the small difference observed between the chromatograms of the wine streated with the tanins and those of the original samples.</p><p style="text-align: justify;">- The reagent to phosphomolybdic acid (bentotest) and the trichloracetice acid test create an important turbidity. After chromatographic examination, the use of these reagents proved to be acting more thoroughly on every sort of protein than the use of heat in the heating tests. For two out of the four wine-samples examined, the bentotest was more drastic than the addition of trichloracetic acid.</p><p style="text-align: justify;">As a conclusion the heating test (80° C for 30 minutes) remains the most reliable laboratory test, because it is sample and easy to make; it is also very close to the conditions in which protein turbidity may appear in reality.</p>

Les vésicules extracellulaires, sécrétées spontanément ou en réponse à un stress par tous les types cellulaires, sont proposés comme des biothérapies alternatives aux thérapies cellulaires et aux nanomédicaments synthétiques. Leurs atouts logistiques (stockage, stabilité, disponibilité, tolérance), leur capacité à franchir les barrières biologiques, à délivrer leurs contenus (protéines, lipides et acides nucléiques) pour modifier leurs cellules cibles, ainsi que leurs activités immunomodulatrice et régénérative, suscitent un intérêt grandissant pour un très large spectre de maladies. Cette synthèse présente les défis qui restent à relever pour appliquer ces biothérapies en clinique. Quelques applications prometteuses dans les domaines du cancer et de la médecine régénérative seront proposées.

<p style="text-align: justify;">L'effet colloïde-protecteur d'extraits mannoprotéiques de parois de levures vis-à-vis de la précipitation tartrique a été étudié en solution hydroalcoolique, en utilisant un IST mètre (Indice de Stabilité Tartrique).</p><p style="text-align: justify;">Nous avons montré que les deux extraits levuriens inhibaient la cristallisation du bitartrate de potassium au même titre que l'acide métatartrique et la carboxyméthylcellulose, mais à un niveau plus faible. Le niveau de stabilité retenu (ISTC-75) est assuré avec des concentrations par litre de 7,5 mg d'acide métatartrique et de 18 mg de carboxyméthylcellulose. Des concentrations en extraits mannoprotéiques inférieures à 100 mg par litre assurent la stabilité tartrique du vin modèle à l'indice retenu. L'efficacité d'inhibition semble dépendre de la quantité de protéines de l'extrait. Ces polymères mannoprotéiques apportés en quantité suffisante éviteraient les risques de précipitation tartrique dans les vins</p>

La capacité moussante et la stabilité de la mousse sont des propriétés fonctionnelles qui déterminent l'utilisation finale d’un aliment. Ces propriétés sont le plus souvent associées aux facteurs intrinsèques des protéines tels que la structure moléculaire et la taille. En revanche, les paramètres physiques extrinsèques sont peu éudiés malgré leur impact significatif sur la qualité technologique d’un produit. Ainsi, l’objectif de ce travail est d’évaluer l’influence de la granulométrie, du type de solvant aqueux, et de la concentration de poudre sur la capacité moussante et la stabilité de la mousse des poudres des racines tubéreuses du manioc Manihot esculenta (Crantz) cv Bonoua 2. Pour y parvenir, la capacité moussante et la stabilité de la mousse d’échantillons de manioc à différentes granulométries ont été déterminées dans deux types de solvants aqueux (eau distillée et eau de robinet ) et à différents ratios. Il ressort que la qualité du solvant aqueux influence la capacité moussante et la stabilité de la mousse des différentes poudres de racines tubéreuses de manioc. La taille des particules des poudres de racines de manioc influence également les capacités moussantes. Au terme de cette étude, nous pouvons noter que les facteurs extrinsèques influencent effectivement les propriétés de la poudre de manioc. Ainsi, ces facteurs doivent etre pris en compte pour une eventuelle application de ces poudres en industrie agroalimentaire. Foaming capacity and foam stability are functional properties that determine the final use of a food. These properties are most often associated with induced factors of proteins such as molecular structure and size. On the other hand, extrinsic physical parameters are little studied despite their significant impact on the technological quality of a product. Thus, the objective of this work is to evaluate the influence of the particle size, the type of aqueous solvent, and the powder concentration on the foaming capacity and the foam stability of powders from the tuberous roots of Manihot esculenta cassava. (Crantz) cv Bonoua 2. To achieve this, the foaming capacity and foam stability of cassava samples at different particle sizes were determined in two types of aqueous solvents (distilled water and tap water) and at different ratios. It appears that the quality of the aqueous solvent influences the foaming capacity and foam stability of different cassava tuberous root powders. Also, the particle size of cassava roots influences foaming capabilities. At the end of this study, we can note that extrinsic factors actually influence the properties of cassava powder. Thus, these factors must be taken into account for a possible application of these powders in the food industry.

Présente chez les mammifères, mitoNEET (mNT) est une protéine à centre Fe-S ancrée à la membrane externe de la mitochondrie. Cette protéine dimérique possède un centre [2Fe-2S] par monomère lié de façon atypique à la protéine par trois cystéines et une histidine. Notre équipe a auparavant montré l’implication de mNT dans une nouvelle voie de réparation du centre [4Fe-4S] de l’Iron Regulatory Protein-1 (IRP-1), régulateur majeur de l’homéostasie du fer intracellulaire, par transfert du centre Fe-S de mNT à l’IRP-1 à réparer. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur la caractérisation in vitro de la réaction de transfert de centre Fe-S de mNT vers une protéine réceptrice modèle, l’apo-ferrédoxine d’E. coli. En combinant des approches de biochimie et biophysique (réalisées en collaboration) à l’aide de protéines purifiées, cette étude a permis de démontrer que mNT agit comme un interrupteur moléculaire : lorsque son centre Fe-S est réduit, la protéine est extrêmement stable et le centre ne peut être ni perdu ni transféré; une fois oxydé, il peut alors être transféré à une protéine réceptrice. La présence d’oxygène n’affecte pas cette réaction même s’il s’agit d’un déterminant majeur de la stabilité de la protéine. De plus, la vitesse de transfert du centre est très sensible au pH, ce qui fait de mNT un senseur de pH. Ces études ont aussi montré que mNT est extrêmement résistante à H2O2 en comparaison à d’autres protéines de transfert de centre Fe-S. J’ai également étudié l’interaction d’une molécule anti-oxydante, le resvératrol-3 sulfate, avec mNT. Pour finir, je me suis intéressée à l’effet du glutathion sur mNT. Acteur majeur de la régulation de l’homéostasie rédox, le glutathion existe sous deux formes: oxydée (GSSG) et réduite (GSH). J’ai alors constaté que le GSH déstabilise fortement mNT à certains pH et peut même se lier à cette protéine. La fonction thiol du GSH et la formation de radicaux sur cette dernière sont clairement impliquées dans la déstabilisation de mNT
Present in mammals, mitoNEET (mNT) is an Fe-S protein anchored to the outer mitochondrial membrane. This dimeric protein contains a [2Fe-2S] per monomer with an atypical ligation involving three cysteines and one histidine. Previously, our team proposed that mNT is involved in a new pathway dedicated to the reparation of the oxidatively damaged [4Fe-4S] cluster of human iron-regulatory protein-1 (IRP-1)/cytosolic aconitase, a key player of the regulation of cellular iron homeostasis. This reparation occurs via Fe-S cluster transfer from mNT to IRP-1 to repair. In the course of my thesis, I focused on the characterization of cluster transfer reaction from mNT to a model receptor protein, the E. coli apo-ferredoxin. Using purified proteins and combining biochemical approaches with biophysical ones performed in colaboration, this study showed that mNT acts as a redox switch: when the Fe-S cluster is reduced, the protein is extremely stable and it cannot be lost or transferred; when it is oxidized, it can be transferred to a receptor protein. Dioxygen does not affect this transfer reaction whereas this is a major determinant of protein stability. The transfer speed is highly sensitive to pH. Thus, mNT seems to act also as a pH sensor. Moreover, this study shows that mNT is extremely resistant to H2O2 compared to other Fe-S cluster transfer proteins. I also looked at the interaction of an antioxidant molecule, the resveratrol-3-sulfate, with mNT. Finally, I studied the effects of glutathione on mNT. Major player of the regulation of redox homeostasis, glutathione exists under two states: a reduced state (GSH) and an oxidized one (GSSG). I observed that GSH strongly destabilizes mNT at specific pHs and can even directly interact with the protein. The thiol function of GSH and the radical formation on this function are clearly involved in the mNT Fe-S destabilization

Récemment Franzetti et al. Ont découvert un nouveau type de protéases auto-compartimentées indépendantes d'énergie dans les archaeas. Les particules ont été appelées TET pour leurs structures tridimensionnelles tétraédriques. Les TETs forment de grands complexes d'un poids moléculaire d'environ 500kDa. Leur rôle dans l'organisme est pourtant inconnu. Dans P. Horikoshii, une Archaea hyperthermophile de la mer profonde, trois protéases TET ont été identifiées (PhTET1, 2 et 3). Nous avons exprimé et purifié PhTET3 recombinante. L'enzyme a été caractérisée biochimiquement et nous avons déterminé la structure d'un complexe de PhTET3 de 12 sous-unités par cristallographie aux rayons X. Afin de mieux comprendre son rôle physiologique potentiel et de s'assurer pourquoi il y a trois protéases TET dans P. Horikoshii, la structure et les propriétés enzymatiques de PhTET3 ont été comparées à celles de deux autres protéases TET déjà caractérisées. Puisque l'auto-compartimentage joue un rôle important dans le fonctionnement et la régulation des protéases, les facteurs commandant l'oligomérisation de PhTET3 in vitro ont été étudiés par ultracentrifugation analytique et diffusion de neutrons aux petits angles. Finalement, dans des états physiologiques de mer profonde, l'enzyme est exposée à la haute température (jusqu'à 100°C) et à la haute pression. Afin d'étudier les limites de la stabilité de grands assemblages macromoléculaires, la structure à basse résolution et l'activité enzymatique de PhTET3 ont été mesurées à hautes pressions et à hautes températures en utilisant la diffusion des rayons X aux petits angles et la spectrophotométrie à haute pression. Au total, ces études ont indiqué que les protéases TET de P. Horikoshii forment un système intégré de dégradation de peptides et que PhTET3 montre une stabilité exceptionnelle à haute pression et à haute température aussi bien que des propriétés enzymatiques associées aux conditions environnementales
Recently Franzetti et al. Discovered a new type of energy-independent self-compartmentalized proteases in Archaea. The particles were named TET for their tetrahedral three-dimensional structure. The TETs self assemble as large molecular weight complexes of about 500kDa. Their role in the organism is yet unknown. In P. Horikoshii, a hyperthermophilic Archaea from the deep sea, three TET proteases have been identified (PhTET1, 2 and 3). We have expressed and purified recombinant PhTET3. The enzyme was characterized biochemically and we determined the structure of a PhTET3 12 subunit complex by x-ray crystallography. In order to gain insight into its potential physiological role and to ascertain why there are three TET proteases in P. Horikoshii, the structure and the enzymatic properties of PhTET3 have been compared to the two other TET proteases that were characterized before. As self-compartmentalization plays an important role in functioning and regulation of proteases, the factors controlling PhTET3 oligomerization in vitro have been studied by analytical ultracentrifugation and small angle neutron scattering. Finally, under physiological deep sea conditions, the enzyme is exposed to high temperature (up to 100°C) and high pressure. In order to study the limits of stability of large molecular weight assemblies, the low-resolution structure and the enzymatic activity of PhTET3 have been monitored under high pressures and temperatures using small angle x-ray scattering and high-pressure spectrophotometry. Taken together, these studies revealed that the TET proteases of P. Horikoshii form an integrated peptide degradation systems and that PhTET3 exhibits unusual stability under high pressure and temperature as well as environment-associated enzymatic properties

LES ANTICORPS RECOMBINANTS ONT DE NOMBREUSES APPLICATIONS, LIMITEES PAR UNE STABILITE INSUFFISANTE. NOUS VOULIONS DEVELOPPER UNE METHODE SIMPLE ET ROBUSTE DE STABILISATION DES FRAGMENTS D'ANTICORPS, ET COMPRENDRE LES MECANISMES DE STABILISATION CORRESPONDANTS. NOUS AVONS DEVELOPPE UNE METHODE FIABLE ET PRECISE POUR MESURER LA STABILITE DES FRAGMENTS D'ANTICORPS. POUR CELA, NOUS AVONS ETABLI UNE LOI RIGOUREUSE DU SIGNAL POUR LA LONGUEUR D'ONDE DU MAXIMUM DE FLUORESCENCE LMAX. LES TERMES CORRECTIFS A APPORTER A LA STABILITE ΔG(H2O) ET AU COEFFICIENT DE COOPERATIVITE m, OBTENUS EN UTILISANT UNE LOI LINEAIRE EMPIRIQUE DU SIGNAL POUR LMAX, ETAIENT MESURABLES EXPERIMENTALEMENT. NOUS AVONS PREDIT AVEC SUCCES UN ENSEMBLE DE MUTATIONS STABILISATRICES SUR LE FRAGMENT MODELE scFvD1. 3, EN UTILISANT DES CRITERES COMPLEMENTAIRES DE STRUCTURES, SEQUENCES ET DONNEES EXPERIMENTALES SUR LES ANTICORPS. UN DERIVE RECOMBINANT CES MUTATIONS AVAIT UNE TRES HAUTE STABILITE, UNE AMELIORATION DE STABILITE ΔΔG(H2O) SUPERIEURE A CELLES PUBLIEES PRECEDEMMENT, UNE ACTIVITE CYTOPLASMIQUE AMELIOREE, ET UNE AFFINITE INCHANGEE POUR L'ANTIGENE. NOS REGLES DE CONCEPTION PERMETTAIENT DE PREDIRE LES EFFETS DES MUTATIONS DE FAÇON QUALITATIVE POUR ΔG(H2O) ET QUANTITATIVE POUR LA CONCENTRATION EN UREE DE DEMI-DENATURATION. L'ACCROISSEMENT DE m CONSTITUAIT UN MECANISME IMPORTANT DE STABILISATION. LES EFFETS DES MUTATIONS DEPENDAIENT DU CONTEXTE STRUCTURAL. CES RESULTATS INDIQUAIENT L'EXISTENCE DE STRUCTURES RESIDUELLES DANS L'ETAT DENATURE DU TYPE PARENTAL. CETTE METHODE A ETE APPLIQUEE A LA STABILISATION DTMMUNOCAPTEURS FLUORESCENTS AUTONOMES, QUI POURRONT SERVIR DE BASE A LA CONSTRUCTION DE PUCES A PROTEINES
RECOMBINANT ANTIBODIES HAVE A NUMBER OF APPLICATIONS, SOME OF THEM LIMITED BY A LOW STABILITY. WE INTENTED TO DEVELOP A SIMPLE AND ROBUST METHOD TO IMPROVE RECOMBINANT ANTIBODIES STABILITY, AND TO UNDERSTAND THE UNDERLYING MECHANISMS OF STABILISATION. WE DEVELOPED A RELIABLE METHOD TO PRECISELY MEASURE THE STABILITY OF ANTIBODY FRAGMENTS. WE ESTABLISHED A RIGOROUS LAW OF THE SIGNAL FOR THE WAVELENGTH OF THE MAXIMUM FLUORESCENCE INTENSITY LAMBDA MAX. THE STABILITY ΔG(H2O) AND THE COEFFICIENT OF COOPERATIVITY m WHEN THE EMPIRICAL LINEAR LAW OF THE SIGNAL IS APPLIED, HAVE TO BE CORRECTED. THE CORRECTIVE TERMS CAN BE DETERMINED EXPERIMENTALE Y. USING COMPLEMENTARY CRITERIA OF SEQUENCE, STRUCTURE AND EXPERIMENTAL DATA ON ANTIBODIES, WE FRAGMENT, COMBINING ALL THE DESIGNED MUTATIONS, HAD A PARTICULARLY HIGH STABILITY, A STABILITY IMPROVEMENT COMPARED TO THE WILD-TYPE HlGHER THAN REPORTED SO FAR BY ANY METHOD, AN INCREASED CYTOPLASMIC ACTIVITY, AND AN UNMODIFIED AFFINITY FOR THE ANTIGEN. OUR RULES OF DESIGN ALLOWED US TO PREDICT THE EFFECTS OF MUTATIONS QUALITATIVELY FOR ΔG(H2O) AND QUANTITATIVELY FOR THE CONCENTRATION OF UREA AT HALF-DENATURATION. THE IMPROVEMENT OF m WAS AN IMPORTANT MECHANISM OF STABILISATION. THE EFFECTS OF MUTATIONS DEPENDED OF THE STRUCTURAL CONTEXT. THESE RESULTS INDICATED THE EXISTENCE OF RESIDUAL STRUCTURES IN THE DENATURATE STATE OF THE WILD-TYPE. WE THEN USED THIS METHOD TO IMPROVE THE PRODUCTION LEVEE AND THE LIFE-SPAN OF REAGENTLESS FLUORESCENT IMMUNOSENSORS, WHICH COULD BE USED FOR THE DEVELOPMENT OF ANTIBODY ARRAYS

La transmission des virus grippaux de type A s’effectue via l’eau, l’air ou les surfaces. Elle implique donc toujours une étape dans l’environnement, durant laquelle les virus sont inactivés plus ou moins rapidement en fonction du sous-type ou de la souche virale analysés. Cependant, à ce jour, les facteurs moléculaires déterminant la stabilité des particules virales en dehors de l’hôte restent largement méconnus. Dans le but d’identifier ces déterminants, nous avons généré différentes combinaisons de réassortiments entre deux virus grippaux de sous-types H1N1 possédant un phénotype de stabilité différent. Les stabilités respectives de ces virus réassortants ont été évaluées dans un environnement-modèle, puis comparées entre elles. Pour cela, nous avons utilisé un système d’analyse en temps réel des cultures cellulaires, permettant de calculer, pour chacun des virus testés, une pente d’inactivation moyenne et, in fine, de mesurer l’influence respective de chacun des segments viraux sur le phénotype de stabilité des virus. D’après nos résultats, le phénotype de stabilité des virus grippaux est majoritairement déterminé par l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), qui sont les principales glycoprotéines de surface de ces virus. De plus, nous avons identifié des changements d’acides aminés dans la HA et dans la NA, qui ont pour effet une diminution ou une augmentation de la stabilité des particules virales dans l’environnement. Nous avons également montré qu’un virus avec un gène de la HA codons-optimisés, et donc porteur de mutations synonymes, suffit pour augmenter significativement la stabilité des particules virales dans l’environnement. La stabilité de la HA à pH acide, le taux d’expression de la HA dans les cellules infectées, et le nombre de sites de fixation aux ions calcium dans la NA sont modifiés par les mutations décrites dans cette étude, et sont donc des facteurs de stabilité des particules virales. De plus, une analyse en microscopie a permis de montrer que les virus inactivés dans l’environnement peuvent fixer leurs récepteurs cellulaires, mais sont incompétents pour induire l’étape de fusion dans l’endosome nécessaire à l’entrée des virus dans la cellule. Ces deux étapes du cycle viral sont dépendantes de la HA. Dans l’ensemble, nos résultats montrent l’importance de la HA et de la NA des virus grippaux dans la détermination du phénotype de stabilité des virus grippaux dans l’environnement. Par conséquent, la diversité connue des HA et NA dans la nature laisse supposer des variations fréquentes du phénotype de stabilité de ces virus. Leur étude pourrait permettre de mieux décrire l’écologie et l’épidémiologie de ces virus. L’analyse des données épidémiologiques et climatiques des épidémies de grippe saisonnière, sur 5 ans et dans 13 pays, a ainsi révélé une différence de distribution des virus H1N1 et H3N2, en fonction de la température hebdomadaire dans ces pays. La comparaison de la stabilité de ces virus sur des surfaces, à 4 °C et à 20 °C, suggère que la distribution des sous-types viraux au début des épidémies est en partie régulée par leur stabilité en fonction de la température
The transmission of Influenza A viruses (IAV), either airborne in mammals or oro-faecal in aquatic birds, submits viral particle to a wide range of environmental conditions. These environmental conditions modulate IAV survival outside the host, which is also dependent on the viral subtype or strains. To date, the molecular drivers of IAV environmental persistence remain to be identified. In order to identify IAV molecular drivers of the environmental persistence, we generated different reassortant viruses between two H1N1 viruses that do not have the same stability outside the host. To this purpose, we performed survival kinetic and compared the inactivation slope of generated reassortant viruses in our controlledenvironment, using a real time cell analysis system. Our results demonstrate that the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA) are the main viral segments driving IAV environmental persistence. In addition, mutations driving viral stability in the environment were identified in the HA and NA amino-acid sequences. We also demonstrated that synonymous mutations introduced in the HA, using a codon-optimization strategy, drive the environmental persistence of IAV. The HA stability at low pH, HA surface expression levels in infected cells and the number of calcium binding sites of the NA were alternately changed by the mutations described in our study, indicating that these are stability determinants of IAV survival outside the host. Then, the sequential events of viral entry were analysed with fluorescence microscopy assays, showing that viral particles being exposed for a long period in saline water at 35°C are still able to bind their cellular receptor whereas the HA-mediated fusion within the endosome is not possible anymore. These two steps of the viral cycle are mainly mediated by the HA protein. Altogether, these result highlight the importance of the HA and the NA proteins, driving the environmental persistence of IAV. Given the known diversity of these two proteins in nature, this arouses interest in studying IAV environmental persistence at a more global scale. Such study could improve our knowledge on IAV ecology and epidemiology. Epidemiologic and climatic data analyse of human seasonal influenza viruses during 5 years and from 13 countries revealed that H1N1 virus and H3N2 virus distribution differs according to the mean weekly temperature in these countries. We then compared the H1N1 virus and H3N2 virus persistence on stainless steel surface at 4 °C and 20 °C, and the preliminary results suggest that IAV seasonal subtypes distribution might be partly regulated by their stability according to the temperature

Chez les mammifères, près de 8 % ARNm présentent dans leur région 3’ non traduite des éléments riches en en adénines et uridines appelés AREs (AU-rich elements). Ces séquences sont reconnues par des facteurs variés, telles les protéines de la famille de la tristétraproline (TTP) qui régulent la vitesse de dégradation et/ou la traduction de ces ARNm. La protéine Tis11 membre fondateur de la famille TTP, contient des deux doigts de zinc en tandem ( domaine TZF) permettant de fixer les AREs et reconnait ainsi des ARNm codant principalement des cytokines et stimule leur dégradation par un mécanisme encore mal connu. Chez Saccharomyces cerevisae, Cth2 la dégradation d’ARNm contenant des AREs et codant des protéines en relation avec le métabolisme du fer. Afin de mieux comprendre le mécanisme permettant de déstabiliser ces ARNm, nous avons entrepris une analyse structure/fonction de Cth2. Nous avons ainsi identifié un domaine conservé appelé CR1, essentiel pour déstabiliser les ARNm mais non requis pour la fixation des AREs. De manière inattendue, l’expression de mutants dépourvus de ce domaine conduit à une accumulation de transcrits cibles présentant une extension en positon 3’. L’analyse de mutants affectant la machinerie de polyadénylation ainsi que l’observation d’une localisation majoritairement nucléaire de Cth2 ont permis de montrer que l’altération de la maturation 3’ de ces ARNm résulte d’une compétition entre Cth2 et la machinerie de polyadénylation au niveau des ARE. Nos résultats révèlent pour la première fois qu’une protéine apparentée au TTP peut affecter la maturation 3’ des ARNm contribuant ainsi à leur déstabilisation
Almost 8 % of mammalian mRNAs display AU-rich element (ARE) in their3’ untranslated region (UTR). Many are specifically bound by ARE-binding proteins, such as the members of the tristetrapolin family (TTP), that act to modulate mRNA decay and/or translation. HTTP contains a characteristic tandem repeat CCCH zinc finger domain involved in ARE binding. Upon binding hTTP destabilizes its targets such as cytokines encoding mRNAs, but its precise mechanism of action remains poorly understood. In budding yeast, Cth2, has recently been shown as a functional homologue of TTP. Under iron deprivation conditions, Cth2 is expressed, binds to ARE of its mRNAs targets, encoding iron metabolism related proteins, and finally stimulates their decay. To understand the mode of action of Cth2, we undertook a structure-function analysis of this factor. Our analysis identified a conserved region (CR1) that is essential to Cth2 activity but unessential for the ARE binding capacity. Interesting, mutants lacking this region exhibited a novel molecular phenotype with accumulation of 3’ elongated forms of target mRNAs. The analysis of mutants affecting the polyadénylation machinery together with the observation of a predominant nuclear localization of Cth2 indicate that Cth2 has also a function in regulating 3’ end processing of ARE containing mRNAs. For the time, our results show that a TTp-related protein can affect mRNA decay and also regulate the 3’ end processing of its ARE-containing mRNA targets

Ce travail de thèse est porté sur l’étude des interactions protéines-protéines, protéines-peptides ainsi que la stabilité des protéines en faisant appel à la spectroscopie Raman et infrarouge. Dans la première partie, nous nous sommes focalisés sur l’étude de l’interaction entre les différentes protéines d’adrénodoxine et d’adrénodoxine réductase afin d’apporter de nouvelles données pour compléter la compréhension du mécanisme d’échange électronique. Le deuxième objectif à atteindre dans le cadre de ce travail est de suivre les changements conformationnels au niveau de la structure secondaire et tertiaire qui se produisent en présence et en absence des peptides lors de la formation des complexes. Enfin, la dernière partie est dédiée dans un premier temps à une étude comparative de la stabilité des hémocyanines de Limulus polyphemus et Eurypelma californicum issue de deux organismes ayant des conditions de vie différentes en suivant l’effet de la température (294-20 K) et du pH sur la structure secondaire des protéines. Dans un deuxième temps l’étude porte sur l’influence de la teneur en oxygène sur la structure secondaire et sur le site actif des hemocyanines de Limulus polyphemus, Eurypelma californicum et Astacus leptodactylus
This thesis is focused on the study of protein-protein and protein-peptide interactions as well as the study of proteins stability by means of Raman and infrared spectroscopies. In the first part, we focused on the interactions between different adrenodoxin and adrenodoxin reductase proteins in order to get a better understanding of the electron transfer mechanism. The second part of the thesis concerns the changes in the secondary and tertiary structure of PDZ domains in the presence and absence of peptides during complex formation. The last part is dedicated to a comparative study of hemocyanins originated from organisms living in vastly different conditions such as Limulus polyphemus and Eurypelma californicum. This part of the project concerns the effect of temperature (294-20 K) and pH on the secondary structure of proteins. Finally the influence of oxygen binding on the secondary structure and the active site of Limulus polyphemus, Eurypelma californicum and Astacus leptodactylus was investigated

Les Nucléoside Diphosphate kinases (NDPK) sont des enzymes responsables de la synthèse des nucléosides triphosphates. Hexamériques chez les eucaryotes, leur structure stabilise les monomères. Chez l'homme, l'isoforme A est codé par le gène Nm23 lequel est également un gène suppresseur de métastases. La mutation naturelle S120G déstabilise les monomères qui perdent leur capacité à se renaturer correctement et restent in vitro sous forme d'intermédiaires de repliement de type molten-globule. (1) Nous avons montré que l'ATP corrige le défaut de repliement du mutant S120G en phosphorylant son histidine catalytique. Ce mécanisme physiologiquement pertinent explique pourquoi la protéine mutée est fonctionnelle dans les cellules cancéreuses. Le chaperon chimique triméthylamine-N-oxyde corrige également le défaut de repliement du mutant S120G, mais par un mécanisme différent de celui de la phosphorylation. Ces deux mécanismes ont un effet additif. Enfin, l'introduction d'une deuxième mutation "suppresseur intra-génique" corrige partiellement le défaut de repliement. (2) Nous avons également montré que le mutant S120G peut adopter une conformation alternative aberrante et former des fibres amyloides en feuillets β. Plusieurs modèles corrèlent la stabilité des enzymes oligomériques à l'aire d'interface enfouie. Plus l'interface est grande, plus le complexe est thermostable. La NDPK de M. Tuberculosis est hexamérique et présente une interface de 30 % plus faible que celle d'autres NDPK (celle de D. Discoideum par exemple) pour une stabilité thermique plus élevée. (3) La stabilité de cette NDPK a été étudiée pour comprendre ce paradoxe au niveau structural
Nucleoside Diphosphate kinases (NDPK) are enzymes responsible of nucleoside triphosphate synthesis. Hexameric in eukaryotes, their quaternary structure stabilises monomers. The human isoforme A is encoded by the Nm23 gene which is also known to be a metastasis suppressor. The S120G natural mutation destabilises monomers which become unable to refold correctly and stay in vitro under a molten-globule like intermediate conformation. (1) We have shown that ATP corrects the S120G mutant folding defect by phosphorylating its catalytic histidine. The refolding mechanism by phosphorylation is pertinent physiologically and explains why the mutated protein is functional in tumoral cells. The presence of the chemical chaperone trimethylamine-N-oxyde corrects the folding defect of the S120G mutant but by a mechanism different of that of phosphorylation. Both mechanisms have an additive effect. Introduction of a second site suppressor mutation partially corrects the S120G mutant folding defect. (2) Moreover, we have shown that the S120G mutant can adopt an alternative aberrant conformation and form amyloid fibres rich in β sheets. Several models correlate the stability of oligomeric enzymes to the interface area. Larger is the interface, more thermostable is the complex. The M. Tuberculosis NDPK is hexameric and presents 30 % less of interface, as compared to the others NDPK (such as Dictyostelium discoideum, for example) the thermostability of which is higher. (3) We have studied the NDPK stability in order to understand such a paradox at the structural level

L’objectif de ce travail est d’identifier les conditions et les mécanismes permettant la création d'aptitudes nouvelles ou améliorées des protéines du lactosérum à la stabilisation et texturation des mousses alimentaires.À cette fin, nous avons étudié la rhéologie interfaciale de protéines adsorbées à l’interface eau/air, les réarrangements topologiques à l’échelle de quelques films liquides, la stabilité et la rhéologie de mousses de protéines. L’étude a porté à la fois sur un mélange de protéines du lactosérum et sur sa protéine majoritaire purifiée, la ß-lactoglobuline. Pour identifier les liens avec leurs propriétés structurales et physico-chimiques, des modifications des protéines ont été générées par étuvage de poudres. Plusieurs paramètres d’étuvage ont été variés simultanément. Une large gamme de modifications structurales des protéines a été obtenue grâce au contrôle de ces paramètres. Nous avons mis en évidence que de petites modifications structurales des protéines ont des conséquences majeures sur la rhéologie interfaciale, la dynamique des réarrangements de films, la stabilité et la rhéologie des mousses.Les effets de l’étuvage des poudres sur les propriétés des mousses sont complexes, car ils dépendent étroitement de la combinaison des effets des paramètres d’étuvage, comme de la propriété de la mousse qui est mesurée. Parallèlement, l’examen de la variabilité des comportements à plusieurs échelles apporte un éclairage original sur la contribution de la rhéologie interfaciale aux propriétés de mousses de protéines. Il met notamment en évidence l’intérê
The objective of this work is to identify the conditions and mechanisms of the creation or improvement of the stability and rheology of whey proteins foams. To this aim, we studied the interfacial rheology of protein layers adsorbed at the air/water interface, the liquid films dynamics after a topological rearrangement, the stability and rheology of whey protein foams. Both a mixture of whey proteins and purified ß-lactoglobulin, used as a model protein, were studied. To study the relationships with protein structure, proteins were modified by dry-heating of whey protein powders. A wide variety of structural changes was obtained by varying simultaneously multiple dry-heating parameters.Interestingly, low-extent structural modifications have a dramatic impact on interfacial rheology, liquid film dynamics, foam stability and foam rheology. The effects of dry-heating parameters on the foam properties are complex and depend on their combination and the considered foam feature. Our original multiscale approach (interface, film dynamics and foam) sheds light on the contribution of the interfacial rheology to protein foam properties. In particular, foam dynamics have been shown to play a predominant role

La cellule est un environnement complexe. Le pH, la force ionique ou l'encombrement cytoplasmique. . . Sont influencent les réactions biochimiques. Il est généralement difficile d'étudier in-vivo l'influence d'un seul de ces paramètres. Le volume exclu induit par la présence de nombreuses macromolécules en solution créé des interactions non spécifiques stériques. Nous avons étudié celle de l'encombrement sur deux aspects différents : la dynamique des protéines et l’équilibre état natif /état dénaturé. Des études ont permis de mettre en évidence que l'encombrement stabilisait la protéine à l'état natif en déstabilisant l'ensemble des états dénaturés. Les protéines dénaturées adoptent une conformation de chaîne gaussienne. Des mesures de diffusion de neutrons aux petits angles ont montré que le rayon de giration d'une chaîne gaussienne modèle diminuait considérablement avec la fraction massique en agent d'encombrement. Dans le cas de la myoglobine, celle-ci est stabilisée. En présence d'encombrement, le rayon de giration de la protéine dénaturée diminue. L'encombrement cytoplasmique modifie la dynamique des protéines. Il existe différents régimes de diffusion collective ou individuelle (à temps court et long). Le temps de relaxation mesuré pour les solutions d'hémoglobine fortement concentrées ne peut-être associé à un mouvement purement diffusif et peut être lié à un mouvement localisé. Nous avons étudié la structure d'un substitut sanguin, l'hémoglobine greffée de deux poly(ethylene glycol). La réactivité du complexe varie avec le poids moléculaire des polymères. L'étude de sa structure a permis d'observer que celle-ci était sans doute fortement reliée à sa réactivité.

Afin d’améliorer la stabilité plasmatique de peptides, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur l’introduction d’une chaîne fluorocarbonée dans la séquence d’un peptide natif. En appliquant le concept à l’apeline-17, un peptide présentant un intérêt potentiel pour le traitement de maladies cardiovasculaires, nous avons amélioré sa stabilité plasmatique de 4 min à plus de 24 h ainsi que son efficacité in vivo. L’étude du mécanisme de stabilisation a permis de mettre en évidence la liaison de la fluoroapeline à l’albumine, conduisant à la protection du peptide vis-à-vis de la protéolyse. Le concept a été appliqué à d’autres peptides tels que l’apeline-13, l’angiotensine II, l’ocytocine et la spexine, démontrant ainsi l’étendue et les limitations de la méthode. Enfin, nous avons également conçu des sondes fluorescentes « turn-on » originales capables de révéler leur fluorescence uniquement après liaison au récepteur ciblé. Ces sondes pourront nous servir, par la suite, pour l’étude in vivo de la biodistribution des fluoropeptides
In order to improve the plasma stability of peptides, we have developed a new strategy based on the introduction of a fluorocarbon chain in the sequence of a native peptide. By applying this concept to apelin-17, a peptide showing a potential interest for the treatment of cardiovascular diseases, we have improved its plasma stability from 4.6 min to more than 24 h as well as its in vivo efficacy. The mechanism leading to the increase of plasma stability has been carefully investigated demonstrating the binding of the fluoroapeline to the albumin, leading to protection towards roteolysis. The concept has been applied to other peptides such as apelin-13, angiotensin II, oxytocin and spexine, showing the extension and the limitations of this method. Finally, we have designed original fluorescent fluorogenic probes which turn on their fluorescence only after binding to the targeted receptor. These probes could be used for in vivo biodistribution studies of fluoropeptides