Academic literature on the topic 'Spettrometria di Massa Imaging'

Gli epidermoidi intracranici hanno caratteristiche RM che sono utili ad una precoce identificazione e riconoscimento, favorendo le possibilità terapeutiche chirurgiche. In due anni abbiamo raccolto due casi di epidermoidi intradurali della fossa cranica posteriore, entrambi i pazienti sono stati studiati anche dopo iniezione di contrasto paramagnetico (Gd-DTPA, 0,2 ml/kg di peso corporeo). In entrambi si è dimostrata la presenza di una massa extra-assiale, neutra al contrasto, insinuantesi negli spazi subaracnoidei senza significativi segni di massa, l'esame tomografico RM è estremamente informativo non solo per evidenziare la lesione, ma anche per chiarire i rapporti con le altre importanti strutture anatomiche cerebrali.

La RM si rivela genericamente più accurata della TC per stabilire l'origine intra o extra-assiale di una formazione neoplastica encefalica; tale scopo può essere raggiunto sia valutando dei segni diretti (presenza di un piano di clivaggio e dislocazione della corteccia per quanto riguarda i tumori estrinseci) che valutando i segni indiretti (per es. compressione dei ventricoli o delle cisterne dell'angolo ponto-cerebellare, angoli che la massa forma con il tessuto adiacente, presenza o meno del segno meningeo). Al fine di poter effettuare tali valutazioni nella maniera più corretta è necessario adottare una tecnica d'esame rigorosa: acquisizione di scansioni secondo tutti i piani necessari per una corretta valutazione della massa neoplastica (assiali, coronali, sagittali e obliqui), uso di spessori di strato sottili (2 o 3 mm) ogni volta che lo si ritenga necessario (es. neurinomi del n. acustico) e infine adozione praticamente routinaria del mdc ev. La RM è estremamente vantaggiosa anche nel tentativo di caratterizzazione istologica del tumore, ma al momento attuale riteniamo che non presenti sufficiente specificità. L'intensità di segnale e il comportamento dopo somministrazione di mdc possono indirizzare nei confronti di un istotipo o di un altro, ma sicuramente non possono essere considerati come categoricamente diagnostici. È opinione degli autori, tuttavia, che il fine più importante da ottenere con la RM sia quello di stabilire l'origine intra o extra-assiale della neoplasia.

L'osteoporosi è una malattia caratterizzata da riduzione della massa ossea, deterioramento microarchitettonico del tessuto osseo e conseguente aumento della fragilità ossea e della predisposizione alle fratture. Questa definizione, stabilita nella consensus conference di Copenhagen (1990)1 e confermata in quella di Hong Kong (1993)2, sottolinea come la fragilità ossea che caratterizza l'osteoporosi sia la conseguenza non solo della riduzione della massa ossea, ma anche del danno architettonico che ne deriva. Viene inoltre precisato come l'osteoporosi divenga clinicamente rilevante solo quando il paziente presenti una frattura. L'osteoporosi, più che una malattia, deve essere considerata una condizione a rischio al pari della ipertensione arteriosa e dell'ipercolesterolemia3. Le osteoporosi possono essere primitive o secondarie e verranno qui analizzate in dettaglio.

Nello studio delle neoplasie cerebrali primitive, anche ai fini di una indicazione per quanto riguarda la benignità o malignità delle lesioni, un adeguato inquadramento può essere ottenuto sulla scorta di conoscenze generali che si riferiscono — oltre ovviamente ai dati anamnestici — alla classificazione, al comportamento biologico-grado di malignità, alla localizzazione, ai segni di effetto massa e alla valutazione di elementi più specifici che hanno diretta espressività sulle immagini di TC e di RM quali: gli aspetti istologici, biologici e clinici. Per quanto riguarda gli aspetti istologici bisogna far riferimento alle basi patologiche delle immagini; per gli aspetti biologici alle indicazioni fornite dalle neuroimmagini che si riferiscono al tipo di accrescimento della neoplasia, all'eventuale presenza di metastasi per via liquorale e, più raramente, per via ematogena ed alla comparsa di una recidiva o meglio di una progressione della malattia. Infine è opportuno tenere in debita considerazione l'espressività clinica che comprende, oltre agli aspetti istologici e biologici, anche l'effetto compressivo sulle strutture nervose vitali (effetto massa ed ernie) e sulle vie liquorali ( idrocefalo ostruttivo) che costituiscono un elemento prognostico sfavorevole anche in caso di tumori benigni. Riteniamo quindi che l'espressività-biologica, clinica ed istopatologica in neuroradiologia rappresenti la strada da seguire per un ulteriore miglioramento nella diagnostica dei tumori cerebrali. Nel contempo è necessario ricercare una più approfondita valutazione degli aspetti funzionali mediante RM e PET ai fini di un più completo inquadramento delle lesioni anche sotto questo aspetto.

Gli autori riportano il caso di un paziente giunto alla loro osservazione per una bolla di enfisema sottogaleale occipitale destra. L'esame TC del basicranio e della cerniera cranio-cervicale evidenziò un'estesa pneumatizzazione della rocca, mastoide ed occipitale di destra. Tale processo si estendeva anche al condilo ed alla massa laterale dell'atlante; fu inoltre evidenziata una bolla di enfisema all'interno del canale spinale lateralmente al dente dell'epistrofeo. Gli autori ritengono che alla base di tale abnorme pneumatizzazione sia un'eccessiva crescita dell'epitelio di rivestimento dell'antro timpanico all'interno delle strutture del basicranio, tale pneumatizzazione potrebbe in seguito diventare evolutiva mediante un meccanismo a valvola. Gli autori concludono sottolineando come la malformazione descritta possa essere alla base di un pneumocefalo iperteso con conseguente comparsa di sintomatologia neurologica acuta.

Le malformazioni vertebro-midollari possono essere classificate in diversi gruppi, le forme phù comuni sono comprese in due grandi categorie: 1- disrafismi spinali (spina bifida aperta, disrafismo spinale occulto), 2- altre anomalie spinocaudali. La conoscenza sia dell'embriologia normale che degli aspetti anatomici delle lesioni congenite porta alla comprensione del momento e della fase di sviluppo in cui la normale sequenza era stata interrotta e permette la classificazione delle malformazioni midollari. La risonanza magnetica fornisce la migliore descrizione delle relazioni anatomiche nelle lesioni congenite e quindi rappresenta il modo migliore per pianificare ii trattamento. Alcune anomalie congenite, sebbene presenti alla nascita, non giungono all'attenzione clinica fino all'età adulta. Altre lesioni sono tipicamente evidenti alla nascita o nei primi anni di vita. Il diffuso uso della RM riduce la diagnosi tardiva delle malformazioni occulte e fornisce le informazioni richieste per la pianificazione chirurgica. La proposta di questo lavoro è di utilizzare l'esperienza acquisita dalla revisione della casistica del Children's Hospital di Philadelphia per evidenziare il ruolo della RM nella scoperta e nella valutazione delle malformazioni midollari nei primi due anni di vita. I problemi diagnostici per la giovane eta dei pazienti (0–2 anni), particolarmente importanti nello studio del neonato sono dovuti a considerazioni anatomiche sulla colonna in sviluppo ed alla necessità di ottenere immagini in tempi brevi per avere un controllo del movimento senza anestesia. Sono stati valutati retrospettivamente 64 esami RM di 52 pazienti con evidente o sospetto disrafismo spinale. Sedici presentavano alla nascita una massa dorsale coperta o non coperta da cute. Trentasei erano disrafismi spinali sospetti senza massa dorsale associata (disrafismi spinali occulti) di cui nove presentavano una RM negativa. La RM è attualmente una procedura diagnostica sicura, sensibile e di facile esecuzione e pertanto va utilizzata non appena se ne renda evidente la necessità.

Descriviamo 3 casi di tumore epidermoide del IV ventricolo, rara localizzazione di una neoplasia congenita the rappresenta circa l'1% di tutti i tumori cerebrali. Dopo alcuni cenni clinici viene trattata la diagnostica strumentale con tomografia computerizzata e tomografia a risonanza magnetica, sottolineando il ruolo di quest'ultima nella diagnosi differenziale con altre patologie della fossa cranica posteriore e la sua superiorità nella diagnosi di natura. I tumori epidermoidi presentano alla RM: 1) un segnale di intensity ridotta rispetto al parenchima nervoso nelle sequenze pesate in T1 ed in densità protonica ed un segnale di intensità aumentata nelle sequenze pesate in T2; 2) un segnale di intensità aumentata rispetto al liquor del IV ventricolo in tutte le sequenze usate, con la possibilità di ben delimitare l'estensione intraventricolare del tumore; 3) una disomogeneità dell'intensità del segnale nell'interno della massa tumorale, elemento utile nella diagnosi differenziale con altre lesioni, soprattutto cisti aracnoidee.

BACKGROUND Cardiovascular diseases are the world’s number one death cause, accounting for 17.1 million deaths a year. There is still much unknown about cardiovascular diseases and their physiological underlying mechanism. Understanding the nature of complex biological processes occurring in both healthy and diseased heart tissue requires identifying the compounds involved and determining where they are located. Summary METHODS We have investigated a complementary mass spectrometry imaging (MSI) approach using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) and secondary ion mass spectrometry (SIMS) on the major areas of rat heart: the pericardium, the myocardium, the endocardium, and the great vessels to study the native distribution and identity of atomics, lipids, peptides and proteins in rat heart sections. 40 layers of horizontal tissue slices were acquired and reconstructed into a 3 D dataset. RESULTS Surface rastering of heart tissue sections generated multiple secondary ions in a mass range up to 1500 m/z. In the negative spectra we identified cholesterol related ions that show high intensity in both atrias, the aorta, the pulmonary artery and the outline both ventricles. The m/z 105 (choline) signal localizes in both atrias, aorta, pulmonary artery, in the atrioventricular valves and semilunar valves but is not present in ventricles surface. DAG species with probable identifications as Oleic, Linoleic [OL]+ at m/z 602 and [OO]+ (Oleic, Oleic) at m/z 604, can be detected. The images of 3D reconstruction show a highly complementary localization between Na+, K+, ion at m/z 145 and ion at m/z 667. Na+ is localized to tissue regions corresponding to atrias, while K+ is strongly localized to tissue regions corresponding to ventricles surface.The ion at m/z 667 localized very precisely within the aortic wall and the ion at m/z 145 is primarily located to the atria regions. CONCLUSIONS To promote further research with cardiovascular disease, we report the identification of characteristic molecules that map the spatial organization in a rat heart’s structure. A series of images obtained from successive sections of animal heart could, in principle, be used to produce a molecular atlas. Such tissue atlases (based optical images) are widely used for anatomical and physiological reference. The specific aim of this project is to optimize the data obtained from Heart SIMS a analysis and the 3-D reconstructive techniques developed to aid in investigating and visualizing differential molecular localizations in heart rat structures. The results reported here represent the first 3D molecular reconstruction of rat heart by SIMS imaging.
Introduzione Le malattie cardiovascolari rappresentano nel mondo la prima causa di morte, contando 17.1 milioni di morti ogni anno. Attualmente i meccanismi fisiopatologici alla base delle patologie sono in larga parte ancora sconosciuti. Capire la natura dei complessi processi biologici in atto sia nel miocardio cardiaco sano che malato richiede l’identificazione e la localizzazione degli stessi elementi molecolari coinvolti. METODO Utilizzando tecniche complementari di spettrometria di massa d’immagine (SMI) quali la spettrometria di massa a ioni secondari (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) e la spettrometria di massa a desorbimento /ionizzazione laser assistita da matrice (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) abbiamo analizzato le principali componenti del cuore del ratto: il pericardio, il miocardio, l’endocardio, le valvole e i grandi vasi al fine di studiare ed identificare l’originale distribuzione di atomi, lipidi, peptici e proteine nel tessuto cardiaco normale. Quaranta sezioni di tessuto cardiaco sono state acquisite e ricostruite ottenendo un database tridimensionale. RISULTATI L’analisi della superficie delle sezione di tessuto cardiaco ha generato molteplici ioni secondari con un intervallo di massa che raggiunge i 1500 m/z. Utilizzando la modalita’ negativa abbiamo identificato il colesterolo e gli ioni relativi ad esso che mostrato un alta intensita’ in entrambi gli atri, l’aorta, l’arteria polmonare e pericardio. La colina corrispondente a 105 m/z di massa molecolare risulta essere localizzata in entrambi gli atri, aorta, arteria polmonare, valvole atrioventricolari e valvole semilunari ma non risulta essere presente sulla superficie ventricolare. Sono state identificate molecole appartenenti al diacilglicerolo come acido Oleico, Linoleico [OL]+ corrispondenti alla massa molecolare di 602 m/z e [OO]+ (Oleico,Oleico) con massa molecolare di 604 m/z. Le immagini ottenute dalla ricostruzione tridimensionale mostrano una specifica localizzazione complementare tra il sodio, il potassio e gli ioni con massa molecolare di 145 m/z e 667 m/z. Il sodio e’maggiormente localizzato nelle regioni cardiache corrispondenti agli atri, mentre il potassio e’ maggiormente localizzato nelle regioni corrispondenti alla superficie ventricolari. Lo ione con massa molecolare di 667 m/z e’ localizzato con molta precisione all’interno della parete dell’aorta e lo ione con massa molecolare di 145 m/z e’ localizzato a livello delle regioni atriali. CONCLUSIONI Al fine di promuovere un’ulteriore ricerca in patologia cardiovascolare, riportiamo l’identificazione delle caratteristiche molecole che mappano l’organizzazione spaziale delle strutture cardiache del cuore del ratto. Una serie di immagini ottenute da sezioni successive del cuore potrebbero inizialmente essere utilizzate come un atlante molecolare e similmente, ad un atlante basato sulle immagini ottiche, essere ampiamente utilizzato come referente sia dal punto di vista fisiologico che anatomico. L’aiuto apportato da questo progetto e’ l’ottimizzazione dei dati ottenuti dall’analisi SIMS e lo sviluppo della tecnica per la ricostruzione tridimensionale al fine di investigare e visualizzare le differenti molecole localizzate nelle strutture del cuore di ratto. I risultati qui riportati rappresentano la prima ricostruzione tridimensionale ottenuta con immagini SIMS, del cuore di ratto.

The PhD thesis is focused on the evaluation of different Mass Spectrometry approaches for the study of the proteome of biological fluids and tissues. In detail, the ClinProt technology has been applied to amniotic fluids and urines respectively, to evaluate potential biomarkers for the preterm premature rupture of the membranes (pPROM) and to invetsigate molecular mechanisms of kidney adaptation to hypobaric hypoxia conditions at high and very high altitude. MALDI Imaging Mass Spectrometry (IMS) has been applied for the study of tissues. In detail, this part of the work evaluated the use of the detergents to enhance sensitivity and number of peaks detected for protein IMS analysis.

The aim of this thesis concerning the setting of new methods to study methabolic pathaways in vivo using both stable isotope tracer (113C-leucine and D2O) both stable isotope at natural abundance. First chapter reports a new method to measure absolute and percentage of AA and DHA synthesis. Preterm infants were fed with a formula enriched in AA and DHA with a higher content of 13C than did the endogeusly sinthesized long chain fatty acids (LCP). The second chapter reports a new menthod to measure SP-B synthesis in vivo in humans by means of stable isotopes. We administered a 24 h infusion of 13C-Leucine as metabolic precursor of SP-B and 2H2O as precursor of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DSPC).
Obiettivo di questa tesi è stato l’applicazione sia di isotopi stabili ad abbondanze naturali sia di traccianti marcati con isotopi stabili (113C-leucina e D2O) per lo studio di diverse vie metaboliche, quali la sintesi, di acidi grassi, nel bambino pretermine e la sintesi proteica e lipidica nell’adulto. Il primo studio ha visto l’utilizzo di una dieta arricchita con due acidi grassi che presentavano un’abbondanza naturalmente diversa di 13C rispetto a quella degli altri acidi grassi per determinare, per un lungo periodo di tempo, la sintesi assoluta e in percentuale di questi due acidi grassi nei bambini pretermine. Nel secondo studio abbiamo utilizzato leucina marcata con 13C e acqua marcata con deuterio per determinare il metabolismo della fosfatidilcolina disatura (DSPC) e della proteina specifica B del surfattante (SP-B).

Mycotoxins are heterogeneous chemical compounds characterized by a low molecular weight and synthesized by the secondary metabolism of different molds. Fumonisins are water-soluble mycotoxins produced by Fusarium species spoiling corn and derived produc ts. These mycotoxins can be a health hazard when consuming contaminated cereals, but they can reach humans also indirectly through the consumption of food products derived from animals fed with contaminated feed. Fumonisins have been associated with several animal and human diseases: they are suspected risk factors for esophageal and liver cancers, neural tube defects and cardiovascular problems. Improved methods are needed to accurately assess fumonisins concentrations in food of vegetable and animal origin, in order to prevent acute and chronic human exposure. The aim of the present work was to evaluate the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis from foods and matrices of animal origin. Different methods for the identification and quantification of fumonisins and related products have been developed and validated to determine fumonisin B1 in milk, fumonisin B1, fumonisin B2 and their complete hydrolyzed products (HFB1 and HFB2) in pig liver and fumonisins B1 and B2 in complete and complementary dry dog food. The experimental procedures have been carefully studied, considering matrices features, number and type of molecules to detect. Therefore, several extraction, clean up and separation techniques were tested in order to obtain the better conditions of sample processing. The fit for purpose sample preparation, matched with high mass spectrometry sensibility and specificity, have allowed to achieve good results in any tested animal matrices. Hence, the developed methods were validated and have shown a high accuracy, sensibility and precision, fulfilling performance requirements of Decision 2002/657/EC and of European Project Standard, Measuring and Testing (SMT). In any developed method, the analytes were identified and quantified even at very low concentrations : the limits of quantification resulted lower than other similar works, performed with different detectors. These methods were applied to some commercial samples and to some samples collected for research projects in the Department of Veterinary Public Health and Animal Pathology (DVPHAP) of University of Bologna. Although the disclosed data must be considered completely preliminary and without statistical significance, they emphasize the presence of mycotoxins in animal products. The outcomes obtained from the processed samples (bovine milk, pig liver and dry dog food) suggest the efficacy of these methods also on other food matrices, confirming the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis. Moreover the results underline the need to set up a large scale monitoring in order to evaluate the presence of fumonisins in food of animal origin for human consumption.

Mycotoxins are heterogeneous chemical compounds characterized by a low molecular weight and synthesized by the secondary metabolism of different molds. Fumonisins are water-soluble mycotoxins produced by Fusarium species spoiling corn and derived produc ts. These mycotoxins can be a health hazard when consuming contaminated cereals, but they can reach humans also indirectly through the consumption of food products derived from animals fed with contaminated feed. Fumonisins have been associated with several animal and human diseases: they are suspected risk factors for esophageal and liver cancers, neural tube defects and cardiovascular problems. Improved methods are needed to accurately assess fumonisins concentrations in food of vegetable and animal origin, in order to prevent acute and chronic human exposure. The aim of the present work was to evaluate the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis from foods and matrices of animal origin. Different methods for the identification and quantification of fumonisins and related products have been developed and validated to determine fumonisin B1 in milk, fumonisin B1, fumonisin B2 and their complete hydrolyzed products (HFB1 and HFB2) in pig liver and fumonisins B1 and B2 in complete and complementary dry dog food. The experimental procedures have been carefully studied, considering matrices features, number and type of molecules to detect. Therefore, several extraction, clean up and separation techniques were tested in order to obtain the better conditions of sample processing. The fit for purpose sample preparation, matched with high mass spectrometry sensibility and specificity, have allowed to achieve good results in any tested animal matrices. Hence, the developed methods were validated and have shown a high accuracy, sensibility and precision, fulfilling performance requirements of Decision 2002/657/EC and of European Project Standard, Measuring and Testing (SMT). In any developed method, the analytes were identified and quantified even at very low concentrations : the limits of quantification resulted lower than other similar works, performed with different detectors. These methods were applied to some commercial samples and to some samples collected for research projects in the Department of Veterinary Public Health and Animal Pathology (DVPHAP) of University of Bologna. Although the disclosed data must be considered completely preliminary and without statistical significance, they emphasize the presence of mycotoxins in animal products. The outcomes obtained from the processed samples (bovine milk, pig liver and dry dog food) suggest the efficacy of these methods also on other food matrices, confirming the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis. Moreover the results underline the need to set up a large scale monitoring in order to evaluate the presence of fumonisins in food of animal origin for human consumption.

L’interesse per lo sviluppo di nuovi metodi e per l’applicazione di tecniche ifenate è generato dalla necessità di caratterizzare campioni biologici complessi. Questo lavoro affronta l’applicazione e la messa a punto di tecniche ifenate allo scopo di: a) identificare un nuovo biomarcatore da associare al PSA (Prostate Specific Antigen) per la diagnostica del cancro prostatico, b) sviluppare una nuova tecnica ifenata per l’analisi di glicosfingolipidi. Negli studi di proteomica clinica, destinati all’identificazione di nuovi biomarcatori, i maggiori problemi sono legati all’incompatibilità dell’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione con l’intervallo di concentrazione delle specie proteiche e peptidiche presenti nei fluidi biologici. Pertanto, poiché l’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione non può essere variato, il passaggio cruciale è rappresentato dalla riduzione dell’intervallo di concentrazione tra le specie più abbondanti e le specie meno abbondanti nei fluidi biologici in esame. Nel caso del siero ciò è stato ottenuto grazie all’eliminazione della frazione contenente le proteine a maggior abbondanza mediante immunodeplezione selettiva. Le frazioni seriche a bassa abbondanza preparate da 30 pazienti affetti da cancro alla prostata (ADK) e da 30 soggetti controllo sono state analizzate tramite MALDI profiling. La metodica applicata ha permesso di individuare delle differenze statisticamente significative nell’espressione di alcune componenti proteiche, rivelate dalla presenza di picchi differenzialmente espressi negli spettri di massa ottenuti. Tuttavia, il punto fondamentale per il trasferimento dei risultati ottenuti in diagnostica clinica è rappresentato dall’identificazione delle specie proteiche contenute nel profilo di massa MALDI al fine di poter utilizzare tecniche immunometriche per la validazione dei dati e sviluppare metodi di dosaggio su larga scala applicabili in diagnostica clinica. Grazie all’ifenazione tra tecniche cromatografiche, quali la cromatogafia per gel filtrazione e la cromatografia a fase inversa, condotte rispettivamente su uno strumento HPLC e su uno strumento nano LC, e tecniche di spettrometria di massa MALDI, è stato possibile identificare il picco 2021 m/z, statisticamente variato, che corrisponde al peptide C3f, derivato dalla proteolisi del fattore del complemento C3, e la sua aumentata espressione in pazienti ADK+ a bassi valori di PSA, è stata confermata attraverso un esperimento di immunoblotting. I risultati sono stati validati su un secondo gruppo di pazienti e controlli. L’aumento di tale peptide indica una deregolazione del fattore del complemento C3 che viene inattivato a iC3b, il quale inibisce il ciclo della via alternativa del sistema del complemento impedendo l’associazione del fattore C3b al fattore B. Il peptide C3f potrebbe pertanto essere usato in associazione con il valore serico di PSA per ridurre il numero di pazienti “falsi negativi”. Un altro aspetto importante della ricerca biomedica e indirettamente della diagnostica clinica è rappresentato da una classe di molecole di segnale che si sono rivelate importanti in numerose patologie quali malattie cardiovascolari e neurodegenerative, tumori, malattie d’accumulo lisosomiale e sindrome metabolica. Nonostante il crescente interesse clinico, l’analisi dei glicosfingolipidi non gode di tecnologie ad alta automazione che permettano una facile identificazione e quantizzazione di specie con pesi molecolari spesso molto simili. Attualmente tale caratterizzazione avviene tramite l’utilizzo di precursori radioattivi, oppure di coloranti che non permettono una quantizzazione precisa, o di metodi III LC-MS di grande precisione ma dispendiosi in termini di tempo e di coinvolgimento dell’operatore. Attraverso l’ifenazione diretta HPTLC-MALDI, è stato possibile effettuare una fine analisi qualitativa e quantitativa del profilo glicosfingolipidomico estratto da mioblasti murini, distinguendo per ogni glicosfingolipide tutte le varianti a diversa catena di acido grasso presenti. Un aspetto importante è che lo sviluppo metodologico è stato accoppiato ad una analisi di campioni biologici i cui risultati sono stati confrontati con quelli precedentemente ottenuti attraverso l’utilizzo di precursori radioattivi e successiva analisi densitometrica su glicosfingolipidi estratti da mioblasti wild-type e overesprimenti la sialidasi NEU3. Pertanto, l’ifenazione proposta si è rivelata di grande applicabilità alla caratterizzazione dei glicosfingolipidi in quanto riduce i passaggi analitici necessari evitando l’uso di precursori radioattivi e di procedure di estrazione della banda dal gel di silice, e potrà essere applicata allo studio di diverse condizioni fisiologiche e patologiche per identificare potenziali biomarcatori.
The interest for the development of new methods and the application of hyphenated techniques for complex biological samples characterization is growing, nowadays, more and more. This work faces the application and setup of hyphenated techniques with two aims: a) to identify a new biomarker that can be associated to PSA (Prostate Specific Antigen) for prostate cancer (ADK) diagnosis, b) to develop a hyphenated technique for glycosphingolipids analysis. In clinical proteomics, the identification of new biomarkers is hampered by the discrepancy between the quantitative range of detection of instruments and the concentration range of proteins and peptides in biological fluids. Since the quantitative range of detection of instruments cannot be changed, the critical point is to reduce the dynamic range in examined biological fluids. In serum, this can be obtained by the elimination of high abundant proteins thanks to a selective immunodepletion. The serum low abundant protein fraction from 30 ADK patients and 30 controls was analyzed by MALDI profiling. The applied methodology was able to detect differentially abundant peaks in spectra of ADK vs no ADK controls. To transfer the obtained results in clinical diagnostic, the identification of species revealed by MALDI profiles is mandatory for two main reasons: data validation through the use of immunometric techniques and methodological development for a large scale test. Thanks to the hyphenation between chromatografic techniques, such as gel filtration on a HPLC and reverse phase on a nanoLC, and MALDI mass spectrometry, we were able to identify the highly changed 2021 m/z peak, that corresponds to C3f peptide and that derives from the proteolyses of Complement C3b. To confirm its increment in ADK patients with low PSA values an immunoblotting experiment was conducted. The results were validated on a second group of patients and controls. The increase of C3f expression could be related to a deregulation of C3 complement, cleft to iC3b, that inhibits the selffeeding cycle of the alternative pathway hampering the association of C3b to factor B. Therefore C3f peptide could be used in association to PSA serum value to decrease the number of “false negative”. An important aspect of the biomedical research and, indirectly, of clinical diagnostic is represented by a class of signal molecules that are important in a number of diseases, including neurological and cardiovascular disorders, cancer, lipid storage diseases, and the metabolic syndrome. Despite the increasing clinical interest, glycosphingolipids (GSLs) analysis cannot benefit by high-throughput techniques that allow an easy identification and quantitation of these species, characterized by similar molecular weights. Actually, their characterization is based on radioactive counts after metabolic radiolabeling, or on staining with proper dyes that doesn’t allow a precise quantitation. New approaches including LC-MS are largely used but they are time consuming and operator dependent. We develop the direct hyphenation HPTLC-MALDI, to obtain a precise qualitative and quantitative analysis of the glycosphingolipids profile from murine myoblasts, and to distinguish every fatty acid chain variant for each GSL. An important aspect is that the methodological setup was coupled to biological samples analysis and results were compared to those obtained through the use of radioactive precursors and densitometric analysis on GSLs extracted from wild type and NEU3 overexpressing murine myoblasts. The proposed hyphenation is of great applicability to the glycosphingolipids characterization because it reduces the V analytical steps, it avoids the use of radioactive precursors and silica scraping, and it could be applied to the study of different physiological and pathological conditions to identify potential biomarkers.

Abstract Background and purposes The obstructive pulmonary diseases in the world – among which asthma and the chronic obstructive pulmonary disease (COPD) – have been growing constantly. In 2006 about 46 million persons suffered from asthma, and 9.5 millions were children; the COPD has also been growing constantly and, despite the fact that the incidence increases with age, it looks like several factors and previous childhood diseases can influence the subjects’ respiratory function and the evolution of the disease. Despite the many studies that have been carried out, it is not clear yet what are the mechanisms on which these respiratory diseases are based, and therefore further investigations must be made. Mass spectrometry, a sensitive and robust analytic technique, has found more and more applications in the clinical-diagnostic field, thanks to its capacity to determine the metabolites in the biological samples with a mass value or to identify their structure through fragmentation with extremely sensitive, specific and selective characteristics. The possibility to analyze complex blends, thanks to combination with gas or liquid chromatographic techniques, reduced analysis time, the qualitative identification but above all the quantitative dosages of several biomarkers in a single analysis, has made this technique preferable for clinical studies. Especially, besides the classical target approach used to quantify already known or presumably proper to certain pathologies specific compounds, over the past years a new type of approach has developed, the so called untargeted approach, known as “metabolomic”, which sees the study of the entire metabolic profile of a biological sample, by means of highly sensitive and precise analytic techniques, such as high resolution mass spectrometry (HMS). This approach allows the characterization of the general metabolic profile of a group of subjects with a specific pathology as compared to a group of control and extracts the discriminating variables, thanks to multivariate statistic analysis techniques. The untargeted analysis, which is not based upon prior hypotheses, can open the doors to new etiopathological hypotheses, besides helping identify the diagnostic and prognostic biomarkers. The purpose of this PhD thesis was to study the infant obstructive respiratory diseases by applying both of these approaches to urine or exhaled breath condensate (EBC) samples. The EBC is a biofluid which, given the extremely non invasive method of collecting it, represents an ideal biological matrix for studies of the kind, but, since the metabolite concentration is extremely low, is at the same time an analytically complex matrix. Methods and results In the first study, the HRMS metabolomic analysis of the EBC was employed to investigate upon the biochemical-metabolic profile of the EBCs of teenagers diagnosed with bronchopulmonary dysplasia (BPD)from birth as compared to a group of healthy teenagers. The samples were analyzed with the LTQ-OrbiTrap mass spectrometer and processed by means of the multivariate statistic analysis. The results have demonstrated that it is possible to discriminate the BPD group from the control group by marking out the EBC samples, obtaining a robust OPLS-DA model (R2: 0.95, Q2:0. 82), indicating how the teenagers who were affected by BPD from birth have a different biochemical-metabolic profile. The individuation of the glycerophospholipids, among the several discriminating variables, has suggested a possible involvement of the alveolar surfactant at the basis of the minor respiratory function in the BPD affected patients, even years later after the severe phase of the disease. The second study employed the HRMS metabolomic in order to obtain a first biochemical-metabolic characterization of children with frequent bronchospasm or with wheezing in preschool age, in view of a perspective study which would help appreciate which of these children will develop asthma when growing up, and, a posteriori, consider whether prognostic biomarkers exist. The preliminary results of this part of the study have been encouraging: thanks to the analysis of the urine samples with the hybrid Q-TOF mass spectrometer associated to the UPLC, we have had a clear distinction of the subjects affected by wheezing as compared to healthy children, through an OPLSA- DA model. The preliminary analysis has allowed to obtain a clear distinction between children who suffered from wheezing and healthy children, highlighting some discriminating molecules. The study is still ongoing since it presupposes the evaluation of the same subjects 18 and 36 months later. The third part of the study was related to the use of the target MS and was meant to evaluate and quantify some oxidative stress indicators in EBC samples belonging to subjects affected by asthma. A UPLC-MS/MS method was developed and validated for the quantitative analysis of the dimethyl arginine, ADMA and SDMA, in samples of EBC. The analysis was conducted by means of MRM technique in quadrupole mass spectrometry associated to UPLC, with a on line sample enrichment system. The analytic system has come out robust (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery between 97 and 102%), rapid (5 minutes chromatographic run) and sensitive, also suitable for the analysis of diluted biological samples, such as the EBCs. The quantification of these metabolites, conducted on samples of asthmatic and healthy children, has pointed out a rise of the ADMA in the EBCs of the asthmatic subjects, indicating a role of the ADMA in the tissue damage of the respiratory tract which typically characterizes the bronchial asthma. Conclusions This research has demonstrated that instrumentally highly sensitive mass spectrometry, which has allowed us to obtain significant information even from small quantities of samples and from extremely diluted matrixes, can be successfully applied to the study of obstructive respiratory diseases, making the follow up studies easier, and also helping medical doctors identify possible markers useful to the diagnosis and/or new therapeutic targets.
Background e obiettivi Le pneumopatie ostruttive nel mondo, tra cui asma e bronco pneumopatia cronica ostruttiva (COPD), sono in continua crescita. Nel 2006 circa 46 milioni di persone erano affette da asma, di cui 9.5 milioni erano bambini; anche la COPD è in continuo aumento e, anche se l’incidenza cresce con l’età anagrafica, sembra che diversi fattori e malattie pregresse dell’infanzia, possano influenzare la funzionalità respiratoria dei soggetti e l’evolvere della patologia. Nonostante i molti studi condotti, i meccanismi alla base di queste malattie respiratorie non sono ancora del tutto chiariti, e necessitano pertanto di ulteriori indagini. La spettrometria di massa, tecnica analitica sensibile e robusta, trova sempre più applicazioni in ambito clinico-diagnostico, grazie alla capacità di determinare i metaboliti presenti nei campioni biologici dai valori di massa o identificarne la struttura tramite frammentazione con caratteristiche di estrema sensibilità, specificità e selettività. La possibilità di analisi di miscele complesse, grazie all’accoppiamento con tecniche cromatografiche gassose o liquide, i tempi di analisi ridotti, l’identificazione qualitativa ma soprattutto i dosaggi quantitativi anche di numerosi biomarcatori in una singola analisi, ha reso questa una tecnica di elezione per studi clinici. In particolare oltre al classico approccio target per quantificare specifici composti già noti o che si suppone siano caratteristici di una patologia, negli ultimi anni si è sviluppato un nuovo tipo di approccio untargeted, noto come “metabolomica”, che vede lo studio dell’intero profilo metabolico di un campione biologico, attraverso tecniche analitiche altamente sensibili e ad elevata capacità, quali la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HMS). Tramite questo approccio è possibile caratterizzare il profilo metabolico generale di un gruppo di soggetti con una determinata patologia rispetto ad un gruppo di controllo ed estrapolare le variabili discriminanti, grazie a tecniche statistiche di tipo multivariato. L’analisi untarget, non basata su ipotesi a priori, può aprire la strada a nuove ipotesi eziopatologiche oltre ad aiutare nell’identificazione di biomarkers diagnostici e prognostici. Obiettivo di questo dottorato era studiare le pneumopatie ostruttive in età pediatrica mediante l’applicazione di entrambi questi approcci, su campioni di urine o condensato di aria espirata (EBC). L’EBC è un biofluido che, data la sua raccolta assolutamente non invasiva, costituisce una matrice biologica ideale per studi di questo tipo, ma essendo la concentrazione dei metaboliti estremamente bassa, risulta al tempo stesso una matrice analiticamente complessa. Metodi e risultati Nel primo studio, l’analisi metabolomica HMS dell’EBC è stata impiegata per indagare il profilo biochimico-metabolico degli EBC di adolescenti con diagnosi di broncodisplasia alla nascita (BPD) rispetto a quello di un gruppo di adolescenti sani. I campioni sono stati analizzati con lo spettrometro di massa LTQ-OrbiTrap e processati tramite analisi statistica multivariata. I risultati ottenuti hanno mostrato che è possibile discriminare il gruppo BPD dal gruppo di controllo attraverso la caratterizzazione dei campioni di EBC, ottenuta con un modello OPLS-DA robusto (R2:0.95, Q2:0.82 ), mostrando un differente profilo biochimico-metabolico negli adolescenti con BPD alla nascita. L’individuazione di glicerofosfolipidi, tra le variabili discriminanti, ha suggerito un possibile coinvolgimento del surfattante alveolare alla base della minore funzionalità respiratoria dei soggetti con BPD, anche dopo anni dalla fase acuta della malattia. Il secondo studio ha previsto l’utilizzo della metabolomica HRMS per ottenere una prima caratterizzazione biochimica-metabolica dei bambini con broncospasmo ricorrente o wheezing in età prescolare, in vista di uno studio prospettico per valutare quali di questi bambini svilupperà asma con la crescita, e considerare a posteriori se esistano dei biomarkers prognostici. I risultati preliminari di questa parte dello studio sono stati promettenti: grazie all’analisi di campioni di urina con lo spettrometro di massa ibrido Q-TOF associato ad UPLC, si è ottenuta une netta differenziazione dei soggetti con wheezing rispetto ai bambini sani, mediante un modello OPLSA- DA. L’analisi preliminare ha permesso di ottenere una netta separazione tra bambini con wheezing e bambini sani, mettendo in evidenza alcune molecole discriminanti. Lo studio è ancora in corso in quanto prevede la valutazione degli stessi soggetti a 18 e 36 mesi. La terza parte dello studio relativa all’utilizzo della MS target prevedeva la valutazione e quantificazione di alcuni indicatori di stress ossidativo in campioni di EBC di soggetti asmatici. È stato sviluppata e validata una metodica UPLC-MS/MS per l’analisi quantitativa di dimetilarginine, ADMA e SDMA, in campioni di EBC. L’analisi è stata condotta tramite tecnica MRM in spettrometria di massa quadrupolare associata ad UPLC, con sistema di arricchimento on-line del campione. Il sistema analitico è risultato robusto (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery% tra 97 e 102%), rapido (corsa cromatografica di 5 minuti), e sensibile, adatto anche ad analisi di campioni biologici diluiti quali gli EBC. La quantificazione di tali metaboliti condotta su campioni di bambini asmatici e sani, ha mostrato un aumento di ADMA negli EBC dei soggetti asmatici, indicando un ruolo dell’ADMA nel danno tissutale delle vie aeree tipico dell’asma bronchiale. Conclusioni Questa ricerca ha dimostrato che la spettrometria di massa ad elevata sensibilità strumentale, grazie alla quale è stato possibile ottenere informazioni significative anche da piccole quantità di campione e da matrici estremamente diluite, può essere applicata con buoni risultati alla studio di pneumopatie ostruttive, rendendo più facili studi di follow up, oltre che aiutare il medico nell’individuare possibili marcatori utili alla la diagnosi e/o nuovi target terapeutici.

La tesi presentata riguarda lo sviluppo e la validazione di metodi analitici basati su cromatografia accoppiata a spettrometria di massa utilizzati per l'analisi di molecole target in matrici complesse. Gli analiti studiati hanno differenti applicazioni che vanno dalla chimica clinica alla nutraceutica. Visti gli standard richiesti per questi studi in termini di selettività, sensibilità ed accuratezza, il lavoro si è concentrato nella fase di sviluppo e validazione di metodi di analisi personalizzati, applicabili agli specifici sistemi investigati.
The present thesis deals with the development and validation of analytical methods based on chromatography coupled with mass spectrometry, which are aimed to the analysis of target molecules in complex matrices. The target compounds have different applications, ranging from the clinical chemistry to the nutraceutical field. Since the requested proper standards of selectivity, sensitivity and accuracy used to depend strongly on the selected application, several efforts have been dedicated to the phase of development and validation of highly customized analytical methods, suitable for the specific system under investigation.