Academic literature on the topic 'Sintesi peptidica in fase solida'

Crop cabbage worm (Crocidolomia pavonana) is one of the pests that has a bad effect on the cabbage production in Indonesia. One of the efforts that has been applied to control this pest is by using bayrusil. However, the bayrusil can cause negative effects such as poisoning and environmentally polluting effects. To prevent the undesired effects, it has been developed the use of environmentally friendly insecticide and one of them is the use of insecticidal peptide. Tripsin-modulating oostatic factor (TMOF) and ist analogues is one of the peptides that has an insecticidal activity. The aim of this research is to synthesise a linear tetrapeptide (DPAP) an analogues of TMOF and to test insecticidal activities against crop cabbage worm. A DPAP has been synthesised by Solid Phase Peptide Synthesis on 2-chlorotrytil chloride resin. Fmoc strategy was applied on the synthesis and a combination DIC/Oxime was employed in the coupling reaction.The tetrapeptidyl resin was cleaved by TFA:water:EDT (90:5:5). The peptide was purified by reverse-phase column chromatography and characterized by TOF ES-MS spectroscopy. A linear peptide was biologically tested towards the C. pavonana, showing percentage of mortality values at 1000 ppm.

Abstract. Antioxidants are compounds that can prevent or inhibit oxidation in a cell caused by free radicals. Based on previous study, one of the natural antioxidant peptides is a tetrapeptide (Phe-Leu- Ala-Pro), which was isolated from Sea Cucumber Collagen (Acaudina Molpadiodes) in Zheijing Province, China. In this study, a tetrapeptide (Phe-Leu-Ala-Pro) has been successfully synthesized using the solid phase peptide synthesis method (SPPS) with the strategy by using a protective group Fmoc, 2-chlorotrityl chloride resin as a buffer and coupling reagents including HBTU, HOBt and DIPEA. FLAP tetrapeptide compound has been formed which is characterized by mass spectrophotometer with an m/z value of 447.2608 for peak of [M+H]+ ion. The results of the RP- HPLC analysis showed that the FLAP tetrapeptide compound was not pure because there were still minor peaks, the target compound retention time was 2 minute. The FLAP tetrapeptide compound has antioxidant activity with an IC50 value of 9376.6 ppm based on DPPH test. Abstrak. Antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat mencegah atau menghambat oksidasi pada suatu sel yang disebabkan oleh radikal bebas. Salah satu peptida antioksidan alami yang ditemukan pada penelitian sebelumnya adalah tetrapeptida (Phe-Leu-Ala-Pro) yang diisolasi dari Kolagen Teripang (Acaudina Molpadiodes) di Provinsi Zheijing Cina yang memiliki aktivitas antioksidan. Pada penelitian ini tetrapeptida (Phe-Leu-Ala-Pro) telah berhasil disintesis menggunakan metode sintesis peptida fase padat (SPPS) dengan strategi pemakaian gugus pelindung Fmoc, penyangga yaitu resin 2-klorotritil klorida dan reagen pengkopling diantaranya yaitu HBTU, HOBt dan DIPEA. Senyawa tetrapeptida FLAP telah terbentuk yang ditandai dengan hasil karakterisasi menggunakan spektrofotometer massa dengan nilai m/z 447,2608 pada puncak ion [M+H]+. Pada hasil analisis RP-HPLC menunjukkan bahwa senyawa tetrapeptida FLAP belum murni karena masih adanya puncak-puncak minor, senyawa target berada pada waktu retensi menit ke-2. Senyawa tetrapeptida FLAP memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 9376,6 ppm pada uji DPPH.

Peptida antioksidan merupakan kelompok peptida yang berperan penting karena dapat menetralkan radikal bebas, sehingga dapat mencegah dan mengobati penyakit kronis. Salah satu senyawa peptida antioksidan alami yang telah ditemukan peneliti sebelumnya adalah senyawa tetrapeptida PAGY (Pro-Ala-Gly-Tyr) yang diisolasi dari gelatin kulit ikan amur sturgeon (Acipenser schrenckii) dan dilaporkan memiliki aktivitas antioksidannya dengan IC50 5.38 mg/mL dalam uji DPPH dan 0,008 mg/mL dalam uji ABTS berturut-turut. Kelompok kami telah berhasil mensintesis PAGY bersama dengan analognya yakni PSGY, PFFY, PAFY, dan PAIY dengan menggunakan metode sintesis peptida fase padat (SPPS). Pengujian aktivitas antioksidan pada senyawa hasil sintesis menunjukkan bahwa PSGY memiliki aktivitas antioksidan lebih baik dari PAGY. Pencarian analog tetrapeptida antioksidan yang lebih baik hingga saat ini masih terus dilakukan. Pada penelitian ini telah berhasil disintesis analog tetrapeptida lainnya PADY (Pro-Ala-Asp-Tyr) dengan metode sintesis peptida fase padat menggunakan strategi Fmoc/t-Bu pada resin 2-klorotritilklorida dilanjutkan dengan pengujian aktivitas antioksidannya. HATU/HOAT digunakan sebagai reagen pengkopling dalam sintesis PADY. Pemurnian krud PADY dilakukan menggunakan RP-HPLC preparatif sehingga diperoleh PADY murni seberat 14.7 mg (12.6%). Penentuan struktur peptida hasil sintesis dianalisis dengan menggunakan spektroskopi 1H-NMR dan TOF-MS. Pada pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH, PADY hasil sintesis memberikan nilai IC50 sebesar 1.850 mg/mL, yang mengindikasikan bahwa PADY menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih rendah daripada PAGY hasil sintesis peneliti sebelumnya. Kata kunci: Antioksidan, tetrapeptida, sintesis peptida fase padat. Antioxidant peptide is a class of peptides that play an important in neutralizing free radicals, therefore this compound can be used to prevent and treat chronic diseases. One of the natural antioxidant peptides reported by previous researcher is PAGY (Pro-Ala-Gly-Tyr), which is isolated from amur sturgeon fish (Acipenser schrenckii) gelatin that showed antioxidant activity with IC50 5.38 and 0.008 mg/mL using DPPH and ABTS assay, respectively. Our group has successfully synthesized PAGY, along with its analogues of PSGY, PFFY, PAFY, and PAIY using solid phase peptide synthesis method (SPPS). Antioxidant assay on synthesised compounds showed that PSGY has better antioxidant activity than PAGY. The search on the analogues of the antioxidant tetrapeptide was continued. From this study, a tetrapeptide analogue PADY (Pro-Ala-Asp-Tyr) has been successfully synthesised by solid phase peptide synthesis method with Fmoc/t-Bu strategy on 2-chlorotrityl chloride resin and tested for its antioxidant activity. HATU and HOAt reagents were used as the coupling reagent for the synthesis of PADY. The resulting PADY peptide solid was then purified using preparative RP-HPLC yielding PADY of 14.7 mg (12.6%). Characterisation of the synthesized compound was analysed by 1H-NMR and TOF-MS. On the antioxidant assay using DPPH method, PADY showed IC50 value of 1.850 mg/mLindicating a lower activity than the synthetic PAGY. Keywords: Antioxidant, tetrapeptide, solid phase peptide synthesis (SPPS).

Abstract: Malaria is a disease that currently affects mortality and health in various regions. Malaria is caused by parasites including Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae and Plasmodium ovale. This Plasmodium will then be transmitted to humans through the bite of an infected female Anopheles mosquito. In the human body, malaria attacks red blood cells and develops in the liver. In 1973 a case of Plasmodium falcifarum resistance was found to chloroquine, sulfadoxine-pyrimethamine. Therefore, new antimalarial drugs are needed that are more potent to overcome the problem of resistance. There is a pipecolisporin compound that can be used as an antimalarial drug which has the composition Ile – -Ala – Trp – Pip – Leu – Pro (IAWPLP) which was isolated from the fungus Nigrospora oyzae which then synthesized a cyclic peptide compound with the amino acid sequence Ile – -Ala. – Trp – Pip – Lys – Pro (IAWPKP). In this research, linear IAYPKP peptides will be synthesized by solid phase peptide synthesis (SPPS) method using Fmoc strategy, HATU/HOAt coupling reagent, 2-CTC resin, and TFA solution as cleavage reagent. The SPPS method is known to be faster because the purification is only carried out at the final stage. Meanwhile, the cyclic formation of this compound was carried out by the solution phase method using HATU/HOAt and DIPEA reagents in DCM solvent. This study succeeded in synthesizing peptides using this strategy. The obtained mass of crude 12.6 mg was confirmed using linear hexapeptide mass spectrometry with an [M] value of 926.4860 and a cyclic hexapeptide value with a value of [M+H] of 707.5417. Abstrak. Malaria merupakan penyakit yang saat ini mempengaruhi angka kematian dan kesehatan di berbagai daerah. Malaria ini disebabkan oleh parasit diantaranya plasmodium falcifarum, plasmodium vivax, plasmodium malariae dan plasmodium ovale. Plasmodium ini yang kemudian akan ditularkan kepada manusia melalui gigitan nyamuk anopheles betina yang terinfeksi. Dalam tubuh manusia, malaria akan menyerang sel darah merah dan berkembang didalam hati. Pada tahun 1973 ditemukan kasus resistensi Plasmodium falcifarum terhadap Klorokuin, Sulfadoksin-Pirimethamin. Maka diperlukan obat antimalaria baru yang lebih poten untuk menanggulangi masalah resistensi. Terdapat senyawa pipecolisporin yang dapat digunakan sebagai obat antimalaria yang memiliki susunan Ile – β-Ala – Trp – Pip – Leu – Pro (IAWPLP) yang diisolasi dari jamur Nigrospora oyzae yang kemudian dilakukan sintesis senyawa peptide siklik dengan urutan asam amino Ile – β-Ala – Trp – Pip – Lys – Pro (IAWPKP). Pada penelitian ini, peptida IAYPKP linier akan disintesis dengan metode sintesis peptida fase padat (SPPS) dengan menggunakan strategi Fmoc, reagen kopling HATU/HOAt, resin 2-CTC, serta larutan TFA sebagai reagen cleavage. Metode SPPS diketahui lebih cepat karena pemurnian hanya dilakukan di tahap akhir saja. Sementara itu pembentukan siklik senyawa ini dilakukan dengan metode fase larutan menggunakan reagen HATU/HOAt dan DIPEA dalam pelarut DCM. Penelitian ini berhasil mensintesis peptida dengan menggunakan strategi tersebut. Perolehan massa crude 12,6 mg yang terkonfirmasi menggunakan spektrometri massa heksapeptida linier dengan nilai [M] sebesar 926,4860 dan nilai heksapeptida siklik dengan nilai [M+H] sebesar 707,5417.

Abstract. Pipecolisporin compound with amino acid sequence Ile-βAla-Trp-Pip-Leu-Pro isolated from the fungus Nigrospora oryzae on the roots of Triticum Sp. has activity as antimalarial against Plasmodium falciparum of 3.21 µM. On this research, modifications were made by changing the N-Terminal of Pipecolisporin that Ile to Lys (Lys-βAla-Trp-Pip-Leu-Pro/Pipecolisporin analogue). Pipecolisporin analogue linear hexapeptide (Lys-βAla-Trp-Pip-Leu-Pro) succeeded synthesized by solid phase peptide synthesis (SPPS) using 2-chlorotrityl chloride resin, Fmoc and Boc protect, using coupling reagents HATU, HOAt, and DIPEA. The analogue was successfully cyclized using the solution phase method using the HATU, DIPEA reagent in DCM. This research has three stages, that is stages of synthesis, cyclization and characterization. At the synthesis stage, it produces a crude mass of 9.5 mg with characterization using a mass spectrometer, the fragment peak is obtained at m/z 925.7979. In the cyclization stage which is characterized by mass spectrometer the fragment peak was obtained at m/z 707.5267 [M+H]+. Abstrak. Senyawa Pipecolisporin dengan urutan asam amino Ile-βAla-Trp-Pip-Leu-Pro yang diisolasi dari jamur Nigrospora oryzae pada akar tumbuhan Triticum Sp. Telah diketahui memiliki aktivitas sebagai antimalaria terhadap Plasmodium Falciparum sebesar 3,21µM. Pada penelitian ini dilakukan modifikasi dengan penggantian N-Terminal pada Pipecolisporin yaitu Ile ke Lys menjadi Lys-βAla-Trp-Pip-Leu-Pro (Analog Pipecolisporin). Senyawa heksapeptida linear analog pipecolisporin dengan urutan asam amino Lys-βAla-Trp-Pip-Leu-Pro telah berhasil disintesis menggunakan metode sintesis peptida fase padat dengan penyangga fase padat berupa resin 2-klorotritil klorida dan gugus pelindung Fmoc serta Boc, dengan menggunakan reagen pengkopling HATU, HOAt, dan DIPEA. Senyawa tersebut juga telah berhasil disiklikan menggunakan metode fase larutan dengan menggunakan reagen HATU, DIPEA dalam pelarut DCM. Adapun tahapan yang dilakukan pada penelitian ini terdiri dari tiga tahapan yaitu tahapan sintesis, siklisasi serta karaterisasi. Pada tahapan sintesis menghasilkan krud sebesar 9,5 mg dengan karakterisasi menggunakan spektrometer massa menghasilkan puncak fragmen pada m/z 925,7979. Kemudian pada tahap siklisasi yang kemudian dikarakterisasi menggunakan spektrometer massa menghasilkan puncak fragmen pada m/z 707,5267 [M+H]+.

Abstract. Malaria is an infectious disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and then transmitted to humans through the Anopheles mosquito. One of the natural peptides found in previous studies is cyclic hexapeptide (Pro-Leu-Pipe-Trp- -Ala-Ile) from endophytic fungi isolated from the roots of Tritikum sp and produced pipecolisporin isolation which has been proven to have antimalarial activity. In this study the cyclic hexapeptide analogue pipecolisporin (Pro-Lys-Pipe-Trp- -Ala-Phe) has been successfully synthesized using a solid phase combination method (Solid Phase Peptide Synthesis) and a solution phase with a strategy of using Fmoc protective groups, solid phase buffers namely 2-chlorotrityl chloride resin and coupling reagents namely HATU, HOAt, and DIPEA. A linear hexapeptide compound has been formed which is indicated by the results of characterization using a mass spectrophotometer with an m/z value of 959.4612 at the ion peak and also a cyclic hexapeptide compound has been formed which is indicated by an m/z value of 741.4842 at the peak of the molecular ion [M+H]. Abstrak. Malaria merupakan penyakit menular yang disebabkan oleh protozoa dari genus Plasmodium dan kemudian ditularkan ke manusia melalui nyamuk anopheles. salah satu peptida alami yang ditemukan pada penelitian sebelumnya adalah heksapeptida siklik (Pro-Leu-Pipe-Trp- -Ala-Ile) dari jamur endofit yang diisolasi dari akar Tritikum sp dan menghasilkan isolasi pipecolisporin yang sudah terbukti memiliki aktivitas antimalaria. Pada penelitian ini heksapeptida siklik analog pipecolisporin (Pro-Lys-Pipe-Trp- -Ala-Phe) telah berhasil disintesis dengan menggunakan metode kombinasi fasa padat (Solid Phase Peptide Synthesis) dan fasa larutan dengan strategi penggunaan gugus pelindung Fmoc, penyangga fasa padat yaitu resin 2-klorotritil klorida serta reagen pengkopling yaitu HATU, HOAt, dan DIPEA. Senyawa heksapeptida linear telah terbentuk yang ditandai dengan hasil karakterisasi menggunakan spektrofotometer masasa dengan nilai m/z 959,4612 pada puncak ion dan juga Senyawa heksapeptida siklik telah terbentuk yang ditandai dengan nilai m/z 741,4842 pada puncak ion molekul [M+H].

Abstract. Malaria is a parasitic disease that is still a major health problem in the world, especially in tropical and sub-tropical countries. Malaria is a health disorder that occurs when red blood cells (erythrocytes) are infected with a protozoan parasite of the genus Plasmodium which is inoculated into the host through the bite of female Anopheles mosquito. Based of previously study, one of the natural antioxidant peptides is cylic hexapeptide (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro), which was isolated from fungus Nigrospora oryzaea which has antimalarial activity. In this study, a cylic hezapeptide analogue of pipecolisporin (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro) has been successfully synthesized using the combination methods of solid phase and liquid phase with strategy by using a protective group Fmoc, 2-chlorotrityl chloride resin as a buffer and coupling reagents including HATU, HOAt, and DIPEA. Cylic hezapeptide analogue of pipecolisporin (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro) compound has been formed which is characterized by mass spectrophotometer with an m/z value of 794,18. The result of the RP-HPLC analysis showed that the cylic hezapeptide analogue of pipecolisporin (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro) compund was not pure because there were still minor peaks. Abstrak. Malaria merupakan salah satu penyakit parasit yang masih menjadi persoalan kesehatan yang utama di dunia terutama di Negara tropis dan sub tropis. Malaria merupakan suatu gangguan kesehatan yang terjadi pada saat sel darah merah (eritrosit) terinfeksi parasit protozoa dari genus Plasmodium yang diinokulasikan ke inang melalui gigitan nyamuk Anopheles betina. Salah satu peptida antimalaria alami yang ditemukan pada penelitian sebelunnya adalah heksapeptida siklik (Pro-Leu-Pip-Trp- -ala-Iso) yang diisolisasi dari jamur NIigrospora oryzae yang memiliki aktivitas antimalaria. Pada penelitian ini heksapeptida siklik analog pipecolisporin (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro) telah berhasil disintesis menggunakan metode kombinasi fase padat dan fase larutan dengan strategi pemakaian gugus pelindung Fmoc, penyangga yaitu resin 2-klorotritil klorida dan reagen pengkopking diantaranya HATU, HOAt, dan DIPEA. Senyawa heksapeptida siklik analog pipecolisporin (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro) telah terbentuk dengan ditandai dengan hasil karakterisasi menggunakan spektrometer massa dengan nilai m/z 794,18. Pada hasil analisis RP-HPLC menunjukkan bahwa senyawa heksapeptida siklik analog pipecolisporin (Phe- -ala-Trp-Pip-Arg-Pro) belum murni karena masih adanya puncak-puncak minor.

PENDAHULUAN Stem cell sering disebut sebagai sel punca atau sel induk, bertanggung jawab atas regenerasi dan pemeliharaan jaringan serta memiliki karakteristik yang unik yaitu menghasilkan salinan dirinya dan keturunan sel yang berbeda ketika membelah.1 Stem cell yang berasal dari tumbuhan memiliki sifat membantu merangsang dan meregenerasi tanaman setelah cedera. Sifat unik plant stem cell telah menjadi bidang yang banyak diminati baru-baru ini, terutama dalam mengembangkan kosmetik baru dan mempelajari bagaimana ekstrak/phytohormone ini dapat mempengaruhi kulit. Usaha regeneratif yang dilakukan tumbuh-tumbuhan tidak hanya pada perbaikan jaringan akibat kerusakan, tetapi juga perkembangan tumbuhan yang baru.2,3Penuaan kulit merupakan suatu proses kompleks yang dipengaruhi faktor internal dan eksternal serta melibatkan seluruh lapisan epidermis dan dermis.4,5 Tujuan dari kosmetik antipenuaan modern adalah untuk memperbaiki tampilan kulit dengan menstimulasi dan meregenerasi proses fisiologis alami demi perbaikan kondisi kulit dan perlindungan dari berbagai faktor yang menyebabkan penuaan, terlepas berapapun usia sesungguhnya. Kandungan yang menarik perhatian adalah plant stem cell, telah dinyatakan memberikan efek proteksi terhadap stem cell manusia dengan cara menstimulasi regenerasi kulit dan mencegah proses penuaannya.4 Penuaan KulitPenuaan adalah proses biologis yang tak terhindarkan, kompleks dan dinamis yang ditandai dengan kemunduran progresif dari berbagai sistem pada tubuh dan penurunan kapasitas cadangan fisiologis.5 Kulit manusia mengalami dua jenis penuaan yaitu penuaan intrinsik dan ekstrinsik. Penuaan intrinsik mencakup serangkaian perubahan fisiologis bertahap yang merupakan konsekuensi dari waktu ke waktu dan dipengaruhi genetik dan hormonal. Penuaan ekstrinsik merupakan perubahan struktural dan fungsional yang disebabkan oleh faktor eksogen, terutama paparan sinar matahari (disebut juga photoaging), alkohol, merokok, malnutrisi dan lingkungan yang merugikan, namun dalam kondisi tertentu masih dapat dihindari.5-7Proses penuaan kulit intrinsik ditandai dengan adanya proses penuaan seluler, penurunan kapasitas proliferasi, penurunan kemampuan perbaikan deoxyribonucleic acid (DNA), stres oksidatif dan mutasi gen.8 Fungsi sawar kulit terganggu akibat perubahan struktur filamen keratin dan penurunan filagrin.Dalam hormonal, hormon seks terutama estrogen mempengaruhi sintesis kolagen, asam hialuronat, elastin dan komponen lain dari matriks ekstraseluler. Bersama-sama, ketiga komponen ini memberikan tampilan kulit yang sehat dan muda.Perubahan biokimia yang terjadi pada kolagen, elastin dan komponen dasar kulit menyebabkan penuaan kulit.5,9 Umumnya terjadi pada area kulit yang terlindungi dari paparan sinar matahari dengan klinis yang relatif lebih ringan, ditandai dengan tampilan kulit kering, pucat dan kendur dengan kerutan halus dan atau berbagai bentuk neoplasma jinak.10Sumber terbesar penuaan ekstrinsik adalah akumulasi dan paparan sinar matahari pada area yang tidak terlindungi seperti wajah, leher, dada dan lengan ekstensor. Faktor lain yang berpengaruh adalah merokok, terbukti kadar matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) lebih tinggi pada perokok.5,6 Diet nutrisi seimbang memperlambat penuaan dengan menyediakan nutrisi, air dan oksigen yang diperlukan sel dalam pembelahan, mengirimkan informasi dan memperbaiki kerusakan.5 Photoaging atau penuaan kulit dini merupakan istilah yang digunakan untuk menggambarkan klinis dan histologi akibat paparan sinar matahari kronis.5-7,11 Peningkatan kerusakan dan penurunan produksi kolagen adalah landasan dari photoaging, ditandai dengan penampilan kulit yang kasar, kerutan, warna kulit menjadi pudar, telangiektasis, pigmentasi tidak merata, dan berbagai lesi jinak, premaligna dan neoplasma ganas.5,9-11 Stres oksidatif dan penuaanSalah satu teori penuaan melibatkan proses penuaan seluler atau apoptosis sekunder adalah stres oksidatif. Stres oksidatif merupakan kondisi ketidakseimbangan antara reactive oxygen species (ROS) dengan mekanisme antioksidan. Pertahanan antioksidan sistem enzimatik dan non-enzimatik pada kulit cenderung melemah seiring bertambahnya usia.5,10 Kerusakan oksidatif menyebabkan peningkatan pembentukan faktor-faktor yang berhubungan dengan stres, kemudian memicu proses penuaan intrinsik. Misalnya, hypoxia-inducible factor dan nuclear factor ĸB menginduksi ekspresi sitokin interleukin 1, interleukin 6, vascular endothelial growth factor (VEGF) dan tumor necrosis factor α (TNFα), yang telah terbukti merupakan regulator proinflamasi dan modulator penghancuran MMP. Selain itu, kerusakan oksidatif terhadap protein seluler bersamaan dengan penurunan aktivitas proteasom sejalan usia membentuk akumulasi kerusakan protein yang dapat mengganggu fungsi seluler normal.5Stres oksidatif juga mampu memodifikasi telomer yang awalnya bertahan terhadap degradasi, fusi atau rekombinasi abnormal.3,5 Pemendekan telomer adalah hasil dari ketidakmampuan DNA polimerase untuk mereplikasi pasangan basa akhir kromosom. Ketika mencapai ambang "sangat pendek", sel akan mengalami penuaan proliferatif atau apoptosis. Mekanisme umum penuaan intrinsik dan photoaging disebabkan oleh gangguan struktur siklus putaran normal pada akhir telomer. Pemaparan ini kemudian mengaktifkan pensinyalan p53 yang mengarah pada peristiwa penuaan proliferatif dan apoptosis.5Penuaan kulit merupakan proses kompleks yang melibatkan seluruh lapisan epidermis dan dermis, mencakup denaturasi protein dan penurunan fungsi regeneratif stem cell.3 Penurunan fungsi stem cell epidermis telah diamati berhubungan dengan telomer yang lebih pendek, yang mengurangi potensi proliferatif sebagai respon terhadap paparan UV.5 Plant Stem CellKarakteristik plant stem cellSalah satu teori Weismann mengenai penuaan menjelaskan bagaimana organisme multiselular menua melalui germ line yang imortal dengan akumulasi kerusakan lebih didistribusikan pada sel somatik. Tumbuhan tidak secara jelas memisahkan mana germ line dan sel somatik, sehingga menjadi pertanyaan apakah teori penuaan berlaku untuk tumbuh-tumbuhan. Plant stem cell memiliki tampilan seperti germ line, sementara jaringan tumbuhan yang mati pada saat musiman, seperti daun dan xilem, memiliki sifat seperti sel somatik. Bagaimana sebuah tumbuhan dapat mencapai usia yang ekstrem, plant stem cell mungkin memegang kunci dalam hal ini karena tumbuhan memiliki pasokan stem cell terus menerus.12Stem cell dipertahankan secara terus menerus melalui mekanisme pembaruan diri yang terjadi di dalam niches stem cell atau dediferensiasi struktur dewasa. Sel-sel ini memunculkan organ baru sehingga memungkinkan bertahan dalam kondisi ekstrem. Sebuah studi mengenai model embriogenesis somatik menunjukkan sistem yang menarik yaitu regenerasi tanaman dari protoplas mesofil sebagai jenis sel yang terpapar dan berkemungkinan dapat mengakumulasi kerusakan lalu berdediferensiasi menjadi sel pluripoten. Contoh model protoplas dari sel-sel mesofil yaitu Arabidopsis, dapat diinduksi dengan menambahkan phytohormones cytokinin dan auksin. Akar dan pucuknya dapat beregenerasi dari callus untuk menghasilkan tanaman dewasa dan memungkinkan untuk digunakan dalam perangkat molekuler genetik yang tersedia. 12Plant stem cell dikelompokkan menjadi niches yang disebut meristem, terdiri atas primer dan sekunder. Meristem primer adalah meristem apikal (pucuk pertumbuhan batang dan akar), meristem interkalari (sisipan) dan meristem germ. Meristem sekunder adalah bagian lateral yaitu kambium (smear) dan phellogen serta bagian traumatik (callus). Pada meristem apikal pucuk batang, proliferasi dan diferensiasi plant stem cell dikendalikan oleh banyak faktor, termasuk proses siklus putaran reversibel negatif antara produk ekspresi gen, yaitu protein WUSCHEL (WUS) dan CLAVATA3 (CLV3). Protein WUS disekresi oleh sel-sel pusat organisasi dan merupakan sinyal untuk proliferasi stem cell, sedangkan protein CLV3 disekresikan oleh stem cell dan terbatas pada area  WUS. Kelebihan stem cell menyebabkan CLV3 berlebihan dan merangsang pengurangan sekresi WUS sehingga sinyal proliferasi menurun. Namun, jika jumlah stem cell terlalu rendah (defisit CLV3), maka WUS akan meningkatkan jumlah stem cell.2,13Meristem traumatik (callus) muncul pada bagian tumbuhan yang terlukai, paling sering berdiferensiasi menjadi kambium. Fenomena penciptaan callus pertama kali dijelaskan oleh ahli botani Austria, Gottlieb Heberlandt pada tahun 1902. Dia menyatakan bahwa sel tumbuhan mampu meregenerasi seluruh tanaman dan percobaan pada tahun 1958, wortel berhasil dikloning dari sel wortel yang dibudidayakan secara in vitro. Proses pembuatan callus adalah satu tahap embriogenesis sel-sel somatik (pembentukan zigot tanpa pembuahan) atau disebut juga tumbuhan mengalami dediferensiasi menjadi stem cell yang mampu menghasilkan jaringan baru atau bahkan seluruh organ. Penelitian menunjukkan bahwa sitokin bertanggung jawab dalam memproduksi batang dari callus, sedangkan auksin bertanggung jawab memproduksi akar.2,13 Contoh lain adalah pada pucuk akar Arabidopsis sp., bagian pusatnya tidak aktif bermitosis namun dikelilingi oleh stem cell yang membentuk bagian distal, lateral serta bagian sel akar proksimal.12Kemampuan diferensiasi plant stem cell untuk dediferensiasi kembali menjadi status pluripotensial saat ini banyak dimanfaatkan untuk menghilangkan gejala penuaan kulit pada manusia dalam bentuk sediaan perawatan kulit atau prosedur kosmetik. Teknologi kultur plant stem cellTeknologi kultur sel tumbuhan memastikan pertumbuhan sel tumbuhan, jaringan atau organ dalam lingkungan dengan nutrisi yang bebas mikroba dan memungkinkan untuk sintesis zat aktif biologis. Kultur ini memungkinkan akses dengan material bebas polusi, mikroorganisme atau toksin, mampu di setiap musim, dengan kandungan zat aktif yang hampir sama di setiap bagian.4 Teknik kultur sel tumbuhan dengan metode perbanyakan plant stem cell bertujuan mendapatkan metabolit tumbuhan.3 Dasar biologis di dalam semua tumbuhan adalah reservoir stem cell yang pluripoten dan sel-sel dengan kemampuan berdediferensiasi (pluripoten). Dengan nutrisi yang tepat, callus dapat tumbuh dalam kultur dan dengan menggunakan stimulasi hormon yang tepat, mungkin dapat menstimulasi regenerasi tumbuhan dewasa (disebut sebagai teknik reproduksi mikro).4,13Langkah pertama adalah memilih bahan tumbuhan yang tepat (buah, daun atau akar). Selanjutnya jaringan tumbuhan disterilisasi dan direduksi menjadi fragmen mikroskopis (disebut "eksplan"). Eksplan ditempatkan pada cawan petri beserta nutrisi solid. Kultur dibuat dalam kondisi gelap (tidak berfotosintesis) dan disuplai oleh zat sumber karbon dan energi organik (seperti sakarosa), phytohormone (auksin dan sitokin), vitamin serta unsur mikro dan makro. Kemudian dipilih turunan sel dengan karakteristik biokimia dan metabolisme terbaik (produktif dalam waktu pembelahan terpendek), stabil dan seragam.Selanjutnya pembesaran volume biomassa yang disebut "scaling". Kultur suspense beradaptasi secara bertahap dimulai dari tabung (volume 200 mL) hingga dalam bioreaktor (volume 100 L). Proses fermentasi dipantau dengan pengukuran kadar gula, konduktivitas, tingkat pH, densitas optik, vitalitas sel dan isi metabolit sekunder seperti, asam ursolat.3,4,14Tahap akhir dari fermentasi adalah pengolahan biomassa yang diawali dengan pencampuran konten kultur dalam suspense, yang terdiri atas liposom, phenoxyethanol (pengawet) dan antioksidan (asam askorbat atau tokoferol). Selanjutnya, dilakukan homogenisasi tekanan tinggi, di mana dinding stem cell dihancurkan, komponen yang dimasukkan dilepaskan secara bersamaan komponen lipofilik ditutup di dalam liposom (lecithin), sedangkan komponen hidrofilik dilarutkan dalam fase air. Produk yang diperoleh adalah likuid berwarna kekuningan dan amber. Solusio ini berasal dari perusahaan Swiss Mibelle AG Biochemistry dan menamakan teknologi mereka PhytoCellTecTM (PCT).3,4,14,15   Plant stem cell versus ekstrak plant stem cellTerminologi merupakan hal yang sangat penting dalam hal penegasan cosmeceutical, yaitu pemahaman bahwa ketika istilah “plant stem cell” digunakan sebagai komposisi, sebenarnya mengacu pada ekstrak dari plant stem cell. Banyak perusahaan perawatan kulit mempromosikan produk mereka dengan mengklaim memanfaatkan teknologi stem cell.Ekstrak dari plant stem cell tidak dapat bertindak dengan cara yang sama seperti stem cell yang hidup.3 Menggabungkan ekstrak plant stem cell di dalam zat pembawa yang dapat membantu sel menembus hingga ke dalam kulit untuk memberikan manfaat kosmetik yang sebenarnya memerlukan teknologi yang tepat untuk mendapatkan potensi yang melekat dalam sediaan perawatan kulit.3,14Dengan pengaturan sedemikian rupa, kultur sel tumbuhan terdediferensiasi dapat mewarisi beberapa modifikasi epigenetik yaitu karakteristik biosintesis dan pertumbuhan jaringan yang sangat heterogen. Fakta ini memungkinkan untuk menghasilkan turunan sel tumbuhan dengan jumlah hampir tak terbatas dengan sifat phytochemical yang unik dan karakteristik tumbuh yang hampir sama dengan yang digunakan untuk inisiasi. Istilah “plant stem cell” dalam komposisi kosmetik sebenarnya mengacu pada kultur callus atau suspensi sel yang didapatkan dari ekstrak kultur sel tumbuhan yang berdediferensiasi ditambah solusio berteknologi tinggi yang mampu mempertahankan potensinya.14 1. 2. Ekstrak Plant Stem Cell sebagai Antipenuaan KulitEkstrak plant stem cell sebagai terapi regeneratif kulit Ekstrak terbaik dapat diperoleh dari plant stem cell yang biji atau buahnya mampu mempertahankan kesegaran dan reproduksibilitas dalam jangka waktu yang lama. Faktor penting yang harus dipertimbangkan selama pemilihan tanaman adalah habitatnya dalam kondisi lingkungan yang sulit atau kemampuannya untuk "menyembuhkan" tanaman lainnya.5 Pelopor dalam memproduksi plant stem cell untuk industri kosmetik adalah Mibelle AG Biochemistry company (Swiss), yang mengimplementasikan stem cell buah apel (PhytoCellTecTM Malus Domestica) dan dipublikasi pada tahun 2008. Pada studi klinis menggunakan krim PhytoCellTecTM Malus Domestica 2% selama 4 minggu, kerutan pada wajah berkurang.3 Sejak saat itu, Mibelle AG Biochemistry telah memperkenalkan ekstrak dari plant stem cell Vitis vinifera (PhytoCellTecTM Solar Vitis), Saponaria pumila (PhytoCellTecTM nunatak®) atau Argania spinosa (PhytoCellTecTM Argan) di pasar dalam bentuk suspensi yang memberikan efek antikerut serta meningkatkan aktivitas stem cell epidermis.21 Selain itu, terdapat bukti yang menunjukkan auksin tanaman memiliki efek regulasi terhadap panjang telomer.4Penting diketahui bahwa plant stem cell sangat sensitif terhadap faktor eksternal, seperti cahaya atau suhu. Dalam produk kosmetik, agar mereka dapat bertahan maka digunakan dalam bentuk ekstrak yang larut dalam lipid (diekstraksi dengan minyak) dan larut dalam air (diekstraksi dengan gliserol), ekstrak bubuk (dengan maltodekstrin), liposom, nanoemulsi atau suspensi.4,14 Aktivitas antioksidan dari ekstrak plant stem cellSeperti yang telah disebutkan di atas, radikal bebas dianggap sebagai senyawa aktif yang paling berperan dalam proses penuaan kulit. Ia merusak DNA dan membantu dehidrogenasi, hidroksilasi dan glikasi protein selain merusak lipid di stratum korneum. Akibatnya, kulit kehilangan elastisitas dan kapasitas dalam mengatur transepidermal water loss (TEWL) serta replikasi sel kurang efisien. Oleh karena itu, antioksidan adalah bahan baku penting dalam cosmeceutical.4 Ekstrak dari plant stem cell merupakan sumber senyawa antioksidan yang sangat baik, seperti polifenol, asam phenolic, flavonoid, triterpenes, karotenoid, stilbenes, steroidal saponin dan peptide.14Goutzourelas et al. mempelajari efek antioksidan senyawa phenolic dari ekstrak stem cell anggur (Vitis vinifera) pada sel endotel dan otot.Terapi ekstrak stem cell anggur konsentrasi rendah mampu meningkatkan status redoks sel. Trans-resveratrol, asam gallic, (+)-catechin, asam ferullic, asam caffeic, quercetin, asam coumaric dan kaempferol merupakan bahan utama aktivitas antioksidan dari ekstrak stem cell anggur. Sumber lain yang kaya senyawa phenylpropanoid, terutama isoverbascoside adalah ekstrak kultur sel daun Syringa Vulgaris.4,14 Tito juga melaporkan bahwa ekstrak stem cell tomat memiliki kandungan asam rutin, coumaric, protocatechuic dan chlorogenic yang lebih tinggi dari pada buah tomat dan memiliki kemampuan antioksidan lebih tinggi. Aktivitas antioksidan yang tinggi dari ekstrak stem cell raspberry juga telah dilaporkan oleh Barbulova dan rekannya. Selain senyawa polyphenolic, ditemukan juga banyak kandungan asam ferulic dan quercitin ramnoside.4Studi Bazylak dan Gryn membandingkan beberapa ekstrak plant stem cell dalam total konten polyphenolic dan scavenging radikal diphenyl picrylhydrazin (DPPH) pada ekstrak stem cell paper mulberry (Brussonetia kazinoki), anggur (Vitis vinifer), magnolsi (Magnolia sieboldii), teh hijau (Camelia sinensis), ginseng putih (Panax ginsgen) dan ginseng hidroponik. Hasilnya menunjukkan semua ekstrak memiliki aktivitas antioksidan serta yang paling tinggi dan efektif adalah teh hijau dan ginseng putih.3,17 KinetinSalah satu agen terpenting yang memberikan sifat antipenuaan pada ekstrak plant stem cell adalah kinetin (N6-furfuryladenine), suatu phytohormone cytokinin. Kinetin merupakan salah satu basa purin asam nukleat turunan adenin.18,19 Kinetin terbentuk secara alami dalam plant stem cell, misalnya, pohon pinus Australia (Casuarina equisetifolia) atau gingergrass (Cymbopogon martinii var. Motia). Konsentrasi kinetin yang sangat tinggi ditemukan dalam stem cell lemon (Citrus limon) dan raspberry (Rubus chamaemorus).4Kinetin dianggap sebagai antioksidan alami terkuat. Ia terlibat dalam induksi sintesis enzim regeneratif dan membentuk senyawa kompleks dengan ion tembaga (II) dan mengaktifkan superoksida dismutase. Kinetin juga melindungi DNA sel dengan menghambat pembentukan 8-oxo-dG, penanda kerusakan oksidatif yang terbentuk dari reaksi Fenton.18-21Faktor pertumbuhan alami ini adalah agen yang tepat untuk merangsang stem cell kulit. Menurut penelitian, ia memperbaiki fungsi sawar pada lapisan spinosum epidermis, merangsang keratinosit, menurunkan TEWL, yang memperbaiki pigmentasi dan mengurangi kerutan permukaan. Efek antipenuaan dari kinetin juga telah terbukti bermanfaat pada sel-sel endotel kulit yaitu dengan cara mengaktifkan proliferasi sel, menghambat penuaan sel dan menstimulasi zat-zat substansi proliferasi dan metaboliknya.4,20,21 SIMPULANTumbuhan memiliki umur panjang karena stem cell-nya mampu berdediferensiasi menjadi pluripoten dan dapat dimanfaatkan guna menghambat penuaan kulit manusia. Penggunaan plant stem cell memerlukan teknologi yang tepat agar mendapatkan potensi yang diharapkan dalam sediaan perawatan kulit. Ekstrak dari plant stem cell merupakan sumber senyawa antioksidan yang sangat baik seperti polifenol, asam phenolic, flavonoid, triterpenes, karotenoid, stilbenes, steroidal saponin dan peptida. Efek yang ditimbulkan adalah stimulasi fibroblas, perbaikan epidermis, perbaikan DNA sel serta melindungi kulit dari paparan sinar UV dan stres oksidatif sebagai antioksidan. Dibutuhkan penelitian lanjutan untuk menilai efektifitas dan keamanan ekstrak plant stem cell sebagai antipenuaan kulit. DAFTAR PUSTAKASlack JMW. What is a Stem Cell?. Dalam: The Science of Stem Cells. United States: John Wiley & Sons;2018.h.1-11.Fehér A. Somatic embryogenesis—stress-induced remodeling of plant cell fate. BBA-Gene Regulatory Mechanisms. 2015;1849(4):385-402.Trehan S, Michniak-Kohn B, Beri K. Plant stem cells in cosmetics: Current trends and future directions. FSOA. 2017;3(4):FS0026.Miastkowska M, Sikora E. Anti-Aging Properties Of Plant Stem Cell Extracts. MDPI Journal Cosmetics. 2018:5(55):1-8.Kerns ML, Chien AL, Kang Sewon. Skin Aging. Dalam: Kang S, Amagai M, Bruckner AL, Enk AH, Margolis DJ, McMichael AJ, dkk, penyunting. Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine. Edisi ke-9. New York: McGraw Hill. 2019.h.1779-91Baumann L, Saghari S. Photoaging. Dalam: Baumann L, Saghari S, Edmund W, penyunting. Cosmetic Dermatology. Edisi ke-2. New York: Mc Graw Hill; 2009.h.34-41.Jusuf NK. Broccoli flower extract (Brassica oleracea L. var.italica plenck) inhibits photoaging by increasing type I procollagen expression in human skin fibroblast. Int J PharmTech Res. 2016;9(3):114–8.Assaf H, Adly M, Hussein M. Aging and intrinsic aging; pathogenesis and manifestations. Dalam: Farage MA, Miller KW, Maibach HI, penyunting. Textbook of Aging Skin. Berlin: Springer; 2010:130-318.Poon F, Kang S, Chien AL. Mechanisms and treatments of photoaging. PPP. 2015;31(2):65-74.Rinnerthaler M, Bischof J, Streubel MK, Trost A, Richter K. Oxidative stress in aging human skin. Biomolecules. 2015;5(2):545-89.Singh J, Chopra D, Dwivedi A, Ray RS. Photoaging. Dalam: Photocarcinogenesis & Photoprotection. Singapore: Springer; 2018.h.65-75.Dijkwel PP, Lai AG, Hypothesis: Plant stem cell hold the key to extreme longevity. TMA. 2019;3:14-6.Moru´s M, Baran M, Rost-Roszkowska M, Skotnicka-Graca U. Plant stem cells as innovation in cosmetics. Acta Poloniae Pharmaceutica. 2014;71(5):701-7.Georgiev V, Slavov A, Vasileva I, Pavlov A. Plant cell culture as emerging technology for production of active cosmetic ingredients. EngLifeSci. 2018;18(11):779-98.Pavlović M, Radotić K. Cultured Plant Stem Cells as a Source of Plant Natural Products. Dalam: Animal and Plant Stem Cells. Cham: Springer;2017.h.211-216.Goutzourelas N, Stagos D, Spanidis Y, Liosi M, Apostolou A, Priftis A, et al. Polyphenolic composition of grape stem extracts affects antioxidant activity in endothelial and muscle cells. Mol. Med. Rep. 2015;12: 5846–56.Bazylak G, Gryn A. Antioxidant activity and total flavonoid content in variable phyto-stem cells extracts obtained by high-pressure homogenization method and assigned for use in biocosmetics. PlantaMed. 2015; 81(16):PW_211.An S, Cha HJ, Ko JM, Han H, Kim SY, Kim KS, et al. Kinetin improves barrier function of the skin by modulating keratinocyte differentiation markers. Ann Dermatol.2017;29:6–12.Voller J, Maková B, Kadlecová A, Gonzalez G, Strnad M. Plant hormone cytokinins for modulating human aging and age-related diseases. Dalam: Hormones in Ageing and Longevity. Cham: Springer; 2017.h.311-335.Kadlecova A, Makova B, Artal-Sanz M, Strnad M, Voller J. The plant hormone kinetin in disease therapy and healthy aging. Ageing research reviews. 2019;55:100958.Jabłońska-Trypuć A, Matejczyk M, Czerpak R. N6-benzyladenine and kinetin influence antioxidative stress parameters in human skin fibroblasts. Molecular and cellular biochemistry. 2016;413(1-2):97-107.

2011/2012
La concentrazione del glucosio emolinfatico è regolata nei Crostacei dal crustacean Hyperglycemic Hormone (cHH), un neuropeptide prodotto e rilasciato in circolo nel complesso organo X-ghiandola del seno, localizzato nei peduncoli oculari. Il cHH, oltre a essere coinvolto nella regolazione di diversi processi fisiologici, è implicato anche nelle risposte da stress di origine ambientale o dovute all’esposizione a xenobiotici, il cui risultato finale è un aumento della glicemia. In numerose specie di crostacei sono state identificate più forme circolanti del cHH, alcune delle quali derivano da geni diversi e si differenziano per la sequenza amminoacidica, altre invece risultano da processi di maturazione post-traduzionale dei peptidi come l’isomerizzazione della L-Phe3 con la conseguente formazione di D-Phe3. Le eventuali differenze nella funzione biologica di queste due isoforme chirali sono ancora poco chiare, ma gli scarsi studi sin qui condotti indicano che il D-cHH ha una maggiore e più prolungata attività iperglicemizzante. Inoltre, è stato proposto un suo coinvolgimento sia nell’inibizione della sintesi degli ecdisteroidi sia nella regolazione osmotica. Due sono stati gli indirizzi principali di ricerca sviluppati in questi anni di dottorato. Il primo è consistito nel gettare le basi per la realizzazione di un organismo bioindicatore capace di rilevare la presenza di sostanze tossiche cambiando la propria colorazione in modo facilmente visualizzabile, ed è stato completato con il clonaggio e l’identificazione del promotore del cHH di Astacus leptodactylus (Crustacea, Decapoda), la verifica in vitro della sua funzionalità e l’identificazione di possibili siti di legame per dei fattori di trascrizione. L’obiettivo finale è la modifica in via transiente di Palaemon elegans e Palaemonetes antennarius (Crustacea, Decapoda) mediante l’iniezione di emociti trasfettati con il plasmide veicolante il promotore del cHH ed un gene reporter che visualizza la risposta mediante colorazione dell’animale. Il secondo progetto ha riguardato la sintesi chimica di alcune forme chirali del cHH di A. leptodactylus che è l’unica strategia possibile per ottenere peptidi identici all’ormone nativo, essendo la sola capace di consentire l’introduzione di tutte le modificazioni post-traduzionali necessarie. I peptidi ottenuti sono stati quindi adoperati in saggi biologici in vivo per provare la loro funzionalità. Inoltre, è stato fatto uno studio per appurare il possibile ruolo del cHH nel controllo dell’aggressività in Procambarus clarkii (Crustacea, Decapoda). Per ottenere una quantità sufficiente delle forme chirali del cHH in modo da poterne studiare la funzione biologica, abbiamo scelto la strada della sintesi chimica in fase solida (SPPS). La SPPS è generalmente limitata alla sintesi di peptidi non più lunghi di 40 amminoacidi. Per ottenere sequenze più lunghe è necessario sintetizzare segmenti diversi e quindi ligarli assieme attraverso delle reazioni chimiche. In questo caso si è adoperata la native chemical ligation. Il primo passo ha riguardato la sintesi di sei segmenti (QVF-cHH4-38, QVdF-cHH4-38, pEVF-cHH4-38, pEVdF-cHH4-38, pEVdA-cHH4-38, cHH-39-72) che legati fra loro in maniera diversa avrebbero portato alla formazione di cinque peptidi ammidati al C-terminale, due con la L-Phe3 e la parte N-terminale libera oppure bloccata con il piroglutammato, due con la D-Phe3 e la parte N-terminale anch’essa libera oppure bloccata, e uno con la D-Phe3 sostituita dalla D-Ala3 e l’N-terminale bloccato dal piroglutammato. La sintesi dei diversi segmenti non ha dato particolari problemi, ma la purificazione del segmento cHH-39-72 è risultata particolarmente difficile, in quanto questo peptide è risultato essere molto poco solubile. Questo problema è stato risolto con l’aggiunta di gruppi –SO3 allo zolfo delle cisteine che ha reso solubile il segmento cHH-39-72. Sono stati quindi sintetizzati in quantità sufficienti, dell’ordine di un centinaio di microgrammi, le seguenti forme chirali del cHH: QVdF-cHH, QVF-cHH, pEVF-cHH, pEVdF-CHH e pEVdA-cHH. In quest’ultima isoforma la D-fenilalanina in posizione 3 è stata sostituita dalla D-alanina, per verificare se la fenilalanina avesse un ruolo fondamentale nella funzionalità del peptide. I peptidi di sintesi sono stati quindi utilizzati per eseguire dei saggi in vivo su A. leptodactylus, iniettando nei gamberi il cHH sintetico e verificando la risposta biologica indotta attraverso il dosaggio della glicemia. I prelievi per il dosaggio del glucosio sono stati fatti ai tempi 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h e 24 h. Il profilo temporale della risposta glicemica indotta dalle due forme chirali è diverso, con il L-cHH avente un picco di risposta tra le 2 h e le 4 h, mentre il picco massimo della risposta del D-cHH è più tardivo, situandosi tra le 4 h e le 8 h. Invece, la differenza nella risposta iperglicemica tra la forma bloccata all’N-terminale (Glp-D-cHH) e la forma non bloccata (D-cHH) non è stata significativa a dimostrazione che la presenza del piroglutammato non influenza la risposta biologica indotta dal cHH. L’attività biologica dell’isomero Glp-dA-cHH è stata verificata usando il medesimo protocollo. L’attività iperglicemizzante di questo peptide è risultata essere significativamente inferiore a quella indotta dal Glp-D-cHH. Il risultato ottenuto dimostra che la porzione N-terminale del cHH è fondamentale per la funzionalità del peptide. Lo studio del promotore del cHH è stato effettuato su una sequenza clonata di 176 nucleotidi a monte della regione 5’ del gene per il cHH di A. leptodactylus, che è stata inserita in un vettore senza promotore (pGL3-Basic) a monte del gene reporter per la luciferasi. Con questo vettore sono state trasfettate cellule HEK 293T e la funzionalità del promotore è stata dimostrata da un incremento di circa 1000 volte nell’espressione della luciferasi rispetto a pGL3-Basic. La ricerca di eventuali siti di legame per elementi di regolazione presenti nella sequenza clonata ha consentito di identificare numerosi possibili siti di legame, inclusi una TATA box a -23, una CCAAT box a -78, due GC box a -63 e -70, ed altri per specifici elementi di trascrizione, più precisamente una sequenza a -91 dove i siti di legame per il cAMP response element-binding (CREB), l’elemento di risposta all’ipossia (HRE), il recettore per l’estrogeno (ER-alpha) si sovrappongono, mentre a -160 è stato identificato un possibile sito di legame per il recettore dell’ecdisone (EcR). L’influenza del cHH sull’aggressività in P. clarkii è stata studiata iniettando negli animali il cHH nativo estratto dalle ghiandole del seno. In generale gli animali in cui era stato iniettato il cHH hanno mostrato un aumento nell’espressione della dominanza, gli alfa attraverso un aumento della durata dei combattimenti e i beta per la maggiore intensità dei combattimenti che ne aumentava la dominanza fino a raggiungere una temporanea inversione della gerarchia. Il potenziamento del comportamento aggressivo potrebbe essere dovuto o a una modulazione da parte del cHH dei neuroni che controllano l’espressione del comportamento agonistico, oppure essere dovuto a una maggiore mobilizzazione delle risorse energetiche necessarie per la lotta. Per la prima volta sono state ottenute diverse isoforme del cHH mediante la sintesi peptidica in fase solida accoppiata alla native chemical ligation. I dati ottenuti indicano che questa è la strategia appropriata per la sintesi dei peptidi della famiglia del cHH, essendo l’unica in grado di consentire l’introduzione di tutte le modifiche post-traduzionali per ottenere un peptide identico all’ormone nativo. L’ottimizzazione del presente protocollo consente di rendere disponibili adeguate quantità di peptidi per esperimenti su larga scala, in vivo e in vitro, che possono portare a una migliore conoscenza della funzione del cHH e della relazione tra funzione e struttura. Inoltre sono state gettate le basi per la realizzazione di un organismo bioindicatore per monitorare l’inquinamento delle acque. È stato clonato il promotore del cHH di A. leptodactylus e per la prima volta la funzionalità di un promotore di un peptide della famiglia del cHH è stata verificata in un saggio in vitro. L’identificazione di diversi possibili siti di legame per gli elementi di regolazione nel promotore del cHH suggerisce che l’espressione del cHH sia regolata da svariati fattori fisiologici e ambientali. I risultati ottenuti sono rilevanti per futuri studi indirizzati alla comprensione del ruolo che i fattori di trascrizione identificati possono avere nella regolazione del promotore del cHH. Infine, lo studio sulla relazione di dominanza in Procambarus clarkii ha dimostrato, per la prima volta, che un neuropeptide, nella fattispecie il cHH, è in grado di modulare il comportamento aggressivo, sino a invertire, sia pur temporaneamente, il rango.
XXIV Ciclo
1955

Solid phase synthesis of tripodal systems and study of their catalytic and molecular recognitions properties Tripodal molecular structures are increasingly applied in the fields of catalysis, recognition, sensing, and biomimetics. The problem is that the combinatorial approach, that gives access to large amounts of heterofunctionalized receptors, uses orthogonally protected scaffolds and requires a very laborious synthesis. In this research project, a versatile synthetic approach for the functionalization of tripodal scaffold molecules on solid support, was developed. The generality of this approach was illustrated by the functionalization of three structurally diverse A3-type scaffold molecules containing multiple amino-groups (1a, 1,3,5-tris(aminoethyl)-2,4,6-triethylbenzene; 1b, tris(2-aminoethyl)amine; 1c, triazacyclononane) with a variety of different functional groups. Advantages of this approach are its simplicity and the freedom to functionalise any desirable scaffold molecule, without the use of protecting groups or special functionalisation patterns (for instance AB3). Intrinsic problems related to the attachment of tripodal scaffolds to a resin (for example mono- versus polyadducts and intramolecular cyclizations) were studied and solutions were provided. Importantly, protecting groups on the scaffold molecule were never used, which significantly facilitates scaffold variation, for instance for combinatorial studies. The synthetic approach was used in order to obtain multivalent C3-symmetrical molecules as artificial models of enzymes catalytic site. The general goal was to understand whether the scaffold structure influenced the cooperativity between the functional groups. First, we have synthesized an artificial model of a serine protease (or esterase), by connecting to scaffold 1a different combinations of peptides, based on the amino acids of the active site of the proteolytic enzyme: Asp, His and Ser. Studies of these compounds in the hydrolysis of activated esters revealed catalytic activity for the scaffold 1a functionalized with the active sequence -CO-Asp-His-H. Subsequently, we have functionalized a Calix[4]arene scaffold with the same active sequence for which a significant 86-fold rate enhancement compared to that of the uncatalyzed background reaction has been observed. This study showed cooperativity between the functional groups only in the hydrolysis reactions performed with excess of catalyst, likely because the catalyst does not provide a well defined active site. Second, a tripodal scaffold functionalized with the -CO-Asp-Pro-Pro-H sequence, active in aldol asymmetric condensations, has been studied. Catalytic studies, performed with excess of catalyst, show that also for this catalyst the presence of the scaffold does not result in an increase in the enantioselectivity with respect to the monomeric unit. In these tripodal catalysts show a prevailing divergent structure that does not allow high cooperativity between the functional groups. Consequently we shifted our attention to tripodals structures for application in the field of molecular (bio)recognition. For this purpose, we have chosen to study multivalent HIV-1 fusion inhibitors based on small 310-helical foldamers. HIV-1 entry into target cells is a multistep process involving a series of proteins and cofactors. Glycoproteins gp41, decorating in the surface of HIV-1 play key roles in this process. The ectodomain (extraviral) of gp41 consists of three important regions: an N-terminal fusion sequence that inserts into the target cell membrane, and two helical regions containing two hydrophobic heptad repeat units (denoted as the N- and C-helical regions, respectively). The N-HR regions of three gp41 molecules form a trimeric ?-helical coiled-coil. Upon dissociation of gp120 from the complex, a six-helix bundle forms, in which the C-helical regions wrap around the inner coil in an antiparallel fashion. We have studied a series of strategies for the synthesis of small peptide inhibitors, based on small 310-helical foldamers. These molecules have been designed for the inhibition of HIV-1 replication by binding to the inner trimeric coiled coil, thus preventing the formation of the six-helix bundle, which is essential for the complete fusion of the virus to target cell membranes. The 310-helix conformation is induced with the introduction of 5 Aib-residues in the peptide inhibitor sequence. In that way the amino acids Trp, Trp, and Ile (the WWI epitope) of the peptide are placed in the same positions of the N-HR helix regions of gp41 molecules. Currently we are studying a synthetic strategy in order to covalently link this foldamer to a tripodal scaffold (with oligoPEG spacers).

Oligonucleotides (ON) are commonly used as research reagents to modulate gene expression in cell culture and in animal models. Various chemistries of ON have been synthesized, incorporating modifications to the phosphodiester backbone, sugar or nucleobases portions. Oligonucleotides 2’-O-Methyl-RNA-Phosphorothioates (2’-OMePS) can modulate gene expression through splicing arrest of pre-mRNA and inducing the skipping of specific exons. In these years, we have set up a fully equipped laboratory and we have developed efficient and reliable protocols for the synthesis and purification of 2’-OMePS full length oligonucleotides. All synthesis were performed on a GE ÄKTATM oligopilot plus 10 fully automated synthesizer in the 1 to 50 μmol scale range using a polystyrene-based solid support at different loading, and β-cyanoethyl phosphoroamidite synthons. All purification were performed on a ÄKTA basic UPC HPLC system by reverse phase chromatography. Furthermore, we have studied the synthesis of news 2’-O-bile acids (AB) conjugated nucleosides, because in future we will insert these building blocks in the automated synthesis process to obtain different 2’-Oconjugates oligonucleotides containing one or more units of AB for improvement of cellular uptake efficiency.