Academic literature on the topic 'Sequenziamento NGS'

L'analisi del DNA è una delle chiavi per la comprensione della vita e dei suoi funzionamenti. Le tecniche di sequenziamento di nuova generazione NGS permettono una analisi parallela di molte sequenze che hanno reso possibili i sequenziamenti di genomi interi e l'impiego di questi dati in una vasta gamma di studi. In questa tesi verranno descritte le principali tecniche di sequenziamento NGS. Per quanto riguarda il genoma umano si tratteranno alcune tematiche di studio di varianti affrontate dal gruppo 1000Genomes. Nella fase conclusiva si introdurranno definizioni di statistica utili nell'affrontare l'elaborazione dei dati. Inoltre vengono descritti alcuni strumenti che permettono di svolgere questo tipo di analisi.

Neurofibromatosis type 1 is one of the most frequent autosomal dominant diseases affecting 1 in 3000 individual worldwide. This disorder is caused by heterozygous inactivating mutations of NF1, a large gene that encodes neurofibromin, a negative regulator of the RAS pathway. The mutation rate at the NF1 locus is one of the highest reported in any human disorder; this observation is reflected in the finding that almost 50% of all NF1 patients exhibit a de novo NF1 mutation. More than 1900 different NF1 mutations have been reported and listed in the Leiden Open Variation Database (LOVD). Splicing defects appear to be the most common molecular defect in NF1: 50% of point mutations cause splicing alterations that can determine elimination of one or more exons (exon skipping) or inclusion of introns. Molecular diagnosis of NF1 is difficult because of the large size of the gene, the existence of highly identical pseudogenes, the lack of mutational hotspots and the complex mutational spectrum. At present, molecular diagnostics of NF1 utilize Sanger sequencing with either mRNA and/or genomic DNA as the starting material. The traditional methods can yield excellent results but are expensive, time-consuming and labor-intensive. With the rapid development of next generation sequencing (NGS) machines, molecular biology is in a new revolutionary phase. This new technology combines high performance with much less expensive operation costs. The purpose of the present study was to develop an NF1 mutation analysis method to use the NGS machine MiSeq Dx in diagnostic settings for Neurofibromatosis type 1. We used and compared two different approach of next generation sequencing for NF1 gene analysis, one based on mRNA (cDNA) analysis and the other one on genomic DNA analysis. 80 unrelated subjects with suspected NF1 phenotypes were analyzed for mutations in the NF1 gene. 24 patients were analyzed using the cDNA-based approach while 20 patients were analyzed with the other approach based on gDNA as starting material. In order to compare the properties of each method, 36 patients were subjected to NGS sequencing from both cDNA and gDNA. The overall mutation detection rate of the two reported methods was 61,1% (22/36) with 22 pathogenic mutations identified by the gDNA approach and 16 mutations identified by cDNA approach. Then all the negative cases (14/36, 38,9%) were analyzed also by Sanger sequencing using cDNA or gDNA and/or by MLPA technique to exclude multi-exon deletion/duplication. In only one case DNA Sanger sequencing detected a mutation previously unidentified by the two NGS methods. Analyzing results retrospectively, gDNA analysis shows a mutation detection rate of 95,7% (22/23), with a single false negative result. cDNA analysis, on the other hand, shows a mutation detection rate equal to 69,6% (16/23) with 7 false negative results. Although cDNA analysis allows direct observation of the effects of splicing mutations, the system shows some bioinformatic limitations that do not allow a complete detection of variants. The instrument alignment tool eliminates reads that do not pair for more than 25 nucleotides in a row with the NF1 transcript reference sequence. It means that it is impossible to identify splicing mutations that determine deletions of more than 25 bp in the transcript. This could explain the false negative results obtained by cDNA analysis: the method is not able to identify intron splicing mutations that are likely to determine deletion of many nucleotides. Differently, gDNA NGS sequencing shows a more efficient workflow that can be easily applied in the diagnostics field for the NF1 gene molecular analysis. The use of genomic DNA as starting material is much easier in clinical settings, allowing you to process more than 50 samples at the same time, without additional preparation step. This method shows high sensitivity and specificity and represent a good strategy for the detection of NF1 mutations using genomic DNA. Our study provides proof of principle of the feasibility and the potential of next generation sequencing techniques in the molecular diagnosis of Neurofibromatosis type 1. Adopting this assay in the diagnostic setting could significantly improve cost- and time-effectiveness and ensure a high overall mutation rate.
La Neurofibromatosi di tipo 1 è la forma più comune di neurofibromatosi con una frequenza nella popolazione di 1 su 3000 nati vivi. La malattia presenta una trasmissione di tipo autosomico dominante e ha un’origine familiare soltanto nel 50% dei casi. Il restante 50% è causato da una mutazione de novo: ne deriva che la NF1 è una delle patologie a più alta frequenza di mutazioni insorte in maniera sporadica. La malattia è causata da mutazioni “loss of function” del gene NF1 che codifica per la neurofibromina, proteina coinvolta nella regolazione negativa della via di segnale di Ras. Le mutazioni a carico del gene NF1 sono estremamente numerose e di diversa tipologia: ad oggi ne sono state riportate oltre 1900 nel database LOVD (Leiden Open Variation Database). I difetti di splicing rappresentano il difetto molecolare più comune nella NF1: circa il 50% delle mutazioni puntiformi del gene NF1 causa l’alterazione dei siti di splicing con conseguente esclusione di uno o più esoni (exon skipping) o la ritenzione degli introni. L’analisi molecolare del gene NF1 per la ricerca di mutazioni è piuttosto complicata per diverse ragioni che includono le grandi dimensioni del gene, la presenza di pseudogeni altamente omologhi al gene NF1, la mancanza di hot spots mutazionali e il complesso spettro mutazionale. Ad oggi la diagnosi molecolare di NF1 si basa sul sequenziamento Sanger del gene a partire da mRNA e/o da DNA genomico. L’approccio tradizionale permette di ottenere dati di sequenza molto accurati ma risulta piuttosto laborioso, costoso e richiede tempi estremamente lunghi. Lo sviluppo di piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha dato un nuovo impulso al mondo della biologia molecolare. La tecnologia NGS, che implementa un sistema dotato di maggiore processività per la lettura delle sequenze in parallelo, è in grado di produrre grandi quantità di dati riducendo i tempi e i costi impiegati. L’obiettivo di questo studio è stato verificare l’applicabilità di metodiche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per l’analisi del gene NF1 da introdurre nella pratica diagnostica di laboratorio. In particolare, sono stati adottati due diversi approcci di sequenziamento di nuova generazione basati sull’utilizzo di cDNA o di DNA genomico come materiale di partenza e sull’impiego della piattaforma MiSeq Dx (Illumina). Per lo studio sono stati analizzati 80 pazienti con diagnosi clinica, o sospetta diagnosi, di Neurofibromatosi di tipo 1. 24 pazienti sono stati analizzati a partire da cDNA mentre per 20 pazienti l’analisi è stata condotta da DNA genomico. Al fine di comparare le potenzialità delle due diverse metodiche nell’analisi del gene NF1, 36 pazienti sono stati sottoposti a sequenziamento NGS sia da cDNA che da gDNA. Le due metodiche hanno individuato complessivamente 22 mutazioni patogenetiche (22/36, 61,1%); nello specifico, l’analisi da gDNA ha rilevato tutte le 22 mutazioni, mentre l’analisi da cDNA ne ha individuate soltanto 16, dando un risultato negativo, o identificando una variante non corretta, in 6 casi. Per i soggetti risultati negativi all’analisi tramite sequenziamento NGS (14/36, 38,9%), l’indagine molecolare è proseguita con la ricerca di eventuali mutazioni patogenetiche tramite analisi Sanger da DNA o RNA o, alternativamente, tramite MLPA, così da escludere la presenza di delezioni/duplicazioni multiesoniche. In un solo caso il sequenziamento Sanger da DNA ha individuato una mutazione non identificata con le due metodiche. Analizzando i risultati in maniera retrospettiva, l’analisi da gDNA mostra una “detection rate” del 95,7% (22/23), con un solo risultato falso negativo. L’analisi da cDNA, invece, presenta una “detection rate” pari al 69,6% (16/23) con 7 risultati falsi negativi. Sebbene l’analisi da cDNA permetta di osservare direttamente gli effetti delle mutazioni di splicing, il sistema mostra alcune limitazioni bioinformatiche che non permettono una completa detection delle varianti. L’algoritmo di allineamento dello strumento elimina tutte le reads di sequenza che non si appaiano per più di 25 nucleotidi consecutivi alla sequenza di riferimento del trascritto del gene NF1; ne deriva che mutazioni di splicing che determinano nel trascritto delezioni superiori a 25 bp non vengono identificate. Questo aspetto potrebbe giustificare i risultati falsi negativi ottenuti dall’analisi da cDNA relativi all’identificazione di mutazioni introniche di splicing che con tutta probabilità determinano nel trascritto la perdita di numerosi nucleotidi. Al contrario, il sequenziamento NGS da gDNA mostra un workflow più lineare facilmente applicabile in campo diagnostico per l’analisi molecolare del gene NF1. L’utilizzo del DNA genomico come materiale di partenza rende la metodica più rapida, permettendo di processare parallelamente oltre 50 campioni, senza ulteriori step di preparazione. La sua applicazione si è rivelata estremamente sensibile e specifica, costituendo una buona strategia per la detection di mutazioni a partire da DNA genomico. In conclusione, le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione rappresentano una valida strategia per l’analisi dei pazienti affetti da Neurofibromatosi di tipo 1, permettendo di ridurre notevolmente i tempi e i costi previsti per l’analisi di un gene complesso come NF1.

2012/2013
Heterotrophic nanoflagellate (HNF) grazing is one of the major source of prokaryotic mortality in marine ecosystems, acting as a strong selection pressure on communities. Protozoans may thus affect prokaryotic abundance and alter the diversity and the taxonomic composition of the prey community, as individual prokaryotes can develop distinct grazing-resistant mechanisms. Moreover, the microbial loop is well known to regulate carbon fluxes in surface marine environments but few studies have quantified the impact of HNF predation on prokaryotes in the dark ocean. The present work was aimed to: (1) quantify the impact of HNF predation on the deep prokaryotes biomass; (2) investigate if and how prey diversity varies in response to different predation pressure; (3) define taxonomic community composition in studied areas and identify most affected prokaryotic phylotypes by HNF grazing (4) evaluate the effects of small HNF (<3 µm), which are known to dominate nano-sized compartment and represent the main bacterivores in aquatic ecosystems, being an important link between bacteria and larger protists; (5) evidence differences in community sensitivity to grazing between surface and mesopelagic ecosystems (6) identify the main environmental drivers shaping microbial community diversity. Predation experiments were performed with surface and mesopelagic water samples collected from the Southern Adriatic and Northern Ionian basins. An additional predation experiment was set up in the North-eastern Adriatic Sea. We coupled the traditional ‘dilution method’ with high-throughput molecular analysis (ARISA and Ion Torrent/454 sequencing) to provide a quantitatively and qualitatively evaluation of the grazing process occurring in marine microbial communities. The present work is structured by four manuscripts in preparation and one manuscript already submitted. 1. Heterotrophic nanoflagellate grazing on picoplankton in deep waters (manuscript in preparation) 2. Effects of heterotrophic flagellate predation on bacterial community diversity (manuscript in preparation) 3. HNF grazing impact on taxonomic composition of marine prokaryotic community (manuscript in preparation) 4. Environmental drivers structuring surface and deep bacterial communities in Adriatic and Ionian Seas (manuscript in preparation) 5. Biodiversity changes of bacterial community under predation pressure analyzed by 16S rRNA pyrosequencing (manuscript submitted) My PhD research led to important progresses in the comprehension of microbial dynamics regulating carbon cycles and bacterial diversity in the Adriatic and Ionian basins. Prokaryotic abundance and biomass were one order of magnitude higher in the photic than in the aphotic layers of Southern Adriatic and Ionian Seas (surface biomass 1.68 ± 1.76 µC L-1, deep biomass 9.00 ± 2.11 µC L-1). The Northern Adriatic community presented the highest biomass value (57.46 µC L-1), according to its richer trophic status. All in situ communities displayed the same evenness, being dominated by rare phylotypes. Rare taxa were confirmed to represent the major contributors of microbial communities, with only a few phylotypes dominant. Mesopelagic bacterial communities were as rich and variable as surface assemblages, despite the significant biomass decrease along the water column. Natural archaeal assemblages were characterized by very low richness as we recovered only two genera (Cenarchaeum and Nitrosopumilus), while in situ bacterial communities were composed by the six major marine phyla (Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes and Deinococcus-Thermus), whose contribution varied according to sampling depth. Flagellates were demonstrated to efficiently control their preys (ingestion rates: 7.86-22.26 µg C L-1 in surface experiments, 0.53-10.61 µg C L-1 in deep experiments), causing important losses in the potentially produced prokaryotic biomass. Despite picoplankton and HNF abundance reduction with depth contrasts with the hypothesis that at least 108 picoplanktonic cells L-1 are necessary to sustain HNF community, our data confirm that also in mesopelagic waters prey and predator concentrations are sufficient to sustain efficient microbial food webs. HNF grazing modified bacterial community diversity in both surface and deep marine systems but with different strength. Mesopelagic communities were more sensitive to grazing impact, evidencing a bell-shaped response to the increasing ingestion rates. Moderate-high top-down control preserved or enhanced bacterial diversity, that fell at low predation. In upper communities grazing did not induce wide variations of bacterial richness and evenness, revealing to be more stable. Small HNF (<3 µm) were the dominant size fraction within flagellate communities and likely constituted the main bacterivores. After the removal of large HNF, a higher fraction of prokaryotic phylotypes was affected. Larger protists partially reduced small flagellate impact on their preys. Larger HNF had a more important role in photic systems compared to mesopelagic waters. The fraction of bacterial taxa favored or affected by predation when small HNF were the only predators more markedly varied in surface experiments, while few phylotypes changes their behavior between the two size treatments in deep experiments. Some taxa were consumed mainly by larger HNF (3-10 µm), while others were grazed by smaller ones (<3 µm). Over 50% of the predated phylotypes belonged to the rare biosphere, mainly in the surface experiments. Rare bacteria are thus not only a dormant ‘seed bank’ but constitute a fundamental component of microbial food webs and actively vector the carbon transfer toward higher trophic levels, being as important as dominant organisms. Although general patterns applicable to all communities were not found, trends of selectivity over different phylotypes were highlighted within sampling layer along the water column and between different systems. While the majority of predator-prey interactions were characteristic to specific environments, some can be considered common to different systems (e.g. Burkholderiaceae and Pseudomonadaceae were exclusively selected in all mesopelagic sites, Bacterivoracaceae were subjected to small HNF predation independently from sampling site or depth). The Southern Adriatic and Ionian basins were significantly distinguished by both the physicochemical water characteristics and the prokaryotes and protists abundance distributions. Cluster analysis based on Jaccard and Bray-Curtis metrics evidenced that depth and geographical location of sampling sites influenced bacterial community similarity. The Southern Adriatic Sea was clearly distinguished from the Ionian Sea. The Northern Adriatic samples were always separated from the others, coherently with different biotic and abiotic characteristics of the sub-basin. Additionally, temperature, chl a and O2 concentration represented important environmental drivers shaping biodiversity of bacterial communities that inhabit Adriatic and Ionian basins. In conclusion, we evidenced that heterotrophic flagellates control bacterial biomass and select certain taxa among all possible preys, grazing also on the rare ones. HNF predation thus shapes bacterial community structures, which in turn influence the ecosystem functioning. Despite the cell abundance decrease of both predators and preys reduces encounter probabilities, the dark ocean hosts complex microbial food webs, structured around three trophic levels (i.e. prokaryotes, small and large heterotrophic flagellates).
I nanoflagellati eterotrofi (HNF) costituiscono una delle principali cause di mortalità dei procarioti in ambiente marino, esercitando una forte selezione sulle comunità predate. Possono modificarne l’abbondanza cellulare e alterarne la diversità e la composizione tassonomica, in quanto le diverse specie procariotiche possono sviluppare distintivi meccanismi di resistenza alla predazione. Mentre l’impatto degli HNF sui procarioti degli acque marine superficiali è ben noto, pochi studi si sono focalizzati sullo studio degli ambienti profondi. Il presenta lavoro di dottorato è stato finalizzato a: (1) quantificare l’impatto della predazione da parte degli HNF sulla biomassa procariotica profonda; (2) capire se e come la biodiversità della comunità predata vari in risposta alla diversa pressione di predazione; (3) definire la composizione tassonomica delle comunità presenti nell’area di studio e identificare i filotipi maggiormente colpiti dalla predazione da parte degli HNF; (4) valutare il contributo dei piccolo flagellati (<3 µm), i quali costituiscono la più abbondante frazione nanoplanctonica e rappresentano i principali organismi batterivori negli ambienti acquatici; (5) evidenziare possibili differenze nella risposta alla predazione tra comunità procariotiche che vivono in acque superficiali e profonde; (6) identificare i principali fattori ambientali che modulano la diversità delle comunità microbiche. Esperimenti di predazione sono stati condotti su campioni di acqua superficiale e mesopelagica raccolti nel Mar Adriatico meridionale e nel Mar Ionio settentrionale. Un ulteriore esperimento è stato condotto nel Mar Adriatico nord-orientale. Il tradizionale metodo delle diluizioni è stato abbinato ad analisi molecolari quali elettroforesi capillare (ARISA) e sequenziamento (Ion Torrent e 454) per consentire una valutazione quali-quantitativa degli effetti della predazione sulle comunità microbiche marine. La presente tesi è costituita da quattro articoli in preparazione e un articolo già sottomesso: 1. Heterotrophic nanoflagellate grazing on picoplankton in deep waters (articolo in preparazione) 2. Effects of heterotrophic flagellate predation on bacterial community diversity (articolo in preparazione) 3. HNF grazing impact on taxonomic composition of marine prokaryotic community (articolo in preparazione) 4. Environmental drivers structuring surface and deep bacterial communities in Adriatic and Ionian Seas (articolo in preparazione) 5. Biodiversity changes of bacterial community under predation pressure analyzed by 16S rRNA pyrosequencing (articolo sottomesso) La ricerca condotta durante il mio dottorato ha portato a interessanti progressi nella comprensione delle dinamiche microbiche che regolano i cicli del carbonio e la diversità batterica nei bacini adriatico e ionico. L’abbondanza e la biomassa delle comunità procariotiche superficiali è risultata un ordine di grandezza superiore rispetto alle comunità profonde in Mar Adriatico meridionale e Mar Ionio (biomassa superficiale 9.00 ± 2.11 µC L-1, biomassa profonda 1.68 ± 1.76 µC L-1). La comunità descritta nel Mar Adriatico settentrionale è caratterizzata dai valori più elevati di biomassa (57.46 µC L-1), coerentemente con l’eutrofia del bacino. I flagellati eterotrofi hanno causando perdite significative nella biomassa procariotica in tutti gli esperimenti condotti, con tassi di ingestione pari a 7.86-22.26 µgC L-1 negli esperimenti superficiali e 0.53-10.61 µgC L-1 negli esperimenti profondi. Un’abbondanza picoplanctonica di 108 cellule L-1 è stata ipotizzata come necessaria per sostenere la comunità degli flagellati. Nonostante l’aumento della profondità comporti una riduzione dell’abbondanza del picoplancton tale da non raggiungere questa soglia, i nostri dati confermano che anche negli ambienti profondi si instaurano interazione preda-predatore sufficienti a sostenere le reti trofiche microbiche. Tutte le comunità in situ hanno mostrato la medesima distribuzione, con prevalenza di filotipi rari e pochi gruppi dominanti. Le comunità mesopelagiche presentano diversità e variabilità analoghe a quelle superficiali, nonostante il decremento in biomassa lungo la colonna d’acqua. Una bassa diversità è stata osservata nelle comunità naturali di Archea, dove sono stati rilevati due soli generi (Cenarchaeum e Nitrosopumilus), mentre le comunità batteriche sono composte dai sei principali phyla marini (Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes e Deinococcus-Thermus), la cui frequenza varia in base alla profondità di campionamento. La predazione esercitata dagli HNF ha modificato la diversità delle comunità sia superficiali che profonde ma con diversi effetti. Le comunità profonde si sono dimostrate più suscettibili alla diversa intensità della predazione. Un controllo top-down medio-alto ha preservato o incrementato la diversità batterica, che invece è risultata fortemente ridotta con bassa pressione di predazione. Al contrario, le comunità superficiali hanno subito solo leggere variazioni nella biodiversità batterica in risposta ai diversi tassi di ingestione, dimostrandosi più stabili. I piccoli flagellati (<3 µm) costituiscono la frazione dominante delle comunità nanoplanctoniche. In seguito alla rimozione dei predatori >3 µm, variazione significative dell’abbondanza sono state riscontrate in una maggiore percentuale di filotipi procariotici. Flagellati di maggiori dimensioni possono quindi mitigare l’impatto dei piccoli predatori sulle prede, con una maggior influenza nei sistemi fotici. Alcuni taxa batterici sono stati consumati prevalentemente dal grandi HNF (3-10 µm), mentre altri sono stati selezionati dai piccoli flagellati (<3 µm). Oltre il 50% dei filotipi predati apparteneva alla biosfera rara, soprattutto negli esperimenti condotti in superficie. I batteri rari (0.1-1% dell’abbondanza totale) non rappresentano quindi una frazione ‘dormiente’ il cui contributo varia in seguito a cambiamenti delle condizioni ambientali, come inizialmente ipotizzato. Costituiscono invece una componente fondamentale delle reti trofiche microbiche e contribuiscono attivamente al trasferimento di carbonio verso i livelli trofici superiori, così come gli organismi dominanti. Nonostante ciascuna comunità risponda in maniera distintiva alla predazione, in funzione della composizione tassonomica delle comunità stesse e dello stato trofico del sistema, alcuni indizi di selettività sono stati individuati. Alcune interazioni preda-predatore si sono rivelate tipiche delle comunità profonde o superficiali, mentre altre erano comuni ad entrambi i sistemi (es. Burkholderiaceae e Pseudomonadaceae sono stati selezionati sono in ambiente pelagico, Bacterivoracaceae sono stati sottoposti a predazione da parte di piccolo flagellati in tutti gli esperimenti, indipendentemente dalla profondità e dal sito di campionamento). I bacini Adriatico meridionale e Ionio settentrionale sono significativamente distinti sia per le caratteristiche chimico-fisiche della colonna d’acqua, sia per l’abbondanza di pico- e nanoplancton. La cluster analisi basata sugli indici di Jaccard e Bray-Curtis ha evidenziato che profondità di campionamento e localizzazione geografica sono i principali fattori che determinano la similarità tra le comunità batteriche. Il Mar Adriatico settentrionale è risultato sempre separato dagli altri campioni, coerentemente con le diverse caratteristiche biotiche e abiotiche del bacino. Oltre a profondità e sito geografico, temperatura, concentrazione di chl a e ossigeno contribuiscono a determinare la biodiversità batterica adriatica e ionica. In conclusione, il presente lavoro ha evidenziato come i flagellati eterotrofi controllino la biomassa procariotica e mostrino preferenza per determinati taxa, selezionando anche quelli rari. La predazione influenza la struttura delle comunità e di conseguenza il funzionamento degli ecosistemi. Anche gli ambienti marini profondi ospitano complesse reti trofiche, strutturate attorno a tre livelli principali (procarioti, piccoli e grandi flagellati eterotrofi) così come le acque superficiali.
XXVI Ciclo
1986

Over the years many different approaches and techniques have been employed to get insight genetic data of family and patients. The first approach for genetic studies and gene discovery was the linkage analysis, but to be efficient it required large family or large numbers of patients sharing the same disease phenotype. The advent of sequencing technology made the genetic analysis more handy but still it was time consuming and not cost effective when a large number of genes needed to be screened , for example in case of diseases with a known genetic heterogeneity as the neuromuscular disorders (NMDs). The high throughput molecular diagnostics tools such as Comparative Genomic Hybridization (CGH) and next Generation Sequencing (NGS) technology are changing medical genomics by accelerating new disease causing mutations discovery; these techniques could enable quick, reliable and cost-effective analysis of numerous NMD genes in parallel. The NGS methods promise to speed up the discovery of the genetic causes of diseases both in the research and the clinical setting. We performed whole exome sequencing analysis (WES) through NGS technology on a family with a Bethlem phenotype (BM) orphan of mutations in COLVI genes and a coohort of patients with a clinical diagnosis of myofibrillar myopathy (MFM). We performed the linkage analysis on BM family; the linkage regions identified were used as filters in WES output data. We selected four components (two affected and two unaffected) of this family and performed Whole Exome Sequencing by Illumina GAIIe platform obtaining a few candidate genes. Regarding the MFMs patients, we identified a large rearrangements in laminin alpha 2 (LAMA2) gene through CGH; while WES identified small variations in five patients: mutations in a known gene, and two variations in two novel genes previously unreported as involved in MFMs.
Over the years many different approaches and techniques have been employed to get insight genetic data of family and patients. The first approach for genetic studies and gene discovery was the linkage analysis, but to be efficient it required large family or large numbers of patients sharing the same disease phenotype. The advent of sequencing technology made the genetic analysis more handy but still it was time consuming and not cost effective when a large number of genes needed to be screened , for example in case of diseases with a known genetic heterogeneity as the neuromuscular disorders (NMDs). The high throughput molecular diagnostics tools such as Comparative Genomic Hybridization (CGH) and next Generation Sequencing (NGS) technology are changing medical genomics by accelerating new disease causing mutations discovery; these techniques could enable quick, reliable and cost-effective analysis of numerous NMD genes in parallel. The NGS methods promise to speed up the discovery of the genetic causes of diseases both in the research and the clinical setting. We performed whole exome sequencing analysis (WES) through NGS technology on a family with a Bethlem phenotype (BM) orphan of mutations in COLVI genes and a coohort of patients with a clinical diagnosis of myofibrillar myopathy (MFM). We performed the linkage analysis on BM family; the linkage regions identified were used as filters in WES output data. We selected four components (two affected and two unaffected) of this family and performed Whole Exome Sequencing by Illumina GAIIe platform obtaining a few candidate genes. Regarding the MFMs patients, we identified a large rearrangements in laminin alpha 2 (LAMA2) gene through CGH; while WES identified small variations in five patients: mutations in a known gene, and two variations in two novel genes previously unreported as involved in MFMs.

The sequencing of the human genome has opened up completely new avenues in research and the notion of personalized medicine has become common. DNA Sequencing technology has evolved by several orders of magnitude, coming into the range of $1,000 for a complete human genome. The promise of identifying genetic variants that influence our lifestyles and make us susceptible to diseases is now becoming reality. However, genome interpretation remains one the most challenging problems of modern biology. The focus of my PhD project is the development of bioinformatics tools to predict diseases predisposition from sequencing data. Several of these methods have been tested in the context of the Critical Assessment of Genome Interpretation (CAGI), always achieving good prediction performances. During my PhD project I faced the complete spectrum of challenges to be address in order to translate the sequencing revolution into clinical practice. One of the biggest problem when dealing with sequencing data is the interpretation of variants pathogenic effect. Dozens of bioinformatics tools have been created to separate mutations that could be involved in a pathogenic phenotype from neutral variants. In this context the problem of benchmarking is critical, as prediction performance are usually tested on different sets of variants, making the comparison among these tools impossible. To address this problem I performed a blinded comparison of pathogenicity predictors in the context of CAGI, realizing the most complete performance assessment among all the iterations of this collaborative experiment. Another challenge that needs to be address to realize the personalized medicine revolution is the phenotype prediction. During my PhD I had the opportunity to develop several methods for the complex phenotype prediction from targeted enrichment and exome sequencing data. In this context challenges like misinterpretation or overinterpretation of variants pathogenicity have emerged, like in the case of phenotype prediction from the Hopkins Clinical Panel. In addition, other complementary issues of phenotype predictions, like the possible presence of incidental findings have to be considered. Ad hoc prediction strategies have been defined while facing with different kinds of sequencing data. A clear example is the case of Crohn’s disease risk prediction. Always in the context of the CAGI experiment, three iterations of this prediction challenge have been run so far. Analysis of datasets revealed how population structure and bias in data preparation and sequencing could affect prediction performance, leading to inflated results. For this reason a completely new prediction strategy has been defined for the last edition of the Crohn’s disease challenge, exploiting data from Genome Wide Association Studies and Protein Protein Interaction network, to address the problem of missing heritability. Good prediction performance have been achieved, especially for individuals with an extreme predicted risk score. Last, my work has been focused on the prediction of a health related trait: the blood group phenotype. The accuracy of serological tests is very poor for minor blood groups or weak phenotypes. Blood groups incompatibilities can be harmful for critical individuals like oncohematological patients. BOOGIE exploits haplotype tables, and the nearest neighbor algorithm to identify the correct phenotype of a patient. The accuracy of our method has been tested in ABO and RhD systems achieving good results. In addition, our analyses paved the way for a further increase in performance, moving towards a prediction system that in the future could become a real alternative to wet lab experiments.
Il completamento del progetto genoma umano ha aperto numerosi nuovi orizzonti di ricerca. Tra questi, la possibilità di conoscere le basi genetiche che rendono ogni individuo suscettibile alle diverse malattie ha aperto la strada ad una nuova rivoluzione: l’avvento della medicina personalizzata. Le tecnologie di sequenziamento del DNA hanno subito una notevole evoluzione, ed oggi il prezzo per sequenziare un genoma è ormai prossimo alla soglia psicologica dei $ 1 000. La promessa di identificare varianti genetiche che influenzano il nostro stile di vita e che ci rendono suscettibili alle malattie sta quindi diventando realtà. Tuttavia, molto lavoro è ancora necessario perché questo nuovo tipo di medicina possa trasformarsi in realtà. In particolare la sfida oggi non è più data dalla generazione dei dati di sequenziamento, ma è rappresentata invece dalla loro interpretazione. L'obiettivo del mio progetto di dottorato è lo sviluppo di metodi bioinformatici per predire la predisposizione a patologie, a partire da dati di sequenziamento. Molti di questi metodi sono stati testati nel contesto del Critical Assessment of Genome Interpretation (CAGI), una competizione internazionale focalizzata nel definire lo stato dell’arte per l’interpretazione del genoma, ottenendo sempre buoni risultati. Durante il mio progetto di dottorato ho avuto l'opportunità di affrontare l’intero spettro delle sfide che devono essere gestite per tradurre le nuove capacità di sequenziamento del genoma in pratica clinica. Uno dei problemi principali che si devono gestire quando si ha a che fare con dati di sequenziamento è l'interpretazione della patogenicità delle mutazioni. Decine di predittori sono stati creati per separare varianti neutrali dalle mutazioni che possono essere causa di un fenotipo patologico. In questo contesto il problema del benchmarking è fondamentale, in quanto le prestazioni di questi tool sono di solito testate su diversi dataset di varianti, rendendo impossibile un confronto di performance. Per affrontare questo problema, una comparazione dell’accuratezza di questi predittori è stata effettuata su un set di mutazioni con fenotipo ignoto nel contesto del CAGI, realizzando la valutazione per predittori di patogenicità più completa tra tutte le edizioni di questo esperimento collaborativo. La previsione di fenotipi a partire da dati di sequenziamento è un'altra sfida che deve essere affrontata per realizzare le promesse della medicina personalizzata. Durante il mio dottorato ho avuto l'opportunità di sviluppare diversi predittori per fenotipi complessi utilizzando dati provenienti da pannelli genici ed esomi. In questo contesto sono stati affrontati problemi come errori di interpretazione o la sovra interpretazione della patogenicità della varianti, come nel caso della sfida focalizzata sulla predizione di fenotipi a partire dall’Hopkins Clinical Panel. Sono inoltre emersi altri problemi complementari alla previsione di fenotipo, come per esempio la possibile presenza di risultati accidentali. Specifiche strategie di predizione sono state definite lavorando con diversi tipi di dati di sequenziamento. Un esempio è dato dal morbo di Crohn. Tre edizioni del CAGI hanno proposto la sfida di identificare individui sani o affetti da questa patologia infiammatoria utilizzando unicamente dati di sequenziamento dell’esoma. L'analisi dei dataset ha rivelato come la presenza di struttura di popolazione e problemi nella preparazione e sequenziamento degli esomi abbiano compromesso le predizioni per questo fenotipo, generando una sovrastima delle performance di predizione. Tenendo in considerazione questo dato è stata definita una strategia di predizione completamente nuova per questo fenotipo, testata in occasione dell'ultima edizione del CAGI. Dati provenienti da studi di associazione GWAS e l’analisi delle reti di interazione proteica sono stati utilizzati per definire liste di geni coinvolti nell’insorgenza della malattia. Buone performance di predizione sono state ottenute in particolare per gli individui a cui era stata assegnata una elevata probabilità di essere affetti. In ultima istanza, il mio lavoro è stato focalizzato sulla predizione di gruppi sanguigni, sempre a partire da dati di sequenziamento. L'accuratezza dei test sierologici, infatti, è ridotta in caso di gruppi di sangue minori o fenotipi deboli. Incompatibilità per tali gruppi sanguigni possono essere critiche per alcune classi di individui, come nel caso dei pazienti oncoematologici. La nostra strategia di predizione ha sfruttato i dati genotipici per geni che codificano per gruppi sanguigni, presenti in database dedicati, e il principio di nearest neighbour per effettuare le predizioni. L’accuratezza del nostro metodo è stata testata sui sistemi ABO e RhD ottenendo buone performance di predizione. Inoltre le nostre analisi hanno aperto la strada ad un ulteriore aumento delle prestazioni per questo tool.