Academic literature on the topic 'Séquençage Nanopore'

Après des années de développement, l’utilisation du nanopore comme sonde pour séquencer les molécules d’ADN est maintenant une possibilité viable et prometteuse. La détection d’une seule paire de bases lors du transport de l’ADN permet d’enregistrer de très longs fragments de polynucléotides, avec une parallélisation et des vitesses élevées. Dans cette revue, les méthodologies actuelles fondées sur la détection électrique et les nanopores biologiques seront présentées de même que les nouvelles méthodes utilisant des nanopores à l’état solide, ou la détection optique.

Le séquençage haut-débit a ouvert de nouvelles perspectives cliniques nous orientant aujourd’hui vers une médecine de précision. Cancérologie, infectiologie ou génomique humaine, de nombreuses applications ont vu le jour ces dernières années. L’arrivée sur le marché d’une troisième génération de technologie de séquençage fondée sur les nanopores, palliant certaines faiblesses de la génération précédente, annonce une nouvelle révolution. Portabilité, temps réel, lectures longues et coût d’investissement marginal, ces nouvelles technologies prometteuses laissent présager un nouveau changement de paradigme. Quelles sont les perspectives ouvertes par les nanopores pour les applications cliniques ?

Chez les eucaryotes, la réplication de l’ADN commence à partir de multiples origines activées en phase S. Chaque origine forme deux fourches de réplication divergentes qui synthétisent l'ADN. La localisation des origines dans le génome humain reste incertaine, et les facteurs qui régulent la progression des fourches sont eux aussi mal connus. Pour y remédier, notre laboratoire a développé FORK-seq, une méthode de cartographie de la réplication en molécule unique, à haut débit et à haute résolution basée sur la détection par séquençage nanopore d’un analogue de la thymidine, le bromodésoxyuridine (BrdU), incorporé pendant la réplication. FORK-seq a été utilisée avec succès chez la levure S. cerevisiae mais transposer cette approche chez l’Homme est un défi majeur car la taille du génome humain, 250 fois celle du génome de levure, décuple les coûts de séquençage et rend indispensable une stratégie d’enrichissement en signaux BrdU. J’ai donc conçu un protocole de marquage spécifique, le « multi-pulse », qui consiste à marquer les cellules avec des pulses successifs de BrdU pour démultiplier les signaux réplicatifs. En plus d’accroître le nombre de fourches détectées, le « multi-pulse » donne également accès à leur vitesse en divisant simplement la distance parcourue par une fourche par l’intervalle de temps séparant deux pulses. Les lectures nanopores les plus longues offrent même l’opportunité de suivre les fourches pendant plusieurs heures, et de voir le programme de réplication se dérouler sous nos yeux. Grâce à cette méthode, j’ai réalisé dans les cellules HCT116 la première carte réplicative du génome humain en molécule unique, positionnant plusieurs millions de fourches individuelles ainsi que des centaines de milliers d’évènements d’initiation et de terminaison. Deux pulses successifs de BrdU suffisant à estimer la vitesse des fourches de réplication, j’ai aussi mis au point le « double-pulse », ersatz simple et rapide du « multi-pulse » permettant de suivre la progression des fourches et de détecter leur ralentissement en présence de stress réplicatif<br>In eukaryotes, DNA replication starts from multiple origins activated in S phase. Each origin forms two divergent replication forks that synthesize DNA. The location of origins in the human genome remains uncertain, and the factors that regulate fork progression are also poorly understood. To address these issues, our laboratory has developed FORK-seq, a high-throughput, high-resolution, single-molecule replication mapping method based on nanopore sequencing detection of the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU) incorporated during replication. FORK-seq has been successfully used in S. cerevisiae, yet applying FORK-seq to human cells is a major challenge since the size of the human genome, 250 times that of yeast’s, drastically increases sequencing costs and makes BrdU signal enrichment strategies mandatory. I have therefore devised the “multi-pulse” method, which consists in labelling cells with successive BrdU pulses to increase the number of replication signals. In addition to multiplying the number of detected forks, the “multipulse” approach also gives access to fork speed by simply dividing the distance traveled by a given fork by the time interval between two pulses. The longest nanopore reads offer the unique opportunity to follow fork progression over several hours, allowing us to observe the replication program unfold right before our eyes. Thanks to the “multi-pulse” protocol, I have generated in HCT116 cells the first ever single-molecule-based replication map of the human genome, positioning millions of individual replication forks as well as hundreds of thousands of replication initiation and termination events. Since only two successive BrdU pulses are sufficient to estimate fork velocity, I have also developed the “double-pulse” protocol, a simpler and faster “multi-pulse” alternative enabling the measurement of thousands of individual fork speeds and the detection of fork slowdown induced by replication stress

Chez les eucaryotes, la réplication de l'ADN commence à partir de multiples origines activées à différents moments de la phase S. Chaque origine forme deux fourches de réplication divergentes où a lieu la synthèse de l'ADN. Mais alors que la duplication du génome dépend de l’avancée des fourches, les déterminants de leur progression demeurent peu connus, et on ne sait toujours pas si les fourches se déplacent à une vitesse variable ou constante le long des chromosomes. Mes travaux de thèse ont consisté à réaliser chez la levure S. cerevisiae la première carte génomique de progression des fourches de réplication basée sur la vitesse individuelle des fourches. Notre laboratoire a mis au point une méthode de cartographie de la réplication en molécule unique basée sur la détection par séquençage nanopore d'un analogue de la thymidine, le BrdU, incorporé pendant la réplication. En me basant sur cette technique, j’ai développé, en association avec des bioinformaticiens du laboratoire, un outil de mesure de la vitesse des fourches nommé NanoForkSpeed (NFS). Après détection du BrdU incorporé dans l'ADN de cellules asynchrones lors d'un court marquage, NFS procède à une segmentation des signaux pour identifier les fourches de réplication, les orienter et extraire leur vitesse ; la séquence des lectures donne quant à elle immédiatement la localisation des fourches. J'ai par ailleurs créé la souche BT1, qui incorpore très efficacement le BrdU tout en conservant une croissance similaire à celle de levures sauvages, ce qui m'a permis d'étudier la progression des fourches de réplication dans des conditions physiologiques. La vitesse moyenne des fourches mesurée par NFS dans les cellules BT1 est de 2,1 kb/min, en accord avec les précédentes estimations chez S. cerevisiae. NFS est aussi capable de détecter le ralentissement des fourches induit par l’hydroxyurée ainsi que les changements de vitesse dans des mutants où la progression du réplisome est altérée. Le débit de NFS surpassant celui des méthodes en molécule unique actuelles, plus de 125000 vitesses de fourches de réplication ont pu être positionnées sur les chromosomes de S. cerevisiae pour générer la première carte génomique de progression des fourches basée sur des mesures individuelles jamais obtenue chez un organisme. Cette carte a révélé une progression homogène des fourches sur l’ensemble du génome de la levure à l'exception de forts ralentissements au niveau des sites de pauses déjà identifiés chez cet organisme, à savoir les centromères, les télomères, l'ADN ribosomique et certains gènes d'ARN de transfert. En parallèle de NFS, j’ai développé Nanotiming, une nouvelle technique d'analyse du programme temporel de réplication du génome de S. cerevisiae. Nanotiming repose sur la quantification du taux de BrdU dans les lectures nanopores : la concentration en thymidine augmentant au cours de la phase S chez la levure, le taux de BrdU sera ainsi plus faible dans les régions se répliquant tardivement que dans celles se répliquant précocement. Contrairement aux approches actuelles basées sur l’analyse de l'augmentation du nombre de copies au cours de la phase S qui sont soit peu résolutives, soit fastidieuses car impliquant une synchronisation ou un tri cellulaire, Nanotiming requière simplement le marquage de cellules asynchrones avec du BrdU pendant un doublement. Les profils obtenus tant dans une souche sauvage que dans une souche où Rif1, un régulateur-clé du programme temporel de réplication, a été inactivé sont remarquablement similaires à ceux établis par les méthodes à haute résolution actuelles, validant mon approche. Outre sa simplicité, Nanotiming ouvre également la voie à l'analyse à haut débit du programme temporel de réplication en molécule unique, et à l'étude approfondie des variations inter-individuelles<br>In eukaryotes, DNA replication initiates from multiple origins activated throughout S-phase. Each origin forms two diverging replication forks that synthesize DNA. Although genome duplication depends on a proper fork progression, the governing factors are poorly understood, and little is known about replication fork velocity variations along eukaryotic genomes. My thesis project aimed at generating in the budding yeast S. cerevisiae the first ever genome-wide map of fork progression based on individual fork rates. Our laboratory has recently introduced a high-throughput, high-resolution, single molecule-based replication mapping technique relying on the detection by nanopore sequencing of 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU), a thymidine analogue incorporated in replicating DNA. In collaboration with bioinformaticians, I have developed NanoForkSpeed (NFS), a method capable of positioning, orienting and extracting the velocity of replication forks from BrdU tracks synthesized during a brief pulse-labelling of asynchronously growing cells. In addition, I have engineered the BT1 yeast strain which exhibits highly efficient BrdU incorporation and wild-type growth, allowing the measurement of fork progression in physiologically relevant conditions. NFS retrieves previous S. cerevisiae mean fork speed estimates (≈2 kb/min) and precisely quantifies speed changes in cells with altered replisome progression or exposed to hydroxyurea. The positioning of &gt;125,000 fork velocities provides a genome-wide map of fork progression based on individual fork rates, showing a uniform fork speed across yeast chromosomes except for a marked slowdown at known pausing sites, namely centromeres, telomeres, the ribosomal DNA and some tRNA genes. During my PhD, I have also created Nanotiming, a novel method to study the replication timing (RT) of S. cerevisiae's genome. Nanotiming relies on the quantification of BrdU rates in nanopore reads: since thymidine concentration increases during S-phase in yeast, BrdU incorporation will be lower in late replicating than in early replicating regions. In contrast to reference techniques based on DNA copy number analysis, which are either low-resolution or difficult to implement as they require cell synchronization or sorting, Nanotiming only demands the labeling of asynchronously growing yeast cells with BrdU during one doubling. RT profiles obtained both in wild-type cells and in a mutant strain where Rif1, a key RT regulator, has been inactivated are remarkably similar to those established by high-resolution methods, validating my approach. In addition to its simplicity, Nanotiming also paves the way for high-throughput analysis of single molecule RT and in-depth study of inter-individual RT variability

Les plantes, organismes sessiles, sont constamment exposées à divers facteurs environnementaux et doivent donc mettre en place des mécanismes moléculaires sophistiqués afin d’assurer efficacement leur survie et leur adaptation. Les stress génotoxiques, peuvent entrainer des réarrangements chromosomiques et des modifications de l’épigénome, entraînant des conséquences sur les programmes transcriptionnels et développementaux. Il est donc important, d’étudier la relation entre la dynamique du génome et celle de l’épigénome en réponse à un stress génotoxique. Dans ce projet de thèse, Arabidopsis thaliana a été utilisée comme plante modèle pour étudier la structure du génome et le profil du méthylome en condition de stress génotoxiques ionisant (protons) et non ionisant (UVB et UVC). Le rôle des deux protéines kinases (Ataxia Telangiectasia Mutated/ATM et Ataxia Telangiectasia mutated RAD3-related/ATR), impliquées dans la DDR (DNA Damage Repair), a été étudié dans le maintien de l’intégrité du génome et celui du méthylome. Une approche de séquençage ONT (Oxford Nanopore Technology), a permis de révéler que le stress génotoxique entraine des variations structurales (VS) majoritairement constituées de délétions et d’insertions, situées dans les régions hétérochromatiniennes riches en éléments transposables (TE) et en régions intergéniques (RI). Nous avons mis en évidence qu’ATM et ATR protègent le génome contre des VS au stade végétatif et en réponse à un stress génotoxique. En effet, les TE et les gènes sont les principales entités génétiques ciblées par ATM pour leur protection contre des VS, en condition de stress. Nous avons pu déterminer que la voie du c-NHEJ (classical Non Homologous End-Joining) est prédominante pour la réparation des cassures doubles brins (DSB) par rapport à la voie MMEJ (Microhomology-Mediated End Joining) et qu’ATM/ATR préviennent l’utilisation de longue séquences MH (Microhomology) conduisant à de longues délétions lors de la réparation par la voie du MMEJ. Les profils de méthylation de l’ADN ont été déterminés par séquençage au Bisulfite et/ou ONT. Nous avons pu identifier des changements du niveau de méthylation de l’ADN principalement aux niveaux des TE, dans le contexte CHH en réponse à des stress génotoxiques. Nous avons également mis en évidence l’implication d’ATR et surtout d’ATM dans le maintien de l’intégrité du méthylome aux niveaux des gènes et des TE respectivement dans les contextes CG et CHH<br>Plants, sessile organisms, are constantly exposed to various environmental factors and therefore need to develop sophisticated molecular mechanisms to ensure their survival and adaptation. Genotoxic stresses can lead to chromosomal rearrangements and changes in the epigenome, impacting transcriptional and developmental programs. It is thus important to study the relationship between genome and epigenome dynamics in response to genotoxic stress. In this thesis project, Arabidopsis thaliana was used as a model plant to study genome structure and methylome profile under ionizing (proton) and non-ionizing (UVB and UVC) genotoxic stress conditions. The role of two protein kinases (Ataxia telangiectasia mutated or ATM and Ataxia telangiectasia mutated RAD3-related or ATR), involved in DDR (DNA damage Repair), have been studied in genome integrity and methylome maintenance. Using an ONT (Oxford Nanopore Technology) sequencing approach, we revealed that genotoxic stress leads to structural variations (SV) consisting mainly in deletions and insertions, located in heterochromatin regions rich in transposable elements (TE) and intergenic regions (RI). We demonstrated that ATM and ATR protect the genome against SV at the vegetative stage and in response to genotoxic stress. In fact, TEs and genes are the main genetic entities targeted by ATM for their protection against SV, under stress conditions. We have determined that c-NHEJ (classical Non-Homologous End-Joining) is the predominant pathway for DSB repair compared to MMEJ (Microhomology-mediated end joining) and that ATM/ATR prevent the use of long MH (Microhomology) sequences leading to long deletions during MMEJ repair. DNA methylation profiles were determined by Bisulfite sequencing and/or ONT. We were able to identify changes in DNA methylation levels mainly at the TE level, in the CHH context in response to genotoxic stresses. We also demonstrated the involvement of ATR and especially ATM in the maintenance of methylome integrity at the gene and TE levels in the CG and CHH contexts respectively

Les membranes nanoporeuses solides [en anglais, SSN (Solid State Nanopore)] sont devenues des dispositifs polyvalents pour l'analyse des biomolécules. L'une des applications les plus prometteuses des SSN est le séquençage de l'ADN et des protéines avec un coût réduit et une vitesse d’exécution plus rapide que les méthodes actuelles de séquençage. Le séquençage par SSN est basé sur la mesure des variations de courant ionique observées quand unebiomolécule, dans un milieu électrolytique, est forcée de traverser de manière séquentielle un nanopore sous l’action d’une différence de potentiel électrique appliquée. Lorsque la biomolécule passe au travers du nanopore, elle occupe de manière transitoire le volume du nanopore et bloque ainsi le passage des ions du milieu électrolytique. Le blocage du courant est dépendant de la nature et de l’encombrement stérique des groupements chimiques des monomères constituant la biomolécule. Donc, la détection ultra-rapide des variations de courant ionique lors du passage de celle-ci au travers du nanopore, peut fournir des informations sur sa séquence. La résolution avec laquelle la séquence peut être déterminée dépend de la taille des nanopores et de l'épaisseur de la membrane. Les matériaux à deux dimensions tels que le graphène et les matériaux dichalcogénures de métaux de transition (MoS2 , WS2, …) sont des candidats très prometteurs pour ledéveloppement des applications de séquençage par SSN. A partir de simulations de dynamique moléculaire (DM) tous atomes, nous avons étudié la faisabilité d'utiliser des SSN de type MoS2 pour le séquençage desprotéines. En premier lieu, nous avons étudié la conductance d’une membrane nanoporeuse de MoS2 de 1 à 5 couches d’épaisseur possédant un seul nanopore de diamètre compris entre 1.0 et 5.0 nm et plongée dans un électrolyte de KCl. Nous avons démontré que le modèle de conductance macroscopique des membranes nanoporeuses cessait d’être valable pour les plus petits nanopores (diamètre &lt; 5 nm). En analysant les simulations de DM des membranes de MoS2, nous avons développé un modèle modifié qui permet d’interpréter les mesures de courant ionique quel que soit le diamètre du nanopore. En second lieu, nous avons simulé le passage de la lysine et du di-lysine, ainsi que d'une protéine modèle, au travers de nanopores de membranes de MoS2, plongées dans un électrolyte de KCl, et soumises à une différence de potentiel électrique. A partir de nos résultats, nous avons proposé que l'utilisation d'acidesaminés chargés positivement ou négativement fixés de manière covalente à une protéine pourrait s’avérer une technique efficace pour favoriser l'entrée des protéines à travers des nanopores dans des expériences de translocation. De plus, nous avons établi la relation entre la trajectoire de la protéine au travers du nanopore et les fluctuations de courant ionique simulées.En troisième lieu, nous avons examiné la conductance ionique de membranes de MoS2 dont les pores ont un diamètre inférieur au nanomètre (sub-nm). Nous avons effectué des simulations de DM de ces systèmes en utilisant le potentiel réactif ReaxFF. Ce potentiel nous a permis de caractériser les variations de la structure atomique de ces très petits pores dans le vide et de simuler la conductance ionique de ce type de membranes. En utilisant le potentiel ReaxFF, des calculs préliminaires de la réactivité des nanopores de membranes de MoS2 à des molécules d’éthanol, utilisées dans le protocole expérimental de la préparation des membranes de MoS2, ont été réalisés<br>Solid-state nanopores (SSN) have emerged as versatile devices for biomolecule analysis. One of the most promising applications of SSN is DNA and protein sequencing, at a low cost and faster than the current standard methods. SSN sequencing is based on the measurement of ionic current variations when a biomolecule embedded in electrolyte is driven through a nanopore under an applied electric potential. As a biomolecule translocates through the nanopore, it occupies the pore volume and blocks the passage of ions. Hence, ultrafast monitoring of ionic flow during the passage of a biomolecule yields information about its structure and chemical properties. The size of the sensing region in SSN is determined by the size and thickness of the pore membrane. Therefore, two-dimensional (2D) transition metal dichalcogenides such as molybdenum disulfide (MoS2) arise as great candidates for SSN applications as an alternative to graphene. In the present work, we investigated the feasibility of using MoS2 nanopores for protein sequencing from all-atom molecular dynamics (MD) simulations. First, we studied the ionic conductance of MoS2 nanoporous membranes by characterizing the KCl electrolyte conductivity through MoS2 nanopores with diameters ranging from 1.0 to 5.0 nm and membranes from single to five-layers. Using MD simulations, we showed the failure of the usual macroscopic model of conductance for the nanoporous membranes with the smallest diameters and developed a modified model which proves usefulness to interpret experimental data. Second, we investigated the threading and translocation of individual lysine residues and a model protein with poly-lysine tags through MoS2 nanopores under the application of an electric potential. A proof-of principle technique based on the use of positively or negatively charged amino acids for protein translocation was proposed to promote the entrance of proteins through SSN in experiments. By analyzing the current-voltage curves simulated, we established the relationship between the translocation sequence events through the nanopores observed at the atomic scale in MD simulations, and the computed current fluctuations. Finally, experimental evidence of ionic conductance measurements in sub-nanometer (sub-nm) pores made of atomic defects has been recently reported. To give a better insight of the ionic transport through atomic scale pores, we performed MD simulations of sub-nm defect MoS2 pores using the reactive potential ReaxFF. Here, we characterized the variations of the atomic structure of the pores in vacuum and then we investigated the ionic conductance performance of one of the MoS2 defect pore membranes. ReaxFF potential was also useful to investigate the possible reactivity of MoS2 defect pore membranes with ethanol molecules. In addition, these simulations might provide a better understanding of the experimental setup of DNA sequencing, in which ethanol plays an unknown role in the sample preparation of the SSN

Les virus influenza sont des virus enveloppés, à ARN négatif segmenté en 8 segments génomiques. Ils sont classés dans la famille des Orthomyxoviridae. Ce sont les agents étiologiques de la grippe, une maladie respiratoire qui touche de nombreuses espèces mammifères et aviaires. La grippe équine est causée par les sous-types H3N8 et H7N7 du virus influenza de type A, ce dernier s'étant éteint depuis les années 1970. Malgré l'existence d'un vaccin, la France a connu plusieurs épidémies de H3N8 depuis les années 2000. Pour réduire l'impact économique important de ces épidémies pour l'industrie équine, il est nécessaire d'établir des tests de diagnostic rapides, robustes et applicables sur le terrain pour limiter au plus la circulation du virus et en identifier les déterminants de virulence et caractériser la dérive antigénique.Nous avons étudié les potentialités de la technique de séquençage dite « long read » développée par Oxford Nanopore Technologies. Nous avons réalisé une caractérisation du génome complet de deux virus H3N8 équins ayant circulé en France en 2009 et 2018 (A/équine/Paris/1/2018 et A/équine/Beuvron-en-Auge/2/2009, deux virus de la clade 1 Florida) ainsi que des deux souches du vaccin couramment utilisé en France.Nos résultats ont démontré la fiabilité de cette technique de séquençage à partir d'amplicons des huit segments génomiques des quatre virus analysés ainsi que la capacité à réaliser des lectures fiables à partir du séquençage direct des ARN viraux (résultats présentés dans une première partie). L'analyse de la séquence en acides aminés de l'hémagglutinine HA des souches circulantes ont mis en évidence une très légère dérive antigénique par rapport aux souches vaccinales avec des substitutions spécifiques comme T161I dans A/equine/Paris/1/2018 and N188T dans les souches post-2015, deux substitutions localisées dans le site antigénique B. Le site antigénique E montre également des modifications dans les souches post-2018, avec la substitution N63D.Le segment génomique 2 code pour une des trois sous-unités de l'ARN-polymérase virale, PB1 ainsi que pour une protéine accessoire, PB1-F2, d'un cadre de lecture alternatif. PB1-F2 est reconnu comme un déterminant de virulence. Alors que la souche A/équine/Paris/1/2018 code pour un variant de 90 acides aminés de long, de nombreuses souches, dont A/équine/Beuvron-en-Auge/2/2009, code pour un variant de seulement 81 résidus. Des essais biologiques et de biochimie ont été réalisés pour caractériser les propriétés de chacune de ces deux formes de PB1-F2. Dans un essai où la forme longue de PB1-F2 est exprimée en cellules eucaryotes sans autre constituant viraux, elle abolit le potentiel membranaire de la mitochondrie cellulaire. Mise en présence de vésicules synthétiques mimant la membrane externe de la mitochondrie, la forme longue de PB1-F2 les perméabilise plus efficacement que la forme courte. Les analyses de séquence en acides aminés des protéines virales (de HA et PB1-F2 essentiellement) sont présentées dans une deuxième partie.Afin de valider l'impact de PB1-F2 sur la virulence en contexte infection, nous avons cherché à établir un système de génétique inverse pour le virus A/équine/Paris/1/2018 (troisième partie). Pour se faire, les 8 segments génomiques ont été clonés dans le plasmide pRF483 permettant d'assurer la synthèse des brins d'ARN génomiques et l'expression des protéines virales. La séquence des inserts de chacun des plasmides a été validée. Pour valider le fonctionnement du complexe réplicatif codé par 4 des 8 segments viraux clonés dans pRF483 (PA, PB1, PB2 et NP), ces plasmides ont été transfectés avec un plasmide codant pour le segment génomique NA dans lequel son cadre de lecture a été substitué par un gène reporter, la luciférase. Dans ces conditions expérimentales, une activité du complexe ARN-polymérase a été détectée. Ces essais seront prolongés pour la production de virus recombinants par transfection des 8 plasmides construits<br>Influenza viruses are enveloped, their genome being segmented into 8 negative RNA segments. They are classified in the Orthomyxoviridae family. They are the etiological agents of the flu, a respiratory disease that affects many mammalian and avian species. Equine influenza is caused by the H3N8 and H7N7 subtypes of the type A influenza virus, the latter being extinct since the 1970s. Despite the existence of a vaccine, France has experienced several H3N8 epidemics since the 2000s. To reduce the significant economic impact of these epidemics for the equine industry, it is necessary to establish rapid, robust, and on-terrain applicable diagnostic tests to limit the circulation of the virus as much as possible and identify its virulence determinants as well as characterize antigenic drift.We studied the potential of the so-called “long read” sequencing technique developed by Oxford Nanopore Technologies. We carried out a characterization of the complete genome of two equine H3N8 viruses that circulated in France in 2009 and 2018 (A/equine/Paris/1/2018 and A/equine/Beuvron-en-Auge/2/2009, two viruses of clade 1 Florida) as well as the two strains of the vaccine commonly used in France.Our results demonstrated the reliability of this sequencing technique using amplicons of the eight genomic segments of the four viruses analyzed as well as the ability to produce reliable readings from direct sequencing of viral RNA (results presented in the first part). Analysis of the amino acid sequence of hemagglutinin HA of circulating strains demonstrated a very slight antigenic drift compared to vaccine strains with specific substitutions such as T161I in A/equine/Paris/1/2018 and N188T in the post-2015 strains, two substitutions located in the antigenic site B. The antigenic site E also shows modifications in the post-2018 strains, with the N63D substitution.Genomic segment 2 encodes one of the three subunits of the viral RNA polymerase, PB1, as well as an accessory protein, PB1-F2, of an alternative reading frame. PB1-F2 is recognized as a virulence determinant. While the A/equine/Paris/1/2018 strain encodes a variant 90 amino acids long, many strains, including A/equine/Beuvron-en-Auge/2/2009, encode a variant only 81 residues. Biological and biochemical tests were carried out to characterize the properties of each of these two forms of PB1-F2. In an assay where the long form of PB1-F2 is expressed in eukaryotic cells without other viral constituents, it abolishes the membrane potential of the cellular mitochondria. Placed in the presence of synthetic vesicles mimicking the mitochondrial outer membrane, the long form of PB1-F2 permeabilizes them more effectively than the short form. Amino acid sequence analyzes of the viral proteins (mainly HA and PB1-F2) are presented in a second part.In order to validate the impact of PB1-F2 on virulence in an infectious context, we sought to establish a reverse genetics system for the A/equine/Paris/1/2018 virus (third part). To do this, the 8 genomic segments were cloned into the pRF483 plasmid to ensure the synthesis of genomic RNA strands and the expression of viral proteins. The sequence of the inserts of each of the plasmids was validated. To validate the functioning of the replicative complex encoded by 4 of the 8 viral segments cloned in pRF483 (PA, PB1, PB2 and NP), these plasmids were transfected with a plasmid coding for the NA genomic segment in which its reading frame was substituted. by a reporter gene, luciferase. Under these experimental conditions, activity of the RNA-polymerase complex was detected. These tests will be extended for the production of recombinant viruses by transfection of the 8 constructed plasmids

La technologie des nanopores s'est imposée comme un outil puissant pour étudier le transport biomoléculaire, en particulier pour la translocation et le dézippage des molécules d'ADN. Les études expérimentales ont montré la capacité des nanopores de l'α-hémolysine (αHL) à distinguer différentes séquences et orientations d'ADN. Cependant, les résultats expérimentaux fournissent principalement des informations sur le courant bloqué et le temps de translocation, laissant les détails au niveau moléculaire du processus de dézippage inexplorés. Bien que les simulations de dynamique moléculaire tout-atome soient informatives, elles sont limitées par des échelles de temps réduites. En revanche, les simulations de dynamique moléculaire à gros-grains utilisant le champ de force MARTINI permettent l'étude du transport de l'ADN sur des échelles de temps plus longues, se rapprochant ainsi de celles observées expérimentalement.Cette thèse explore les dynamiques de translocation de l'ADN simple-brin et de dézippage de l'ADN double-brin à travers le nanopore αHL à l'aide d'approches expérimentales et de simulations de dynamique moléculaire dirigées (SMD) à gros-grains. Les différences de temps de translocation entre les extrémités 3' et 5' de l'ADN simple-brin et les temps de dézippage de l'ADN double-brin dans différentes conditions, telles que la structure du duplex d'ADN et la tension appliquée, ont été observées dans les études expérimentales. En particulier, nous avons mesuré des temps de dézippage distincts pour les molécules d'ADN double-brin utilisées, et il a été observé que la dépendance du temps de dézippage à la tension appliquée suivait une loi exponentielle. À mesure que la longueur du duplex augmente, les mécanismes semblent changer en fonction de la structure du duplex. Cependant, les raisons derrière les comportements de translocation et de dézippage restent inaccessibles expérimentalement.En utilisant des simulations de dynamique moléculaire gros-grains, l'influence de l'orientation de l'ADN simple-brin, de la composition en séquences et de la force appliquée sur les dynamiques de translocation a été examinée de manière computationnelle. Nos résultats de simulation ont reproduit les principales observations expérimentales, telles que la large distribution des temps de translocation, les comportements de translocation dépendants de l'orientation, le rôle crucial des interactions électrostatiques entre l'ADN et le nanopore, soulignant l'impact des charges des phosphates de l'ADN sur les taux de translocation, et les dynamiques de translocation dépendantes des séquences sous des forces appliquées variables. En particulier, le rapport entre les temps de translocation des bases puriques et pyrimidiques a également été en bon accord avec les résultats expérimentaux. À la suite des simulations gros-grains, une relation non linéaire entre la vitesse de translocation et la force appliquée a été observée. De plus, les différences de conformations de l'ADN à l'intérieur du nanopore ont apporté des explications supplémentaires aux comportements de translocation dépendants de la séquence et de l'orientation.Cette étude valide le modèle MARTINI à gros-grains comme un outil efficace pour l'étude du transport de l'ADN, montrant sa capacité à compléter les travaux expérimentaux. Nos résultats suggèrent que les simulations de MD gros-grains sont bien adaptées pour dévoiler les mécanismes moléculaires du dézippage de l'ADN, offrant des perspectives inaccessibles par les techniques expérimentales actuelles<br>Nanopore technology has emerged as a powerful tool for studying biomolecular transport, particularly for the translocation and unzipping of DNA molecules. Experimental studies have shown the ability of α-hemolysin (αHL) nanopores to distinguish between different DNA sequences and ori-entations. However, experimental results primarily provide blocked current and translocation time information, leaving molecular-level details of the unzipping process unexplored. All-atom molecular dynamics (MD) simulations, though informative, are limited by short time scales. Coarse-grained (CG) MD simulations using the MARTINI force field, on the other hand, enable the study of DNA transport over extended time scales, approaching those observed experimentally.This thesis investigates the dynamics of both ssDNA translocation and dsDNA unzipping through the αHL nanopore using a combination of experimental techniques and CG-steered MD (SMD) simulations. Experimental studies explored the translocation times of ssDNA at the 3' and 5' ends, as well as the unzipping times of dsDNA under various conditions, including different duplex structures and applied voltages. Our findings on ssDNA translocation aligned with previous experimental and theoretical results, confirming faster translocation of 3' oriented ssDNA. Additionally, distinct unzipping times were observed for the different duplex structures under identical experimental conditions, with an exponential relationship noted between unzipping time and applied voltage. As the duplex length increased, the unzipping mechanisms appeared to vary depending on the duplex structure. However, the underlying molecular mechanisms behind these translocation and unzipping behaviors remain experimentally inaccessible, highlighting the need for further theoretical studies.By employing CG MD simulations, the influence of ssDNA orientation, sequence composition, and pulling force on translocation dynamics were computationally examined. Our simulation results reproduced the key experimental findings, such as the wide distribution of the translocation times, the orientation-dependent translocation behaviors, the crucial role of electrostatic interactions be-tween DNA and the nanopore, highlighting the impact of DNA phosphate charges on translocation rates, and the sequence-dependent translocation dynamics under varying applied forces. Specifically, the ratio of translocation times of purine and pyrimidine bases was also found to be in good agreement with the experimental findings. As a result of the CG simulations, a non-linear relation-ship between translocation velocity and the applied force was observed. Additionally, differences in DNA conformations inside the nanopore provided additional explanation for the sequence- and orientation-dependent translocation behaviors.This study validates the MARTINI CG model as an effective tool for investigating DNA transport, demonstrating its ability to complement experimental data. Our findings suggest that CG MD simulations are well suited for uncovering the molecular mechanisms underlying DNA unzipping, offering insights that are otherwise inaccessible through current experimental techniques