Academic literature on the topic 'Séquençage de troisième génération (TGS)'

Le séquençage haut-débit a ouvert de nouvelles perspectives cliniques nous orientant aujourd’hui vers une médecine de précision. Cancérologie, infectiologie ou génomique humaine, de nombreuses applications ont vu le jour ces dernières années. L’arrivée sur le marché d’une troisième génération de technologie de séquençage fondée sur les nanopores, palliant certaines faiblesses de la génération précédente, annonce une nouvelle révolution. Portabilité, temps réel, lectures longues et coût d’investissement marginal, ces nouvelles technologies prometteuses laissent présager un nouveau changement de paradigme. Quelles sont les perspectives ouvertes par les nanopores pour les applications cliniques ?

La ténosynovite causée par le réovirus aviaire (ARV) chez les volailles de chair peut entraîner des boiteries et des ruptures de tendons, générant des pertes économiques importantes. Identifié pour la première fois en 1957, le réovirus est contrôlé par vaccination, mais la résurgence de la maladie et l’émergence de nouvelles souches, notamment en France depuis 2016, posent des défis importants. Les souches d’ARV sont classées en cinq groupes génétiques, avec des variations notables dans la protéine sigma C, protéine ciblée pour le génotypage. Malgré les vaccins existants, les souches circulantes montrent une dérive génétique, rendant les vaccins moins efficaces. Des outils moléculaires récents, comme le séquençage de troisième génération, améliorent la détection des souches, soulignant la nécessité d’une surveillance génétique continue pour adapter les stratégies de vaccination.

Contexte : Une éclosion de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est survenue en Saskatchewan du 12 septembre au 20 octobre 2020. L’événement index, la fréquentation d’un centre d’entraînement physique local, a donné naissance à six éclosions/agrégats de cas supplémentaires dans de multiples contextes. Il s’agissait d’une école secondaire, d’un hôpital, de trois lieux de travail (A, B et C) et de plusieurs ménages. L’aggrégat comprenait 63 cas au total, soit 27 membres du centre d’entraînement et 36 autres cas de deuxième, troisième et quatrième génération. Méthodes : Tous les cas de COVID-19 liés à l’éclosion et confirmés en laboratoire ont été inclus dans l’analyse. Les autorités locales de santé publique ont interrogé tous les cas et les contacts et ont mené des enquêtes environnementales dans le centre d’entraînement physique. Nous avons utilisé des méthodes épidémiologiques descriptives pour comprendre la dynamique de transmission de l’aggrégat associé au centre d’entraînement en utilisant l’enquête des cas, l’enquête sur les contacts et les données de laboratoire, y compris le séquençage du génome entier. Résultats : Les données de séquençage ont confirmé la lignée unique des cas liés à l’aggrégat (n = 32 séquencés; coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 [SRAS-CoV-2] lignée B.1.1.72). En plus de la fréquentation du centre d’entraînement, des cas infectieux fréquentaient l’école secondaire et étaient impliqués dans d’autres activités. Malgré la transmission continue dans le centre d’entraînement, aucun cas secondaire n’a été identifié dans l’école secondaire où quatre élèves appartenant à l’aggrégat ont assisté à des cours pendant leur période infectieuse. Conclusion : Nous décrivons une éclosion de COVID-19 où le ou les cas index fréquentaient un centre d’entraînement, et où la propagation s’est poursuivie pendant 38 jours malgré le dépistage et l’isolement des cas positifs au cours de cette période. En raison de la fréquentation du centre d’entraînement au fil du temps, la fermeture à court terme et le nettoyage peuvent ne pas interrompre les chaînes de transmission. Une mesure de santé publique ciblée et préventive dans les installations d’entraînement physique peut être justifiée. Les mesures de contrôle ont permis de limiter la propagation dans les écoles.

Cette thèse propose des solutions pour améliorer l'assemblage des génomes à partir de lectures de séquençage de troisième génération (lectures longues). Plus précisément, elle se concentre sur l'amélioration de l'assemblage des (méta)génomes contenant plusieurs haplotypes, comme des génomes polyploïdes ou des souches bactériennes proches. Les assembleurs actuels ont du mal à séparer les haplotypes très similaires, et fusionnent généralement des (parties d')haplotypes, ce qui entraîne la perte de polymorphismes et d'hétérozygotie dans l'assemblage final. Ce travail présente une série de méthodes et de logiciels pour obtenir des assemblages contenant des haplotypes bien séparés. Plus précisément, GenomeTailor et HairSplitter transforment un assemblage obtenu avec des lectures longues erronées en un assemblage phasé, améliorant considérablement l'état de l'art lorsque de nombreuses souches sont présentes. Le logiciel Alice propose une nouvelle méthode, basée sur des nouveaux sketchs ``MSR'', pour assembler efficacement plusieurs haplotypes séquencés avec des lectures de haute fidélité. Enfin, cette thèse propose une nouvelle stratégie de scaffolding Hi-C basée sur le démêlage des graphes d'assemblage qui améliore considérablement les assemblages finaux, en particulier lorsque plusieurs haplotypes sont présents
This thesis presents solutions to improve genome assembly from third-generation sequencing reads, with a specific focus on improving the assembly of (meta)genomes containing multiple haplotypes, such as polyploid genomes or close bacterial strains. Current assemblers struggle to separate highly similar haplotypes, often collapsing all or parts of the haplotypes into one, thereby discarding polymorphisms and heterozygosity. This work introduces a series of methods and software tools to achieve haplotype-separated assemblies. Specifically, GenomeTailor and HairSplitter transform a collapsed assembly obtained with erroneous long reads into a phased assembly, significantly improving on the state of the art when numerous strains are present. The software Alice introduces a new method based on the new ``MSR'' sketching technique for efficiently assembling multiple haplotypes sequenced with high-fidelity reads. Additionally, this thesis proposes a new Hi-C scaffolding strategy that involves untangling assembly graphs which significantly improves final assemblies, particularly when several haplotypes are present

Les objectifs de cette thèse s’inscrivent dans la large problématique du traitement des données issues de séquenceurs à très haut débit, et plus particulièrement des reads longs, issus de séquenceurs de troisième génération.Les aspects abordés dans cette problématiques se concentrent principalement sur la correction des erreurs de séquençage, et sur l’impact de la correction sur la qualité des analyses sous-jacentes, plus particulièrement sur l’assemblage. Dans un premier temps, l’un des objectifs de cette thèse est de permettre d’évaluer et de comparer la qualité de la correction fournie par les différentes méthodes de correction hybride (utilisant des reads courts en complément) et d’auto-correction (se basant uniquement sur l’information contenue dans les reads longs) de l’état de l’art. Une telle évaluation permet d’identifier aisément quelle méthode de correction est la mieux adaptée à un cas donné, notamment en fonction de la complexité du génome étudié, de la profondeur de séquençage, ou du taux d’erreurs des reads. De plus, les développeurs peuvent ainsi identifier les limitations des méthodes existantes, afin de guider leurs travaux et de proposer de nouvelles solutions visant à pallier ces limitations. Un nouvel outil d’évaluation, proposant de nombreuses métriques supplémentaires par rapport au seul outil disponible jusqu’alors, a ainsi été développé. Cet outil, combinant une approche par alignement multiple à une stratégie de segmentation, permet également une réduction considérable du temps nécessaire à l’évaluation. À l’aide de cet outil, un benchmark de l’ensemble des méthodes de correction disponibles est présenté, sur une large variété de jeux de données, de profondeur de séquençage, de taux d’erreurs et de complexité variable, de la bactérie A. baylyi à l’humain. Ce benchmark a notamment permis d’identifier deux importantes limitations des outils existants : les reads affichant des taux d’erreurs supérieurs à 30%, et les reads de longueur supérieure à 50 000 paires de bases. Le deuxième objectif de cette thèse est alors la correction des reads extrêmement bruités. Pour cela, un outil de correction hybride, combinant différentes approches de l’état de l’art, a été développé afin de surmonter les limitations des méthodes existantes. En particulier, cet outil combine une stratégie d’alignement des reads courts sur les reads longs à l’utilisation d’un graphe de de Bruijn, ayant la particularité d’être d’ordre variable. Le graphe est ainsi utilisé afin de relier les reads alignés, et donc de corriger les régions non couvertes des reads longs. Cette méthode permet ainsi de corriger des reads affichant des taux d’erreurs atteignant jusqu’à 44%, tout en permettant un meilleur passage à l’échelle sur de larges génomes et une diminution du temps de traitement, par rapport aux méthodes de l’état de l’art les plus efficaces. Enfin, le troisième objectif de cette thèse est la correction des reads extrêmement longs. Pour cela, un outil utilisant cette fois une approche par auto-correction a été développé, en combinant, de nouveau, différentes méthodologies de l’état de l’art. Plus précisément, une stratégie de calcul des chevauchements entre les reads, puis une double étape de correction, par alignement multiple puis par utilisation de graphes de de Bruijn locaux, sont utilisées ici. Afin de permettre à cette méthode de passer efficacement à l’échelle sur les reads extrêmement longs, la stratégie de segmentation mentionnée précédemment a été généralisée. Cette méthode d’auto-correction permet ainsi de corriger des reads atteignant jusqu’à 340 000 paires de bases, tout en permettant un excellent passage à l’échelle sur des génomes plus complexes, tels que celui de l’humain
The aims of this thesis are part of the vast problematic of high-throughput sequencing data analysis. More specifically, this thesis deals with long reads from third-generation sequencing technologies. The aspects tackled in this topic mainly focus on error correction, and on its impact on downstream analyses such a de novo assembly. As a first step, one of the objectives of this thesis is to evaluate and compare the quality of the error correction provided by the state-of-the-art tools, whether they employ a hybrid (using complementary short reads) or a self-correction (relying only on the information contained in the long reads sequences) strategy. Such an evaluation allows to easily identify which method is best tailored for a given case, according to the genome complexity, the sequencing depth, or the error rate of the reads. Moreover, developpers can thus identify the limiting factors of the existing methods, in order to guide their work and propose new solutions allowing to overcome these limitations. A new evaluation tool, providing a wide variety of metrics, compared to the only tool previously available, was thus developped. This tool combines a multiple sequence alignment approach and a segmentation strategy, thus allowing to drastically reduce the evaluation runtime. With the help of this tool, we present a benchmark of all the state-of-the-art error correction methods, on various datasets from several organisms, spanning from the A. baylyi bacteria to the human. This benchmark allowed to spot two major limiting factors of the existing tools: the reads displaying error rates above 30%, and the reads reaching more than 50 000 base pairs. The second objective of this thesis is thus the error correction of highly noisy long reads. To this aim, a hybrid error correction tool, combining different strategies from the state-of-the-art, was developped, in order to overcome the limiting factors of existing methods. More precisely, this tool combines a short reads alignmentstrategy to the use of a variable-order de Bruijn graph. This graph is used in order to link the aligned short reads, and thus correct the uncovered regions of the long reads. This method allows to process reads displaying error rates as high as 44%, and scales better to larger genomes, while allowing to reduce the runtime of the error correction, compared to the most efficient state-of-the-art tools.Finally, the third objectif of this thesis is the error correction of extremely long reads. To this aim, aself-correction tool was developed, by combining, once again, different methologies from the state-of-the-art. More precisely, an overlapping strategy, and a two phases error correction process, using multiple sequence alignement and local de Bruijn graphs, are used. In order to allow this method to scale to extremely long reads, the aforementioned segmentation strategy was generalized. This self-correction methods allows to process reads reaching up to 340 000 base pairs, and manages to scale very well to complex organisms such as the human genome

On reconnaît maintenant aux transcrits des implications multiples dans le fonctionnement des cellules eucaryotes. En plus de leur rôle originel de messagers assurant la liaison entre l'ADN et la synthèse protéique, l’usage de transcrits alternatifs apparaît comme un mode de contrôle post-transcriptionnel de l'expression génique. Exemplairement, plusieurs mécanismes distincts de régulation impliquant la production de transcrits matures retenant des introns (IRTs) ont été récemment décrits. Ces observations sont largement tributaires du développement de la seconde génération de séquençage haut-débit de l'ARN (RNA-seq). Cependant, ces données ne permettent pas d’identifier la structure complète des IRTs , dont le répertoire est encore très parcellaire. L’émergence d’une troisième génération de séquençage, à même de lire les transcrits dans leur intégralité, pourrait permettre d’y remédier. Bien que chaque technologie présente des inconvénients propres qui n'autorisent qu'une vision partielle et partiale du transcriptome, elles se complètent sur plusieurs points. Leur association, au moyen de méthodes dites hybrides, offre donc des perspectives intéressantes pour aborder l'étude des isoformes. L'objet de cette thèse est d'examiner ce que ces deux types de données peuvent, seuls ou combinés, apporter plus spécifiquement à l'étude des événements de rétention d'intron (IR). Un nombre croissant de travaux exploitent la profondeur et la largeur de couverture des données de seconde génération pour déceler et quantifier l'IR. Toutefois, il existe encore peu de méthodes informatiques dédiées à leur analyse et l’on fait souvent appel à des méthodes conçues pour d'autres usages comme l'étude de l'expression des gènes ou des exons. En tous les cas, leur capacité à apprécier correctement l'IR ne sont pas garanties. C'est la raison pour laquelle nous mettons en place un plan d'évaluation des méthodes de mesure des niveaux d’IR. Cette analyse révèle un certain nombre de biais, susceptibles de nuire à l'interprétation des résultats et nous amène à proposer une nouvelle méthode d’estimation. Au-delà de la vision centrée sur les variants, les données de longs reads Oxford Nanopore ont le potentiel de révéler la structure complète des IRTs, et ainsi, d’inférer un certain nombre de leurs caractéristiques. Cependant, leur taux d’erreur élevé et la troncation des séquences sont des obstacles incontournables. A large échelle, le traitement informatique de ces données nécessite l’introduction d’heuristiques, qui privilégient certaines formes de transcrits et, en général, occultent les formes rares ou inattendues. Il en résulte une perte importante d’information et de qualité d’interprétation. Pour la réduire, nous développons une méthode hybride de correction des séquences et proposons des stratégies ciblées pour reconstituer et caractériser les IRTs
In eucaryotic cells, the roles of RNA transcripts are known to be varied. Besides their role as messengers, transferring information from DNA to protein synthesis, the usage of alternative transcripts appears as a means to control gene expression in a post-transcriptional manner. Exemplary, the production of mature transcripts retaining introns (IRTs) was recently shown to take part in several distinct regulatory mechanisms. These observations benefited greatly from the development of the second generation of RNA-sequencing (RNA-seq). However, these data do not allow to identify the entire structure of IRTs, whose catalog is still fragmented. The emerging third generation of RNA-seq, apt to read RNA sequences in their full extent, could help achieve this goal. Despite their respective drawbacks and biases, both technologies are, to some extent, complementary. It is therefore appealing to try and combine them through so-called hybrid methods, so as to perform analyses at the isoform level. In the present thesis, we aim to investigate the potential of these two types of data, alone or in combination, in order to study intron retention (IR) events, more specifically. A growing number of studies harness the high coverage depths provided by second generation data to detect and quantify IR. However, there exist few dedicated computational methods, and many studies rely on methods designed for other purposes, such as gene or exon expression analysis. In any case, their ability to accurately measure IR has not been certified. For this reason, we set up a benchmark of the various IR quantification methods. Our study reveals several biases, prone to prejudice the interpretation of results and prompted us to suggest a novel method to estimate IR levels. Beyond event-centered analyses, Oxford Nanopore long read data have the capability to reveal the full-length structure of IRTs, and thereby to allow to infer some of their features. However, their high error rate and truncation events constitute inescapable impediments. Transcriptome-wide, the computational treatment of these data necessitates heuristics which will favor specific transcript forms, and, generally, overlook rare or unexpected ones. This results in a considerable loss of information and precludes meaningful interpretations. To address these issues, we develop a hybrid correction method and suggest specific strategies to recover and characterize IRTs