Academic literature on the topic 'Séquençage à haut débit (NGS)'

L’essor de la génétique au cours des dernières décennies a permis des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes conduisant aux maladies rénales héréditaires. Des premières études par clonage positionnel jusqu’à l’avènement du séquençage à haut débit (NGS), les techniques d’analyse du génome sont devenues de plus en plus performantes, avec un niveau de résolution extraordinaire. Les prix de séquençage se sont effondrés, passant d’un million de dollars (environ 940 millions d’euros) pour le séquençage du génome de James Watson en 2008, à quelques centaines d’euros pour le séquençage d’un génome aujourd’hui. Le diagnostic moléculaire tient ainsi une place centrale pour le diagnostic des patients et influe sur la prise en charge thérapeutique dans de nombreuses situations. Mais si le NGS est un outil performant pour l’identification de variants impliqués dans les maladies, il expose au risque de surinterprétation de certains variants, conduisant à des diagnostics erronés. Dans cette revue, nous proposons une brève rétrospective des étapes essentielles qui ont conduit aux connaissances actuelles et au développement du NGS pour l’étude des néphropathies héréditaires de l’enfant. Nous développerons ensuite les principales néphropathies héréditaires et les mécanismes moléculaires sous-jacents.

L’étude de l’écologie des micro-organismes est récente malgré son importance pratique et théorique intrinsèque, mais également son rôle central dans la niche des macro-organismes. Les interactions plantes-champignons, de par leur importance socio-écologique et leur diversité — du mutualisme au parasitisme en passant par le commensalisme —, offrent un modèle judicieux pour étudier l’écologie des communautés de micro-organismes en interaction avec des macro-organismes. À l’aide de techniques de séquençage à haut débit (NGS) et d’analyse des réseaux, nous explorons certains déterminants de la structure des champignons des forêts de Corse à travers trois guildes : les champignons ectomycorhiziens, endophytiques et saprotrophes. Ce travail considère les processus de dispersion, les perturbations (feux et chablis), les facteurs environnementaux (par exemple la profondeur du sol) et les contraintes dérivées de l’interaction avec les hôtes (par exemple la taxinomie). Les assemblages des communautés des différentes guildes présentent des patrons communs qui pourraient être issus de mécanismes identiques. Ainsi, l’ensemble des guildes étudiées présentent des variations fortes à l’échelle des microrégions de Corse et entre forêts ayant des histoires de feux différentes. En revanche, l’importance des différents processus d’assemblage et les échelles spatiales auxquelles ils s’appliquent varient selon les guildes. Nous discutons des implications que suscite ce travail pour les écologues des communautés et pour les gestionnaires d’espaces naturels.

Le séquençage haut-débit a ouvert de nouvelles perspectives cliniques nous orientant aujourd’hui vers une médecine de précision. Cancérologie, infectiologie ou génomique humaine, de nombreuses applications ont vu le jour ces dernières années. L’arrivée sur le marché d’une troisième génération de technologie de séquençage fondée sur les nanopores, palliant certaines faiblesses de la génération précédente, annonce une nouvelle révolution. Portabilité, temps réel, lectures longues et coût d’investissement marginal, ces nouvelles technologies prometteuses laissent présager un nouveau changement de paradigme. Quelles sont les perspectives ouvertes par les nanopores pour les applications cliniques ?

Dans les syndromes polymalformatifs, les causes génétiques sont fréquentes, avec un risque éventuel de récidive, à l’origine d’une très forte demande de conseil génétique. La stratégie diagnostique actuelle (examen foetopathologique, cytogénétique et examens ciblés de biologie moléculaire) ne permet un diagnostic étiologique que dans environ un tiers des familles concernées. Depuis la mise en place du séquençage haut débit d’exome (ES), les bases moléculaires de nombreux nouveaux syndromes ont pu être identifiées.Notre objectif a été d’étudier l’apport du ES en solo dans l’identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement embryonnaire chez des fœtus atteints de syndromes polymalformatifs non étiquetés après la stratégie diagnostique classique grâce à une stratégie d’analyse de l’ES multiétapes originale.Nous avons réalisé un ES solo chez 95 fœtus polymalformés provenant de 10 centres de diagnostic prénatal en France. L’analyse reposait dans un premier temps sur l’étude des gènes OMIM morbides grâce à des scores bioinformatiques et la présence des variations dans des bases de données, indépendamment du phénotype foetal, puis sur une étape de corrélations génotype-phénotype. Enfin, une analyse recherche basée sur les scores bioinformatiques étendue à l’ensemble de l’ES. La confirmation des variations et leur ségrégation parentale ont été réalisées par séquençage Sanger.L’ES a permis d’identifier une/des variation(s) causale(s) chez 23 fœtus (24%), des variations de signification inconnue (VUS) chez 6 fœtus (6%) et des variations dans des gènes candidats chez 6 fœtus (6%). Parmi les variations causales, la majorité était de transmission autosomique récessive (50%), 42% étaient de survenue sporadique et 4% de transmission autosomique dominante.En conclusion, l’efficacité du ES en solo (stratégie classique et additionnelle) pour identifier de nouveaux gènes du développement est faible, mais il permet d’étendre les spectres phénotypiques de pathologie pédiatrique connues. Une analyse des cas négatif en trio voire en génome est maintenant une piste à explorer
Multiple congenital anomalies (MCA) are often genetic conditions, with a risk of recurrence. The etiologic diagnosis of these conditions in fetuses is mandatory to allow genetic counseling for the future pregnancies. Regarding current diagnostic tests (fetal autopsy, cytogenetic test and targeted molecular tets), the diagnostic rate in MCA fetuses is about 30%, allowing genetic counselling in only one third of families. Exome sequencing (ES) has allowed to identify the molecular basis of many new syndromes.We aimed to assess the contribution of ES solo-based strategy to identify new developmental genes in fetuses presenting with MCA without etiological diagnosis after standard investigations with an original multistep strategy.We performed solo ES in 95 MCA fetuses from 10 prenatal diagnostic centers in France. First, we focused on OMIM related disease genes, with a first step using bioinformatic scores and public databases independently of phenotype, a second step using genotype-phenotype correlation and a third step of research analysis extended to the whole exome. Variant confirmation and parental segregation were done by Sanger sequencing. ES allowed the identification of a causative variants in 23 fetuses (24%), variants of unknown significance (VUS) in 7 fetuses (7%) and variants in new candidate genes in 6 fetuses (6%). Among causative variants, most were from autosomal recessive inheritance (50%), 42% were sporadic and 4% were from autosomal dominant inheritance. The additionnal strategy identified 17/23 causative variants, including 2 new causative variants not identified by the classical approach because of atypical or extreme fetal phenotype, and 2 new VUS. No new candidate gene was identified by this strategy.To conclude, solo ES with classical and additionnal strategy presents a low efficiency to identify new genes implicated in embryonary development but allows the extension of the clinical spectrum of well-known pediatric pathologies to the prenatal period. Trio ES or genome sequencing would be now insteresting strategies to be explored

La diffusion du séquençage haut débit (ou NGS pour Next Generation Sequencing) représente un tel changement d’échelle par rapport aux méthodes classiques de séquençage que les indications et l’organisation du diagnostic moléculaire s’en trouvent profondément modifiées. Le NGS permet à la fois de raccourcir le temps d’analyse et de rendu de résultat et d'élargir considérablement le nombre de gènes testés. Il promet donc d’augmenter la proportion de diagnostics posés et de faciliter l'identification de nouveaux variants et de nouveaux gènes impliqués en pathologie. Cependant dans tous les cas, il génère une quantité de données importante, données qui doivent être analysées et interprétées à l’aide d’outils bioinformatiques spécifiques.Dans la première partie de ce travail, les stratégies existantes ainsi que les difficultés et les enjeux du séquençage haut débit pour le diagnostic moléculaire des maladies génétiques sont discutés. Dans la deuxième partie, la mise en place et la validation technique de cette approche diagnostique sont décrites au sein du laboratoire de Génétique Moléculaire de la Timone à Marseille et illustrées par trois exemples concrets de diagnostics moléculaires posés grâce à la technique de séquençage à haut débit. Dans le domaine spécifique des maladies rares, ces nouvelles technologies sont porteuses d’un réel espoir pour les patients atteints de maladie génétique, permettant d'améliorer globalement leur prise en charge et d'accélérer les progrès dans le domaine de la recherche
The diffusion of Next Generation Sequencing (NGS) technologies induces an important change that modifies molecular diagnostics indications and prompts laboratories to re-think their diagnostic strategies, up-to-now based on Sanger sequencing routine. Several high throughput approaches are available from the sequencing of a gene panel, to a whole exome, or even a whole genome. In all cases, a tremendous amount of data are generated, that have to be filtered, interpreted and analyzed by the use of powerful bioinformatics tools.In part 1, existing strategies and the difficulties and challenges of high-throughput sequencing for molecular diagnosis in genetic diseases are discussed. In part 2, the set up and the technical validation of this diagnostic approach in the Molecular Genetics’ Laboratory of the Timone Hospital in Marseille is presented and illustrated by 3 examples of complex diagnostics solved thanks to NGS. NGS promises to shorten significantly the time of analysis and results reporting, and to expand the number of tested genes. It also promises to increase the proportion of positive diagnoses. Finally, the NGS can identify new variants and new genes involved in human pathology, thus will globally improve patient clinical care

Les entérovirus (EV) sont des Picornavirus (virus nus à génome ARN positif), caractérisés par une grande diversité génétique et antigénique (116 types classés en 4 espèces taxonomiques EV-A à D) et une évolution rapide. Les infections humaines sont très fréquentes, hautement contagieuses à partir des selles et épidémiques. La plupart des infections sont asymptomatiques ou bénignes ; elles peuvent être graves voire mortelles, en particulier chez les jeunes enfants. La poliomyélite, modèle d’infection à EV, est en voie d’éradication grâce aux programmes de vaccination et de surveillance sous l’égide de l’OMS. La détection de poliovirus sauvages dans des pays déclarés exempts de polio depuis plusieurs années et l’émergence récente de plusieurs EV non poliomyélitiques (EV-A71, EV-D68) associés à des manifestations cliniques sévères dans plusieurs régions du monde montrent l’importance de surveiller la circulation des EV dans la population humaine. Le but de la thèse était de rechercher et caractériser les EV dans les eaux usées de l’agglomération de Clermont-Ferrand et de comparer les données à celles de la surveillance clinique pour avoir une image plus complète de la circulation virale dans la population générale. Une méthode de concentration virale à partir des eaux usées prélevées en entrée (eaux usées brutes) et sortie (eaux usées traitées) de station d’épuration a été mise au point, permettant la détection moléculaire des EV et de 6 autres virus entériques humains. La présence de génomes viraux a été détectée dans tous les échantillons d’octobre 2014 à octobre 2015, avec une médiane de 6 virus différents en entrée de station et de 4 virus en sortie. L’analyse phylogénétique des séquences d’EV et des virus des hépatites A et E présents dans les eaux usées et les prélèvements cliniques des patients hospitalisés au CHU de Clermont-Ferrand pendant la même période, a validé l’approche mise en place pour surveiller la circulation communautaire d’un virus entérique. La diversité des EV présents dans les eaux usées brutes a été analysée par séquençage d’amplicons avec une technique haut débit Illumina (metabarcoding). Les résultats montrent la présence d’une grande diversité d’EV et la circulation silencieuse de 25 types (notamment 9 EV-C, dont des séquences de poliovirus 1 vaccinal) dans la population générale. L’analyse phylogénétique des variants intra-typiques a mis en évidence plusieurs profils épidémiques parmi les principaux types ayant circulé pendant la période d’étude. Les données obtenues montrent la faisabilité et la sensibilité de la stratégie développée pour détecter et caractériser les EV présents dans les eaux usées. Ils permettent de discuter la place de la surveillance environnementale dans la surveillance des infections à EV non polio (études épidémiologiques, prévention des épidémies, alertes sanitaires). Surveiller conjointement les virus entériques dans l’environnement et chez les patients permet une meilleure compréhension de leur prévalence. Cette approche globale de la circulation virale et de l’écologie de la santé représente un engagement important de la part des laboratoires et nécessitera une intégration dans des réseaux structurés de collaboration nationales et internationales dépassant la seule surveillance des EV
Enterovirus (EV) are Picornaviruses (non-enveloped, positive-sense RNA viruses), characterized by a large genetic and antigenic diversity (116 types classified within 4 taxonomic species EV-A to D) and rapid evolution. Human infections are frequent, highly contagious from stools and occur as outbreaks. The infections are mainly asymptomatic or benign but severe or fatal cases can be reported in young children. Poliomyelitis is the model EV infection. Combined with clinical and virological surveillance, mass vaccination is closer than ever to achieve the WHO program of the Global Polio Eradication Initiative. However, the detection of wild type polioviruses in polio-free countries and the recent worldwide emergence of non-polio enteroviruses (EV-A71, EV-D68) associated with severe clinical manifestations underscore the importance of surveilling EV circulation in the general population. The aim of the PhD thesis was the detection and identification of EV strains in wastewater treated in the sewage treatment plant at Clermont-Ferrand (France). The viral data were compared with those reported through clinical surveillance to obtain a comprehensive picture of the viral circulation in the local population. A method was developed to concentrate viruses from raw and treated wastewater and molecular assays were used to detect EVs and 6 other human enteric viruses. The viral genomes were detected in all samples from October 2014 to October 2015, with a median of 6 and 4 different viruses in raw and treated wastewater respectively. Phylogenetic analysis of viral sequences (EV, hepatitis A and E viruses) determined in wastewater and reported in patients during the sampling period, showed the efficiency of the method for surveilling enteric viruses in the community. The EV diversity in raw wastewater was analyzed by sequencing of amplicons with the Illumina high throughput technology (metabarcoding). The analysis revealed a large viral diversity and the silent circulation of 25 types not detected from hospital data (in particular 9 EV-C, of which sequences of vaccine poliovirus 1). The phylogenetic analyses of intra-typic variants showed different epidemic patterns in the predominant EV types circulating over the study period. The data demonstrate the feasibility and sensitivity of the strategy developed for the detection and characterization of EV in wastewater and provide a future prospect for the implementation of environmental surveillance of non-polio EV infections in epidemiological studies, epidemic prevention, and for health alert. Combining the surveillance of enteric viruses in the environment and in the clinical setting allows a better understanding of their prevalence. This global approach of virus circulation and ecological health represents an important investment for laboratories, which will require integration in national and international collaboration networks beyond the scope of enterovirus surveillance

La capacité de détection des agents pathogènes est un enjeu croissant tant les maladies infectieuses représentent un risque pour la santé animale et humaine. La globalisation des échanges commerciaux et des voyages, l’évolution des pratiques agricoles, les changements climatiques ou encore les migrations de masse sont autant de facteurs bouleversant la biologie des micro-organismes et de fait, leurs capacités d’émergence. Ce manuscrit décrit trois approches complémentaires, basées sur trois techniques innovantes de biologie moléculaire pour la détection d’agents pathogènes et appliquées à trois contextes différents : (i) la recherche d’une liste précise de micro-organismes par PCR quantitative en temps réel en format microfluidique, (ii) la détection sans a priori d’agents infectieux dans un milieu complexe par métagénomique et séquençage Illumina (Miseq) et (iii) le génotypage d’un agent infectieux sans amplification préalable des génomes par NGS (Nouvelles Générations de séquençage) de troisième génération, le MinION d’Oxford Nanopore Technologies. Ces trois études ont permis de montrer l’apport de ces techniques, qui présentent toutes des caractéristiques distinctes, adaptées à différentes applications. Au-delà de l’application de ces techniques au domaine du diagnostic microbiologique, leur utilisation dans le cadre du contrôle des médicaments immunologiques vétérinaires est une perspective prioritaire de ce travail. En effet, les préparations vaccinales vétérinaires sont soumises à l’obligation de recherche d’une liste d’agents pathogènes à exclure mais également à la vérification de l’identité génétique des souches vaccinales. L’accessibilité et les performances exponentielles des nouvelles technologies de PCR et de séquençage ouvrent ainsi des perspectives révolutionnaires dans le domaine du diagnostic et du contrôle microbiologique
Detection of pathogens becomes an increasing challenge, since infectious diseases represent major risks for both human and animal health. Globalization of trade and travels, evolution of farming practices and global climatic changes, as well as mass migrations are impacting the biology of pathogens and their emerging potential. This manuscript describes three approaches, based on three innovative technologies of molecular biology applied to the detection of pathogens in three different settings : (i) detection of a list of pathogens using real-time quantitative PCR on a microfluidic platform, (ii) unbiased detection of pathogens in complex matrix, using metagenomics and Illumina (Miseq) sequencing and (iii) genotyping of pathogens without isolation of PCR-enrichment using a 3rd generation NGS (Next Generation Sequencing) platform MinION from Oxford Nanopore Technologies. The three studies shown the contribution of these techniques, each representing distinctive features, suitable for the respective applications. Beyond application of these techniques to the field of microbial diagnostics, their use for the control of veterinary immunological drugs is a priority of this project. Veterinary vaccines are not only submitted to mandatory detection of listed pathogens to be excluded, but also to validation of the genetic identity of vaccine strains. The exponential availability and performances of new PCR or sequencing technologies open cutting-edge perspectives in the field of microbial diagnostic and control

Le déploiement du séquençage haut débit (SHD) ces dernières années au sein des laboratoires de génétique hospitaliers en France et dans le monde a révolutionné la prise en charge des maladies rares dont les anémies hémolytiques constitutionnelles (AHC). Il a conduit à la multiplication des variations de signification incertaine (VSI) nécessitant la mise en œuvre de tests fonctionnels pour aboutir à une re-classification. L’objectif de ce travail est de proposer une stratégie réaliste et efficace d’exploration fonctionnelle de VSI associés aux AHC. Cette démarche repose sur les études génétiques familiales, l’étude de transcrits sur tubes Paxgene, le développement de méthodes d’études du GR comme le LORRCA pour l’étude de la membrane, la réorientation de techniques comme la courbe de densité des GR par gradient de phtalates et la mise en place d’un réseau collaboratif (CNRS de Roscoff pour les études électrophysiologiques). Nous avons montré l’intérêt du SHD chez ces patients avec suspicion d’AHC et mis en évidence des associations de variations d’intérêt dans différents gènes de pathologies du GR chez un même patient (Mansour-Hendili et al 2020). Nous avons identifié une nouvelle entité pathologique chez deux patients avec une anémie hémolytique « auto-immune à test direct à l’antiglobuline négatif » non répondeurs aux immunomodulateurs. Il s’agit d’un mécanisme de sphérocytose acquise par mutation ponctuelle du gène ANK1 probablement associé à une hématopoièse clonale du sujet âgé (soumission en cours). La réalisation d’un génome entier a permis d’aboutir à un diagnostic pour un enfant atteint d’une hémolyse inexpliquée transfuso-dépendante avec retard neurodéveloppemental due au gène VPS4A (Lunati-Rozie et al 2021). Via un système de reconvocation de patients, les explorations complémentaires ont pu être réalisées. Vingt-cinq patients ont eu une étude de transcrits permettant la reclassification de seize variations. Dix études familiales ont été réalisées dont une excluant le caractère délétère d’un VSI du gène GATA1. Nous avons montré l’intérêt de la mesure de la densité des GR comme outil de screening des pathologies de membrane du GR. Son utilisation comme test fonctionnel dans les cas d’associations de variations dans des gènes de membrane a mis en exergue l’utilité du taux de cellules denses comme marqueur différentiel de la présence/absence de la variation associée. De plus, les profils d’osmoscan permettent de discriminer des profils de patients avec associations de variations comparativement à des témoins « positifs » sans association. Les études de stabilité menées pour ces tests à différents temps et températures de stockage montrent l’importance des conditions pré-analytiques. Nous avons illustré ce problème avec la mutation connue du gène KCNN4 : p.R352H décrite avec des profils d’osmoscan et d’ektacytométrie normaux. Nous avons retrouvé à deux reprises sur deux échantillons et manipulations indépendantes réalisées sans stockage des profils d’osmoscan anormaux. Par ailleurs, nous montrons l’intérêt de l’étude des propriétés électrophysiologiques des canaux PIEZO1 et KCNN4 réalisée à Roscoff dans la classification de VSI (Mansour-Hendili et al 2021). Pour les cas d’associations de variations d’intérêt les profils d’interprétation sont plus complexes mais montrent également des différences de profil par rapport à des témoins bien choisis. Ce travail a permis de démontrer l’utilité en plus des études familiales et de transcrits, d’outils diagnostic ou de suivi phénotypiques du GR (LORRCA, densité des GR) pour l’aide à la validation fonctionnelle de VSI isolés ou en association. Cela nécessite des moyens de reconvocation, des contrôles positifs adéquats et un respect des conditions préanalytiques. La mise en place de réseaux collaboratifs apporte une véritable utilité et une plus-value intellectuelle et humaine réciproque. Le retour au phénotype est indispensable à la classification des VSI concernant les AHC
The deployment of next generation sequencing (NGS) over the past ten years in hospital genetic laboratories in France and around the world has revolutionized the management of rare diseases, including constitutional hemolytic anemia (CHA). It has led to the multiplication of variations of uncertain significance (VUS) requiring the implementation of functional tests to permit a re-classification. The objective of this work is to propose a realistic and effective strategy for the functional exploration of VUS associated with CHs. This approach is based on family genetic studies, study of transcripts on Paxgene tubes, development of methods on-site such as the LORRCA MaxSis for the study of the RBC membrane properties, improvment of techniques such as the RBC density measurement by phthalate gradient and establishment of a collaborative network (example of CNRS in Roscoff for electrophysiological studies). We have shown the interest of NGS in these patients with suspected CHA and have highlighted associations of variations of interest in different genes of RBC pathologies in the same patient (Mansour-Hendili et al 2020). We identified a new pathological entity in two patients with “autoimmune direct antiglobulin test negative” haemolytic anemia who did not respond to immunomodulators. This is a mechanism of acquired spherocytosis by point mutation of the ANK1 gene probably due to clonal hematopoiesis in the elderly (submission in progress). The realization of a whole genome sequencing led to a diagnosis for a child suffering from unexplained transfusion-dependent hemolysis with neurodevelopmental delay due to the VPS4A gene (Lunati-Rozie et al 2021). Via a patient recall system, additional explorations have been carried out. Twenty-five patients underwent a transcript study allowing the reclassification of sixteen variations. Ten family studies have been carried out, one of which excludes the deleterious nature of a VUS of the GATA1 gene. We have shown the interest of measuring RBC density as screening tool for RBC membrane diseases. Its use as a functional test in the case of associations of variations in RBC membrane genes has highlighted the usefulness of the dense cell rate as a differential marker of the presence/absence of the associated variation. Concerning the LORRCA, osmoscan profiles make it possible to discriminate patient with associations of variations compared to “positive” controls without association. Stability studies conducted for these phenotypic tests at different storage times and temperatures show the importance of pre-analytical conditions. We illustrated this problem with the known KCNN4 gene mutation: p.R352H described with a normal osmoscan and ektacytometry profiles. We found twice on two independent samples and manipulations realized on D0 without storage abnormal osmoscan profiles. In addition, we show the interest of the study of electrophysiological properties of the PIEZO1 and KCNN4 channels carried out in Roscoff in the classification of VUS (case one patient with a new KCNN4 mutation and thrombosis, Mansour-Hendili et al 2021). For the associations of variations of interest, the interpretation profiles are more complex but also show profiles differences compared to well-chosen controls. This work has made it possible to demonstrate the usefulness, in addition to family and transcript studies, of RBC phenotypic diagnostic or monitoring tools (LORRCA, density of the GR) to help with the functional validation of isolated or associated VUS in CHA patients. This requires means of revocation, adequate positive controls (intrafamilial cases) and compliance with preanalytical conditions. The establishment of collaborative networks also brings real usefulness and reciprocal intellectual and human added value. The return to the phenotype is an essential recourse for the classification of VUS in particular for the CHA

La maladie à virus Ébola (EBOV) est un enjeu de santé publique majeur puisqu’aucune molécule antivirale ni candidat vaccin n’a reçu d’autorisation de commercialisation. L’ampleur des récentes a montré l’importance de trouver des traitements efficaces. La première partie de cette thèse porte sur le développement d’un modèle d’infection à EBOV chez des primates non-humains. Après l’administration de différentes doses d’EBOV, les paramètres vitaux ainsi que l’évolution du génome viral au cours de l’infection ont été étudiés. Les résultats montrent que l’évolution de la maladie, dans ce modèle, est plus proche de ce qui est observé chez l’homme que les modèles précédemment proposés (les signes cliniques, la détérioration des paramètres biologiques et la mort surviennent plus tardivement). La létalité est de 100%. La variabilité virale est assez faible et la dose d’infection a une influence limitée sur l’évolution de la maladie. La seconde partie porte sur l’utilisation dans ce modèle d’une molécule antivirale, le favipiravir (T-705), administrée à différentes doses (100, 150, 180mg/kg). Les paramètres cliniques, biologiques et la variabilité virale ont été suivis au cours de l’infection. L’administration de la plus forte dose de favipiravir (180 mg/kg) a été associée à la survie de 60% des singes.Les sous populations ayant une fréquence supérieure à 1% étaient significativement plus nombreuses dans le groupe traité que dans le groupe témoin et fournissent des indications sur le mécanisme d’action du favipiravir. Il s’agit d’un analogue du GTP inhibiteur de la polymérase virale qui engendre des mutations conduisant à un mécanisme inhibiteur de type « error catastrophe »
Ebola virus disease (EVD) is a major public health issue due to the lack of antiviral treatment or candidate vaccine receiving market authorisation. The scope of the recent outbreaks (2014-2016 and 2018) has highlighted the urgent need to develop efficient treatments.The first scope of this thesis concerns the implementation of a non-human model (Mauritian Cynomolgus Macaques) of Ebola virus (EBOV-Gabon 2001 strain) infection. Following intramuscular administration of EBOV, vital parameters and viral genomic evolution (consensus mutations and viral quasi species) over the disease course were observed. Results demonstrated that evolution of EVD, in this model, is closer from human than previously described models (clinical, biological parameters deteriorate later, and death occurs later). Lethality is 100%. Viral variability is low and infectious dose has a limited impact on disease course.The second scope would highlight the antiviral efficacy of different favipiravir (T-705) doses (100, 150, 180mg/kg) administrated intravenously in this model. Clinical, biological parameters and viral variability were evaluated during disease course. The highest favipiravir dose administration (180 mg/kg) was associated with 60% of monkeys’ survival.Next generation sequencing of viral quasi species over disease course has given some insights into the Proposed mechanism of action of favipiravir. Viral quasi specie number was increased by five between treated monkeys and negative controls. Favipiravir is a GTP analogue inhibiting viral polymerase which induces C to T and G to A mutations leading to error catastrophe mechanism

Les papillomavirus humains (HPV) constituent une famille de petits virus à double brin d’ADN qui ont un tropisme pour les cellules épithéliales de la peau et des muqueuses. Plus de 200 types d’HPV ont été découverts, et classifiés en plusieurs genres taxonomiques en fonction de la constitution de leur séquence ADN. De part le rôle de certains HPV dans les maladies affectant les humains, allant de l’apparition de verrues anogénitales bénignes jusqu’au développement d’un cancer, il est nécessaire de développer des méthodes de détection et de caractérisation de la population d’HPV dans un échantillon d’ADN. Elles sont nécessaires à la clarification du rôle de l’HPV dans les différentes étapes de la progression de la maladie. Cette détection d’HPV lors d’approches ciblées en laboratoire a principalement reposé sur des méthodes de PCR couplées avec du séquençage Sanger. Avec l’introduction des nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS), ces approches peuvent être revisitées afin d’intégrer la puissance de séquençage de ces technologies. Alors que des outils d’analyse in-silico ont été développés pour la recherche de virus, connus ou nouveaux, à partir de données de NGS, aucun outil approprié n’est disponible pour la classification et l’identification de nouvelles séquences virales à partir de données produites par des méthodes de séquençage d’amplicons. Dans cette thèse, la première partie présente cinq nouveaux génomes d’HPV isolés via l’utilisation d’amorces d’amplification dégénérées ciblant le gène L1 à partir d’échantillons de peau humaine. Puis, dans une seconde partie, nous présentons PVAmpliconFinder, un outil d’analyse de données conçu pour identifier et classifier rapidement des séquences connues et potentiellement nouvelles de la famille Papillomaviridae, à partir de données de NGS d’amplicons générées par PCR via l’utilisation d’oligonucleotides dégénérés ciblants les HPV. Enfin, les caractéristiques de PVAmpliconFinder sont présentées, ainsi que plusieurs applications sur des données biologiques obtenues lors du séquençage d’amplicons de spécimens humains. Ces applications ont permis la découverte de nouveaux types d’HPV
Human Papillomaviruses (HPV) are a family of small double-stranded DNA viruses that have a tropism for the mucosal and cutaneous epithelia. More than 200 types of HPV have been discovered so far and are classified into several genera based on their DNA sequence. Due to the role of some HPV types in human disease, ranging from benign anogenital warts to cancer, methods to detect and characterize HPV population in DNA sample have been developed. These detection methods are needed to clarify the implications of HPV at the various stages of the disease. The detection of HPV from targeted wet-lab approaches has traditionally used PCR- based methods coupled with cloning and Sanger sequencing. With the introduction of next generation sequencing (NGS) these approaches can be improved by integrating the sequencing power of NGS. While computational tools have been developed for metagenomic approaches to search for known or novel viruses in NGS data, no appropriate bioinformatic tool has been available for the classification and identification of novel viral sequences from data produced by amplicon-based methods. In this thesis, we initially describe five fully reconstructed novel HPV genomes detected from skin samples after amplification using degenerate L1 primers. Then, is the second part, we present PVAmpliconFinder, a data analysis workflow designed to rapidly identify and classify known and potentially new Papillomaviridae sequences from NGS amplicon sequencing with degenerate PV primers. This thesis describes the features of PVAmpliconFinder and presents several applications using biological data obtained from amplicon sequencing of human specimens, leading to the identification of new HPV types

Le développement embryonnaire des membres est un processus complexe dont le mécanisme reste à ce jour imparfaitement connu. Ses anomalies sont des entités très hétérogènes et individuellement rares, mais touchent plus de 1/500 nouveau-nés et une proportion plus élevée de foetus. Elles représentent donc un véritable problème de santé publique, d’où l’importance d’un diagnostic précis. Il peut s’agir d’anomalies uniques ou multiples, isolées ou syndromiques, sporadiques ou familiales. L’étude de larges cohortes de patients porteurs de malformations des membres est un excellent outil qui permet d’identifier des gènes ou éléments régulateurs impliqués dans leur pathologie et par conséquent dans le développement du membre. Dans la majorité des cas, l’événement génétique responsable est une mutation ponctuelle située dans des gènes codant des facteurs de transcription ou dans des régulateurs transcriptionnels. Cependant, des variations du nombre de copies peuvent être également impliquées. Actuellement, de nouvelles technologies d’étude du génome, allant du séquençage haut débit d’un panel de gènes cibles, au séquençage de l’exome complet voire du génome, peuvent permettre d’identifier ces nouvelles cibles. C’est donc grâce à l’apport de ces avancées technologiques que nous avons souhaité étudier le déterminisme moléculaire du développement des membres. Pour ce faire nous avons analysé une très large cohorte de 684 patients, tous porteurs d’une malformation des extrémités, via différents panels de gènes, plus ou moins larges, voire via l’analyse d’exome complet ou d’une CGH pangénomique enrichie. Les résultats de ce travail nous ont permis, d’une part, d’établir un panel de gènes, adapté au laboratoire d’analyse moléculaire, dont l’analyse bioinformatique et le coût sont optimisés, permettant d’identifier les SNVs mais également les CNVs en une seule technique. D’autre part, d’identifier 5 gènes peu ou non décrits en pathologie humaine mais dont le rôle dans le développement des membres semble plus que probable et dont des analyses fonctionnelles, prometteuses, ont débuté pour l’un d’entre eux
Limbs development is a complex process of which mecanism is today only partially known. Embryological development abnormalities of genetic origins are rare entities. Such abnormalities can be unique or multiple, single or syndromic, sporadic or of family origins.The study of large cohorts of patients carrier of limb extremities malformations is an excellent tool that allows an identification of the genes or regulatory elements involved in their pathology and consenquently, in the development of the limb. In most of the cases, the genetic event involved is a point mutation in the genes coding transcriptionnal factor or regulatory sequence. However, variations in the number of copies are also involved.Today, new technologies of genome study, from high through put sequencing of a target genes panel to a whole exome or genome sequencing, can allow an identification of these new targets. It is thank to these technological advances that we decided to study the moleculary determinism of limbs development. To do so, we analyzed a very large cohort of 684 patients, all carriers of a limb malformation, through different genes panels, of different sizes, but also through a whole exome analysis and a pangenomic CGH array.The results of this work allowed us, in the first part, to establish a genes panel, suitable to a molecular analysis laboratory, to the bioinformatic analysis with an optimized cost, and that can identify the SNVs but also the CNVs in only one analysis.On a second part, we managed to identify 5 genes, not yet described in human pathology, which seemed to have a role in limb development. For one of these genes a promising functional analysis has started

Le cancer résulte de la prolifération excessive de cellules qui dérivent toutes de la même cellule initiatrice et suivent un processus Darwinien de diversification et de sélection. Ce processus est défini par l'accumulation d'altérations génétiques et épigénétiques dont la caractérisation est un élément majeur pour pouvoir proposer une thérapie ciblant spécifiquement les cellules tumorales. L'avènement des nouvelles technologies de séquençage haut débit permet cette caractérisation à un niveau moléculaire. Cette révolution technologique a entraîné le développement de nombreuses méthodes bioinformatiques. Dans cette thèse, nous nous intéressons particulièrement au développement de nouvelles méthodes computationnelles d'analyse de données de séquençage d'échantillons tumoraux permettant une identification précise d'altérations spécifiques aux tumeurs et une description fine des sous populations tumorales. Dans le premier chapitre, il s'agît d'étudier des méthodes d'identification d'altérations ponctuelles dans le cadre de séquençage ciblé, appliquées à une cohorte de patientes atteintes du cancer du sein. Nous décrivons deux nouvelles méthodes d'analyse, chacune adaptée à une technologie de séquençage, spécifiquement Roche 454 et Pacifique Biosciences.Dans le premier cas, nous avons adapté des approches existantes au cas particulier de séquences de transcrits. Dans le second cas, nous avons été confronté à un bruit de fond élevé entraînant un fort taux de faux positifs lors de l'utilisation d'approches classiques. Nous avons développé une nouvelle méthode, MICADo, basée sur les graphes de De Bruijn et permettant une distinction efficace entre les altérations spécifiques aux patients et les altérations communes à la cohorte, ce qui rend les résultats exploitables dans un contexte clinique. Le second chapitre aborde l'identification d'altérations de nombre de copies. Nous décrivons l'approche mise en place pour leur identification efficace à partir de données de très faible couverture. L'apport principal de ce travail consiste en l'élaboration d'une stratégie d'analyse statistique afin de mettre en évidence des changements locaux et globaux au niveau du génome survenus durant le traitement administré à des patientes atteintes de cancer du sein. Notre méthode repose sur la construction d'un modèle linéaire permettant d'établir des scores de différences entre les échantillons avant et après traitement. Dans le troisième chapitre, nous nous intéressons au problème de reconstruction clonale. Cette problématique récente est actuellement en plein essor, mais manque cependant d'un cadre formel bien établi. Nous proposons d'abord une formalisation du problème de reconstruction clonale. Ensuite nous utilisons ce formalisme afin de mettre en place une méthode basée sur les modèles de mélanges Gaussiens. Cette méthode utilise les altérations ponctuelles et de nombre de copies - comme celles abordées dans les deux chapitres précédents - afin de caractériser et quantifier les différentes populations clonales présentes dans un échantillon tumoral
Cancer results from the excessive proliferation of cells decending from the same founder cell and following a Darwinian process of diversification and selection. This process is defined by the accumulation of genetic and epigenetic alterations whose characterization is a key element for establishing a therapy that would specifically target tumor cells. The advent of new high-throughput sequencing technologies enables this characterization at the molecular level. This technological revolution has led to the development of numerous bioinformatics methods. In this thesis, we are particularly interested in the development of new computational methods for the analysis of sequencing data of tumor samples allowing precise identification of tumor-specific alterations and an accurate description of tumor subpopulations. In the first chapter, we explore methods for identifying single nucleotide alterations in targeted sequencing data and apply them to a cohort of breast cancer patients. We introduce two new methods of analysis, each tailored to a particular sequencing technology, namely Roche 454 and Pacific Biosciences. In the first case, we adapted existing approaches to the particular case of transcript sequencing. In the second case, when using conventional approaches, we were confronted with a high background noise resulting in a high rate of false positives. We have developed a new method, MICADo, based on the De Bruijn graphs and making possible an effective distinction between patient-specific alterations and alterations common to the cohort, which makes the results usable in a clinical context. Second chapter deals with the identification of copy number alterations. We describe the approach put in place for their efficient identification from very low coverage data. The main contribution of this work is the development of a strategy for statistical analysis in order to emphasise local and global changes in the genome that occurred during the treatment administered to patients with breast cancer. Our method is based on the construction of a linear model to establish scores of differences between samples before and after treatment. In the third chapter, we focus on the problem of clonal reconstruction. This problem has recently gathered a lot of interest, but it still lacks a well-established formal framework. We first propose a formalization of the clonal reconstruction problem. Then we use this formalism to put in place a method based on Gaussian mixture models. Our method uses single nucleotide and copy number alterations - such as those discussed in the previous two chapters - to characterize and quantify different clonal populations present in a tumor sample

L'infection par le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) reste un problème majeur de santé publique à l'échelle mondiale, avec environ 37,7 millions de personnes vivant avec le virus et de nouvelles contaminations dépassant le million de cas par an. Des antirétroviraux efficaces permettent maintenant de traiter durablement les personnes infectées. Ces thérapies contribuent également à améliorer la prévention et à ralentir la progression de l'épidémie. Cependant, un vaccin reste nécessaire, en particulier pour contrôler l'épidémie dans les régions à faible revenu et les environnements précaires.Le rôle protecteur des anticorps neutralisants (AcN) a été démontré sans équivoque dans les modèles animaux d'infection par le VIH et chez l'homme. Par conséquent, le développement d'un vaccin visant à la production, par les cellules B, d'anticorps (Ac) capables de neutraliser la majorité des virus en circulation, à savoir des AcN à large spectre (AcNLS), pourrait être envisagé comme une réponse à la pandémie de VIH.L'étude du développement des AcNLS chez certains individus, dénommés neutraliseurs d’élite du VIH-1, fournit des informations précieuses pour la conception de tels vaccins. Jusqu'à présent, la plupart des études entreprises se sont appuyées sur le tri conventionnel de cellules B uniques par cytométrie en flux (FACS) pour isoler les AcNLS. Dans la présente étude, nous avons utilisé l'approche "Chromium Single Cell Immune Profiling" à haut débit sur cellules uniques (scRNA-seq) pour réaliser une exploration longitudinale du répertoire des cellules B chez un neutraliseur d'élite du VIH-1. Cette méthode permet d'utiliser comme appâts pour l'identification des cellules B spécifiques un nombre beaucoup plus important de glycoprotéines d’enveloppe (Env) du VIH par rapport aux approches d'isolement d'Ac basées sur le FACS, ce qui permet d'obtenir une analyse plus complète du répertoire en Ac anti-Env. En outre, cette approche fournit une multitude d'informations sur la nature des Ac spécifiques identifiés et sur les cellules B correspondantes.Notre étude a permis d'identifier la séquence de 12 130 anticorps spécifiques de la protéine Env du VIH. Des Ac de 39 lignées ont été produits et testés pour leurs capacités de neutralisation, révélant 21 lignées neutralisantes. Ces résultats démontrent la capacité de la méthode à explorer de vastes répertoires spécifiques d'antigènes à partir d'échantillons longitudinaux. L'activité neutralisante des Ac de quatre lignées récapitulait l'activité sérique du donneur, permettant de neutraliser 62,4 % d'un large panel prédictif de 126 pseudovirus. Une de ces lignées neutralisantes ciblait la région riche en mannose de la gp120. Par ailleurs, les Ac de cette lignée étaient sensibles à la présence d'un glycane en position N332. Un seul de ces Ac était responsable de la plus grande partie de cette neutralisation (51,1 %) avec une activité à faible concentration (IC50 moyenne de 91,1 ng.mL-1). Cet Ac possède un CDRH3 de 23 AA de long et 20 % d'hypermutation somatique (SMH). La lignée a montré une maturation continue sur 6,5 ans, avec des taux de SMH observés de 2,0 % à 30,6 % pour la chaîne lourde, sans insertion ou délétion.Un tri conventionnel basé sur la méthode FACS avait été utilisé précédemment pour isoler des AcNLS du même donneur. En comparaison, l'approche scRNA-seq a permis d'isoler des Ac en nombre bien supérieur. En outre, les AcN nouvellement isolés étaient globalement plus neutralisants et de plus large spectre que ceux isolés précédemment, ce qui indique la supériorité de la nouvelle méthode pour l'identification de lignées neutralisantes. Les études structurales en cours permettront d'élucider les épitopes responsables de la neutralisation observée chez ce donneur. L'ensemble de ces résultats pourrait contribuer à la conception d'approches de "vaccinologie inverse", qui représentent à l'heure actuelle un espoir pour la mise au point d'un vaccin contre le VIH
Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) infection remains a major global health concern, with an estimated 37.7 million people living with the virus worldwide and new contaminations above a million cases yearly. Efficient anti-retroviral therapies are available, allowing a sustained relief for infected individuals. These therapeutics have also contributed to a better prevention and helped curb the epidemic, notably in high-income countries. However, a vaccine is still highly awaited for controlling this epidemic, especially in lower-income regions and precarious settings.The protective role of neutralizing antibodies (NAbs) has been unequivocally demonstrated in both animal models of HIV infection and in human settings. Consequently, the development of a B-cell-based vaccine capable of eliciting antibodies (Abs) with the ability to neutralize the majority of circulating viruses, namely broadly NAbs (bNAbs), could be foreseen as an answer to the HIV pandemic.The investigation of bNAb development in HIV-1 elite neutralizers provides valuable insights to inform the design of such vaccines. To date, most of the undertaken studies have relied on conventional single B-cell FACS sorting to isolate bNAbs. In the present study, we have used the Chromium Single Cell Immune Profiling approach to conduct a high-throughput longitudinal single-cell exploration of the B-cell repertoire in an HIV-1 elite neutralizer. Importantly, this novel method enables the use of a much greater number of HIV envelope glycoprotein (Env) baits compared to regular FACS-based Ab isolation studies, providing a more comprehensive view of the anti-Env Ab repertoire. In addition, this approach yields a wealth of information on the nature of the specific Abs identified and the corresponding B-cells.The study enabled the uncovering of the sequence of 12,130 putative HIV Env specific Abs. Antibodies from 39 lineages were produced and tested for neutralization, revealing 21 distinct neutralizing lineages. The results thus demonstrated the ability of the method to explore large antigen-specific Ab repertoires from longitudinal samples. The neutralizing activity of Abs from four neutralizing lineages together recapitulated the serum activity of the donor, achieving neutralization against 62.4 % of a large predictive panel of 126 pseudoviruses. One of these neutralizing Ab lineages was shown to target the gp120 high-mannose patch supersite with great breadth and potency; Abs from this lineage were sensitive to the presence of a glycan in position N332. A single of those Abs achieved most of the neutralization breadth (51.1 %) with a high potency (mean IC50 of 91.1 ng.mL-1). This Ab exhibited a 23 AA-long CDRH3 and 20 % somatic hypermutation (SMH). The lineage showed continuous evolution over 6.5 years of maturation, with observed SHM rates ranging from 2.0 % to 30.6 % for the heavy chain, without any insertions or deletions.Conventional FACS-based sorting was previously used to isolate bNAbs from the same donor. In comparison, the single cell high-throughput approach made possible the isolation of orders of magnitude more Abs. Furthermore, the newly isolated NAbs were overall more potent and broader than those isolated previously, indicating the superiority of the novel method in recovering neutralizing lineages. Ongoing structural studies will elucidate the epitopes responsible for the broad neutralization observed in this donor. Together, the findings may help the design of reverse vaccine approaches, which show promise in the development of an effective AIDS vaccine