Academic literature on the topic 'SAMDH1'

Les VIH-1 et VIH-2, lentivirus responsables du SIDA, sont issus de transmissions inter-espèces de virus simiens (SIV) à l'homme. Outre leurs protéines de structure et de régulation, les lentivirus codent pour des protéines auxiliaires qui favorisent la réplication virale dans la cellule hôte en contrecarrant des facteurs cellulaires antiviraux, appelés facteurs de restriction. Le mécanisme d'action de ces protéines virales auxiliaires repose souvent sur le détournement de complexes Ubiquitine-Ligases, un mécanisme très répandu chez une grande variété de pathogènes, en vue de dégrader des protéines de la cellule hôte. Ce mécanisme est utilisé par la protéine Vpx, exprimée uniquement par VIH-2 (et non par VIH-1), qui induit la dégradation de SAMDH1, un facteur de restriction bloquant l'étape de transcription inverse. Ainsi, Vpx fait un pont moléculaire entre l'adaptateur DCAF1 du complexe Ubiquitine-Ligase Cul4A-DDB1(DCAF1) et SAMHD1, ce qui entraîne l'ubiquitination et la dégradation de SAMHD1. En 2018, notre équipe a montré que Vpx induisait la dégradation d'un facteur cellulaire supplémentaire : le complexe HUSH, composé de TASOR, MPP8 et Périphiline. Ce complexe intervient dans la répression épigénétique non seulement de nombreux gènes cellulaires, d'éléments rétro-transposables et de rétrovirus endogènes, mais aussi du génome du VIH intégré dans celui de la cellule infectée. En dégradant HUSH, Vpx favorise l'expression virale. Dans ce contexte, les objectifs de ma thèse ont été de : (i) Déterminer si le mécanisme de dégradation de HUSH induit par Vpx de VIH2 était identique au mécanisme de dégradation de SAMHD1. J'ai pu mettre en évidence des différences importantes entre les deux mécanismes bien que Vpx utilise, dans les deux cas, le même adaptateur d'Ubiquitine-Ligase, DCAF1 (coeur principal du travail de thèse, article soumis). (ii) Caractériser les déterminants moléculaires en jeu dans l'antagonisme de HUSH par d'autres protéines lentivirales. Premièrement, il s'agissait de savoir si les différentes protéines virales apparentées à Vpx chez différentes espèces de virus simiens avaient toutes la même capacité à dégrader le complexe HUSH. Nous avons ainsi pu mettre en évidence une spécificité lentivirale de l'antagonisme du complexe HUSH, une caractéristique majeure des facteurs de restriction (contribution à l'article Chougui et al., Nature microbiology, 2018). Dans un second temps, ceci m'a conduit à débuter l'étude des déterminants viraux de ces protéines apparentées à Vpx, telles les protéines Vpr de différentes souches de SIVagm (infectant le singe vert africain) qui présentent des phénotypes différents quant à la dégradation de SAMHD1 ou de HUSH (travail en cours). L'ensemble des résultats a permis, d'une part de mieux caractériser le mécanisme d'antagonisme de HUSH par les protéines lentivirales Vpx/Vpr, et d'autre part de fournir de premiers outils moléculaires pour différencier l'antagonisme de HUSH de celui de SAMHD1 dans les cellules primaires. Dans le futur, les données pourront aider à mieux comprendre comment diverses protéines lentivirales se sont adaptées à leurs différents substrats cellulaires (et vice-versa) au cours de l'évolution. Enfin, cibler HUSH grâce à l'identification de déterminant d'interaction ou de dégradation pourrait être intéressant pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques<br>HIV-1 and HIV-2, lentiviruses responsible for AIDS, appeared in humans after cross-species transmissions from simian viruses (SIV). In addition to their structural and regulatory proteins, lentiviruses encode auxiliary proteins that promote viral replication in the host cell by counteracting antiviral cellular factors, called restriction factors. The mechanism of action of these viral auxiliary proteins often relies on the hijacking of Ubiquitin-Ligase complexes, a mechanism widely used by various pathogens, to degrade host cell proteins. This mechanism is used by the Vpx protein, expressed only by HIV-2 (and not by HIV-1), which induces the degradation of SAMDH1, a restriction factor blocking the reverse transcription step. Thus, Vpx molecularly bridges the DCAF1 adaptor of the Cul4A-DDB1(DCAF1) Ubiquitin-Ligase complex with SAMHD1, resulting in ubiquitination and degradation of SAMHD1. In 2018, our team showed that Vpx induces the degradation of an additional cellular factor: the HUSH complex, composed of TASOR, MPP8 and Periphilin. This complex is involved in the epigenetic repression not only of many cellular genes, retro-transposable elements and endogenous retroviruses, but also of the HIV genome integrated into the infected cell. By degrading HUSH, Vpx promotes viral expression. In this context, the objectives of my thesis were to: (i) Determine whether HUSH degradation mechanism induced by HIV-2 Vpx was identical to SAMHD1 degradation mechanism. I was able to highlight important differences between the two mechanisms although Vpx uses, in both cases, the same Ubiquitin-Ligase adaptor, DCAF1 (main focus of the thesis work, submitted article). (ii) Characterize the molecular determinants involved in the antagonism of HUSH by other lentiviral proteins. First, we wanted to know if different Vpx-related viral proteins, in various simian virus species, had the same capacity to degrade the HUSH complex. This allowed us to reveal a lentiviral species-specificity of HUSH complex antagonism, a major characteristic of restriction factors (contribution to Chougui et al., Nature microbiology, 2018). Secondly, this led me to start studying the viral determinants of these Vpx-related proteins, such as the Vpr proteins from different strains of SIVagm (infecting the African green monkey) that present different phenotypes regarding both SAMHD1 or HUSH degradation (work in progress). All the results allowed us to better characterize the mechanism of HUSH antagonism by Vpx/Vpr lentiviral proteins, and to provide the first molecular tools to differentiate HUSH antagonism from SAMHD1 antagonism in primary cells. In the future, these data may help to better understand how various lentiviral proteins have adapted to their different cellular substrates (and vice versa) along evolution. Finally, targeting HUSH through the identification of interaction or degradation determinants could be interesting for the development of new therapeutic targets

La mise en évidence du rôle de la molécule SAMHD1 dans l’infection par le VIH-1 en tant que facteur de restriction a ouvert de nouvelles perspectives dans la compréhension de la pathogénicité du virus.En effet, il a été clairement démontré que dans les cellules myéloïdes comme les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques ainsi que les lymphocytes T CD4+ quiescents, SAMHD1 jouait un rôle important dans la protection de ces cellules de l’infection. En revanche, le rôle de cette molécule dans l’infection des lymphocytes activés, qui sont souvent la cible préférentielle du virus, n’est pas élucidé.Nos résultats ont révélé l'existence d'une sous-population de lymphocytes T CD4+ mémoires exprimant de faibles niveaux de SAMHD1 (CD4+ CD45RO+ SAMHD1low), tandis que la grande majorité des lymphocytes expriment cette molécule à des niveaux plus élevés (94±0.7%). Nous montrons également que ces cellules sont hautement différenciées, qu’elles expriment en larges proportions le marqueur de cycle cellulaire Ki67 et qu’elles sont enrichies en cellules « T helper 17 » (Th17) dans le sang périphérique.De plus, la fréquence de la population CD4+ CD45RO+ SAMHD1low, est diminuée de manière significative chez les patients infectés par le VIH-1 par rapport aux sujets sains. De manière intéressante, nous montrons que dans les ganglions, les cellules T follicular helper (Tfh) expriment faiblement SAMHD1 et sont plus susceptibles à l’infection par le VIH-1 in vitro.L’ensemble de ces résultats suggère que les cellules SAMHD1 low représentent une cible préférentielle pour le virus et pourraient contribuer au réservoir viral.Les objectifs de ce projet sont:1. Déterminer si les cellules SAMHD1low contiennent plus de virus par comparaison aux cellules mémoires SAMHD1high et comparer les séquences virales isolées des cellules mémoires SAMHD1low et SAMHD1high.2. Caractérisation des cellules SAMHD1low au niveau moléculaire par une analyse transcriptomique qui permettra la mise en évidence de marqueurs membranaires<br>We have previously reported the presence of memory CD4+ T cells that display low levels of SAMHD1 (SAMHD1low ) enriched in Th17 and Tfh cells. Here we investigated gene expression profile and the size and composition of HIV DNA population in SAMHD1 low cells.A total of 36 individuals on c-ART (median: 7y) with median CD4+ counts and nadir of 549 cells/ul and 210 cells/ul respectively, including 6 elite controllers (EC, CD4+: 900 cells/ul) and 8 healthy donors were studied. Blood memory CD4+ CD45RO+ SAMHD1low, CD45RO+ SAMHD1high and naive CD45RO- SAMHD1high cells were sorted. Cell associated HIV-1 DNA levels were quantified (HIV DNA Cell, Biocentric) and ultra-deep-sequencing (UDS, 454/Roche) of partial env (C2/V3) HIV-1 DNA was performed. Gene expression profile on sorted cells was deternined with RNA-Sequencing (Illumina RNASeq technology). Levels of HIV-1 DNA were significantly higher in memory SAMHD1low cells compared to SAMHD1high cells (4.5 [3.1-6.2] vs 3.8 [2.9-5.7] log/10 6 cells, respectively, p=0.02) among c-ART individuals, while naïve CD45RO- SAMHD1high showed lower levels (3.1 [1.6-4.4]). EC exhibited low HIV-1 DNA level in both SAMHD1low and SAMHD1high (1.6 and 2.3 log/10 6 cells respectively p&gt;0.05). Naïve CD45RO - SAMHD1 high cells from EC showed lower DNA compared to naïve cells from c-ART pts (1.6 and 3.1 log/10 6 cells, respectively, p=0.01). Phylogenetic analyses revealed well-segregated HIV-DNA populations between subsets with significant compartmentalization between SAMHD1low and SAMHD1high cells in all but 2 participants (p&lt;0.001) and limited viral exchange. Moreover SAMHD1low cells exhibited a distinct gene profile as compared to SAMHD1high allowing thus further characterisation of these cells.This pilot study revealed distinct HIV DNA populations in size and composition associated with unique genes profile in memory SAMHD1low cells. We show that memory SAMHD1low cells exhibit distinct genes profile which segregates them from the SAMHD1 high counterpart, and contain the highest level of HIV-1 DNA. We reveal distinct/well-segregated HIV-1 DNA populations in both subsets, suggesting minimal viral exchange

Aicardi-Goutières Syndrome (AGS) is a rare encephalopathy which mimics a viral intrauterine infection and is characterized by calcifications of the basal ganglia, cerebral atrophy and IFN-a in the cerebrospinal fluid. AGS is a heterogenic disease associated with mutations in the gene of the exonuclease TREX1, in any of the genes codifying for the ribonuclease H2, in the phosphohydrolase SAMHD1, in the deaminase ADAR1 or in the cytoplasmic sensor MDA5. The knowledge of these functions is basic for the comprehension of the beginning of the pathogenesis of AGS. In this thesis we focused in the mechanism of Samhd1 transcription. We have seen that Samhd1 is induced by pro-inflammatory stimuli but neither by anti-inflammatory stimuli nor TNF-a, and that the induction of Samhd1 is through STAT1 pathway. We wanted to know a bit more about Samhd1 induction so we focused on the study of its promoter. We did a construct in a luciferase-reporter vector with 1500bp of Samhd1 promoter, and we saw that this region of the promoter is enough to induce luciferase expression. From this construct, we did new plasmids and when deleting a specific region, the luciferase expression was abolished, indicating that in Samhd1 promoter, 161bp are critical for Samhd1 induction. EMSA assays showed that Samhd1 expression is repressed in basal conditions by an unknown protein, and ChIP assays also showed that IRF1 is involved in Samhd1 induction by IFN-.. We hypothesized that the regulation mechanism is depending in an STAT1-depending pathway, through IRF1, and also in an STAT1-independing pathway, through an unknown mechanism up to date. We checked with proteomics analysis the protein which might be involved in Samhd1 repression but the results were not significant. We also constructed a conditional KO mouse for TREX1, and now we are crossing it with different CRE­Socs2 expressing strands. Homozygous KO expressing CRElitter, show a similar phenotype to TREX1 total KO. We are in the process to obtain homozygous KO expressing CRELysM, but due to problems with the penetrance of this CRE allele we have some difficulties. All together, the results of this thesis will shed light in the inner operation of AGS.<br>La síndrome d'Aicardi-Goutières (AGS), és una malaltia autoimmunitària recessiva que mimetitza una infecció vírica intrauterina, i la qual és caracteritzada per calcificacions intracranials, atròfia cerebral i augment d'IFN-alfa al líquid cefaloraquidi. L'AGS és una malaltia genètica heterogènia associada amb mutacions al gen que codifica per a l'exonucleasa TREX1, a qualsevol dels gens codificants per a les components de la ribonucleasa RNASE H2, a la fosfo­hidrolasa SAMHD1, a la deaminasa ADAR1 o al sensor citoplasmàtic MDA5. El coneixement d'aquestes funcions és fonamental per tal d'entendre la patogènesi de l'AGS. En aquesta tesi s'ha aprofundit en el coneixement del mecanisme regulador de la transcripció de Samhd1. Hem vist que Samhd1 es troba expressat en diferents òrgans sense necessitat de cap estímul previ, com el pàncrees, l’intestí prim i els macròfags derivats de moll d’os, i en diferents quantitats en altres òrgans de ratolí. Donada la important afectació que té l’AGS al cervell, també es va analitzar la seva expressió en neurones i cèl·lules de la micròglia. També hem vist que Samhd1 es troba induït en presència de citocines proinflamatòries, però no es troba afectada la seva expressió en presència de citocines antiinflamatòries així com tampoc en presència de TNF-gamma. Utilitzant macròfags derivats de ratolins deficients en STAT1, hem pogut demostrar que l’expressió de Samhd1 per IFN-alfa és a través d’STAT1, ja que la seva expressió es troba completament reprimida en aquestes cèl·lules. Ens vam centrar en la inducció de Samhd1 i per la seva comprensió vam focalitzar en l’estudi del seu promotor. Es van clonar 1500 parells de bases del promotor de Samhd1 en un plasmidi reporter de luciferasa, i es va veure que aquest fragment era suficient per induir l’expressió de luciferasa. A partir d’aquest constructe, es van realitzar llavors noves construccions delecionant cada vegada una regió del promotor. Es va veure que en delecionar una regió específica de 161pb, l’expressió de luciferasa es trobava completament reprimida, indicant que aquesta regió del promotor és crítica per a la inducció de Samhd1. Experiments de retard en gel (EMSA) van mostrar que Samhd1 es troba reprimit en condicions basals per una proteïna que no hem arribat a caracteritzar, i experiments de precipitació de cromatina (ChIP) van mostrar que IRF1 es troba involucrada en la inducció de Samhd1 per IFN-alfa. La nostra hipòtesi doncs, és que l’expressió de Samhd1 té un mecanisme de regulació doble: en condicions basals es troba reprimit i en presència d’IFN-alfa s’indueix una via de senyalització independent d’STAT1 que fa saltar el complex repressor del promotor, i també s’indueix una via de senyalització dependent d’STAT1, que indueix l’expressió d’IRF1 i que activa la transducció de Samhd1. Fins ara no hem caracteritzat la proteïna o complex de proteïnes que reprimeix l’expressió de Samhd1 en condicions basals, però s’està investigant mitjançant anàlisis proteòmics. En aquesta tesi també s’ha fet la construcció d’un ratolí KO condicional per a TREX1. Una vegada aconseguit aquest animal condicional, el qual conté el gen de Trex1 flanquejat per dues dianes LoxP, aquest s’està encreuant amb diferents soques que expressen CRE sota regulació de diferents Socs2 promotors. Els ratolins homozigots KO i que expressen CRE, tenen un fenotip similar al fenotip que mostren els ratolins KO totals de TREX1. Estem en el procés d’obtenció de ratolins homozigots KO i que expressen CRELysM però, donat a problemes amb la penetrància d’aquest al·lel, hem tingut algunes dificultats. Els resultats d’aquesta tesi en conjunt poden ajudar a entendre una mica més el funcionament de l'AGS.

Les syndromes d’insuffisance médullaire sont liés à des mutations constitutionnelles à l’origine d’une hématopoïèse déficiente chez les patients atteints. Ils représentent un groupe hétérogène de maladies syndromiques, et impliquent plusieurs familles de gènes avec des mécanismes biologiques différents conduisant à l’insuffisance médullaire. Ces maladies prédisposent à une évolution clonale somatique, avec un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique (SMD) ou une leucémie aigüe myéloïde (LAM) au cours du temps. Nous avons séquencé et analysé l’exome d’ADN fibroblastique d’une cohorte de 179 patients ayant des insuffisances médullaires, des SMD ou des LAM, supposés d’origine constitutionnelle mais sans diagnostic établi. Ce travail a permis de porter un diagnostic moléculaire chez 86 (48%) patients, et de participer à la description de nouveaux syndromes impliquant les gènes SAMD9/SAMD9L (N=16/86, 18,6%), MECOM/EVI1 (N=6, 7%) et ERCC6L2 (N=7, 8,1%). Le suivi longitudinal des patients nous a permis de décrire un modèle d’évolution clonale particulier chez les patients ayant des mutations SAMD9/SAMD9L. Le syndrome d’insuffisance médullaire le plus fréquent est la maladie de Fanconi (AF ou FA), causée par une mutation germinale dans un des gènes de la voie de réparation FA/BRCA. Les cellules des patients FA ont une instabilité chromosomique liée à un défaut de réparation, avec une pression de sélection conduisant à une évolution clonale prototypique. Nous avons étudié une cohorte de 335 patients FA et confirmé de façon statistiquement significative l’ordre d’apparition des évènements cytogénétiques de ces patients au cours de l’évolution clonale et de la leucémogenèse : 1q+, 3q+, -7/del7q, délétion ou mutation RUNX1. L’étude moléculaire longitudinale des patients (NGS panel, WES, WGS) a confirmé un mécanisme oncogénique en rapport avec une instabilité chromosomique plus que génomique. En nous intéressant à l’anomalie cytogénétique la plus fréquente et la plus précoce : le 1q+, nous avons observé que le point de cassure péricentromérique sur ce chromosome correspondait à un site fragile, réparé ensuite par une voie de réparation alt NHEJ. La zone minimale dupliquée contenait le gène MDM4, un inhibiteur des fonctions transactivatrices de p53, qui constituait ainsi un bon candidat pour conférer aux cellules un avantage clonal et initier la leucémogenèse. Nous avons d’abord confirmé que les cellules des patients 1q+ avaient une surexpression de MDM4 et une inactivation de la voie p53 en aval (RNAseq). Puis, nous avons montré que cette surexpression permettait de restaurer les capacités fonctionnelles des progéniteurs hématopoïétiques humains FA, de façon réversible avec l’inhibition de MDM4, constituant ainsi une éventuelle cible thérapeutique. Les syndromes d’insuffisance médullaire sont des maladies rares, et nos travaux, en parallèle de ceux d’autres équipes, ont participé à la description de nouveaux gènes impliqués. L’étude de l’évolution clonale de ces syndromes représente une évolution dans la compréhension de la physiopathologie des SMD/LAM, et peut conduire à l’identification de cibles thérapeutiques chez ces patients<br>Inherited bone marrow failure (IBMF) syndromes are heterogeneous diseases related to germ line mutations causing deficient hematopoiesis in mutated patients. Mutations involve several families of genes with different biological pathways driving the bone marrow failure. Most germ line genetic BMF disorders are characterized by a high propensity to clonal evolution and to develop MDS or AML. We used a whole-exome sequencing (WES) comprehensive analysis on fibroblast DNA samples from 179 patients with BMF/MDS of unresolved inherited origin. We provided a molecular diagnosis for 86/179 BMF patients (48%) including several seldom-reported IBMF/MDS entities like SAMD9/SAMD9L, MECOM/EVI1, and ERCC6L2. In particular, we described a specific clonal evolution in patients having mutations in SAMD9 and SAMD9L.Fanconi anemia (FA) is the most common IBMF syndrome, caused by a germ line mutation in one gene of the FA pathway. DNA repair deficiency in patient’s FA cells leads to chromosomal instability, which sets the stage for clonal evolution with a specific pattern of chromosomal abnormalities. We used integrated clinical, next-generation genomic and functional studies on primary cells from a National cohort of 335 FA patients, including 98 with clonal evolution, to decipher the mechanisms of BM progression. While relatively few somatic point mutations were found, unbalanced translocations leading to gross chromosomal copy-number abnormalities were most prominent. Whole genome sequencing revealed an FA-specific signature in which microhomology-mediated end joining (MMEJ) or non homologous end joining (NHEJ) repair had mediated genome rearrangements, consistent with the constitutive homologous repair defect. Longitudinal studies confirmed the order of chromosomal events during FA patients oncogenesis: 1q+, 3q+, -7/del7q, del or RUNX1 mutations. A major initial step was duplication of chromosome 1q, resulting in strong expression of MDM4, a negative regulator of p53, which can be targeted by MDM4-inhibitors.IBMF are rare diseases and our study participated to describe new genetic and clinical entities. Studying the clonal evolution of IBMF syndromes can help to understand MDS and AML pathophysiology and lead to therapeutic target identification

L'étude des interactions entre un pathogène et son hôte, bien qu'ayant généralement pour objectif de contrôler l'infection par le pathogène, permet parfois de découvrir des éléments fondamentaux sur le fonctionnement de l'hôte. J'ai choisi d'étudier les fonctions cellulaires d'une protéine initialement identifiée comme un facteur de restriction du VIH-1. SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) est une protéine exprimée dans la plupart des tissus humains. Elle est capable d'hydrolyser les déoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) cellulaires et possède une activité nucléase ciblant différents acides nucléiques dont les ARN simple brin in vitro. Des mutations dans le gène SAMHD1 entraînent le développement d'une maladie auto-immune pouvant conduire à la mort précoce des nourrissons, ce qui suggère un rôle de la protéine correspondante dans la régulation de la réponse immunitaire. Il a été montré que SAMHD1 est un facteur de restriction capable d'empêcher l'infection de cellules ne se divisant pas par le VIH-1. La protéine virale Vpx, exprimée par le VIH-2, est capable d'induire la dégradation de SAMHD1 par le protéasome et permet de rendre permissives les cellules initialement résistantes à l'infection par le VIH. SAMHD1 est en réalité capable de restreindre l'infection par des virus aussi différents que les rétrovirus et le virus de l'herpès simplex 1. Néanmoins, le mécanisme permettant à SAMHD1 de contrecarrer différents virus reste aujourd'hui sujet à controverse. Initialement considéré comme agissant en dégradant les dNTP cellulaires, SAMHD1 semble également capable de dégrader l'ARN génomique du VIH-1. Si de nombreux travaux portent sur l'activité antivirale de SAMHD1, peu de données sont disponibles concernant la fonction cellulaire de cette protéine. Or SAMHD1 est capable de réguler la quantité de dNTP cellulaires et d'interagir avec certains acides nucléiques. Ces données font de SAMHD1 un acteur potentiel de différents processus cellulaires fondamentaux sensibles à la quantité intracellulaire de dNTP, notamment la réplication du génome ou la réparation des dommages à l'ADN. J'ai montré au cours de mon doctorat que SAMHD1 module le cycle cellulaire et notamment que la surexpression de cette protéine ralentit la prolifération cellulaire. J'ai également observé que la surexpression de SAMHD1 augmente la sensibilité des cellules aux agents induisant des ruptures double brin de l'ADN. De plus, j'ai découvert qu'en cas de ruptures double brin de l'ADN cellulaire, SAMHD1 est régulé de façon spécifique par phosphorylation sur sa thréonine 592 et est recruté aux sites de cassures. D'autres travaux ont confirmé l'importance de la régulation de SAMHD1 au cours du cycle cellulaire, sa surexpression et sa réduction induisant toutes deux un ralentissement de la prolifération cellulaire. En complément de mes résultats, quelques études suggèrent que SAMHD1 joue un rôle dans le maintien de l'intégrité du génome, qui pourrait être dû à son effet sur la réponse aux dommages à l'ADN. Dans l'ensemble, ces résultats font de SAMHD1 un garant de l'homéostasie cellulaire. J'ai de plus montré que l'expression de SAMHD1 est réduite chez environ 80% des patients souffrant de leucémie lymphoïde chronique. La perte de cette protéine est donc corrélée à l'apparition d'une maladie découlant de la perturbation du fonctionnement cellulaire. L'étude d'échantillons d'autres types de tumeurs montre que, dans de moindres proportions, l'altération de l'expression de SAMHD1 est une caractéristique générale des cancers. Mes travaux de doctorat soulignent ainsi le rôle fondamental de SAMHD1 dans le maintien de l'intégrité cellulaire<br>Understanding host pathogen interactions reveals not only important information regarding the replication cycle of the pathogen but it often leads to the discovery and better understanding of key biological processes of the host. The aim of my PhD was to decipher the cellular functions of the HIV-1 restriction factor SAMHD1. SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) is expressed in most human tissues. This protein is able to hydrolyze cellular deoxyribonucleotides triphosphate (dNTP) and possesses a nuclease activity primarily against single stranded RNA. Mutations in SAMHD1 have been described in patients suffering from an auto-immune disease causing premature death of newborns. This phenotype suggests a role of SAMHD1 in the control of immune response. Moreover, SAMHD1 restricts HIV-1 in non-cycling cells. The HIV-2 accessory protein Vpx induces SAMHD1 degradation by the proteasome, conferring cell permissiveness to HIV. In fact, the antiviral activity of SAMHD1 has been extended to other viruses including Herpes Simplex Virus 1 and Hepatitis B virus. Nevertheless, the mechanism by which SAMHD1 restrict HIV replication is debated. It was initially thought to act by depleting the dNTP pool but recent studies highlighted a potential role of SAMHD1 nuclease function in degrading HIV-1 genomic RNA. Many studies aiming at understanding the antiviral activity of SAMHD1 are being pursued, whereas little is known about the cellular function of this protein. The fact that SAMHD1 is able to regulate the cellular dNTP pool and to interact with nucleic acids suggests a key role of this protein in cellular processes, such as DNA replication and repair. During my PhD, I showed that SAMHD1 modulates the cell cycle, as the overexpression of this protein slows down cell proliferation. I also observed that SAMHD1 overexpression increases cellular sensitivity to double strand DNA breaks-inducing agents. Moreover I discovered that, after double strand breaks induction, SAMHD1 is specifically regulated by phosphorylation on its threonine 592 and recruited at the damaged sites. Other studies confirmed the importance of SAMHD1 regulation along the cell cycle as its overexpression and depletion both decrease cell proliferation. In addition to my observations, some studies suggested that SAMHD1 is important to maintain genomic integrity, presumably through its implication in DNA repair. Altogether, these results promote SAMHD1 as a key player in cellular homeostasis. I additionally showed that SAMHD1 expression is reduced in 80% of patients suffering from chronic lymphocytic leukemia (CLL). SAMHD1 loss is therefore correlated to the development of a disease due to disturbances of cellular integrity. Looking at samples from different types of tumors, I showed that SAMHD1 loss is shared between all tested cancers, although at lesser extent than in CLL. My PhD work underlines the central role of SAMHD1 to maintain cellular integrity

La phase S est une période critique du cycle cellulaire au cours de laquelle le génome est particulièrement vulnérable. La duplication efficace des génomes eucaryotes dépend de la progression de milliers de fourches de réplication. Les premières étapes de la tumorigenèse sont associées au stress de réplication spontané, caractérisé par un blocage de la fourche. Comprendre comment le stress de réplication survient dans les cellules normales et contribue à la tumorigenèse est un grand défi dans la recherche sur le cancer. Mon travail de thèse vise à comprendre la régulation de la progression de la fourche de réplication par deux protéines différentes,SAMHD1 et CTF18, qui participent à divers aspects du métabolisme de l'ADN.La duplication du génome dépend d'un approvisionnement équilibré de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP).Des pools de dNTP déséquilibrées augmentent les taux de mutation. SAMHD1 a été identifié comme une triphosphohydrolase de dNTPs. Cette enzyme est impliquée dans le syndrome d'Aicardi-Goutières. Récemment, il a été montré que SAMHD1 est impliquée dans la régulation des pools de dNTPs dans des cellules humaines. Cette protéine est exprimée au maximum pendant la quiescence et peu en phase S. Cependant, l'impact de SAMHD1 sur la réplication de l'ADN n'a pas encore été abordée. En utilisant la technique DNA fiber spreading, nous avons constaté que SAMHD1 module la vitesse de progression de la fourche. En plus de son activité de dNTPase, SAMHD1 contient un domaine putatif 3'-5 'exonucléase qui clive à la fois l'ADN et l'ARN in vitro. Un nombre croissant de preuves indique que les exonucléases 3'-5 'sont essentielles pour assurer la progression de la fourche et la fidélité de la réplication de l'ADN. Nous avons constaté que l'activité d'exonucléase de SAMHD1 favorise le backtracking des fourches arrêtées et qu'elle est requise pour la progression normale des fourches de réplication. Nous proposons que cette activité de backtracking est importante pour enlever désoxynucléotides ou ribonucléotides mal incorporés. Au-delà du cancer, notre découverte pourrait avoir des implications pour la compréhension du lien entre SAMHD1 et le syndrome d'Aicardi-Goutières. CTF18 fait partie d'un complexe de type RFC impliqué dans la cohésion des chromatides sœurs (CCS). Dans les cellules humaines, il a été suggéré que CTF18 contrôle la progression des fourches de réplication, en favorisant l'acétylation de la cohésine SMC3 à la fourche de réplication. Cependant, plusieurs résultats indiquent que la fonction de CTF18 n'est pas limitée à la mise en place de la CCS.En effet, notre groupe a montré que Ctf18 chez la levure est essentielle pour l'activation du checkpoint de la réplication, indépendamment de son rôle dans la CCS.Chez l'homme, CTF18 participe également au recrutement de PCNA, le facteur de processivité des ADN polymérases δ et ε. CTF18 interagit également avec la polymérase translésionnelle ƞ. Le but de mon travail était de caractériser le rôle de CTF18 lors de la réplication de l'ADN. En utilisant le peignage moléculaire, nous avons remarqué que la vitesse de la fourche de réplication est plus lente dans les cellules dépletés en CTF18 dans une phase S normale.Curieusement, l'augmentation de la vitesse de la fourche a été observée dans les cellules dépletés en CTF18 traités avec l'hydroxyurée (HU), qui ressemble au phénotype des cellules dépletés pour SAMHD1. Avec l'utilisation de la technique iPOND, nous avons observé une accumulation de PCNA aux fourches de réplication dans les cellules CTF18 traités avec HU. Nous avons également constaté que la déplétion de CTF18 induit une accumulation de yH2AX, ce qui suggère que CTF18 est nécessaire pour la stabilité du génome. Enfin, nous avons observé que la résection dépendante de SAMHD1 ne se produit pas en l'absence de CTF18. Collectivement, ces données indiquent que CTF18 agit en amont de SAMHD1 aux fourches arrêtées, probablement par le déchargement de PCNA<br>S phase is a critical period of the cell cycle during which the genome is particularly vulnerable. The efficient duplication of eukaryotic genomes depends on the unperturbed progression of thousands of replication forks.The early stages of tumorigenesis are associated with spontaneous replication stress, characterized with a blockage of fork progression. Understanding how replication stress arises in normal cells and contributes to tumorigenesis is a major challenge in cancer research.My thesis work aims at understanding the regulation of replication fork progression by two different proteins, SAMHD1 and CTF18, which have important roles in various aspects of DNA metabolism.Faithful duplication of the genome depends on a balanced supply of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs). Imbalanced dNTP pools decrease the fidelity of DNA polymerases and increase mutation rates. SAMHD1 was originally identified as a dNTP triphosphohydrolase. This enzyme is implicated in Aicardi-Goutières syndrome. It has also been identified as a component of the human innate immune system that restricts HIV-1 infection. Recently, SAMHD1 was shown to be involved in the regulation of dNTP pools in cultured human cells. This protein is maximally expressed during quiescence and minimally during S phase. However, the impact of SAMHD1 upon DNA replication has not been addressed. Using DNA fiber spreading, we found that SAMHD1 modulates the speed of fork progression. In addition to its dNTPase activity, SAMHD1 contains a putative 3'-5' exonuclease domain that cleaves both DNA and RNA in vitro. A growing body of evidence indicates that 3'-5' exonucleases are critical to ensure fork progression and the fidelity of DNA replication. Remarkably, we found that the exonuclease activity of SAMHD1 promotes backtracking at paused forks and is important for replication fork progression. We propose that this backtracking activity is important to remove miss-incorporated deoxynucleotides or ribonucleotides. Our finding may have implications for our understanding of the link between SAMHD1 and the Aicardi-Goutières syndrome.CTF18 is part of a RFC-like complex involved in sister chromatid cohesion (SCC). In human cells it has been suggested that CTF18 controls the progression of replication forks, presumably by promoting acetylation of the SMC3 cohesin at replication forks. However, several results indicate that the function of CTF18 is not restricted to the establishment of SCC. Indeed, our group has shown that the yeast Ctf18 is essential for activation of the replication checkpoint, independently of its role in SCC. In human, CTF18 also participates in the recruitment of PCNA, the processivity factor of DNA polymerases δ and ε. CTF18 also interacts with the translesion polymerase . The aim of my work was to characterize the role of CTF18 during DNA replication. Using DNA combing, we first noticed that replication fork speed is slower in CTF18-depleted cells under unperturbed conditions. Intriguingly, increased fork speed was observed in CTF18-depleted cells challenged with hydroxyurea (HU), which is reminiscent of the phenotype of SAMHD1-depleted cells. Using iPOND, we observed an accumulation of PCNA at replication forks in HU-treated CTF18-depleted cells. We also found that CTF18 depletion induces an accumulation of yH2AX, suggesting that CTF18 is required for genome stability. Finally, we observed that the resection mediated by SAMHD1 at paused forks does not occur in the absence of CTF18. Together, these data indicate that CTF18 acts upstream of SAMHD1 at stalled forks, presumably through the unloading of PCNA