Dissertations / Theses on the topic 'SAMD14'

Les syndromes d’insuffisance médullaire sont liés à des mutations constitutionnelles à l’origine d’une hématopoïèse déficiente chez les patients atteints. Ils représentent un groupe hétérogène de maladies syndromiques, et impliquent plusieurs familles de gènes avec des mécanismes biologiques différents conduisant à l’insuffisance médullaire. Ces maladies prédisposent à une évolution clonale somatique, avec un risque accru de développer un syndrome myélodysplasique (SMD) ou une leucémie aigüe myéloïde (LAM) au cours du temps. Nous avons séquencé et analysé l’exome d’ADN fibroblastique d’une cohorte de 179 patients ayant des insuffisances médullaires, des SMD ou des LAM, supposés d’origine constitutionnelle mais sans diagnostic établi. Ce travail a permis de porter un diagnostic moléculaire chez 86 (48%) patients, et de participer à la description de nouveaux syndromes impliquant les gènes SAMD9/SAMD9L (N=16/86, 18,6%), MECOM/EVI1 (N=6, 7%) et ERCC6L2 (N=7, 8,1%). Le suivi longitudinal des patients nous a permis de décrire un modèle d’évolution clonale particulier chez les patients ayant des mutations SAMD9/SAMD9L. Le syndrome d’insuffisance médullaire le plus fréquent est la maladie de Fanconi (AF ou FA), causée par une mutation germinale dans un des gènes de la voie de réparation FA/BRCA. Les cellules des patients FA ont une instabilité chromosomique liée à un défaut de réparation, avec une pression de sélection conduisant à une évolution clonale prototypique. Nous avons étudié une cohorte de 335 patients FA et confirmé de façon statistiquement significative l’ordre d’apparition des évènements cytogénétiques de ces patients au cours de l’évolution clonale et de la leucémogenèse : 1q+, 3q+, -7/del7q, délétion ou mutation RUNX1. L’étude moléculaire longitudinale des patients (NGS panel, WES, WGS) a confirmé un mécanisme oncogénique en rapport avec une instabilité chromosomique plus que génomique. En nous intéressant à l’anomalie cytogénétique la plus fréquente et la plus précoce : le 1q+, nous avons observé que le point de cassure péricentromérique sur ce chromosome correspondait à un site fragile, réparé ensuite par une voie de réparation alt NHEJ. La zone minimale dupliquée contenait le gène MDM4, un inhibiteur des fonctions transactivatrices de p53, qui constituait ainsi un bon candidat pour conférer aux cellules un avantage clonal et initier la leucémogenèse. Nous avons d’abord confirmé que les cellules des patients 1q+ avaient une surexpression de MDM4 et une inactivation de la voie p53 en aval (RNAseq). Puis, nous avons montré que cette surexpression permettait de restaurer les capacités fonctionnelles des progéniteurs hématopoïétiques humains FA, de façon réversible avec l’inhibition de MDM4, constituant ainsi une éventuelle cible thérapeutique. Les syndromes d’insuffisance médullaire sont des maladies rares, et nos travaux, en parallèle de ceux d’autres équipes, ont participé à la description de nouveaux gènes impliqués. L’étude de l’évolution clonale de ces syndromes représente une évolution dans la compréhension de la physiopathologie des SMD/LAM, et peut conduire à l’identification de cibles thérapeutiques chez ces patients<br>Inherited bone marrow failure (IBMF) syndromes are heterogeneous diseases related to germ line mutations causing deficient hematopoiesis in mutated patients. Mutations involve several families of genes with different biological pathways driving the bone marrow failure. Most germ line genetic BMF disorders are characterized by a high propensity to clonal evolution and to develop MDS or AML. We used a whole-exome sequencing (WES) comprehensive analysis on fibroblast DNA samples from 179 patients with BMF/MDS of unresolved inherited origin. We provided a molecular diagnosis for 86/179 BMF patients (48%) including several seldom-reported IBMF/MDS entities like SAMD9/SAMD9L, MECOM/EVI1, and ERCC6L2. In particular, we described a specific clonal evolution in patients having mutations in SAMD9 and SAMD9L.Fanconi anemia (FA) is the most common IBMF syndrome, caused by a germ line mutation in one gene of the FA pathway. DNA repair deficiency in patient’s FA cells leads to chromosomal instability, which sets the stage for clonal evolution with a specific pattern of chromosomal abnormalities. We used integrated clinical, next-generation genomic and functional studies on primary cells from a National cohort of 335 FA patients, including 98 with clonal evolution, to decipher the mechanisms of BM progression. While relatively few somatic point mutations were found, unbalanced translocations leading to gross chromosomal copy-number abnormalities were most prominent. Whole genome sequencing revealed an FA-specific signature in which microhomology-mediated end joining (MMEJ) or non homologous end joining (NHEJ) repair had mediated genome rearrangements, consistent with the constitutive homologous repair defect. Longitudinal studies confirmed the order of chromosomal events during FA patients oncogenesis: 1q+, 3q+, -7/del7q, del or RUNX1 mutations. A major initial step was duplication of chromosome 1q, resulting in strong expression of MDM4, a negative regulator of p53, which can be targeted by MDM4-inhibitors.IBMF are rare diseases and our study participated to describe new genetic and clinical entities. Studying the clonal evolution of IBMF syndromes can help to understand MDS and AML pathophysiology and lead to therapeutic target identification

La mise en évidence du rôle de la molécule SAMHD1 dans l’infection par le VIH-1 en tant que facteur de restriction a ouvert de nouvelles perspectives dans la compréhension de la pathogénicité du virus.En effet, il a été clairement démontré que dans les cellules myéloïdes comme les monocytes/macrophages et les cellules dendritiques ainsi que les lymphocytes T CD4+ quiescents, SAMHD1 jouait un rôle important dans la protection de ces cellules de l’infection. En revanche, le rôle de cette molécule dans l’infection des lymphocytes activés, qui sont souvent la cible préférentielle du virus, n’est pas élucidé.Nos résultats ont révélé l'existence d'une sous-population de lymphocytes T CD4+ mémoires exprimant de faibles niveaux de SAMHD1 (CD4+ CD45RO+ SAMHD1low), tandis que la grande majorité des lymphocytes expriment cette molécule à des niveaux plus élevés (94±0.7%). Nous montrons également que ces cellules sont hautement différenciées, qu’elles expriment en larges proportions le marqueur de cycle cellulaire Ki67 et qu’elles sont enrichies en cellules « T helper 17 » (Th17) dans le sang périphérique.De plus, la fréquence de la population CD4+ CD45RO+ SAMHD1low, est diminuée de manière significative chez les patients infectés par le VIH-1 par rapport aux sujets sains. De manière intéressante, nous montrons que dans les ganglions, les cellules T follicular helper (Tfh) expriment faiblement SAMHD1 et sont plus susceptibles à l’infection par le VIH-1 in vitro.L’ensemble de ces résultats suggère que les cellules SAMHD1 low représentent une cible préférentielle pour le virus et pourraient contribuer au réservoir viral.Les objectifs de ce projet sont:1. Déterminer si les cellules SAMHD1low contiennent plus de virus par comparaison aux cellules mémoires SAMHD1high et comparer les séquences virales isolées des cellules mémoires SAMHD1low et SAMHD1high.2. Caractérisation des cellules SAMHD1low au niveau moléculaire par une analyse transcriptomique qui permettra la mise en évidence de marqueurs membranaires<br>We have previously reported the presence of memory CD4+ T cells that display low levels of SAMHD1 (SAMHD1low ) enriched in Th17 and Tfh cells. Here we investigated gene expression profile and the size and composition of HIV DNA population in SAMHD1 low cells.A total of 36 individuals on c-ART (median: 7y) with median CD4+ counts and nadir of 549 cells/ul and 210 cells/ul respectively, including 6 elite controllers (EC, CD4+: 900 cells/ul) and 8 healthy donors were studied. Blood memory CD4+ CD45RO+ SAMHD1low, CD45RO+ SAMHD1high and naive CD45RO- SAMHD1high cells were sorted. Cell associated HIV-1 DNA levels were quantified (HIV DNA Cell, Biocentric) and ultra-deep-sequencing (UDS, 454/Roche) of partial env (C2/V3) HIV-1 DNA was performed. Gene expression profile on sorted cells was deternined with RNA-Sequencing (Illumina RNASeq technology). Levels of HIV-1 DNA were significantly higher in memory SAMHD1low cells compared to SAMHD1high cells (4.5 [3.1-6.2] vs 3.8 [2.9-5.7] log/10 6 cells, respectively, p=0.02) among c-ART individuals, while naïve CD45RO- SAMHD1high showed lower levels (3.1 [1.6-4.4]). EC exhibited low HIV-1 DNA level in both SAMHD1low and SAMHD1high (1.6 and 2.3 log/10 6 cells respectively p&gt;0.05). Naïve CD45RO - SAMHD1 high cells from EC showed lower DNA compared to naïve cells from c-ART pts (1.6 and 3.1 log/10 6 cells, respectively, p=0.01). Phylogenetic analyses revealed well-segregated HIV-DNA populations between subsets with significant compartmentalization between SAMHD1low and SAMHD1high cells in all but 2 participants (p&lt;0.001) and limited viral exchange. Moreover SAMHD1low cells exhibited a distinct gene profile as compared to SAMHD1high allowing thus further characterisation of these cells.This pilot study revealed distinct HIV DNA populations in size and composition associated with unique genes profile in memory SAMHD1low cells. We show that memory SAMHD1low cells exhibit distinct genes profile which segregates them from the SAMHD1 high counterpart, and contain the highest level of HIV-1 DNA. We reveal distinct/well-segregated HIV-1 DNA populations in both subsets, suggesting minimal viral exchange

Les protéines signal Hedgehog (HH) sont des acteurs majeurs du développement animal et de la carcinogenèse. Leur transduction requiert la protéine à 7 domaines transmembranaires Smoothened (SMO) dont l’activité est régulée par Patched (PTC), un récepteur et antagoniste d’HH. PTC et HH régulent le trafic, la phosphorylation et l’accumulation de SMO mais de nombreux aspects de sa régulation restent incompris. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur Smaug, un nouveau partenaire de SMO chez la drosophile identifié au laboratoire dans un crible double-hybride. Smaug est connue pour lier et réprimer de nombreux ARNm au cours de l’embryogenèse chez la mouche. Durant ma thèse j’ai étudié comment Smaug agit sur SMO et la voie HH et aussi comment elle est régulée par HH. J’ai montré que Smaug était un régulateur positif de la voie HH et ce très probablement via sa capacité à fixer des ARNm. J’ai également montré que SMO et Smaug colocalisaient dans des foci cytoplasmiques en absence de signal et que Smaug était relocalisée à la membrane plasmique avec SMO en réponse à HH. Enfin j’ai mis en évidence un effet de SMO et d’HH sur la phosphorylation de Smaug suggérant une potentielle régulation en retour sur l’activité de Smaug. Ce travail m’a permis de proposer à la fois un nouveau rôle de la protéine de liaison aux ARN Smaug dans un processus de signalisation cellulaire ainsi que l’implication jusqu’ici insoupçonnée, d’une possible régulation post-transcriptionnelle d’ARNm dans la voie HH<br>Hedgehog Proteins (HH) are major players of animal development and carcinogenesis. Their transduction requires the 7 transmembrane protein Smoothened (SMO) whose activity is regulated by Patched (PTC), the HH receptor and antagonist. PTC and HH regulates SMO trafficking, phosphorylation and accumulation but numerous aspects of these regulations remain poorly understood. During my thesis, I focused on Smaug, a new partner of SMO in drosophila which was identified in the laboratory in a yeast two-hybrid screen. Smaug is known to bind and repress numerous mRNA during embryonic development in fly. I analyzed how it acts on SMO and HH signaling and also how is it regulated by HH. I have shown that Smaug is a positive regulator of the HH pathway and that it probably acts via its capacity to bind mRNA. I have also demonstrated that SMO and Smaug colocalise in cytoplasmic foci in absence of signal and that SMO is sufficient to localized Smaug to the plasma membrane in response to HH. Finally, I highlighted an effect of SMO and HH on the phosphorylation of Smaug suggesting the existence of a regulatory loop

Aicardi-Goutières Syndrome (AGS) is a rare encephalopathy which mimics a viral intrauterine infection and is characterized by calcifications of the basal ganglia, cerebral atrophy and IFN-a in the cerebrospinal fluid. AGS is a heterogenic disease associated with mutations in the gene of the exonuclease TREX1, in any of the genes codifying for the ribonuclease H2, in the phosphohydrolase SAMHD1, in the deaminase ADAR1 or in the cytoplasmic sensor MDA5. The knowledge of these functions is basic for the comprehension of the beginning of the pathogenesis of AGS. In this thesis we focused in the mechanism of Samhd1 transcription. We have seen that Samhd1 is induced by pro-inflammatory stimuli but neither by anti-inflammatory stimuli nor TNF-a, and that the induction of Samhd1 is through STAT1 pathway. We wanted to know a bit more about Samhd1 induction so we focused on the study of its promoter. We did a construct in a luciferase-reporter vector with 1500bp of Samhd1 promoter, and we saw that this region of the promoter is enough to induce luciferase expression. From this construct, we did new plasmids and when deleting a specific region, the luciferase expression was abolished, indicating that in Samhd1 promoter, 161bp are critical for Samhd1 induction. EMSA assays showed that Samhd1 expression is repressed in basal conditions by an unknown protein, and ChIP assays also showed that IRF1 is involved in Samhd1 induction by IFN-.. We hypothesized that the regulation mechanism is depending in an STAT1-depending pathway, through IRF1, and also in an STAT1-independing pathway, through an unknown mechanism up to date. We checked with proteomics analysis the protein which might be involved in Samhd1 repression but the results were not significant. We also constructed a conditional KO mouse for TREX1, and now we are crossing it with different CRE­Socs2 expressing strands. Homozygous KO expressing CRElitter, show a similar phenotype to TREX1 total KO. We are in the process to obtain homozygous KO expressing CRELysM, but due to problems with the penetrance of this CRE allele we have some difficulties. All together, the results of this thesis will shed light in the inner operation of AGS.<br>La síndrome d'Aicardi-Goutières (AGS), és una malaltia autoimmunitària recessiva que mimetitza una infecció vírica intrauterina, i la qual és caracteritzada per calcificacions intracranials, atròfia cerebral i augment d'IFN-alfa al líquid cefaloraquidi. L'AGS és una malaltia genètica heterogènia associada amb mutacions al gen que codifica per a l'exonucleasa TREX1, a qualsevol dels gens codificants per a les components de la ribonucleasa RNASE H2, a la fosfo­hidrolasa SAMHD1, a la deaminasa ADAR1 o al sensor citoplasmàtic MDA5. El coneixement d'aquestes funcions és fonamental per tal d'entendre la patogènesi de l'AGS. En aquesta tesi s'ha aprofundit en el coneixement del mecanisme regulador de la transcripció de Samhd1. Hem vist que Samhd1 es troba expressat en diferents òrgans sense necessitat de cap estímul previ, com el pàncrees, l’intestí prim i els macròfags derivats de moll d’os, i en diferents quantitats en altres òrgans de ratolí. Donada la important afectació que té l’AGS al cervell, també es va analitzar la seva expressió en neurones i cèl·lules de la micròglia. També hem vist que Samhd1 es troba induït en presència de citocines proinflamatòries, però no es troba afectada la seva expressió en presència de citocines antiinflamatòries així com tampoc en presència de TNF-gamma. Utilitzant macròfags derivats de ratolins deficients en STAT1, hem pogut demostrar que l’expressió de Samhd1 per IFN-alfa és a través d’STAT1, ja que la seva expressió es troba completament reprimida en aquestes cèl·lules. Ens vam centrar en la inducció de Samhd1 i per la seva comprensió vam focalitzar en l’estudi del seu promotor. Es van clonar 1500 parells de bases del promotor de Samhd1 en un plasmidi reporter de luciferasa, i es va veure que aquest fragment era suficient per induir l’expressió de luciferasa. A partir d’aquest constructe, es van realitzar llavors noves construccions delecionant cada vegada una regió del promotor. Es va veure que en delecionar una regió específica de 161pb, l’expressió de luciferasa es trobava completament reprimida, indicant que aquesta regió del promotor és crítica per a la inducció de Samhd1. Experiments de retard en gel (EMSA) van mostrar que Samhd1 es troba reprimit en condicions basals per una proteïna que no hem arribat a caracteritzar, i experiments de precipitació de cromatina (ChIP) van mostrar que IRF1 es troba involucrada en la inducció de Samhd1 per IFN-alfa. La nostra hipòtesi doncs, és que l’expressió de Samhd1 té un mecanisme de regulació doble: en condicions basals es troba reprimit i en presència d’IFN-alfa s’indueix una via de senyalització independent d’STAT1 que fa saltar el complex repressor del promotor, i també s’indueix una via de senyalització dependent d’STAT1, que indueix l’expressió d’IRF1 i que activa la transducció de Samhd1. Fins ara no hem caracteritzat la proteïna o complex de proteïnes que reprimeix l’expressió de Samhd1 en condicions basals, però s’està investigant mitjançant anàlisis proteòmics. En aquesta tesi també s’ha fet la construcció d’un ratolí KO condicional per a TREX1. Una vegada aconseguit aquest animal condicional, el qual conté el gen de Trex1 flanquejat per dues dianes LoxP, aquest s’està encreuant amb diferents soques que expressen CRE sota regulació de diferents Socs2 promotors. Els ratolins homozigots KO i que expressen CRE, tenen un fenotip similar al fenotip que mostren els ratolins KO totals de TREX1. Estem en el procés d’obtenció de ratolins homozigots KO i que expressen CRELysM però, donat a problemes amb la penetrància d’aquest al·lel, hem tingut algunes dificultats. Els resultats d’aquesta tesi en conjunt poden ajudar a entendre una mica més el funcionament de l'AGS.

L'étude des interactions entre un pathogène et son hôte, bien qu'ayant généralement pour objectif de contrôler l'infection par le pathogène, permet parfois de découvrir des éléments fondamentaux sur le fonctionnement de l'hôte. J'ai choisi d'étudier les fonctions cellulaires d'une protéine initialement identifiée comme un facteur de restriction du VIH-1. SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) est une protéine exprimée dans la plupart des tissus humains. Elle est capable d'hydrolyser les déoxyribonucléotides triphosphates (dNTP) cellulaires et possède une activité nucléase ciblant différents acides nucléiques dont les ARN simple brin in vitro. Des mutations dans le gène SAMHD1 entraînent le développement d'une maladie auto-immune pouvant conduire à la mort précoce des nourrissons, ce qui suggère un rôle de la protéine correspondante dans la régulation de la réponse immunitaire. Il a été montré que SAMHD1 est un facteur de restriction capable d'empêcher l'infection de cellules ne se divisant pas par le VIH-1. La protéine virale Vpx, exprimée par le VIH-2, est capable d'induire la dégradation de SAMHD1 par le protéasome et permet de rendre permissives les cellules initialement résistantes à l'infection par le VIH. SAMHD1 est en réalité capable de restreindre l'infection par des virus aussi différents que les rétrovirus et le virus de l'herpès simplex 1. Néanmoins, le mécanisme permettant à SAMHD1 de contrecarrer différents virus reste aujourd'hui sujet à controverse. Initialement considéré comme agissant en dégradant les dNTP cellulaires, SAMHD1 semble également capable de dégrader l'ARN génomique du VIH-1. Si de nombreux travaux portent sur l'activité antivirale de SAMHD1, peu de données sont disponibles concernant la fonction cellulaire de cette protéine. Or SAMHD1 est capable de réguler la quantité de dNTP cellulaires et d'interagir avec certains acides nucléiques. Ces données font de SAMHD1 un acteur potentiel de différents processus cellulaires fondamentaux sensibles à la quantité intracellulaire de dNTP, notamment la réplication du génome ou la réparation des dommages à l'ADN. J'ai montré au cours de mon doctorat que SAMHD1 module le cycle cellulaire et notamment que la surexpression de cette protéine ralentit la prolifération cellulaire. J'ai également observé que la surexpression de SAMHD1 augmente la sensibilité des cellules aux agents induisant des ruptures double brin de l'ADN. De plus, j'ai découvert qu'en cas de ruptures double brin de l'ADN cellulaire, SAMHD1 est régulé de façon spécifique par phosphorylation sur sa thréonine 592 et est recruté aux sites de cassures. D'autres travaux ont confirmé l'importance de la régulation de SAMHD1 au cours du cycle cellulaire, sa surexpression et sa réduction induisant toutes deux un ralentissement de la prolifération cellulaire. En complément de mes résultats, quelques études suggèrent que SAMHD1 joue un rôle dans le maintien de l'intégrité du génome, qui pourrait être dû à son effet sur la réponse aux dommages à l'ADN. Dans l'ensemble, ces résultats font de SAMHD1 un garant de l'homéostasie cellulaire. J'ai de plus montré que l'expression de SAMHD1 est réduite chez environ 80% des patients souffrant de leucémie lymphoïde chronique. La perte de cette protéine est donc corrélée à l'apparition d'une maladie découlant de la perturbation du fonctionnement cellulaire. L'étude d'échantillons d'autres types de tumeurs montre que, dans de moindres proportions, l'altération de l'expression de SAMHD1 est une caractéristique générale des cancers. Mes travaux de doctorat soulignent ainsi le rôle fondamental de SAMHD1 dans le maintien de l'intégrité cellulaire<br>Understanding host pathogen interactions reveals not only important information regarding the replication cycle of the pathogen but it often leads to the discovery and better understanding of key biological processes of the host. The aim of my PhD was to decipher the cellular functions of the HIV-1 restriction factor SAMHD1. SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1) is expressed in most human tissues. This protein is able to hydrolyze cellular deoxyribonucleotides triphosphate (dNTP) and possesses a nuclease activity primarily against single stranded RNA. Mutations in SAMHD1 have been described in patients suffering from an auto-immune disease causing premature death of newborns. This phenotype suggests a role of SAMHD1 in the control of immune response. Moreover, SAMHD1 restricts HIV-1 in non-cycling cells. The HIV-2 accessory protein Vpx induces SAMHD1 degradation by the proteasome, conferring cell permissiveness to HIV. In fact, the antiviral activity of SAMHD1 has been extended to other viruses including Herpes Simplex Virus 1 and Hepatitis B virus. Nevertheless, the mechanism by which SAMHD1 restrict HIV replication is debated. It was initially thought to act by depleting the dNTP pool but recent studies highlighted a potential role of SAMHD1 nuclease function in degrading HIV-1 genomic RNA. Many studies aiming at understanding the antiviral activity of SAMHD1 are being pursued, whereas little is known about the cellular function of this protein. The fact that SAMHD1 is able to regulate the cellular dNTP pool and to interact with nucleic acids suggests a key role of this protein in cellular processes, such as DNA replication and repair. During my PhD, I showed that SAMHD1 modulates the cell cycle, as the overexpression of this protein slows down cell proliferation. I also observed that SAMHD1 overexpression increases cellular sensitivity to double strand DNA breaks-inducing agents. Moreover I discovered that, after double strand breaks induction, SAMHD1 is specifically regulated by phosphorylation on its threonine 592 and recruited at the damaged sites. Other studies confirmed the importance of SAMHD1 regulation along the cell cycle as its overexpression and depletion both decrease cell proliferation. In addition to my observations, some studies suggested that SAMHD1 is important to maintain genomic integrity, presumably through its implication in DNA repair. Altogether, these results promote SAMHD1 as a key player in cellular homeostasis. I additionally showed that SAMHD1 expression is reduced in 80% of patients suffering from chronic lymphocytic leukemia (CLL). SAMHD1 loss is therefore correlated to the development of a disease due to disturbances of cellular integrity. Looking at samples from different types of tumors, I showed that SAMHD1 loss is shared between all tested cancers, although at lesser extent than in CLL. My PhD work underlines the central role of SAMHD1 to maintain cellular integrity

The eukaryotic nuclear envelope (NE), separates the nucleoplasm from cytoplasm and is made up of two concentric lipid membranes, the outer and the inner nuclear membranes (ONM and INM), the nuclear pore complexes (NPCs) and an underlying filamentous nuclear lamina. The INM contains hundreds of unique transmembrane proteins of which only a handful have been characterized. In this thesis, I aimed to understand the functional organization of proteins in the nuclear envelope and I focused on investigating the functions of a recently identified INM transmembrane protein, Samp1. We have developed a novel and robust approach, MCLIP, to identify specific protein-protein interactions taking place in live cells. Using MCLIP, we have shown that Samp1 interacts with proteins of the LINC complex, the nuclear lamina and components of the mitotic spindle. Samp1's specific interactions with a variety of binding partners, suggest that Samp1 plays important roles both in interphase and in mitosis.  We have also shown that Samp1 can provide a binding site at the INM for the GTPase Ran, a master regulator of protein interactions in interphase and in mitosis. Furthermore, we have also investigated the role of Samp1 in cell differentiation using two independent model systems. In human iPSCs, ectopic expression of Samp1 promoted differentiation despite pluripotent culture conditions. In C2C12 myoblast, depletion of Samp1 completely blocked differentiation into myotubes. The two studies complement each other and suggest that Samp1 has a strong differentiation promoting activity. Taken together, the findings in this thesis, give insights on the unexpected and unforeseen roles played by a transmembrane protein in different fundamental cellular process.<br><p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript. Paper 4: Manuscript. Paper 5: Manuscript.</p>

La phase S est une période critique du cycle cellulaire au cours de laquelle le génome est particulièrement vulnérable. La duplication efficace des génomes eucaryotes dépend de la progression de milliers de fourches de réplication. Les premières étapes de la tumorigenèse sont associées au stress de réplication spontané, caractérisé par un blocage de la fourche. Comprendre comment le stress de réplication survient dans les cellules normales et contribue à la tumorigenèse est un grand défi dans la recherche sur le cancer. Mon travail de thèse vise à comprendre la régulation de la progression de la fourche de réplication par deux protéines différentes,SAMHD1 et CTF18, qui participent à divers aspects du métabolisme de l'ADN.La duplication du génome dépend d'un approvisionnement équilibré de désoxyribonucléosides triphosphates (dNTP).Des pools de dNTP déséquilibrées augmentent les taux de mutation. SAMHD1 a été identifié comme une triphosphohydrolase de dNTPs. Cette enzyme est impliquée dans le syndrome d'Aicardi-Goutières. Récemment, il a été montré que SAMHD1 est impliquée dans la régulation des pools de dNTPs dans des cellules humaines. Cette protéine est exprimée au maximum pendant la quiescence et peu en phase S. Cependant, l'impact de SAMHD1 sur la réplication de l'ADN n'a pas encore été abordée. En utilisant la technique DNA fiber spreading, nous avons constaté que SAMHD1 module la vitesse de progression de la fourche. En plus de son activité de dNTPase, SAMHD1 contient un domaine putatif 3'-5 'exonucléase qui clive à la fois l'ADN et l'ARN in vitro. Un nombre croissant de preuves indique que les exonucléases 3'-5 'sont essentielles pour assurer la progression de la fourche et la fidélité de la réplication de l'ADN. Nous avons constaté que l'activité d'exonucléase de SAMHD1 favorise le backtracking des fourches arrêtées et qu'elle est requise pour la progression normale des fourches de réplication. Nous proposons que cette activité de backtracking est importante pour enlever désoxynucléotides ou ribonucléotides mal incorporés. Au-delà du cancer, notre découverte pourrait avoir des implications pour la compréhension du lien entre SAMHD1 et le syndrome d'Aicardi-Goutières. CTF18 fait partie d'un complexe de type RFC impliqué dans la cohésion des chromatides sœurs (CCS). Dans les cellules humaines, il a été suggéré que CTF18 contrôle la progression des fourches de réplication, en favorisant l'acétylation de la cohésine SMC3 à la fourche de réplication. Cependant, plusieurs résultats indiquent que la fonction de CTF18 n'est pas limitée à la mise en place de la CCS.En effet, notre groupe a montré que Ctf18 chez la levure est essentielle pour l'activation du checkpoint de la réplication, indépendamment de son rôle dans la CCS.Chez l'homme, CTF18 participe également au recrutement de PCNA, le facteur de processivité des ADN polymérases δ et ε. CTF18 interagit également avec la polymérase translésionnelle ƞ. Le but de mon travail était de caractériser le rôle de CTF18 lors de la réplication de l'ADN. En utilisant le peignage moléculaire, nous avons remarqué que la vitesse de la fourche de réplication est plus lente dans les cellules dépletés en CTF18 dans une phase S normale.Curieusement, l'augmentation de la vitesse de la fourche a été observée dans les cellules dépletés en CTF18 traités avec l'hydroxyurée (HU), qui ressemble au phénotype des cellules dépletés pour SAMHD1. Avec l'utilisation de la technique iPOND, nous avons observé une accumulation de PCNA aux fourches de réplication dans les cellules CTF18 traités avec HU. Nous avons également constaté que la déplétion de CTF18 induit une accumulation de yH2AX, ce qui suggère que CTF18 est nécessaire pour la stabilité du génome. Enfin, nous avons observé que la résection dépendante de SAMHD1 ne se produit pas en l'absence de CTF18. Collectivement, ces données indiquent que CTF18 agit en amont de SAMHD1 aux fourches arrêtées, probablement par le déchargement de PCNA<br>S phase is a critical period of the cell cycle during which the genome is particularly vulnerable. The efficient duplication of eukaryotic genomes depends on the unperturbed progression of thousands of replication forks.The early stages of tumorigenesis are associated with spontaneous replication stress, characterized with a blockage of fork progression. Understanding how replication stress arises in normal cells and contributes to tumorigenesis is a major challenge in cancer research.My thesis work aims at understanding the regulation of replication fork progression by two different proteins, SAMHD1 and CTF18, which have important roles in various aspects of DNA metabolism.Faithful duplication of the genome depends on a balanced supply of deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs). Imbalanced dNTP pools decrease the fidelity of DNA polymerases and increase mutation rates. SAMHD1 was originally identified as a dNTP triphosphohydrolase. This enzyme is implicated in Aicardi-Goutières syndrome. It has also been identified as a component of the human innate immune system that restricts HIV-1 infection. Recently, SAMHD1 was shown to be involved in the regulation of dNTP pools in cultured human cells. This protein is maximally expressed during quiescence and minimally during S phase. However, the impact of SAMHD1 upon DNA replication has not been addressed. Using DNA fiber spreading, we found that SAMHD1 modulates the speed of fork progression. In addition to its dNTPase activity, SAMHD1 contains a putative 3'-5' exonuclease domain that cleaves both DNA and RNA in vitro. A growing body of evidence indicates that 3'-5' exonucleases are critical to ensure fork progression and the fidelity of DNA replication. Remarkably, we found that the exonuclease activity of SAMHD1 promotes backtracking at paused forks and is important for replication fork progression. We propose that this backtracking activity is important to remove miss-incorporated deoxynucleotides or ribonucleotides. Our finding may have implications for our understanding of the link between SAMHD1 and the Aicardi-Goutières syndrome.CTF18 is part of a RFC-like complex involved in sister chromatid cohesion (SCC). In human cells it has been suggested that CTF18 controls the progression of replication forks, presumably by promoting acetylation of the SMC3 cohesin at replication forks. However, several results indicate that the function of CTF18 is not restricted to the establishment of SCC. Indeed, our group has shown that the yeast Ctf18 is essential for activation of the replication checkpoint, independently of its role in SCC. In human, CTF18 also participates in the recruitment of PCNA, the processivity factor of DNA polymerases δ and ε. CTF18 also interacts with the translesion polymerase . The aim of my work was to characterize the role of CTF18 during DNA replication. Using DNA combing, we first noticed that replication fork speed is slower in CTF18-depleted cells under unperturbed conditions. Intriguingly, increased fork speed was observed in CTF18-depleted cells challenged with hydroxyurea (HU), which is reminiscent of the phenotype of SAMHD1-depleted cells. Using iPOND, we observed an accumulation of PCNA at replication forks in HU-treated CTF18-depleted cells. We also found that CTF18 depletion induces an accumulation of yH2AX, suggesting that CTF18 is required for genome stability. Finally, we observed that the resection mediated by SAMHD1 at paused forks does not occur in the absence of CTF18. Together, these data indicate that CTF18 acts upstream of SAMHD1 at stalled forks, presumably through the unloading of PCNA

Les atàxies espinocerebel·loses (SCAs) consisteixen en un grup heterogeni de trastorns del moviment hereditaris caracteritzats clínicament per atàxia progressiva associada de forma variable amb altres signes neurològics addicionals com són signes piramidals o extrapiramidals, oftalmoplegia, retinosi pigmentària, demència o convulsions. Aquesta heterogeneïtat clínica s’explica per l’heterogeneïtat genètica, amb més de 53 loci i 40 gens identificats i associats fins a dia d’avui. En aquesta tesi s’ha estudiat una cohort de 308 pacients amb atàxia, identificant variants genètiques causatives en 82 casos índex (26,6%), 45 d’elles no descrites prèviament. Durant el curs d’aquesta tesi, el nostre grup va identificar un nou subtipus d’atàxia, la SCA37, i va localitzar el seu defecte genètic en el cromosoma 1p32. En el present estudi s’ha identificat la mutació intrònica repetitiva i inestable ATTTC dins de la regió reguladora 5 ‘no codificant de el gen Disabled 1 (DAB1) com el defecte genètic causant de la SCA37. A més, es descriu la correlació clínica i genètica i les primeres troballes neuropatològiques en SCA37 que indiquen que la malaltia està causada per la desregulació de l’expressió del DAB1 en el cerebel amb pèrdua severa de cèl·lules de Purkinje en l’escorça cerebel·losa i la presència de grànuls perisomàtics ubiquitinats i immunotenyits per DAB1. És important destacar que la repetició ATTTC desregula l’expressió de l’ARN de DAB1 resultant en la sobreexpressió de la ruta de senyalització de la reelina-DAB1 i PI3K/AKT en el cerebel SCA37. Finalment, però no menys important, s’han realitzat estudis de lligament de el genoma complet i seqüenciació de l’exoma en una família de Menorca amb set individus afectes que presentaven atàxia, nistagme, disàrtria, polineuropatia i signes piramidals de forma variable amb una herència autosòmica dominant. L’edat d’inici de la malaltia oscil·la entre els 15 i 50 anys. Les ressonàncies magnètiques van revelar atròfia cerebel·losa amb desmielinització cerebral, i els estudis neurofisiològics van mostrar polineuropatia sensitiva axonal moderada amb resposta cutània simpàtica anormal predominantment en les extremitats inferiors. Es va identificar la variant c.1877C> T (p.Ser626Leu) en el gen SAMD9L com el defecte genètic causant de la malaltia. L’estudi també demostrà la localització mitocondrial de la proteïna SAMD9L humana, amb nivells disminuïts en els fibroblasts dels pacients i deficiències mitocondrials i lisosomals en aquest nou subtipus d’atàxia. A més, la sobreexpressió de l’ARNm de SAMD9L mutat humà demostrà deteriorament de la mobilitat i afectació vestibular/sensorial en els embrions del peix zebra. En conclusió, aquest estudi ha identificat els dèficits genètics en el 26,6% dels nostres casos d’atàxia, es demostra la mutació intrònica repetitiva i inestable ATTTC dins el gen DAB1 com la causa genètica subjacent proporcionant evidència de desregulació de la senyalització de reelina- DAB1 en l’atàxia espinocerebel·losa tipus 37, i identifica un nou subtipus d’atàxia espinocerebel·losa causada per la mutació a SAMD9L, que desencadena una desregulació mitocondrial i lisosomal, apuntant al paper de la proteïna SAMD9L en les funcions neurològiques motores i sensorials. Com a resultat d’aquesta tesi, s’aporten nous coneixements sobre els mecanismes clínics, genètics i fisiopatològics subjacents a la neurodegeneració en les atàxies espinocerebel·loses, identificant noves dianes terapèutiques candidates per al tractament.<br>Las ataxias espinocerebelosas (SCAs) consisten en un grupo heterogéneo de trastornos del movimiento hereditarios caracterizados clínicamente por ataxia progresiva asociada de forma variable con otros signos neurológicos adicionales como signos piramidales o extrapiramidales, oftalmoplejía, retinosis pigmentaria, demencia o convulsiones. La heterogeneidad clínica se explica por la heterogeneidad genética, con más de 53 loci y 40 genes identificados asociados hasta la fecha. En esta tesis se ha estudiado una cohorte de 308 pacientes con ataxia, identificando variantes genéticas causativas en 82 casos índice (26,6%), 45 de ellas no descritas previamente. Durante el curso de esta tesis, nuestro grupo identificó un nuevo subtipo de ataxia, SCA37, y localizó su defecto genético en el cromosoma 1p32. En el presente estudio se ha identificado la mutación intrónica repetitiva e inestable ATTTC dentro de la región reguladora 5’ no codificante del gen Disabled 1 (DAB1) como el defecto genético causante de SCA37. Además, se describe la correlación clínico-genética y los primeros hallazgos neuropatológicos en SCA37 que indican que la enfermedad está causada por la desregulación de la expresión de DAB1 en el cerebelo con pérdida severa de células de Purkinje en la corteza cerebelosa y la presencia de gránulos perisomáticos ubiquitinados e inmunoteñidos para DAB1. Es importante destacar que la repetición ATTTC desregula la expresión del ARN de DAB1 resultando en la sobreexpresión de la ruta de señalización mediada por reelina-DAB1 y PI3K/AKT en el cerebelo SCA37. Por último, pero no menos importante, se han realizado estudios de ligamiento del genoma completo y secuenciación del exoma en una familia de Menorca con siete individuos afectos que presentaban ataxia, nistagmo, disartria, polineuropatía y signos piramidales de forma variable y con una herencia autosómica dominante. La edad de inicio de la enfermedad oscila entre los 15 y 50 años. Las resonancias magnéticas revelaron atrofia cerebelosa con desmielinización cerebral, y los estudios neurofisiológicos mostraron polineuropatía sensitiva axonal moderada con respuesta cutánea simpática anormal predominantemente en las extremidades inferiores. Se identificó la variante c.1877C> T (p.Ser626Leu) en el gen SAMD9L como el defecto genético causante de la enfermedad. El estudio también demuestra la localización mitocondrial de la proteína SAMD9L humana, con niveles disminuidos en fibroblastos de los pacientes, así como deficiencias mitocondriales y lisosomales en este nuevo subtipo de ataxia. Además, la sobreexpresión del ARNm de SAMD9L mutado humano demuestra deterioro de la movilidad y afectación vestibular/sensorial en los embriones del pez cebra. En conclusión, este estudio ha identificado los déficits genéticos en el 26,6% de nuestros casos de ataxia, demuestra la mutación intrónica repetitiva e inestable ATTTC dentro del gen DAB1 como la causa genética subyacente proporcionando evidencia de la desregulación de la señalización mediada por reelina-DAB1 en la ataxia espinocerebelosa tipo 37, y describe un nuevo subtipo de ataxia espinocerebelosa causada por la mutación SAMD9L, que desencadena una desregulación mitocondrial y lisosomal, apuntando al papel de SAMD9L en las funciones neurológicas motoras y sensoriales. Como resultado de esta tesis, se aportan nuevos conocimientos sobre los mecanismos clínicos, genéticos y fisiopatológicos subyacentes a la neurodegeneración en las ataxias espinocerebelosas, y se identifican nuevas dianas terapéuticas candidatas para el tratamiento.<br>Spinocerebellar ataxias (SCAs) consist of a heterogeneous group of inherited movement disorders clinically characterised by progressive ataxia variably associated with additional neurological signs such as pyramidal or extrapyramidal signs, ophthalmoplegia, pigmentary retinopathy, dementia or seizures. This clinical heterogeneity is explained by its genetic heterogeneity, with more than 53 loci and 40 genes identified and associated to date. In this thesis, a cohort of 308 ataxia patients were studied, finding causative genetic variants in 82 index cases (26.6%), 45 of them previously not described. During the course of this thesis our group identified a novel SCA37 ataxia subtype and localised its genetic defect to chromosome 1p32. The present study identifies the unstable intronic ATTTC repeat mutation within the 5′-non-coding regulatory region of the Disabled 1 gene (DAB1), as the causative genetic defect of SCA37. Moreover, it describes the clinical-genetic correlation and the first neuropathological findings in SCA37 which reveal that the disease is caused by dysregulation of cerebellar DAB1 expression with severe loss of Purkinje cells in the cerebellar cortex, and the presence of ubiquitinated perisomatic granules immunostained for DAB1. Importantly, the ATTTC repeat induced DAB1 RNA switch resulting in the upregulation of reelin-DAB1 and PI3K/AKT signalling in the SCA37 cerebellum. Last but not least, whole-genome linkage and exome studies were performed in a family from Menorca with seven affected individuals variably presenting with ataxia, nystagmus, dysarthria, polyneuropathy and pyramidal signs with an autosomal dominant inheritance. Variable age at onset ranged from 15 to 50 years. MRI revealed cerebellar atrophy with cerebral demyelination, and neurophysiological studies showed moderate axonal sensory polyneuropathy with abnormal sympathetic skin response predominantly in the lower limbs. The c.1877C>T (p.Ser626Leu) variant in the SAMD9L gene was identified as the disease causative genetic defect. The study also demonstrated the mitochondrial location of human SAMD9L protein, with its levels decreased in patients’ fibroblasts and evidenced mitochondrial and lysosomal deficits in this novel ataxia subtype. In addition, overexpression of the human mutated SAMD9L mRNA revealed impaired mobility and vestibular/sensory functions in zebrafish embryos. In conclusion, this study identifies the genetic deficits in 26.6% of our ataxia cases, demonstrates the unstable ATTTC repeat mutation within the DAB1 gene as the underlying genetic cause providing evidence of reelin-DAB1 signalling dysregulation in the spinocerebellar ataxia type 37, and describes a novel spinocerebellar ataxia subtype caused by SAMD9L mutation, which triggers mitochondrial and lysosomal dysregulation, pointing to the role of SAMD9L in neurological motor and sensory functions. As a result of this thesis novel insights into the clinical, genetic and physiopathological mechanisms underlying neurodegeneration in spinocerebellar ataxias are identified providing new candidate targets for treatment.<br>Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Neurociències

La réplication de l’ADN est un processus extrêmement complexe, impliquant des milliers de fourches de réplication progressant le long des chromosomes. Ces fourches sont fréquemment ralenties ou arrêtées par différents obstacles, tels que des structures secondaires de l’ADN, des protéines agissant sur la chromatine ou encore un manque de nucléotides. Ce ralentissement, qualifié de stress réplicatif, joue un rôle central dans le développement tumoral. Des processus complexes, qui ne sont pas encore totalement connus, sont mis en place pour répondre à ce stress. Certaines nucléases, comme MRE11 et DNA2, dégradent l’ADN néorépliqué au niveau des fourches bloquées, ce qui permet le redémarrage des réplisomes.La voie interféron est un mécanisme de défense contre les agents pathogènes qui détecte la présence d’acides nucléiques étrangers dans le cytoplasme et active la réponse immunitaire innée. Des fragments d’ADN issus du métabolisme de l’ADN génomique (réparation, rétrotransposition) peuvent diffuser dans le cytoplasme et activer cette voie. Une manifestation pathologique de ce processus est le syndrome d’Aicardi-Goutières, une maladie rare caractérisée par une inflammation chronique générant des problèmes neurodégénératifs et développementaux. Dans le cadre de cette encéphalopathie, il a été suggéré que la réplication de l’ADN pouvait générer des fragments d’ADN cytosoliques, mais les mécanismes impliqués n'avaient pas été caractérisés.SAMHD1 est fréquemment muté dans le syndrome d’Aicardi-Goutières ainsi que dans certains cancers, mais son rôle dans l’étiologie de ces maladies était jusqu’à présent largement inconnu. Ce facteur de restriction du VIH possède une activité dNTPase impliquée dans la régulation des pools de nucléotides en G1, ainsi qu’une activité 3’-5’ exonucléase qui est, encore aujourd’hui, controversée.Le but de mon projet de thèse était de comprendre les mécanismes moléculaires responsables de l’inflammation dans les cellules déficientes pour SAMHD1.Nous montrons que de l’ADN cytosolique s’accumule dans les cellules déficientes pour SAMHD1, particulièrement en présence de stress réplicatif, activant la réponse interféron. Par ailleurs, SAMHD1 est important pour la réplication de l’ADN en conditions normales et pour le processing des fourches arrêtées, indépendamment de son activité dNTPase. De plus, SAMHD1 stimule l’activité exonucléase de MRE11 in vitro. Lorsque SAMHD1 est absent, la dégradation de l’ADN néosynthétisé est inhibée, ce qui empêche l’activation du checkpoint de réplication et entraine un défaut de redémarrage des fourches de réplication. De plus, la résection des fourches de réplication est réalisée par un mécanisme alternatif qui libère des fragments d’ADN dans le cytosol, activant la réponse interféron.Les résultats obtenus pendant ma thèse montrent, pour la première fois, un lien direct entre la réponse au stress réplicatif et la production d’interférons. Ces résultats ont des conséquences importantes dans notre compréhension du syndrome d’Aicardi Goutières et des cancers liés à SAMHD1. Par exemple, nous avons démontré que MRE11 et RECQ1 sont responsables de la production des fragments d’ADN qui déclenchent la réponse inflammatoire dans les cellules déficientes pour SAMHD1. Nous pouvons donc imaginer que bloquer l’activité de ces enzymes pourrait diminuer la production des fragments d’ADN et, in fine, l’activation de l’immunité innée dans ces cellules. Par ailleurs, la voie interférons joue un rôle essentiel dans l’efficacité thérapeutique de l’irradiation et de certains agents chimiothérapiques comme l’oxaliplatine. Moduler cette réponse pourrait donc avoir un intérêt beaucoup plus large en thérapie anti-tumorale<br>DNA replication is an utterly complex process, implicating thousands of replication forks that progress along chromosomes. These forks frequently slow-down or stall when they encounter obstacles such as DNA secondary structures, proteins acting on chromatin or a lack of dNTPs. Such impediment on the progression of replication forks, termed replication stress, plays a major role in tumorigenesis. Intricate processes, still not entirely understood, are established to respond to this stress. For instance, nucleases such as DNA2 and MRE11 degrade nascent DNA at arrested forks to allow their restart.The interferon pathway is a defense mechanism against pathogens that detects non-self-nucleic acids in the cytosol to activate the innate immune response. However, DNA fragments originating from the metabolism of genomic DNA, such as DNA repair and retrotransposition, may also diffuse into the cytosol to activate this pathway. The Aicardi-Goutières Syndrome (AGS), a rare genetic disorder characterized by neurological and developmental defects is caused by chronic inflammation due to the over-production of type I IFNs. It has been proposed that DNA replication may generate cytosolic DNA fragments triggering this encephalopathy. However, the mechanisms involved have remained unexplored.SAMHD1 is frequently mutated in the Aicardi-Goutières Syndrome as well as in some cancers. However, its role in the etiology of these diseases remains poorly understood. This HIV-1 restriction factor has a dNTPase activity involved in the regulation of dNTP pools and a putative 3’-5’ exonuclease activity.The goal of my PhD thesis was to understand the molecular mechanisms responsible for inflammation induced by SAMHD1 deficiency.We show that cytosolic DNA accumulates in SAMHD1-deficient cells, especially in conditions of replication stress, activating the interferon response. In addition, we demonstrate that SAMHD1 is necessary for DNA replication and for the processing of arrested forks, independently of its dNTPase activity. SAMHD1 stimulates the exonuclease activity of MRE11 in vitro. In the absence of SAMHD1, nascent DNA degradation is inhibited, preventing replication checkpoint activation and fork restart. Besides, forks are aberrantly processed by an alternative pathway that generates cytosolic DNA fragments, thereby activating the interferon response.Altogether, we demonstrate for the first time a direct link between the DNA replication stress response and interferon production. This result has important consequences regarding our understanding of the Aicardi-Goutières Syndrome and cancers caused by SAMHD1 mutations, which could be translated into new therapeutic opportunities. For instance, we have shown that MRE11 and RECQ1 are responsible for the production of DNA fragments triggering the pro-inflammatory response in SAMHD1-deficient cells. Inhibiting these enzymes decreases the production of cytosolic nucleic acids and, consequently, reduces the activation of cell-autonomous innate immunity in SAMHD1-depleted cells. Accordingly, inhibiting these enzymes may as well decrease IFN production in AGS in vivo models caused by SAMHD1 mutations. The interferon pathway also plays a major role in tumorigenesis as well as in the clinical efficacy of irradiation and some chemotherapeutic agents such as oxaliplatin. Modulating this response may therefore have much broader implications in anti-cancer therapy

Thesis (M.A.)--Boston University PLEASE NOTE: Boston University Libraries did not receive an Authorization To Manage form for this thesis or dissertation. It is therefore not openly accessible, though it may be available by request. If you are the author or principal advisor of this work and would like to request open access for it, please contact us at open-help@bu.edu. Thank you.<br>Previous studies have showed effects of irradiation on bone and on fracture healing. This is a histological study of the effect of a combined irradiation/fracture injury model in a strain of aged mice (SAMP6) and controls (SAMR1) and the effects of the radioprotective agent, JP4-039 (a mitochondria targeted GS-nitroxide). Hind legs in SAMR1 and SAMP6 control mice and mice pretreated with JP4-039 were exposed to a single dose of radiation (0 or 20 Gy). Twenty four hours after irradiation, unicortical osseous wounds were created in each proximal tibia. Mice were sacrificed at intervals (14, 21 days), tibias excised, radiographed, and prepared for histology (day 21 only). Tibias were examined and graded histologically for evidence of cortical bridging and intramedullary fibrosis. Irradiated SAMP6 wounds showed significantly diminished cortical bridging and significantly more intramedullary fibrosis. In contrast, JP4-039 showed a statistical trend in ameliorating intramedullary fibrosis in irradiated SAMP6 mice. In control SAMR1 mice, JP4-039 had no significant effect on cortical bridging or fibrosis with the number of replicates available. In summary, SAMP6 mice display diminished capacity to recover from the combined irradiation/fracture injury model, with subgroups pretreated with JP4-039 showing beneficial trends in mitigating irradiation induced injury.

Depuis sa découverte il y a sept ans, les recherches intensives sur SAMHD1 en ont fait un facteur cellulaire important qui limite la réplication du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) à l’étape de transcription inverse dans les cellules immunitaires non-cyclantes. Le VIH-2 et certains virus de l’immunodéficience simienne (VIS) surmontent cette restriction en exprimant la protéine Vpx, qui conduit SAMHD1 à sa dégradation protéasomique. De nombreuses données expérimentales indiquent que l’activité triphosphohydrolase (dNTPase) de SAMHD1, qui diminue les niveaux cellulaires de dNTP, est responsable de la restriction. Cependant, la seule expression de SAMHD1 ne suffit pas à rendre les cellules résistantes à l’infection par le VIH-1 et ce quel que soit le type cellulaire. De plus, il n’existe pas de corrélation stricte entre la fonction neutralisante de SAMHD1 et sa capacité à dégrader les dNTP. Il a été suggéré que la phosphorylation du résidu T592 puisse inhiber les fonctions antivirales de SAMHD1 dans les cellules en division. Cependant, l’étude de mutants phospho-mimétiques ou phospho-ablatifs mène à des résultats contradictoires. Ces données permettent d’envisager que l’activité antivirale de SAMHD1 ne repose pas exclusivement sur son activité dNTPase et que sa régulation ne peut pas être expliquée que par la phosphorylation. Nous avons démontré que SAMHD1 est modifiée par la SUMOylation, i.e. une modification post-traductionnelle consistant en la conjugaison réversible des protéines SUMO ; et avons identifié les sites principaux modifiés. Nos résultats indiquent que les mutations empêchant la SUMOylation de SAMHD1, particulièrement celle du résidu K595 adjacent au résidu phosphorylable T592, invalident sa fonction antivirale sans affecter son activité dNTPase. Un phénotype similaire est observé après suppression de la région C-terminale de SAMHD1 (résidus 595-626). Nous suggérons donc que les résidus K595 SUMOylé et T592 phosphorylé font partie d’une interface responsable du recrutement d’un co-facteur méconnu, dépendant du type cellulaire, et pouvant jouer un rôle dans le mécanisme de restriction de l’infection par le VIH-1. Notre travail permet d’entrevoir un nouvel aspect de la régulation de SAMHD1 et contribue à la caractérisation des mécanismes moléculaires sous-jacents à son pouvoir antiviral. L’identification d’un ou plusieurs partenaires cellulaires de SAMHD1 permettra de mieux comprendre le mécanisme de restriction et pourra servir de cible thérapeutique pour combattre l’infection par le VIH-1<br>Since its discovery seven years ago, SAMHD1 has emerged as an important cellular factor that limits the replication of the Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) at the reverse transcription step in non-cycling immune cells. HIV-2 and some SIV overcome this restriction by encoding the Vpx protein, which bridges SAMHD1 to the proteasomal degradation pathway. A wealth of experimental evidence indicates that SAMHD1 triphosphohydrolase (dNTPAse) activity, which is responsible for cellular dNTP pools depletion, accounts for the premature termination of viral replication. Notably, SAMHD1 expression is not sufficient to render any tested cell type resistant to HIV-1. Besides, there is no strict link between SAMHD1 capacity to deplete dNTP pools and its neutralizing function. Phosphorylation of residue T592 is proposed to downregulate the antiviral function of SAMHD1 in cycling cells. However, the analysis of phosphomimetic or unphosphorytable mutants of SAMHD1 leads to contradictory results. Altogether, these data suggest that SAMHD1-mediated restriction may neither exclusively rely on its dNTPase activity, nor solely depend on the phosphorylation status of T592.We have demonstrated that SAMHD1 undergoes SUMOylation, i.e. a post-translational modification consisting in the reversible conjugation of SUMO on a target protein; and have identified the major sites of modification. Our results show that mutations preventing SAMHD1 SUMOylation, in particular at residue K595 that lies close to the phosphorytable T592 site, inhibit its antiviral properties without impairing its dNTPase activity. Notably, an analogous phenotype is observed upon deletion of SAMHD1 C-terminus (Δ595-626). Based on these data, we speculate that phosphorytable T592 and SUMOylated K595 residues are part of an interface in SAMHD1 C-terminal tail that is responsible for the recruitment of still unknown cofactor(s) involved in the mechanism of HIV-1 infection restriction. Our work highlights a novel aspect of SAMHD1 regulation and participates to the characterization of molecular basis underlying its antiviral function. The identification of one or several cellular partners will allow a better understanding of retroviral restriction mechanism and could serve as new therapeutic targets to fight HIV-1 infection

Le virus Chikungunya (CHIKV), arbovirus en pleine ré-émergence, a envahi rapidement de nombreuses zones géographiques du monde. La propagation mondiale de ce virus constitue une menace pour la santé humaine car il n'y a pas de vaccin ou d'agents antiviraux appropriés pour contrôler l'infection virale. La transmission du virus s’effectue lors de la piqure d’un moustique infecté du genre Aedes, qui injecte sa salive contenant le virus dans la peau de l’hôte humain. Afin de contrôler la dissémination du virus, il est primordial de développer des recherches sur l’identification de molécules antivirales et de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans les interactions hôte-virus et/ou vecteur-virus-hôte. En utilisant différentes stratégies moléculaires et cellulaires, nous avons étudié le potentiel antiviral de l'Imipramine, une molécule déjà commercialisée et qui a la capacité de perturber le transport du cholestérol intracellulaire. Nous avons démontré que cette molécule est capable d'inhiber la réplication du CHIKV dans les fibroblastes cutanés humains. Nous avons mis en évidence que l'Imipramine affectait à la fois les étapes de fusion et de réplication pendant le cycle de réplication du virus. En outre, la molécule a également fortement inhibé la réplication de plusieurs Flavivirus comme le virus Zika (ZIKV), le virus du Nil occidental et le virus de la Dengue. Nous avons également déterminé le profil protéomique global des fibroblastes humains infectés par le CHIKV ou le ZIKV. Cela nous a permis de mettre en évidence les modulations significatives de plusieurs protéines stimulées par l'interféron et de protéines impliquées dans à la défense anti-virale dans les cellules infectées. Plus important encore, nos résultats montrent pour la première fois le rôle de la protéine SAMHD1 dans l'infection des fibroblastes cutanés par les arbovirus. Enfin, compte tenu des fortes interactions entre l’hôte, le vecteur et le CHIKV, l'effet de la salive du moustique Ae. Aegypti sur l'infection virale a été étudié. À notre connaissance, cette étude est la première à montrer l’importance de la salive d’Ae. aegypti sur la facilitation de l’infection du CHIKV, dans des fibroblastes cutanés, à travers la régulation des gènes impliqués dans la réponse interféron de type I<br>Chikungunya virus (CHIKV) is a re-emerging mosquito-borne alphavirus that has been spread worldwide. The dissemination of this virus is a threat to human health since there is no approved vaccine or appropriate antiviral agents to control viral infection. The global expansion of the virus is preceded by biting of infected Aedes mosquitos, which injects saliva containing the virus into the skin of the human host. Searching for effective antiviral compounds and understanding of the molecular mechanisms involved in host-virus or vector-virus-host interactions are crucial for controlling viral spread.Using different molecular and cellular strategies, we demonstrated that the FDA approved drug, imipramine, which has the capability to disturb intracellular cholesterol transport inhibits CHIKV replication in human skin fibroblasts. Imipramine was found to affect both the fusion and replication steps of the viral life cycle. Moreover, it also strongly inhibited the replication of several Flaviviridae family members, including Zika, West Nile and Dengue virus. We have also determined the global proteomic profile of Chikungunya and Zika virus infected human skin fibroblasts, and found that several interferon-stimulated proteins and antiviral response proteins are significantly up-regulated in the infected cells. More importantly, our results also provided for the first time a role of SAMHD1 in arbovirus infection of human skin fibroblasts. Finally, we demonstrated that Aedes aegypti saliva enhances CHIKV replication in human skin fibroblasts. To our knowledge, this is the first report showing the importance of Aedes aegypti saliva on promoting CHIKV infection via down regulation of the genes involving type I IFN secretion in the infected human cutaneous cells

The nuclear envelope forms the interface between the nucleus and the cytoplasm. The nuclear envelope consists of the two concentric lipid membranes, the nuclear pores and the nuclear lamina. The inner nuclear membrane contains hundreds of unique transmembrane proteins showing high tissue diversity. Mutations of some proteins in the nuclear envelope give rise to a broad spectrum of diseases called envelopathies or laminopathies. In this thesis, I aimed to study the functional organization of the nuclear envelope by identifying and characterizing interactions between the nuclear envelope proteins. For this, we developed a novel method called the Membrane Protein Crosslink Immuno-Precipitation, which enable identification of protein-protein interactions in the nuclear envelope in live cells. We identified several novel interactions of the inner nuclear membrane protein, Samp1, and studied the interaction between the Samp1 and the nuclear GTPase, Ran in detail. Samp1 can bind to Ran and is thus the first known transmembrane Ran binding protein and Samp1 might provide a local binding site for Ran in the inner nuclear membrane. We found that Samp1 also binds to the inner nuclear membrane protein, Emerin and Ran can regulate the Samp1-Emerin interaction in the nuclear envelope. During mitosis, Samp1 distributes in the mitotic spindle. Therefore, we investigated a possible functional role of Samp1 in the mitotic machinery. Samp1 depletion resulted in aneuploid phenotypes, metaphase prolongation and decreased distribution of γ-tubulin and β-tubulin in the mitotic spindle. We found that Samp1 can bind to γ-tubulin, which is essential for the microtubule nucleation and hence for the spindle stability. The new interesting features of Samp1 provide insights on the unforeseen functions of the nuclear envelope proteins.<br><p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript. Paper 4: Manuscript.</p>

La malaltia d'Alzheimer (MA) es caracteritza per la presència a l'hipocamp i l'escorça de plaques senils de la proteïna &#946;-amilode (A&#946;), cabdells neurofibrilars de la proteïna tau hiperfosforilada i pèrdua de sinapsis. La hipòtesi neurovascular de la MA dóna una especial importància a les alteracions de la Barrera Hematoencefàlica (BHE) i els increments de la proteïna &#946;-amilode (A&#946;). Els ratolins modificats genèticament són els models animals més utilitzats en la investigació de la MA. Tanmateix, aquests ratolins imiten aspectes de la MA de tipus familiar, on alteracions genètiques predisposen a patir la malaltia. Els ratolins d'edat avançada poden ajudar a discernir la frontera entre l'envelliment normal i el patològic. En aquest context prenen especial rellevància els ratolins amb senescència accelerada SAMP8. Aquesta soca ja ha estat descrita com a model de MA i presenta vàries característiques de la MA com dèficits en l'aprenentatge i la memòria, alteracions emocionals, nivells elevats d'APP i A&#946;, patologia neuronal associada a tau, alteracions en el sistema colinèrgic, neurodegeneració i estrès oxidatiu entre d'altres. En aquesta tesi hem investigat: 1-Les alteracions i l'evolució temporal de les modificacions en la integritat de la BHE en escorça i hipocamp de ratolins SAMP8; 2-La presència de dipòsits amiloides en aquests ratolins a les zones cerebrals abans esmentades així com el seu increment amb l'edat i 3-La relació temporal i en la localització de les alteracions de la BHE i els dipòsits d'A&#946; d'aquests ratolins. Les conclusions que hem estret són que en ratolins SAMP8: 1- Presenten alteracions de la BHE a partir dels 9 mesos d'edat. 2- Presenten acumulacions d'A&#946; a partir de 6 mesos d'edat. 3- Presenten nivells més elevats d'angiopatia amiloïdal cerebral (CAA) a partir dels 3 mesos d'edat. 4- Tots els vasos amb CAA mostren també alteracions de la BHE, tot i que hi ha altres basos amb la BHE alterada sense CAA. 5- No hi ha relació directa entre la localització dels dipòsits amiloides i la localització dels vasos sanguinis, els vasos amb CAA ni amb els vasos amb la BHE alterada.

This thesis is focused on the main concepts of Active Directory and the creation of an application allowing basic management tasks. It introduces the logical as well as physical components and provides an overview of existing servers that are using the services of Active Directory. The functionality of existing management applications is discussed and desired properties of management applications are discovered. On these grounds, a new application concept is introduced and the benefits of the new application over the existing ones is shown. According to the concept, a new application is developed supporting the management of users and groups and implementing additional features such as profile photo editing and a definition of customized object creation process. This application is also tested on different levels and possibilities of future improvements are given.

Au cours du vieillissement, les artères cérébrales subissent des modifications structurelles et fonctionnelles, notamment au niveau des cellules musculaires lisses (CML). La CML a pour rôle de maintenir la réactivité vasculaire via une signalisation calcique qui fait intervenir différents acteurs pouvant ainsi réguler deux phénomènes : la contraction et la relaxation. Ces acteurs rassemblent, au sein d’une même cellule, des canaux (CCVD, RYR, IP3R), des pompes calciques (SERCA, PMCA, NCX, STIM/ORAI) et leurs régulateurs (PLB, FKBP12.6, TRPP2, SARAF, TRIC). La restriction calorique (RC), apparaît comme étant un facteur retardant le vieillissement et ses pathologies. Notre travail s’est donc fortement impliqué dans l’étude de la signalisation calcique de la CML, en se focalisant sur les altérations génomiques et fonctionnelles au cours du vieillissement des artères cérébrales chez la souris C57Bl6/j. Nous avons ainsi pu mettre en évidence une altération de la signalisation calcique qui passe en partie par une modulation des niveaux d’expressions génique et protéique des canaux et pompes calciques impliqués dans ce phénomène, et par une modification fonctionnelle en termes de signaux calciques et de contraction. Après 5 mois de régime RC, il a été mis en évidence un ralentissement des altérations de la signalisation calcique liées au vieillissement et une diminution de l’oxydation des CML<br>During aging, cerebral arteries undergo structural and functional changes, particularly in smooth muscle cells (SMC). SMC is responsible for maintaining vascular reactivity via calcium signaling involving different actors and can regulate two phenomena: contraction and relaxation. These actors regroup channels (CCVD, RYR, IP3R) calcium pumps (SERCA, PMCA, NCX, STIM / ORAI) and their regulators (PLB, FKBP12.6, TRPP2, SARAF, TRIC). Caloric restriction (CR) appears as a factor in delaying aging and its pathologies. Our work is strongly involved in the study of calcium signaling in SMC, focusing on genomic and functional alterations during aging of cerebral arteries in mice C57BL6/J. We were able to demonstrate an altered calcium signaling, which is partly through modulation of gene and protein expression levels of calcium channels and pumps involved in this phenomenon, and a functional change in terms of calcium signals and contraction. After 5 months under RC, it was highlighted a slow calcium signaling alterations associated with aging and a decrease of SMC oxidation by SAMP8

Crohn's disease, a chronic inflammation of the bowel, is a multi-factorial condition where uncontrolled immune responses to luminal bacteria occur in genetically predisposed individuals. The first observable clinical signs are small ulcers that form at a specialised form of epithelium, follicle-associated epithelium (FAB). The FAB covers immune inductive sites, Peyer's patches, which function primarily as sensory areas that sample the externaI gut environment. Dendritic cells are one of the key cells that are involved in sensing luminal contents and orchestrating the gut immune system. The main aim of this thesis was to determine whether the barrier of the FAB is breached in Crohn's disease and if dysfunctional immune regulators, namely dendritic cells, playaroIe in initiating and/or maintaining the chronic intestinal inflammation. Using biopsies and surgical specimens, we were able to show that in Crohn's disease, there was an increased transmucosaI transport of Escherichia coli compared to specimens from ulcerative colitis and non-inflammatory bowel disease (IBD) controIs. Dendritic cells internalised a higher percentage of bacteria that had translocated across the FAB in the Crohn's samples. Furthermore, significantly higher concentrations of TNF-u was released upon bacterial stimulation by tissues from patients with Crohn's disease than in controIs. We went on to characterise the dendritic cells present in the Peyer's patches of patients with Crohn's disease. We found an accumulation of both immature and mature dendritic cells beneath the FAB, in the sub-epithelial dome (SED). Normally, mature dendritic cells migrate towards T cell-rich areas. However, we observed mature dendritic cells accumulating in the SED because they lacked the CCR7 migratory receptor. Furthermore, they were more prone to take-up bacteria, and produced TNF-α. To study the function of mucosal dendritic cells, we performed isolation experiments and mixed Iymphocyte reactions. Dendritic cells from both the ileum and blood of patients with active Crohn's had reduced capacity for inducing T cell proliferation than non-IBD controIs. Blood dendritic cells of patients in remission had normalised function that was similar to dendritic cells from healthy controls. The SAMPl/YitFc mice, considered an appropriate murine model for Crohn's disease, had an inherent permeability defect that increased with the chronicity of intestinaI inflammation. However unlike in human Crohn's disease, dendritic cells did not seem to playaroIe in murine ileitis. This thesis highlights the accumulation of the actively surveying dendritic cells that are prone to bacterial internalisation, and points to their possible different functional roles in active versus in-active disease; thereby confirming dendritic cells as one ofthe key components in the pathogenesis ofCrohn's disease.

O controlo da dosimetria individual dos profissionais expostos a radiações ionizantes é legalmente obrigatório desde 6 de abril de 2003. É também obrigatório, a partir de 2008, que todos os trabalhadores, que acedam a áreas controladas, possuam controlo dosimétrico. No ICNAS, Instituto de Ciências Nucleares Aplicadas à Saúde, esse controlo é realizado pelo Físico Responsável de uma forma manual e sujeita a todas as desvantagens e inconvenientes de um processo realizado deste modo. Este processo começa com a receção das leituras dos dosímetros individuais de cada colaborador sob a forma de uma tabela impressa numa folha A4. As leituras são realizadas por uma entidade externa que recolhe os dosímetros mensalmente, deixando outros novos. Depois de efetuadas as leituras dos dosímetros, as tabelas são devolvidas com a respetiva informação. Após a receção das leituras, o Físico responsável tem que as analisar detalhadamente para verificar se algum dos valores ultrapassa os limites legalmente impostos. Esta atividade é de muita responsabilidade e é ainda efetuada, hoje em dia, de uma forma manual. O problema que se coloca é o seguinte: serão as novas tecnologias de informação e comunicação capazes de oferecer uma solução para esta tarefa de forma a monitorizar eficazmente as leituras da dosimetria individual? Este trabalho procura apresentar uma solução para resolver o problema descrito, sob a forma de uma aplicação Web, para ser apresentada ao ICNAS.