Dissertations / Theses on the topic 'Réponse aux thérapies'

Les chondrosarcomes (CHS), tumeurs primitives osseuses, sont considérés comme radio- et chimio-résistants. Dans ce contexte, cette étude vise à déterminer la sensibilité de ces derniers aux traitements conventionnels (rayons X et cisplatine), à mieux caractériser les mécanismes de résistance et à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques (thérapie épigénétique ciblant la méthyltransférase EZH2 et l’hadronthérapie par ions carbone). Tout d’abord, nous avons montré que les CHS possédaient des sensibilités différentes à la fois aux rayons X et au cisplatine et que les rayons X induisaient l’apoptose ou la sénescence des cellules sensibles alors que seule l’apoptose était induite par le cisplatine. Nous avons mis en évidence différents mécanismes de résistance en fonction des CHS. Par ailleurs, nous avons montré pour la première fois que les chondrosarcomes sont plus sensibles aux ions carbone. Dans un second temps, nous avons étudié l’efficacité d’une thérapie épigénétique utilisant un inhibiteur ciblant EZH2 et montré qu’il réduisait la croissance in vitro et in vivo des chondrosarcomes. Cependant, bien que cet effet anti-tumoral soit très intéressant, son mécanisme d’action n’est pas encore clair et est indépendant d’EZH2. Ces études soulignent l’hétérogénéité et la variété des réponses des CHS aux traitements conventionnels. Il est donc important d’utiliser des CHS de grade et d’origine différents. De plus, ces travaux confirment l’intérêt de l’hadronthérapie par ions carbone pour traiter les CHS
Chondrosarcomas (CHS) are malignant bone mesenchymal tumors and known to be radio- and chemo-resistant. In this context, the aim of this study was to determine their sensitivity to conventional treatments (X-ray and cisplatin), to better characterize their resistance mechanisms and to identify new therapeutics targets (epigenetic therapy targeting the methyltransferase EZH2 and hadrontherapy by carbon ions). First, we showed that CHS had different sensitivities to X-rays and cisplatin. Moreover, X-rays induced apoptosis or senescence of sensitive cells whereas cisplatin induced only apoptosis. Resistance mechanisms are different and are strongly linked to CHS type. Furthermore, we showed for the first time that CHS were more sensitive in vitro to carbon ions than X-rays. Second, we investigated the efficiency of epigenetic therapy using an EZH2 inhibitor. We showed that the inhibitor reduces chondrosarcomas growth, both in vitro and in vivo. However, its molecular mechanisms remains unclear even if it is independent of EZH2. This work highlights the heterogeneity and the variety of chondrosarcomas responses to conventional treatments. Therefore, it is of importance to use chondrosarcomas with different grades and origins. Moreover, we confirm the interest of the hadrontherapy by carbon ions to treat CHS

Les thérapies moléculaires ciblées ont changé la prise en charge des patients atteints de cancer, et en particulier dans le cancer colorectal (CCR). Il est important d'identifier des biomarqueurs de sensibilité ou de résistance à ces traitements. En premier, la signalisation en aval de l'EGFR au niveau tumoral pourrait conditionner la réponse au cétuximab dans les cancers colorectaux (CCR). Notre premier travail a évalué le niveau d'expression tumorale de phosphoprotéines de signalisation en aval de l'EGFR (p-MEK, p-ERK1/2, p-AKT, p-GSK3b, p-P70S6K) analysés par Bioplex phosphoprotein array chez 42 patients avec un CCR métastatique, traités par anti-EGFR. L'expression de p-P70S6K est plus faible chez les patients répondeurs (p=0,02). La survie sans progression (SSP) est supérieure en cas d'expression faible de p-P70S6K (p=0,0001) et p-MEK (p=0,0006). p-MEK et p-P70S6K ont une expression plus élevée chez les KRAS mutés et apparaissent comme deux marqueurs pronostiques indépendants de KRAS (HR 0,34, p=0,01 et HR 0,42, p=0,03). Ainsi, le niveau d'expression des phosphoprotéines en aval de l'EGFR pourrait prédire la réponse et la SSP dans les CCR traités par anti-EGFR, indépendamment du statut KRAS. Il est difficile dans certain cas d'avoir accès au tissu tumoral. L'ADN circulant (cADN) dans les stades avancés de cancer peut aider à la caractérisation moléculaire des tumeurs, en tant que biopsie. Notre deuxième travail a étudié la faisabilité, la sensibilité et la spécificité d'une technique de spectrométrie de masse (Sequenom) pour détecter des mutations (238 mutations parmi 19 oncogènes) à partir du tissu tumoral et du cADN de 105 patients ayant un cancer avancé. La concentration médiane de cADN était de 17ng/ml de plasma (0,5-1600), soit 3 fois le niveau chez les volontaires sains. En analyse multivariée, la concentration de cADN, l'albumine et l'état général étaient des facteurs prédictifs indépendants de la survie globale des patients. De plus, il existait une concordance élevée des statuts mutationnels (KRAS, BRAF et PIK3CA) entre le tissu tumoral et le cADN dans plusieurs types tumoraux (CCR, sein, mélanome): un taux de concordance de 70% pour le gène KRAS et de 100% pour le gène BRAF ont été retrouvés dans le CCR. Notre Étude suggère que l'analyse du cADN pourrait être un matériel utilisable pour la recherche de mutations, notamment dans le suivi des patients ayant un cancer du colon traités par thérapies ciblées. Notre travail a donc montré l'intérêt de poursuivre l'étude de facteurs moléculaires qui pourraient prédire la réponse ou la résistance à des thérapies ciblées utilisées dans les cancers du colon, au niveau du tissu tumoral (phosphoprotéines) ou au niveau du sang (cADN).

Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus répandu dans le monde avec plus d’un million de patients diagnostiqués chaque année, dont 50% auront une évolution métastatique de leur maladie. Les récentes études pour améliorer les traitements du cancer colorectal métastatique (CCRm) ont permis le développement d’anticorps monoclonaux, le cetuximab et le panitumumab, capables d’inhiber l’activation des récepteurs au facteur de croissance épidermique (EGFR) et les voies de signalisation en aval (RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR), responsables de la croissance cellulaire, la prolifération, l’inhibition de l’apoptose, l’invasion et de l’évolution métastatique. Cependant, dans les études incluant des patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage », c’est à dire exemptes de mutation des gènes KRAS et NRAS, le taux de réponse aux thérapies à base de cetuximab ou du panitumumab sont de l’ordre de 40 à 60% seulement, ce qui signifie qu’une grande partie des patients traités échappent au traitement par le biais d’autres mécanismes. La présence d’altérations d’autres gènes comme PIK3CA, BRAF est responsable en partie des cas où les patients ne présentent pas de réponse. De plus, la surexpression ou l’altération de protéine comme PTEN, PI3K, AKT impliquées dans les voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT/mTOR peuvent avoir un impact significatif sur la prolifération cellulaire ou l’apoptose. L’absence ou la surexpression des protéines sous leur forme active phosphorylée pourrait présenter un intérêt pour prédire la réponse aux anti-EGFR chez les patients dont les tumeurs sont « RAS sauvage ». Dans ce travail, nous avons tout d’abord développé des techniques pour le génotypage des gènes RAS et PIK3CA à partir d’échantillons de tumeurs colorectales fixées au formol et incluses en paraffine, puis dans un second temps, nous avons validé ces méthodes selon la norme ISO 15189, puis dans un dernier temps, nous avons étudié l’expression des phosphoprotéines en aval des récepteurs à l’EGF ainsi que les statuts mutationnels des gènes KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA à partir de 100 échantillons de tumeurs congelées issues de patients atteints d’un CCRm et traités par un anti-EGFR. Sur 100 échantillons de tumeurs, 60 ne présentaient pas de mutation des gènes RAS. Parmi les patients dont les tumeurs ne présentaient pas de mutation des gènes RAS, 45,0% présentaient une réponse tumorale partielle ou complète et 55,0% étaient en maladie stable ou évolutive lorsqu’ils étaient traités par un anti-EGFR. Les patients dont les tumeurs présentaient une mutation des gènes RAS avaient une survie sans progression (PFS) significativement plus faible (HR=3.04 [1.91; 4.83];p<0.001) ainsi qu’une survie globale (OS) plus faible (HR=2.49 [1.56; 3.97];p<0.001). La PFS et la survie globale (OS) étaient significativement plus élevées chez les patients dont les tumeurs étaient « RAS sauvage ». L’expression de pAKT, pERK1/2 et pMEK1 étaient significativement plus faibles chez les patients dont les tumeurs étaient sauvages que chez les patients présentant des tumeurs RAS mutées (p=0,0246 ; p=0,004 ; p=0,0110 respectivement) et aucune différence significative d’expression entre les tumeurs RAS sauvage et RAS mutées n’a été démontrée pour pEGFR, pGSK3, pIGFR et pP90SRK. Chez les patients présentant des tumeurs RAS sauvage, le taux de réponse était significativement supérieur pour les tumeurs surexprimant pEGFR et pAKT au dessus des seuils calculés (p=0,0258 et p=0,0277 respectivement). Aucune différence significative n’a été trouvée entre le taux de réponse et l’expression des autres phosphoprotéines. Notre étude montre qu’associer la mesure de l’expression des phosphoprotéines de signalisation en aval d’EGFR, à l’analyse du statut mutationnel des gènes RAS, BRAF, PIK3CA pourrait présenter un intérêt dans la prédiction de la réponse aux thérapies anti-EGFR chez les patients atteints d’un cancer colorectal métastatique
Colorectal cancer is the third most common cancer worldwide with more than one million patients diagnosed each year, among 50% will develop metastatic disease. Recent efforts to improve the treatment of metastatic colorectal cancer (mCRC) has led to the development of monoclonal antibodies such as cetuximab and panitumumab, that inhibit the activation of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) and its downstream pathways (namely RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT/mTOR) that promote cell growth, proliferation, inhibition of apoptosis, invasion and metastasis. However, from studies including “RAS wild-type” i.e. KRAS and NRAS wild-type tumors, the response rates to cetuximab or panitumumab therapy ranged from only 40 to 60% which results in a large fraction of patients without any known causes for treatment failure. The presence of alterations in other genes such as PIK3CA or BRAF in the EGFR-dependent signaling pathways is responsible for some of the non-responding cases. Moreover, overexpression or alterations of proteins such as PTEN, PI3K, AKT, involved in the RAS/RAF/MAPK or PI3K/AKT/mTOR signaling pathways can have a significant impact on cell proliferation or apoptosis. Absence or overexpression of proteins under their active phosphorylated forms may be of interest to predict response to anti-EGFR in RAS wild-type patients. In this work, we first developed assays to assess RAS and PIK3CA mutations in formalin fixed paraffin embedded colorectal tumors, then we validated these assays according to ISO 15189 and we finally studied expression of downstream signalling phosphoproteins and KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA status in 100 frozen samples of patients with mCRC and treated with anti-EGFR. Among the 100 tumor samples, 60 were RAS wild-type. Among the RAS wild-type patients, 45.0% achieved a complete or partial response, and 55.0% had a stable disease or progression (p<0.001) when treated with anti-EGFR. Patients with a RAS mutation had significant lower progression-free survival (PFS) (HR=3.04[1.91; 4.83];p<0.001) and overall survival (OS) (HR=2.49[1.56; 3.97];p<0.001). PFS and OS were significantly higher in RAS wild-type patients. Expression of pAKT, pERK1/2 and pMEK1 was significantly lower in RAS wild-type patients than in RAS mutated patients (p=0.0246; p=0.004; p=0.0110 respectively) and no significant difference was observed between RAS wild-type and RAS mutated tumors in the expression of pEGFR, pGSK3, pIGFR, pP70S6K and pP90SRK. In RAS wild-type patients, response rate was significantly higher for tumors that overexpressed pEGFR and pAKT above the calculated threshold (p=0.0258 and p=0.0277 respectively). No significant relation was found between response rate and the level of expression of the other phosphoproteins. Our study shows that combining the analysis of the expression of EGFR downstream signalling phosphoproteins, RAS, BRAF or PIK3CA status could be of interest to predict the response to anti-EGFR therapies in patients with mCRC

Le VEGF-A joue un rôle clé au cours de l’angiogenèse physiologique mais aussi de la néo-vascularisation tumorale essentielle à la croissance des tumeurs malignes. Le VEGF-A et ses récepteurs (VEGFR1/2) représentent une cible de première importance pour le développement de thérapies anti-tumorales, et un certain nombre de médicaments anti-angiogéniques (AAG) inhibant le VEGF-A ou ses récepteurs sont actuellement utilisés en clinique dans le traitement des carcinomes pulmonaires. Parmi les thérapies anti-angiogéniques ciblant le VEGF-A, on peut lister soit l’anticorps monoclonal anti-VEGF Bevacizumab (BVZ) ou bien les inhibiteurs pharmacologiques du domaine tyrosine kinase des VEGFR: les VEGFR-TKI. Seuls les patients porteurs d’adénocarcinomes pulmonaires peuvent bénéficier de thérapies AAG, les patients porteurs de carcinomes squameux présentant de sévères complications (hémorragies pulmonaires). Le sVEGFR1, est un variant tronqué du VEGFR1 qui ne contient que les premiers six motifs N-terminaux extracellulaires de type Ig du domaine extracellulaire et il est dépourvu des domaines transmembranaire et tyrosine kinase. Le sVEGFR1 a éte initialement considéré comme un facteur anti-angiogénique qui neutralise les fonctions du VEGF-A dans les cellules endothéliales. Les hauts niveaux ont été corrélés avec un mauvais pronostic et une mauvaise réponse aux thérapies dans plusieurs types de cancer. Nous avons montré in vitro dans 4 lignées cellulaires de SCC que le bevacizumab, ainsi que les inhibiteurs VEGF-TKI (Semaxanib, KI8751) augmentent les niveaux intra- et extra-cellulaires du sVEGFR1. Nous avons confirmé ces résultats in vivo dans des modèles murins de xénogreffes squameux induits par NCTU. De façon intérssante, l’augmentation du sVEGFR1 en réponse aux thérapies anti-angiogénique est spécifique aux modèles squameux et n’a pas été observée dans les modèles d’adénocarcinomes in vitro et in vivo. Sur le plan moléculaire, nous avons montré que le VEGF165 par l’intermédiaire de SOX2 régule l’expression du sVEGFR1 en réponse aux thérapiesAAG. De plus, nous avons identifié une boucle autocrine 1 intégrine / VEGFR1 / VEGFR2 par laquelle sVEGFR1 contrôle différentiellement la prolifération cellulaire et la survie, permettant notamment de distinguer les cellules SCC sensibles ou résistantes aux thérapies AAG. Enfin, dans une série de 77 cancers bronchiques non à petites cellules, nous avons montré que 11% et 44% des patients SCC expriment de bas ou de hauts nivaux de sVEGFR1 respectivement. Les hauts niveaux ont été corrélés avec des stades pTNM avancés. Dans l'ensemble, nos résultats sont la première preuve que les thérapies AAG augmentent l'expression du sVEGFR1 dans les cellules SCC. En outre, nos données mettent en évidence une fonction pro-tumorale inattendue de sVEGFR1 grâce à l'activation d'une boucle autocrine VEGFR/ β1 intégrine. Ces résultats pourraient aider à comprendre pourquoi les SCC répondent différemment aux AAG que les ADC et d'identifier les patients SCC qui pourraient etre éligibles à ces thérapies
Vascular endothelial growth factors (VEGFs) and their receptors are regulators of physiological and pathological angiogenesis. In patients with squamous cell lung carcinoma (SCC), clinical trials evaluating anti-angiogenic therapies (AAG) have failed to identify strong benefits. Rather, these patients are at higher risk of bleeding complications when exposed to Bevacizumab (BVZ), a humanized monoclonal anti-VEGF-A antibody. The soluble VEGF receptor-1, namely sVEGFR1, is a truncated version of the cell membrane-spanning VEGFR1 that only retains the first six N-terminal Ig-like extracellular motifs of VEGFR1 owing to alternative splicing of its pre-mRNA. As a consequence, sVEGFR1 is mainly viewed as an anti-angiogenic factor that counteracts VEGF-A functions on endothelial cells. Moreover, high levels of sVEGFR1 were correlated with bad prognosis and bad response to therapies in many cancer types. Using various SCC cell lines, we showed that Bevacizumab as well as VEGFR-Tyrosine Kinase Inhibitors (Semaxanib, KI8751) increase the intra- and extra-cellular levels of sVEGFR1. We confirmed this up-regulation in NCTU-induced SCC murine tumorgrafts models treated with VEGFR-TKI (sunitinib) or anti-VEGFR2 (DC101). Of note, this effect was never observed in the lung adenocarcinoma histological sub-type (ADC), using either cell lines or a mouse model treated in the same conditions. At the molecular level, we identified the VEGF165 and SOX2 proteins as crucial upstream regulators of sVEGFR1 in response to AAG. Moreover, we unraveled an original and SOX2 proteins as crucial upstream regulators of sVEGFR1 in response to AAG. Moreover, we unraveled an original ines or a mouse model treato discriminate between AAG-sensitive or -resistant SCC cells. Finally, in a series of 77 Non Small Cell Lung Carcinoma, we provided the first description of a differential pattern of sVEGFR1 expression with 11% and 44% of SCC exhibiting no or high expression respectively, high levels of sVEGFR1 being correlated with advanced pTNM stages. As a whole, our results provide the first evidence that AAG therapies upregulate sVEGFR1 expression in SCC cells. In addition, our data highlight an unexpected pro-tumoral function of sVEGFR1 through the activation of a beta 1 integrin-dependent VEGFR autocrine loop. These results might help to understand why SCC are less responsive to anti-angiogenic drugs than ADC and to identify SCC patients eligible to these therapies

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez la femme et constitue un véritable problème de santé publique. Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la caractérisation des principales voies de signalisation et ont mis en évidence l'implication majeure de la signalisation cellulaire dans les processus de cancérogenèse. Des cibles moléculaires ont ainsi été identifiées et ont permis le développement de thérapeutiques dites ciblées, telles que les anticorps monoclonaux ou encore les inhibiteurs de kinase. Malgré ces avancées considérables qui ont permis l'amélioration de la prise en charge des patientes, on constate l'apparition de résistances aux traitements. Ce travail avait pour objectifs d'identifier de nouveaux biomarqueurs et de déterminer leur signification clinique, leur intérêt théranostique ainsi que leur impact sur la réponse aux traitements. Dans un premier temps nous avons étudié les mutations activatrices du gène PIK3CA. Ces mutations sont retrouvées dans 25% des cancers du sein et sont impliquées dans la résistance au trastuzumab, aux anti-œstrogènes et aux inhibiteurs de mTOR. 149 échantillons de tumeurs de sein infiltrantes ont été analysés par une technique de PCR-HRM (High Resolution Melting) et 118 échantillons par une technique de PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Les résultats des 2 techniques étaient concordants (k=0,845 ; p<0,001) et une relation entre mutations du gène PIK3CA et grade SBR a été mise en évidence, les tumeurs de grade SBR III étant moins fréquemment mutées que les autres (p=0.025 en HRM et p=0.009 en ARMS). Dans un second temps, notre travail a consisté en l'exploration fonctionnelle des voies de signalisation PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases et P38MAPKinase. Pour cela nous avons analysé le niveau d'expression des phosphoprotéines p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1/2, p-P90RSK, p-IGF1R ainsi que p-P38MAPK par immuno-analyse multiplexe. Cette partie a comporté 3 études. Une première étude rétrospective sur 45 échantillons de tumeurs mammaires invasives congelées a mis en évidence des niveaux d'expression de P38 et de p-P38 plus élevés dans les tumeurs RE+. La deuxième étude était une étude prospective visant à déterminer des biomarqueurs de réponse à l'association trastuzumab-évérolimus chez des patientes présentant un cancer du sein précoce traitées en préopératoire. Cette étude a révélé une augmentation statistiquement significative du niveau d'expression de p-MEK1 (p=0.012), p-ERK1/2 (p=0.003) et p-P38MAPK (p<0.001) dans le bras de traitement associant l'évérolimus au trastuzumab qui pourrait s'expliquer par la suppression par l'évérolimus d’une boucle de rétrocontrôle négatif contrôlant l'activation de la voie RAS/RAF/MAPKinases. Dans le bras de traitement évaluant le trastuzumab seul, aucune variation du niveau d'expression des phosphoprotéines n'a été mise en évidence, y compris en aval du récepteur HER2, ce qui soulève l'hypothèse d'un mécanisme d'action prédominant immunologique du trastuzumab. La troisième étude qui comparait l'impact du trastuzumab in vitro et en situation clinique confirme la différence des mécanismes d'action mis en jeu en fonction des conditions cellulaires et cliniques. Dans son ensemble, ce travail a mis en évidence que la détermination du statut mutationnel du gène PIK3CA et du niveau d’expression des phosphoprotéines pourrait être utile à une meilleure caractérisation moléculaire des cancers du sein et à l’optimisation de la personnalisation des prescriptions de thérapies ciblées
Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and is a real public health problem.Advances in molecular biology have allowed the characterization of the major signaling pathways and revealed their major implication in carcinogenesis processes. Molecular targets have been identified and have enabled the development of targeted therapies, such as monoclonal antibodies, or kinase inhibitors. Despite these considerable advances that have improved the care of patients, emerging of resistance to treatments has been observed. The aim of this work was to identify new tumor biomarkers and determine their clinical significance, their theranostic interest and their impact on the response to targeted therapies. Initially, we studied the activating mutations of the PIK3CA gene. These mutations are found in 25% of breast cancers and are involved in resistance to trastuzumab, antiestrogens and mTOR inhibitors. We analyzed 149 invasive breast tumor samples for PIK3CA gene mutations by PCR-HRM (High Resolution Melting) and 118 by PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). The results achieved with the 2 techniques were consistent (k = 0.845; p <0.001) and a relationship between PIK3CA mutations and grade SBR was highlighted with a lower occurrence of mutations in SBR grade III tumors (p=0.025 in HRM and p=0.009 in ARMS). Secondly, we investigated the functional alteration of PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases and P38MAPKinase signaling pathways. We have analyzed the expression level of phosphoproteins p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1 / 2, p-P90RSK, p-IGF1R and p-p38MAPK by multiplex immunoanalysis. This part includes 3 studies. The first study was a retrospective study of 45 frozen samples of invasive breast tumors in which we observed that the level of expression of P38 and p-P38 was higher in the ER + tumors. The second study was a prospective study to identify biomarkers of response to trastuzumab-everolimus association in patients with early breast cancer treated preoperatively. This study showed a statistically significant increase of the expression level of p-MEK1 (p = 0.012), p-ERK1/2 (p = 0.003) and p-p38MAPK (p<0.001) in arm treated by trastuzumab associated with everolimus. It could be explained by the repression of a negative feedback loop involving S6K, PI3K and RAS by everolimus, leading to the activation of RAS/RAF/MAPKinases signaling pathway. In the control arm investigating trastuzumab alone, no significant variations of the level of expression of phosphoproteins was demonstrated, raising the hypothesis of the implementation of a predominant immunological mechanism of action for Trastuzumab. The third study that compared effect of trastuzumab in vitro and in clinical setting confirms that trastuzumab has different modes of action when evaluated in cells and in clinical conditions. As a whole, this work showed that determining the mutation status of PIK3CA and the expression level of phosphoproteins could be useful to refine the molecular characterization of breast cancers and optimize the criteria used to personalize the prescription of targeted therapies

Les thérapies ciblées ont amélioré la survie des patients atteints de mélanome cutané métastatique, toutefois certains patients échappent au traitement. La réponse au traitement met en jeu des paramètres dépendants du patient, de la biologie de la tumeur, et de la survenue de mécanismes de résistance largement étudiés.Le but de ce travail est d’étudier deux marqueurs mesurables en pratique clinique lors du suivi des patients, pour leur potentiel prédictif de réponse aux inhibiteurs de BRAF en monothérapie, l’un biologique et l’autre pharmacologique : la charge allélique mutée (CAM), définie par le rapport muté/total, des oncogènes BRAF et NRAS, et la concentration plasmatique de vemurafenib (CPV).Nous rapportons pour la première fois la prévalence et les mécanismes du déséquilibre allélique des oncogènes BRAF et NRAS, défini par une CAM élevée (>60%) ou faible (≤30%), par opposition à une CAM « hétérozygote » équilibrée (entre 30 et 60%). Des arguments in vitro et in vivo soutiennent l’hypothèse qu’une CAM BRAFV600E >60% puisse être associée à une meilleure réponse aux inhibiteurs de BRAF. La CAM de NRAS ne semble pas être un marqueur pronostique au moment du diagnostic de mélanome, toutefois sa valeur prédictive sur la réponse aux inhibiteurs de MEK sera intéressante à étudier.Nous montrons pour la première fois l’impact du dosage de la CPV lors du suivi des patients traités en monothérapie. Une CPV basse serait prédictive d’une progression ; ainsi, la CPV semble être un marqueur prédictif original de réponse, pour lequel la valeur seuil ainsi que les mécanismes pharmacogénétiques impliqués restent à déterminer
Targeted therapies have improved survival in patients with metastatic cutaneous melanoma, but some patients escape treatment. Response to treatment involves parameters dependent of the patient, the tumor biology, and the occurrence of resistance mechanisms extensively investigated. The aim of this work is to study two measurable markers in clinical practice in patient monitoring, for their predictive potential of response to BRAF inhibitors monotherapy; the first one is biological and the other one is pharmacological: mutant allele burden (MAB), defined by the ratio mutant/total, of BRAF and NRAS oncogenes, and plasma vemurafenib concentration (PVC).We report for the first time the prevalence and the mechanisms of BRAF and NRAS oncogenic allelic imbalance, defined by a high (>60%) or a low (≤30%) MAB, as opposed to a balanced “heterozygous” MAB (30 to 60%). In vitro experiments and in vivo data support the hypothesis that a BRAFV600E MAB >60% may be associated with a better response to BRAF inhibitors. NRAS MAB does not seem to be a baseline prognostic marker, but its predictive value of response to MEK inhibitors will be interesting to investigate.We demonstrated for the first time the impact of CPV assay during the monitoring of patients treated with monotherapy. A low CPV would be predictive of progression; thus, CPV appears to be an original predictive marker of response, for which the threshold value and the involved pharmacogenetic mechanisms remain to be determined

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. L'angiogenèse tumorale est le processus de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Une tumeur cancéreuse peut induire l'angiogenèse afin de disposer d'apports supplémentaires en oxygène et nutriments, indispensables à la poursuite de son développement. Cette thèse consiste en l'élaboration d'un modèle mathématique multi-échelle de l'angiogenèse tumorale. Ce modèle intègre les principaux mécanismes intervenant aux échelles tissulaire et moléculaire. Couplé à un modèle de croissance tumorale, notre modèle permet d'étudier les effets de l'apport en oxygène sur la croissance tumorale. D'un point de vue mathématique, ces modèles d'angiogenèse et de croissance tumorale reposent sur des équations aux dérivées partielles de réaction-diffusion et d'advection régissant l'évolution spatio-temporelle des densités de cellules endothéliales, cellules constituant la paroi des vaisseaux sanguins, et tumorales, ainsi que celle des concentrations tissulaires en substances pro- et antiangiogéniques et en oxygène. A l'échelle moléculaire, la liaison des substances angiogéniques aux récepteurs membranaires des cellules endothéliales, mécanisme clé de la communication intercellulaire, est modélisée à l'aide de lois pharmacologiques. Ce modèle permet ainsi de reproduire in silico les principaux mécanismes de l'angiogenèse et d'analyser leur rôle dans la croissance tumorale. Il permet également de simuler l'action de différentes thérapies anti-angiogéniques, et d'étudier leur efficacité sur le développement tumoral afin d'aider à l'innovation thérapeutique

Colicines et bactériophages parasitent le système Tol d'E. Coli. La translocation de la colicine A et de l'ADN de phage M13 à travers l'enveloppe implique la liaison avec le domaine C-terminal de la protéine TolA (TolAIII). Nous avons entrepris l'étude par RMN du domaine TolAIII d'E. Coli. Nous avons caractérisé 3 échantillons de TolAIII, déterminé l'attribution des résonances de l'un d'eux et étudié les interactions entre TolAIII et ses partenaires. L'étude de la liaison de TolAIII avec TolB permet de localiser sa zone d'interaction sur TolA. La liaison de TolAIII avec le domaine N-terminal de la colicine A augmente la flexibilité de TolAIII. La liaison du domaine de protéine de phage g3p N1 avec TolAIII suggère des changements de conformation de TolAIII. Nous avons déterminé la structure 3D de TolAIII isolé en solution à l'aide du protocole ARIA pour l'attribution semi-automatique des NOE. Nous comparons cette structure avec celle (radiocristallographique) de TolAIII complexé à g3p N1.

De l’ADN libre circulant (ADNc) dérivant de la tumeur peut être isolé dans le plasma des patients présentant un cancer. Cet ADNc tumoral (ADNct) permet un accès indirect à la tumeur puisqu’il porte les même caractéristiques génétiques et épigénétiques et représente une biopsie liquide. Nous avons évalué l’intérêt du séquençage ciblé de l’ADNct comme biomarqueur de réponse à des thérapies ciblées développées en phase précoce en oncologie. Dans la première partie de ce travail, nous avons évalué les mutations identifiables par séquençage de l’ADNct d’une cohorte de 39 patients recevant un traitement anti-cancéreux dans le cadre d’un essai thérapeutique de phase I. Un total de 157 échantillons de plasma a été séquencé avec une couverture moyenne de 1685x. A l’initiation du traitement, 23 des 39 patients (59%) avaient au moins une mutation identifiable dans l’ADNct. Parmi les 44 mutations identifiées, TP53, PIK3CA et KRAS étaient les gènes les plus fréquemment mutés avec des fréquences de 41%, 20% et 18% respectivement. Dans un second temps, l’ADNc des patients ayant des mutations identifiées a été collecté et séquencés tous les mois au cours du traitement jusqu’à progression. Parmi les 23 patients, 13 ont reçu une thérapie ciblant directement l’anomalie moléculaire identifiée. Le suivi longitudinal des mutations identifiées dans l’ADNct et la dynamique des fréquences alléliques pendant le traitement a mis en évidence des variations associées à la réponse thérapeutique. Par ailleurs, pour les patients présentant plusieurs mutations identifiées dans un même échantillon d’ADNct, le suivi de ces mutations a mis en évidence la présence de clones évoluant de manière discordante au cours du traitement. Les variations quantitatives des fréquences alléliques des mutations dans l’ADNct étaient associées au temps jusqu’à progression sous traitement. L’ADNct est un biomarqueur d’intérêt pour le développement des thérapies ciblées en oncologie fait l’objet de nombreux développement en oncologie qui seront discutés dans ce travail
Circulating cell free DNA (ccDNA) deriving from tumor can be isolated in plasma of cancer patients. This circulating tumor DNA (ctDNA) shared the same genetics and epigenetics characteristics with the tumor and represents virtually a liquid biopsy. We evaluated whether targeted next-generation sequencing (NGS) of circulating tumor DNA (ctDNA) could be used for patient selection and as a tumor clone response biomarker in 39 patients with advanced cancers participating in early-phase clinical trials of targeted drugs. Overall, 159 plasma samples were sequenced with a mean sequencing coverage achieved of 1,685X across experiments. At trial initiation (C1D1), 23 of 39 (59%) patients had at least one mutation identified in cfDNA. Out of the 44 mutations identified at C1D1, TP53, PIK3CA and KRAS were the top three mutated genes identified, with 18 (41%), nine (20%), eight (18%) different mutations, respectively. In the second part of this work, we performed sequential NGS of ctDNA for the 23 patients with cfDNA mutation identified at C1D1. The monitoring of mutation allele frequency (AF) in consecutive plasma samples during treatment with targeted drugs demonstrated potential treatment associated clonal responses. Longitudinal monitoring of cfDNA samples with multiple mutations indicated the presence of separate clones behaving discordantly. Molecular changes at cfDNA mutation level were associated with time to disease progression. Targeted NGS of ctDNA has potential clinical utility to monitor the delivery of targeted therapies and future directions are discussed

Les thérapies ciblées dirigées contre les récepteurs de la famille des HER représentent un progrès majeur en cancérologie. Leur efficacité repose sur leur capacité à inhiber la signalisation oncogénique notamment recrutant les voies RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT. Indépendamment de l'expression de la cible moléculaire, l'activité des thérapies ciblées est tributaire de la présence dans le tissu tumoral d'anomalies génétiques capables de perturber la signalisation cellulaire tumorale en aval des récepteurs. Notre travail a consisté à évaluer l'intérêt de l'évaluation de la fonctionnalité des voies de signalisation par analyse multiplexe des niveaux d'expression des formes phosphorylées des principales kinases intracellulaires en aval des récepteurs HER. La preuve de concept a été tout d'abord apportée sur des modèles cellulaires génétiquement modifiés, en montrant l'impact d'anomalies génétiques tumorales sur la fonctionnalité des voies de signalisation RAS/RAF/MAPK et PI3K/AKT et sur la réponse au cétuximab. Dans la seconde partie de ce travail, après validation des techniques utilisées en situation clinique, nous avons montré la pertinence d'une approche de biologie intégrative combinant analyse de génétique moléculaire et analyses fonctionnelles avec analyse en composante principale. Nos résultats, obtenus au cours d'une étude clinique rétrospective dans les cancers colorectaux métastatiques, suggèrent que l'utilisation des données issues de l'évaluation de la fonctionnalité des voies de signalisation en aval des récepteurs HER, pourraient à terme trouver des applications en qualité de marqueurs prédictifs de réponse clinique aux thérapies ciblées anti-HER
Targeted therapies, monoclonal antibodies and tyrosine kinase inhibitors, directed against the Human Epidermal Growth Factor Receptors (HER) family, represent a major advance in oncology. Their efficacy depends on their ability to inhibit oncogenic signalling, including the RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT signalling pathways. Regardless of the expression of the molecular target, the efficacy of targeted therapies is independent on the genetic abnormalities of the tissue which are able to disrupt tumour cell signalling, and the research of these abnormalities is now included in the prescription criteria. The aim of this work was to evaluate the usefulness of assessing HER downstream signalling functionality using multiplex analysis of the phosphorylated forms of key intracellular kinase signalling. Proof of concept was first introduced with genetically modified cell lines models, showing the consequences of tumour genetic abnormalities on RAS/RAF/MAPK and PI3K/AKT signalling pathways and on response to cetuximab. In the second part of this work, after validation of the techniques used in clinical situation, we demonstrated the relevance of system biology approach, combining molecular biology and functional analysis with principal component analysis. Our results obtained in a retrospective clinical study in metastatic colorectal cancer, suggests that the use of data from the evaluation of HER downstream signalling pathways functionality could eventually find applications as predictive markers of clinical response to anti-HER targeted therapies

Le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) est la tumeur du rein la plus fréquente. Il se caractérise par une inactivation fréquente du gène suppresseur de tumeur VHL retrouvée dans 70% des tumeurs conduisant à une transcription des gènes cibles du facteur de transcription HIF dont le VEGF. Il s’agit d’une tumeur agressive métastatique chez 50% des patients. Le sunitinib, un inhibiteur des récepteurs tyrosine kinase anti-angiogénique, est actuellement le plus utilisé en 1ère ligne malgré 30% des patients qui progressent rapidement. L’avènement d’un nouvel anti-angiogénique ciblant MET (cabozantinib) et d’immunomodulateurs (anticorps anti-PD-1, nivolumab) rend cruciale la découverte de facteurs prédictifs de réponse au traitement. Dans une 1ére partie, nous avons étudié une série rétrospective de 98 ccRCC consécutifs pour lesquels nous souhaitions étudiés le statut VHL complet et le corréler à l’expression de PD-L1. De plus, alors que le pronostic est différent entre ccRCC métastatiques synchrones (d’emblée) et métachrones (à distance), leur phénotype n’avait jamais été comparé. Pour cela, nous avons effectué une analyse histologique des principaux facteurs pronostiques, immunohistochimique (CAIX, VEGF, PAR3, PD-1 et PD-L1) et moléculaire (statut complet VHL : délétion, mutation et méthylation du promoteur) corrélée à la survie spécifique. Nous avons démontré que le statut VHL non-inactivé (niVHL) était associé à la présence de métastases synchrones, une composante sarcomatoïde, un infiltrat lymphocytaire dense, une surexpression de VEGF, une expression de PD-L1 et à un mauvais pronostic. Nous avons aussi comparé les phénotypes des ccRCC métastatiques métachrones et synchrones. Ces derniers étaient associés à une composante sarcomatoïde, une expression cytoplasmique de PAR-3, une surexpression de VEGFA, un statut niVHL et à un mauvais pronostic depuis le diagnostic des métastases. Dans une 2ème partie, nous avons étudié une série rétrospective de 90 ccRCC métastatiques consécutifs traités par sunitinib en première ligne afin d’identifier des facteurs prédictifs de réponse ou de résistance. Nous avons utilisé les mêmes techniques que précédemment avec en plus le statut MET (mutation en NGS et expression en IHC). Les patients ont été classés en résistants primaires, intermédiaires et longs répondeurs en fonction de la durée de leur réponse évaluée par des critères radiologiques (RECIST). Nous avons aussi caractérisé le profil génétique de 73 ccRCC de cette série par CGH array pour lesquels nous disposions de congélation. Les patients résistants primaires avaient plus souvent un mauvais pronostic (score de Heng), des métastases hépatiques, une infiltration de la graisse hilaire. Sur le plan cytogénétique, leurs tumeurs présentaient des altérations génétiques plus nombreuses tant au niveau des gains que des pertes. Parmi ces altérations récurrentes, étaient décrites les gains du 5p, 7p, 8q22.1-qter et la perte de la région 6q21-q25.3. Le modèle de Cox multivarié mettait en évidence 4 facteurs indépendants : le score de Heng, des métastases hépatiques, une infiltration de la graisse hilaire et le gain du 8q qui intégrés dans un nomogramme pronostique avaient un c-index de 0.74 et 0.77 pour la survie sans progression et la survie globale. En conclusion, notre étude a permis d’identifier un sous-type de ccRCC avec un statut niVHL de mauvais pronostic qu’il conviendrait d’étudier de manière plus approfondie sur le plan génomique. De plus, nous avons montré une différence de phénotype entre les ccRCC des patients métastatiques synchrones et métachrones alors que leur prise en charge est actuellement équivalente. Enfin nous avons mis en évidence un nomogramme pronostique dans les ccRCC métastatiques traités par sunitinib en 1ère line. Ce nomogramme s’il est confirmé par une étude prospective plus large pourrait avoir un impact clinique important dans la sélection des patients les plus à même de bénéficier des anti-angiogéniques
Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is the most common kidney cancer. It is characterized by frequent inactivation of the tumor suppressor gene VHL found in 70% of tumors leading to the transcription of HIF transcription factor target genes such as VEGF. This is an aggressive tumor with 50% of metastatic patients. Sunitinib, an inhibitor of receptor tyrosine kinase antiangiogenic, is currently the most used in 1st line despite 30% of patients who progress quickly. The advent of a new anti-angiogenic targeting MET (cabozantinib) and immunomodulators (anti-PD-1 antibody, nivolumab) makes crucial discovery of predictors of response to treatment. In the first part, we studied a retrospective study of 98 consecutive ccRCC. We assessed complete VHL status and correlated it with the expression of PD-L1. Moreover, while the prognosis is different between ccRCC synchronous metastatic and metachronous, their phenotype have never been compared. In this purpose, we performed an analysis of the main pathological prognostic factors, immunohistochemical markers (CAIX, VEGF, PAR3, PD-1 and PD-L1) and molecular (VHL status: deletion, mutation and promoter methylation) correlated with specific survival. We demonstrated that non-inactivated VHL tumors (niVHL) were associated with the presence of synchronous metastases, sarcomatoid component, a dense lymphocytic infiltrate, an overexpression of VEGF, an expression of PD-L1 and a poor prognosis. We also compared the phenotypes of metachronous and synchronous metastatic ccRCC. The first ones were associated with sarcomatoid component, cytoplasmic expression of PAR-3 overexpression VEGFA and niVHL status and a poor prognosis even from the diagnosis of metastases. In the second part, we studied a retrospective study of 90 consecutive metastatic ccRCC treated with first line sunitinib to identify predictors of response or resistance. We used the same techniques as above plus the MET status (mutation in Next-Generation sequencing and expression by IHC). Patients were classified as primary-refractory, intermediate and long-term responders depending on the duration of their response as assessed by radiological criteria (RECIST). We also characterized the genetic profile of 73 ccRCC of this series by CGH array for which we had frozen tumor. Primary refractory patients often had poor prognosis (Heng criteria), liver metastases, infiltration of the hilar fat. Cytogenetically, their tumors had many more genetic alterations, both gains as losses. These recurrent alterations were gains of 5p, 7p, 8q22.1-qter and loss of 6q21-q25.3 region. The multivariate Cox model highlighted four independent factors: the score of Heng, liver metastases, infiltration of the hilar fat and gain of 8q which integrated into a prognostic nomogram had a c-index of 0.74 for survival progression-free survival and 0.77 for overall survival. In conclusion, our study identified a subtype of ccRCC with a poor prognosis with niVHL status that should be explored at the genomic level. Furthermore, we showed a phenotype difference between ccRCC synchronous and metachronous metastatic patients whereas their care is currently the same. Finally we have identified a prognostic nomogram in metastatic ccRCC treated with sunitinib in the first line. This nomogram if confirmed by a larger prospective study could have a significant clinical impact in the selection of patients most likely to benefit from anti-angiogenic therapy

Le VEGF-A est l'un des facteurs de croissance les plus importants au cours de la néo-angiogénèse tumorale. Ce rôle en a fait une cible de choix pour le développement de thérapies. Ainsi, différents médicaments le ciblant (Bevacizumab, AvastinR) ou ciblant ses voies de signalisation (inhibiteurs des récepteurs VEGFR) sont actuellement utilisés en clinique, notamment dans les adénocarcinomes pulmonaires. Cependant, malgré des résultats initiaux prometteurs, un grand nombre de patients apparaissent d'emblée résistants ou échappent à ces thérapies, voir même développent des tumeurs plus agressives. A ce jour, il n'existe aucun moyen d'identifier les patients susceptibles de répondre à ces thérapies. Récemment, de nouveaux variants d'épissage du VEGF-A issus d'un épissage alternatif différentiel au niveau du dernier exon ont été identifiés, les isoformes VEGFxxxb. A l'inverse des VEGFxxx, ces variants sont anti-angiogéniques. Si les effets paracrines des isoformes du VEGF-A sur les cellules endothéliales ont été bien caractérisés, bien peu d'études se sont penchées sur leurs effets autocrines sur les cellules tumorales qui expriment à leur surface les récepteurs VEGFR1 et VEGFR2. Dans ce contexte, le but principal de notre étude était de déterminer le statut d'expression et les fonctions biologiques de l'isoforme VEGF165b dans les tumeurs primaires et dans des modèles cellulaires dérivés de Carcinomes Pulmonaires Non à Petites Cellules (CBnPCs). Nos résultats identifient des profils d'expression variables du VEGF165b chez les patients atteints de CBnPCs, et montrent que de hauts niveaux intratumoraux de VEGF165b sont associés à un envahissement ganglionnaire. De plus, nos résultats identifient une boucle autocrine au travers de laquelle l'activation des récepteurs VEGFR1/VEGFR2 par le VEGF165b conduit à l'apparition de cellules tumorales présentant un phénotype plus invasif. Finalement, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par le Bevacizumab (BVZ) mais aussi par les sels de platine auquel il est associé en clinique augmente l'expression du VEGF165b, la signalisation autocrine qu'il active et conduit à l'apparition de cellules tumorales plus agressives et résistantes à l'apoptose induite par le cisplatine. Ces résultats sont la première démonstration de la capacité du VEGF165b à signaliser sur les cellules tumorales. Dans une seconde étape de notre travail, nous avons étudié le rôle que pourraient jouer les intégrine β1 et β3 dans le maintien de la signalisation induite par le VEGF165b dans les cellules de CBnPCs. Nous montrons que le VEGF165b active l'intégrine β1. Cette activation aboutit à un réarrangement du cytosquelette d'actine en fibres de stress, ce qui pourrait favoriser la migration de ces cellules. De manière intéressante, le BVZ est capable d'induire ce même phénotype par un mécanisme nécessitant l'expression du VEGF165b, de l'intégrine β1, mais aussi de l'intégrine β3. La formation de ces fibres de stress est associée à l'activation de voies de signalisation d'aval mettant en jeu la phosphorylation des protéines FAK et cofiline. De plus, nous mettons en évidence l'existence de complexes entre la neuropiline 2 et l'intégrine β1 dans les cellules de CBnPCs qui seraient susceptibles de participer à l'activation de ces voies. Ainsi, le VEGF165b et le BVZ apparaissent capable de signaliser à travers les intégrines β1 et β3 dans les cellules de CBnPCs, suggérant un rôle de ces intégrines dans la réponse des cellules tumorales aux thérapies anti-angiogéniques. En conclusion, nos résultats identifient un rôle du variant VEGF165b dans la progression des CBnPCs et la réponse aux thérapies anti-angiogéniques et aux chimiothérapies, ce qui suggère que le VEGF165b pourrait être un marqueur réponse au BVZ dans les CBnPCs
VEGF-A is one of the most important factors during tumor neoangiogenesis. This role has made it a prime target for the development of therapies. Thus, various drugs targeting VEGF-A (Bevacizumab, Avastin®) or its signaling pathways (VEGFR inhibitors) are currently used in clinical practice, especially in lung adenocarcinomas treatment. However, despite promising initial results, many patients are refractory or escape these therapies, and sometimes, even develop more aggressive tumors. To date, there is no means to identify patients who are likely to respond these treatments. Recently, new splicing variants of VEGF-A resulting from an alternative splicing at the last exon, were identified and called VEGFxxxb. Unlike VEGFxxx, these variants are antiangiogenic. If paracrine effects of VEGF-A isoforms on endothelial cells have been well characterized, few studies have examined their autocrine effects on tumor cells expressing VEGFR1 and VEGFR2. In this context, the main aim of our study was to determine the expression status and biological functions of VEGF165b in primary tumors and derived cell models of non small cell lung carcinoma (NSCLC). Our results identify variable expression profiles of VEGF165b in NSCLC patients, and show that high levels of intratumoral VEGF165b are associated with lymph node metastases. Furthermore, our results identify an autocrine loop through which the VEGFR1/VEGFR2 activation by VEGF165b leads to the appearance a more invasive phenotype on tumor cells. Finally, our results show that treatment of tumor cells by Bevacizumab (BVZ) but also platinum salts, with which it is associated clinics, increases VEGF165b expression and autocrine signaling, which leads to appearance of tumor cells that are more aggressive and resistant to cisplatin-induced apoptosis. These results are the first evidence of the VEGF165b ability to signalize on tumor cells. In a second stage of our work, we investigated the potential role of β1 and β3 integrins in maintaining VEGF165b signaling in NSCLC cells. We show that VEGF165b activates beta1 integrin. This activation leads to a rearrangement of the actin cytoskeleton in stress fibers, which may promote tumor cell migration. Interestingly, BVZ is able to induce this same phenotype by a mechanism requiring the expression of VEGF165b , beta1 integrin and beta3 integrin. The formation of these stress fibers is associated with the activation of downstream signaling pathways involving proteins phosphorylation of FAK and cofilin. In addition, we highlight the existence of neuropilin-2/β1 integrin complexes in NSCLC cells, which are likely to participate in these pathways activation. Thus, VEGF165b and especially BVZ appear able to signal through beata1 and beta3 integrins NSCLC cells, suggesting a role of these integrins in tumor cells response to antiangiogenic therapies. In conclusion, our results are the first evidence of a role of VEGF165b in NSCLC progression and response to antiangiogenic therapies and chemotherapies; they suggest that VEGF165b could be a marker of response to BVZ in NSCLC

Une forte production de la chimiokine CCL2 par les cellules malignes et les cellules stromales a été démontrée dans la plupart des cancers humains. Ainsi, l’axe chimiokinique CCR2/CCL2 est un important marqueur du développement des cancers ; ce même axe est associé à la récurrence de tumeurs après thérapie anticancéreuses. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Treg) ont des capacités immunosuppressives robustes et contribue à la croissance tumorale. Durant cette thèse, je me suis intéressé à la fonction de l’expression du récepteur de chimiokine CCR2 par ces cellules dans le contexte de thérapies anticancéreuses. Nous avons montré que le récepteur de chimiokines CCR2 contrôle la migration des Treg en contexte tumoral, chez l’homme et la souris, et que son expression par les Treg peut servir de biomarqueur de la réponse à la chimiothérapie. Notre étude indique une nouvelle fonction de CCR2 et définie un nouveau sous-type de Treg impliqué dans la régulation de l’immunité antitumorale. En parallèle, nous avons pu mettre en évidence que les métastases pulmonaire sont composées à la fois de macrophages résident du tissu et de macrophages recrutés via l’axe CCR2. La présence de macrophages résidents au sein des tumeurs pourrait contribuer à l’hétérogénéité des microenvironnements de diffèrent type de tumeurs. Le récepteur CCR2 est important pour le la phase de rechute après chimiothérapie, indiquant un rôle limité des macrophages résidents dans ce phénomène. De plus, nous avons montré que le VEGF joue un rôle direct dans la survie des TAM. Ainsi, la combinaison de la chimiothérapie avec un anticorps anti-VEGF cible simultanément les TAM résidents et recrutés et permet d’augmenter l’efficacité de la chimiothérapie
Malignant and stromal cells are strong producer of the chemokine CCL2 in most human cancers. The chemokine axis CCR2/CCL2 is thus a key marker of cancer development, but is also associated with relapse following therapy. Tumour associated macrophages (TAM) and regulatory T cells (Treg) display robust immunosuppressive capacities and contribute to tumour growth. My thesis work focused on the function of the expression of the chemokine receptor CCR2 by these cell types in the context of anticancer therapies. We have shown that CCR2 controls the migration of Treg in tumoral context, in both human and mice, and that the expression of this receptor by Treg could serve as a biomarker of the response to chemotherapy. Our study indicate a novel function of CCR2, defining at the same time a new Treg subset implicated in the regulation of antitumor immunity.We have also demonstrated that pulmonary metastases are composed of both tissue resident and recruited macrophages. The presence of resident macrophages within tumours could contribute to the heterogeneity of the microenvironment of different tumour types. CCR2 is largely implicated in the relapse phase following chemotherapy, indicating a limited role for resident macrophages in this phenomenon. Meanwhile, we have demonstrated that VEGF plays a direct role in TAM survival. The combination of chemotherapy with an anti-VEGF antibody targets both resident and recruited TAM, thereby enhancing the efficacy of chemotherapy. Finally, we have shown that the CCR2/CCL2 axis is implicated in the response to radiotherapy by enhancing the recruitment of both Treg and TAM. This work provides evidences for a central role of the CCR2/CCL2 axis in mediating Treg and TAM co-localization in response to anticancer therapy, this axis could also contribute to establishment of immunosuppressive networks in tumours. Our results provide a better understanding of the immune mechanism implicated in resistance to anticancer therapies

Une forte production de la chimiokine CCL2 par les cellules malignes et les cellules stromales a été démontrée dans la plupart des cancers humains. Ainsi, l’axe chimiokinique CCR2/CCL2 est un important marqueur du développement des cancers ; ce même axe est associé à la récurrence de tumeurs après thérapie anticancéreuses. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et les lymphocytes T régulateurs (Treg) ont des capacités immunosuppressives robustes et contribue à la croissance tumorale. Durant cette thèse, je me suis intéressé à la fonction de l’expression du récepteur de chimiokine CCR2 par ces cellules dans le contexte de thérapies anticancéreuses. Nous avons montré que le récepteur de chimiokines CCR2 contrôle la migration des Treg en contexte tumoral, chez l’homme et la souris, et que son expression par les Treg peut servir de biomarqueur de la réponse à la chimiothérapie. Notre étude indique une nouvelle fonction de CCR2 et définie un nouveau sous-type de Treg impliqué dans la régulation de l’immunité antitumorale. En parallèle, nous avons pu mettre en évidence que les métastases pulmonaire sont composées à la fois de macrophages résident du tissu et de macrophages recrutés via l’axe CCR2. La présence de macrophages résidents au sein des tumeurs pourrait contribuer à l’hétérogénéité des microenvironnements de diffèrent type de tumeurs. Le récepteur CCR2 est important pour le la phase de rechute après chimiothérapie, indiquant un rôle limité des macrophages résidents dans ce phénomène. De plus, nous avons montré que le VEGF joue un rôle direct dans la survie des TAM. Ainsi, la combinaison de la chimiothérapie avec un anticorps anti-VEGF cible simultanément les TAM résidents et recrutés et permet d’augmenter l’efficacité de la chimiothérapie
Malignant and stromal cells are strong producer of the chemokine CCL2 in most human cancers. The chemokine axis CCR2/CCL2 is thus a key marker of cancer development, but is also associated with relapse following therapy. Tumour associated macrophages (TAM) and regulatory T cells (Treg) display robust immunosuppressive capacities and contribute to tumour growth. My thesis work focused on the function of the expression of the chemokine receptor CCR2 by these cell types in the context of anticancer therapies. We have shown that CCR2 controls the migration of Treg in tumoral context, in both human and mice, and that the expression of this receptor by Treg could serve as a biomarker of the response to chemotherapy. Our study indicate a novel function of CCR2, defining at the same time a new Treg subset implicated in the regulation of antitumor immunity.We have also demonstrated that pulmonary metastases are composed of both tissue resident and recruited macrophages. The presence of resident macrophages within tumours could contribute to the heterogeneity of the microenvironment of different tumour types. CCR2 is largely implicated in the relapse phase following chemotherapy, indicating a limited role for resident macrophages in this phenomenon. Meanwhile, we have demonstrated that VEGF plays a direct role in TAM survival. The combination of chemotherapy with an anti-VEGF antibody targets both resident and recruited TAM, thereby enhancing the efficacy of chemotherapy. Finally, we have shown that the CCR2/CCL2 axis is implicated in the response to radiotherapy by enhancing the recruitment of both Treg and TAM. This work provides evidences for a central role of the CCR2/CCL2 axis in mediating Treg and TAM co-localization in response to anticancer therapy, this axis could also contribute to establishment of immunosuppressive networks in tumours. Our results provide a better understanding of the immune mechanism implicated in resistance to anticancer therapies

Contexte : Le mélanome est un cancer agressif chez l’homme, développé aux dépens des mélanocytes. L’identification de la mutation BRAF conditionne la prescription d’une thérapie ciblée. L’objectif de ce travail a été de mettre au point dans les tissus tumoraux et dans le sang (cellules tumorales circulantes, ADN libre tumoral plasmatique) des approches technologiques de biologie moléculaire et d’immunohistochimie (IHC) pour identifier des biomarqueurs prédictifs d’une réponse ou de résistance thérapeutique. Nous montrons que l’IHC BRAF (clone VE1, Roche, Ventana) pourrait remplacer l’analyse en biologie moléculaire dans certaines indications, notamment sur un matériel tumoral de petite taille. Parallèlement, nous montrons que la présence de cellules mélanocytaires circulantes [détectées par cytomorphologie (Technique ISET)] chez des patients atteints de mélanome métastatique est un facteur prédictif indépendant de mauvais pronostic de la survie globale. Enfin, nous montrons que le système Biocartis Idylla™ (processus automatisé couplant l’extraction, le séquençage et l’analyse de l’ADN) est sensible et spécifique pour la détection plasmatique des mutations BRAF et NRAS et que cette technique pourrait être indiquée dans le suivi de la maladie résiduelle (apparition de résistance) après traitement des patients atteints de mélanomes métastatiques. Conclusion : L’identification des biomarqueurs tissulaires et sanguins (BRAF, NRAS et CTC) permettent : 1- Une optimisation des délais diagnostiques de la mutation BRAF/NRAS – 2) L’identification de facteurs de mauvais pronostic – 3) De détecter une récidive précoce et de suivre la maladie résiduelle après traitement
Background: Knowledge of the BRAFV600E status is mandatory in metastatic melanoma patients (MMP). Molecular biology is currently the gold standard method for status assessment. The aim of this work was to assess and compare several methods of molecular biology and immunohistochemistry (IHC) in tissue and blood (cell-free circulating tumor DNA, circulating tumor cell (CTC)) to identify predictive biomarkers of response or resistance to targeted treatment. Results: We showed that BRAFV600 IHC could be a substitute for molecular biology in the initial assessment of the BRAFV600E status in MPP. We also found that the presence of circulating tumor cell detetcted by a cytomorphological approach ISET (Isolation by Size of Epithelial Tumor Cell – Rarecells Diagnostics, Paris, France) in MMP is an independent predictor of shorter survival. Then, in a monocentric study conducted at the University of Nice Hospital, we evaluated a novel and fully automated CE-IVD PCR-based system (IdyllaTM, Biocartis, Mechelen, Belgium) for plasmatic BRAF and NRAS mutation detection. We showed that this technology is highly sensitive and specific and provide promising potential to assess tumor progression, identify targets for therapy, and evaluate clinical response to treatment. In conclusion, identification of tissue and blood biomarkers with these technologies allow a quick turnaround-time to BRAF/NRAS diagnosis and improve monitoring of treatment response and development of resistance in metastatic melanoma patients

Contexte : Le mélanome est un cancer agressif chez l’homme, développé aux dépens des mélanocytes. L’identification de la mutation BRAF conditionne la prescription d’une thérapie ciblée. L’objectif de ce travail a été de mettre au point dans les tissus tumoraux et dans le sang (cellules tumorales circulantes, ADN libre tumoral plasmatique) des approches technologiques de biologie moléculaire et d’immunohistochimie (IHC) pour identifier des biomarqueurs prédictifs d’une réponse ou de résistance thérapeutique. Nous montrons que l’IHC BRAF (clone VE1, Roche, Ventana) pourrait remplacer l’analyse en biologie moléculaire dans certaines indications, notamment sur un matériel tumoral de petite taille. Parallèlement, nous montrons que la présence de cellules mélanocytaires circulantes [détectées par cytomorphologie (Technique ISET)] chez des patients atteints de mélanome métastatique est un facteur prédictif indépendant de mauvais pronostic de la survie globale. Enfin, nous montrons que le système Biocartis Idylla™ (processus automatisé couplant l’extraction, le séquençage et l’analyse de l’ADN) est sensible et spécifique pour la détection plasmatique des mutations BRAF et NRAS et que cette technique pourrait être indiquée dans le suivi de la maladie résiduelle (apparition de résistance) après traitement des patients atteints de mélanomes métastatiques. Conclusion : L’identification des biomarqueurs tissulaires et sanguins (BRAF, NRAS et CTC) permettent : 1- Une optimisation des délais diagnostiques de la mutation BRAF/NRAS – 2) L’identification de facteurs de mauvais pronostic – 3) De détecter une récidive précoce et de suivre la maladie résiduelle après traitement
Background: Knowledge of the BRAFV600E status is mandatory in metastatic melanoma patients (MMP). Molecular biology is currently the gold standard method for status assessment. The aim of this work was to assess and compare several methods of molecular biology and immunohistochemistry (IHC) in tissue and blood (cell-free circulating tumor DNA, circulating tumor cell (CTC)) to identify predictive biomarkers of response or resistance to targeted treatment. Results: We showed that BRAFV600 IHC could be a substitute for molecular biology in the initial assessment of the BRAFV600E status in MPP. We also found that the presence of circulating tumor cell detetcted by a cytomorphological approach ISET (Isolation by Size of Epithelial Tumor Cell – Rarecells Diagnostics, Paris, France) in MMP is an independent predictor of shorter survival. Then, in a monocentric study conducted at the University of Nice Hospital, we evaluated a novel and fully automated CE-IVD PCR-based system (IdyllaTM, Biocartis, Mechelen, Belgium) for plasmatic BRAF and NRAS mutation detection. We showed that this technology is highly sensitive and specific and provide promising potential to assess tumor progression, identify targets for therapy, and evaluate clinical response to treatment. In conclusion, identification of tissue and blood biomarkers with these technologies allow a quick turnaround-time to BRAF/NRAS diagnosis and improve monitoring of treatment response and development of resistance in metastatic melanoma patients

Les œstrogènes (E2), via le récepteur aux œstrogènes (ER), contrôlent l'expression de nombreux gènes impliqués dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. La régulation de ces gènes résulte de la fixation du ER sur une séquence d'ADN : Elément de Réponse aux Œstrogènes (ERE). ER joue un rôle majeur dans le cancer du sein, il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires qui modulent in vivo son activité. Nous observons que, comparé à l'EREconsensus, les ER présentent une affinité vis-à-vis d'un EREimparfait (rtvtgERE), une activité cellulaire et une sensibilité à E2 plus faible. Une étude in vitro du comportement conformationnel, thermodynamique et dynamique des ER a démontré un rôle du réseau électrostatique au sein des ER dans leurs différences de fonctionnalité. Nous avons recherché et comparé l'impact de la liaison au ligand sur l'activité cellulaire de deux ER : hERalpha et rtERS. La reconstitution de leur mécanisme d'action chez la levure a montré que hERalpha est un facteur d'activation de la transcription plus puissant que rtERS et qu'il est plus sensible à E2. Nous observons aussi que la présence de ligand induit une relocalisation des ER au sein de foci. Une étude cinétique de l'activation transcriptionnelle et de la relocalisation subcellulaire des ER en présence de ligand nous pousse à distinguer ces deux aspects. Nous suggérons qu'un fort niveau de phosphorylation de ER par les kinases activées en présence de ligand, augmente son caractère anionique conduisant à empêcher sa fixation à l'ADN ou à l'en dissocier. Ainsi, ER pourrait être recruté par des complexes dans le noyau ou dans le cytoplasme et formé ces foci.

Les œstrogènes (E2), via le récepteur aux œstrogènes (ER), contrôlent l’expression de nombreux gènes impliqués dans la croissance, la différenciation cellulaire et les fonctions reproductrices. La régulation de ces gènes résulte de la fixation du ER sur une séquence d’ADN : Elément de Réponse aux Œstrogènes (ERE). ER joue un rôle majeur dans le cancer du sein, il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires qui modulent in vivo son activité. Nous observons que, comparé à l’EREconsensus, les ER présentent une affinité vis-à-vis d’un EREimparfait (rtvtgERE), une activité cellulaire et une sensibilité à E2 plus faible. Une étude in vitro du comportement conformationnel, thermodynamique et dynamique des ER a démontré un rôle du réseau électrostatique au sein des ER dans leurs différences de fonctionnalité. Nous avons recherché et comparé l’impact de la liaison au ligand sur l’activité cellulaire de deux ER : hER et rtERS. La reconstitution de leur mécanisme d’action chez la levure a montré que hERest un facteur d’activation de la transcription plus puissant que rtERS et qu’il est plus sensible à E2. Nous observons aussi que la présence de ligand induit une relocalisation des ER au sein de foci. Une étude cinétique de l’activation transcriptionnelle et de la relocalisation subcellulaire des ER en présence de ligand nous pousse à distinguer ces deux aspects. Nous suggérons qu’un fort niveau de phosphorylation de ER par les kinases activées en présence de ligand, augmente son caractère anionique conduisant à empêcher sa fixation à l’ADN ou à l’en dissocier. Ainsi, ER pourrait être recruté par des complexes dans le noyau ou dans le cytoplasme et formé ces foci
Estrogens (E2), through estrogen receptors (ERs), control the expression of a number of genes involved in growth, cellular differentiation and reproductive functions. Regulation of these genes is carried out by the ER binding to a DNA sequence: the Estrogen Responsive Element (ERE). ERs play a major role in breast cancer and therefore it’s important to understand the molecular mechanisms which modulate ER activity in vivo. We found that, compared to the consensus ERE, ERs exhibit a lesser affinity for the imperfect ERE (rtvtgERE), cellular activity and E2 sensitivity. An in vitro study on the ERs conformational, thermodynamical and dynamical behaviour has proved that the electrostatic network plays a role in their different functionalities. We researched and compared the impact of the ligands fixation on the cellular activity of two ER: hER and rtERS. The transcriptional mechanism created in yeast allowed us to show that hER is a transcriptional activator which is more potent and more sensitive to E2 than rtERS. We observed that the presence of the ligand induces ER localization within foci. Time curses of the ER transcriptional activation and sub-cellular localization in the presence of ligands lead us to distinguish these two aspects. We suggest that a high phosphorylation level by kinases activated in the presence of ligand increases the ER anionic character tending either to prevent the fixation on the DNA or to increase their dissociation from the DNA. Thus, ERs could be recruited by complexes in the nucleus or cytoplasm and form some foci

Les rétinopathies pigmentaires sont la première cause de dégénérescence rétinienne héréditaire, affectant 1,5 millions de personnes dans le monde. A ce jour, aucun traitement n’est disponible dans la majorité de ces pathologies. Basé sur une étude antérieure, le projet vise au développement d’un traitement dans certaines d’entre elles. L’approche testée cible une voie activée dans plusieurs de ces atteintes ; l’Unfolded Protein Response (UPR), mécanisme de réponse au stress activée en particulier an cas de surcharge protéique. Le traitement permet de diminuer cette charge protéique. Il est composé d’IFB-088, inhibiteur du complexe GADD34/PP1c, permettant le maintien de l’inhibition de la traduction induit par l’UPR et d’acide valproïque stimulant BiP et les capacités de repliement du réticulum. Il a été testé dans deux modèles présentant une activation de l’UPR. Les résultats ont montré qu’il pouvait ralentir la dégénérescence rétinienne à court terme, réduisant le stress cellulaire et maintenant les capacités visuelles
Retinitis pigmentosa is the first cause of inherited retinal degeneration affecting 1.5 million persons worldwide. Currently, there is no available treatment for most of these diseases. Based on a previous study, the project aims to develop a treatment for some of them. The tested approach targets a common cellular pathway activated in many of these diseases; the Unfolded Protein Response (UPR), pathway activated in response to a stress due to a protein overload. The treatment decreases this overload. is the treatment is composed of IFB-088, a GADD34/PP1c inhibitor, allowing maintaining the translation inhibition and of valproic acid which increases BiP and the folding capacities of the reticulum. The treatment was tested in two models displaying UPR activation. In these models, the treatment slow-down the short-term retinal degeneration by decreasing cellular stress to maintain visual capacities

Il est clairement admis que la voie des MAPK est essentielle à la mélanomagenèse. Le développement de nouveaux médicaments ciblant cette voie, tels que les inhibiteurs de BRAF et/ou de MEK, a constitué une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique du mélanome. Cependant, les patients rechutent systématiquement sous traitement, ce qui suggère l'émergence de mécanismes de résistances. De nombreuses études montrent que l'expression et l'activation du facteur de transcription c-Jun sont induites après traitement de cellules de mélanome BRAF-mutées par des inhibiteurs de la voie des MAPK (MAPKi). De plus, la déplétion de c-Jun sensibilise ces cellules à ces inhibiteurs en induisant l'apoptose. Nous avons transfecté des lignées cellulaires de mélanome BRAF-mutées par des siARN dirigés contre c-Jun et traité ces cellules avec un inhibiteur de BRAF (PLX4032). Nous avons ensuite analysé l'expression du génome par une étude de transcriptomique afin de déterminer les gènes cibles de c-Jun qui pourraient être impliqués dans la réponse pharmacologique aux MAPKi. Cette étude a révélé que SLIT And NTRK Like Family Member 6 (SLITRK6) est un gène cible de c-Jun qui pourrait être associé à une réponse pharmacologique antitumorale aux MAPKi. En effet, l'ARNm et la protéine SLITRK6 sont induits dans les lignées cellulaires de mélanome BRAF-mutées après traitement par inhibiteur de BRAF seul ou en association avec un inhibiteur de MEK (AZD6244). Nous avons également montré que la combinaison des inhibiteurs de la voie des MAPK avec un anticorps conjugué à un cytotoxique ciblant SLITRK6 augmente la mort des cellules de mélanome BRAF-mutées en induisant de l'apoptose in vitro. Finalement, nos travaux montrent que SLITRK6 pourrait être une nouvelle cible pharmacologique pour le traitement du mélanome métastatique BRAF-muté et/ou être un biomarqueur potentiel de cellules résistantes aux MAPKi
It is clearly recognized that the MAPK pathway is essential for melanomagenesis. The development of new drugs targeting this pathway such as BRAF inhibitors and/or MEK inhibitors has been a major advance in the therapeutic management of melanoma. However, patients still relapse suggesting the emergence of mechanisms of resistance. Many data show that both the expression and activation of the transcription factor c-Jun are induced after treatment of BRAF-mutant cells with MAPK pathway inhibitors (MAPKi). Furthermore, depletion of c-Jun sensitizes cells to these inhibitors triggering apoptosis. We depleted BRAF-mutant melanoma cell lines for c-Jun by siRNA and treated cells with a BRAF inhibitor (PLX4032). Whole genome expression was then analysed by transcriptomic study to determine target genes of c-Jun that could be associated with pharmacological response to MAPKi. This study revealed that SLIT And NTRK Like Family Member 6 (SLITRK6) is a target gene of c-Jun that could be associated with antitumor pharmacological response to MAPKi. Indeed, SLITRK6 mRNA and protein are induced in BRAF-mutant melanoma cell lines after BRAF inhibitor treatment alone or in combination with MEK inhibitor (AZD6244). We also show that the combination of MAPKi with an antibody conjugated with a cytotoxic drug targeting SLITRK6 increases BRAF-mutant melanoma cell death triggering apoptosis in vitro. Finally, our data show that SLITRK6 could be a new pharmacological target for the treatment of BRAF-mutant metastatic melanoma and/or a potential biomarker of resistant cells to MAPKi

Le traitement des DMG altérés H3 K27, n’ayant pas connu d’amélioration au cours de ces 50 dernières années, figure parmi les plus grands défis de la neuro-oncologie pédiatrique. En 2012, a été découverte une mutation spécifique de l’histone 3 (oncohistone), dite H3.3 K27M, présentant une prévalence très élevée (70-80% des cas) dans les DMG. Bien que l’impact épigénétique de cette mutation ait été décrit, des études demeurent nécessaires afin de mieux comprendre son rôle dans le phénotype agressif et la réponse aux thérapies des cellules DMG. Afin d’étudier précisément l’impact de la mutation H3.3 K27M sur le phénotype des cellules de DMG,nous avons développé et caractérisé des modèles cellulaires isogéniques complémentaires de gliome pédiatrique de haut grade induits et invalidés pour l’oncohistone. À l’aide de ces modèles, nous souhaitions élucider l’impact de H3.3 K27M sur la biologie des cellules de DMG et leur réponse aux traitements anti-cancéreux, notamment la radiothérapie, unique traitement de référence actuel pour la prise en charge des DMG. Par la caractérisation de nos lignées cellulaires de gliomes pédiatriques sustentoriels induites pourH3.3 K27M, nous avons montré que l’oncohistone impacte la réponse aux radiations ionisantes et à certaines thérapies ciblées de manière dépendante du contexte cellulaire.Sur la base de ce constat, nous avons pris le parti de caractériser les impacts biologiques de l’oncohistone dans un contexte cellulaire plus pertinent de DMG. En ce sens, nous avons établi des modèles cellulaires knock-out pour H3.3 K27M et les avons caractérisés comparativement à leurs lignées cellulaires parentales mutées. Par des caractérisations omiques (transcriptomique et protéomique) et du métabolisme cellulaire de ces modèles, nous avons notamment identifié un impact de la mutation H3.3 K27M sur le métabolisme lipidique des cellules DMG. De surcroit, dans des modèles de sphéroïdes 3D, cette modification du métabolisme lipidique associée à l’oncohistone semblait conditionnée par des facteurs du microenvironnement encore à l’étude.D’autre part, une approche fonctionnelle par criblage pharmacologique nous a permis d’identifier des dépendances à certaines voies de réparation des dommages à l’ADN spécifiquement associées à la mutationH3.3 K27M. De plus, la caractérisation radiobiologique de nos modèles, actuellement en cours, indique une radiosensibilité associée à H3.3 K27M, corrélant avec une diminution de l’efficacité de réparation de l’ADN postirradiation. Au-delà de cet impact sur la réparation des dommages à l’ADN, notre criblage pharmacologique a également révélé une sensibilité exacerbée à certains composés de la famille des glycosides cardiaques induite par H3.3 K27M. Ce résultat apparaît particulièrement intéressant au regard de nos données transcriptomiques montrant un enrichissement en gènes impliqués dans les cardiomyopathies et l’homéostasie ionique parmi les gènes différentiellement exprimés en présence de l’oncohistone. Dans ce contexte, nous avons entrepris l’étude des processus moléculaires et biologiques sous-jacents à cette différence de sensibilité gouvernée parH3.3 K27M.In fine, nous avons utilisé nos modèles cellulaires isogéniques pour montrer que l’oncohistoneH3.3 K27M entraîne des modifications du métabolisme lipidique des cellules de DMG. Ces changements métaboliques pourraient rendre les cellules de DMG altérés H3 K27 plus susceptibles au déclenchement de certaines voies de morts cellulaires (e.g. ferroptose) et affecter la réponse à certaines thérapies. De plus, H3.3K27M semble induire des sensibilités spécifiques, notamment à la radiothérapie et aux glycosides cardiaques [...]
H3K27-altered DMG treatment is one of the most significant challenges in pediatric neuro-oncology,with no improvement in patient survival over the past 50 years. In 2012, it was shown that DMGs harbor a specific histone 3 mutation (oncohistone) called H3.3 K27M with a very high prevalence (70-80% of cases). Although theH3.3 K27M impact on the epigenetic landscape has been well described, studies are needed to understand betterits role in DMG cells’ aggressiveness and response to therapies.To study the H3.3 K27M mutation impact on DMG cell phenotypes precisely, we developed andcharacterized pediatric high-grade glioma isogenic cellular models induced and knock-out for the oncohistone.Using these models, we aimed to decipher the oncohistone impact on DMG cell biology and response to anticancertherapies, including radiation therapy, the only current standard of care for DMGs. Characterization of our H3.3 K27M-induced pediatric supratentorial glioma cell lines reveals that the oncohistone affects the response to ionizing radiations and specific targeted therapies in a cellular context-dependentway. Based on these results, we settled to characterize oncohistone biological impacts in a more relevant cellular context of DMG. In that sense, we established H3.3 K27M knock-out cellular models and characterized them regarding their parental DMG H3.3 K27M mutated cell lines. Through omic (transcriptomic and proteomic)and cell metabolism characterizations of these models, we notably showed the H3.3 K27M mutation impact on DMG cells’ lipid metabolism. In 3D spheroid models, this H3.3 K27M-induced lipid metabolism rewiring appeared conditioned by microenvironment factors still under investigation.On the other hand, a functional pharmacological screen identified H3.3 K27M-driven dependencies tospecific DNA repair pathways. In addition, ongoing radiobiological characterization of our models indicates anH3.3 K27M-associated radiosensitivity correlating with a decrease in DNA repair efficiency following ionizingradiations. Beyond this DNA repair impact, our pharmacological screen also revealed an H3.3 K27M-relatedsensitivity to cardiac glycoside drugs. This result makes sense with our transcriptomic data showing enrichmentin genes involved in cardiomyopathies and ion homeostasis among differentially expressed genes with theoncohistone. In this context, we began unraveling the molecular and biological processes underlying thisH3.3 K27M-driven effect.Finally, we used our isogenic cellular models to show that the H3.3 K27M oncohistone drives lipidmetabolism modifications. These metabolic changes could prime H3K27-altered DMG cells to specific regulatedcell death pathways (e.g., ferroptosis) and affect the response to certain therapies. Moreover, the H3.3 K27Mseems to drive specific sensitivities, notably to radiation therapy and cardiac glycoside drugs. Understanding the underlying molecular mechanisms governing these H3.3 K27M-associated Achille heels could highlight newinsights into the oncohistone role in DMG cells and provide rationales for developing new therapeutic strategies

Pendant le traitement antirétroviral de l'infection par le VIH, différents cas d'échecs thérapeutiques peuvent survenir, dans ce travail nous nous sommes intéressés à deux aspects de cet échec: D'une part la grande variabilité du VIH permet au virus d'échapper aux médicaments antirétroviraux et peut être à l'origine d'un échec virologique. Il a été observé que plusieurs mutations de résistances sont localisées au sein des épitopes reconnus par les CTL, suggérant que la réponse immune peut avoir un effet sur les virus résistants. Afin d’étudier cette question, nous avons évalué, la réponse cytotoxique dirigée contre l’épitope RT181-189 chez 34 patients HLA-A2+ séropositif pour le VIH. Cet épitope comprend la mutation M184V, responsable de la résistance virale à la Lamivudine. Chez la majorité des patients en échec virologique sous Lamivudine la réponse contre cet épitope n'est pas présente alors qu'elle est fréquente chez les patients naïfs de traitement. Une étude détaillée sur les facteurs influençant le développement de la réponse à cet épitope a été effectuée. Par ailleurs, chez certains patients la reconstitution du compartiment CD4 n’est pas complète, il s'agit d'un échec immunologique. Dans ce cadre nous avons comparé les effets de trois cytokines (IL-2, IL-7, IL-15) et d'un agoniste de l'IL-15 RLI, sur les CD4+ et CD8+ des patients pour évaluer leur possible rôle thérapeutique dans la reconstitution de l'immunocompétence. Nos résultats montrent que la réponse proliférative des patients à l'IL-7 est préservée chez les patients VIH+ même chez ceux dont le taux de CD4 est faible. L'IL-15 et le RLI induisent une prolifération efficace de la population CD4 effecteur mémoire
During HIV infection antiretroviral tritherapy efficiently inhibits viral replication and restores CD4 counts in infected patients. Nevertheless treatment failure may occur. In this work, we investigated two different aspects of this problem : Firstly, HIV sequence variability may provoke the emergence of resistant viruses leading to virological failure. The fact that many drug resistance mutations in HIV fall within CTL epitopes suggests that the immune response play a role in inhibiting resistant virus. In order to address this question we analyzed the response against the RT181-189 epitope covering the Lamivudine resistance mutation, M184V in 34 HLA-A2+ HIV+ infected patients. We found that RT181-189 is frequently recognized by ART Naive patients and poorly recognized by patients with virological failure under Lamivudine treatment. Both viral load and viral sequence polymorphism were associated with the presence of a CTL response against RT181-189. Secondly, some patients may undergo immunological failure; the recovery of CD4+ T-cell counts is incomplete despite complete suppression of viral replication. The aim of our study was to compare the effects of IL-2, IL-7, IL-15 and an agonist of IL-15, RLI, on CD4+ and CD8+ lymphocytes from HIV-infected patients, in order to evaluate the therapeutic potential of these molecules on immune reconstitution. Overall our results indicate that the proliferative response of CD4+ T-cells to IL-7 is preserved, even in patients with low CD4+ T-cell counts, and that both IL-15 and RLI can induce homeostatic proliferation of CD4+ effector-memory T-cells. In, RLI did not show greatly increased potency compared to native IL-15

Cette thèse présente des travaux de modélisation mathématiquede la réponse au traitement en oncologie appliquée à trois pathologies différentes.La première partie traite du cas des GIST et de la réponse à la thérapie ciblée.Deux modèles sont décrits afin d’étudier différents critères de suivie del’évolution tumorale. La deuxième partie porte sur les tumeurs colorectales etla réponse à la radiothérapie. Un premier modèle d’équations aux dérivées partielles,couplé à un modèle décrivant l’examen du PET-scan, est mis en place,puis il est simplifié afin de rendre la phase de calibration plus rapide. Cetteméthode est testée sur deux cas cliniques.La dernière partie traite des tumeurs ORL sous radiothérapie. Une méthodede personnalisation du modèle, similaire à celle de la partie précédente, est miseen place et est testée sur six cas cliniques
We first present two mathematical models to simulate the evolution and theresponse to treatments of GIST.Then, we study colorectal tumors and radiotherapy response. We present apartial differential equations model to simulate the tumor evolution, the responseto radiotherapy and the PET-scan. We introduce a simplification of thefirst model to develope a calibration technic based on medical images of thetumor. Two applications on clinical cases are presented.To finish, a similar method is adapted to ORL tumors and response to radiotherapyand tested on six clinical cases

Le but de cette thèse était de déterminer des facteurs prédictifs de réponse aux anticorps monoclonaux anti-EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), dans le cancer colorectal métastatique. Nous avons d'abord montré que l'expression immunohistochimique (IHC) de la cible EGFR, pré-requis initial pour la prescription d'anticorps anti-EGFR, était équivalente entre site primitif et métastatique, ce qui ne permet pas d'expliquer l'absence de corrélation entre la technique IHC détectant l'EGFR et l'efficacité du traitement prescrit au stade métastatique. Nous avons ensuite souligné que les mutations de TP53 constituaient un facteur prédictif de contrôle de la maladie métastatique et étaient associées à une meilleure survie sans progression (SSP), notamment au sein des patients porteurs de tumeurs KRAS non mutées. Les mutations de TP53 pourraient caractériser des tumeurs avec une voie de l'EGFR particulièrement active, et donc potentiellement plus sensibles aux anticorps anti-EGFR. Dans cette étude, les mutations de KRAS étaient associées à l'absence de réponse et à une SSP plus courte, confirmant leur statut de biomarqueur de résistance aux anti-EGFR. Enfin, nous avons étudié l'impact clinique des polymorphismes des gènes codant pour les récepteurs FcγRIIa et RIIIa exprimés par les effecteurs immunitaires, qui conditionnent l'affinité de la portion Fc de l'anticorps thérapeutique et modulent le phénomène d'ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytoxicity). L'analyse conjointe du statut KRAS était réalisée, objectivant toujours l'impact négatif des mutations sur la réponse et la SSP. Les patients avec les génotypes FcγRIIa-131HH et/ou FcγRIIIa-158VV, supposés entrainer la meilleure affinité, avaient une SSP plus longue que ceux qui présentaient les deux allèles 131R et 158F, y compris chez les patients porteurs de tumeurs mutées pour KRAS. Ce travail traduit ainsi l'apport de la pharmacogénomique et de la pharmacogénétique dans les traitements dits à la carte des CCRm
The goal of this thesis was to assess predictive factors of response to anti-EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) antibodies in metastatic colorectal cancer. We have first shown that immunohistochemical EGFR expression, the initial prerequisite for anti-EGFR antibodies prescription, was similar in primary colon cancer and related metastases. Thus, the lack of discrepancy between primary ans metastases can not explain the absence of correlation between EGFR expression and response, reported in clinical trials. In the second study, we observed that TP53 mutations were predictive of disease control and better progression free survival (PFS), notably in patients harbouring KRAS wild type tumors. TP 53 mutations may caracterize tumors with an activated EGFR pathway, thus particularly sensitive to anti-EGFR antibodies. In this study, KRAS mutations were associated with a lack of response and a shorter PFS, confirming this parameter as a biomarker of resistance to anti-EGFR antibody therapy. In the third study, we analyzed the clinical relevance of polymorphisms of genes encoding for FcγRIIa and RIIIa receptors, expressed by immune effectors, which impact on the affinity of the Fc portion of the therapeutic antibody and thus modulate the ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytoxicity) phenomenon. The KRAS status was also analyzed in combination, showing a negative effect of mutations on response and PFS. Patients with FcγRIIa-131H/H and/or FcγRIIIa-158V/V genotypes, leading to a stronger affinity, had longer PFS than 131R and 158F carriers, including KRAS mutated patients. This work support an important place for pharmacogenomics and pharmacogenetics in the setting of so called "personalized treatments" of mCRC

Les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (LAGC) sont des lymphomes non-hodgkiniens dits de type T ou nul, représentant la majorité des lymphomes T pédiatriques (20 à 30%). Dans plus de 80% des cas, une translocation chromosomique réciproque aboutissant à l'expression anormale de protéines chimères de type X-ALK qui arborent constitutivement et de manière anormale l'activité tyrosine-kinase ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est le moteur de la tumorigenèse (LAGC dits "ALK+ "). L'une des particularités de ces lymphomes, mise en évidence par mon équipe, est le fait que B-Cell Lymphoma-2 (BCL-2) demeure indétectable dans les cas ALK+ contrairement aux cas ALK-. Ce point est d'autant plus surprenant que BCL-2, oncogène largement établi comme prototype de protéines anti-apoptotiques ainsi que régulateur clé de l'autophagie, est fortement surexprimé dans la majorité des lymphomes. A l'inverse, Human Antigen R (HuR) est surexprimée dans les LAGC (comme dans la plupart des cancers). Il a été démontré que cette protéine de liaison aux ARN participait au maintien du phénotype tumoral, et que sa localisation subcellulaire et ses fonctions dépendaient étroitement de son statut de phosphorylation, lequel est régulé par ALK dans les LAGC ALK+. Au niveau du cytoplasme, HuR permet de stabiliser et d'augmenter la traduction d'ARNm possédant, dans leur région 3'-UTR, des séquences riches en adénine et uridine (AU-rich elements, "ARE"). De manière plus générale, HuR a la capacité de dialoguer avec les microARNs (miARN), soit en empêchant leur action par compétition, soit à l'inverse en coopérant avec ces derniers et en promouvant ainsi leur fonction de régulateur négatif sur certains transcrits cibles communs. Le transcrit Bcl-2, dont l'expression est réprimée dans les LAGC ALK+, fait partie des cibles potentielles de HuR. Au cours de ma thèse, j'ai ainsi cherché à comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la répression de l'expression de Bcl-2, en me focalisant sur le rôle de HuR et de miARN "partenaires" dans ce processus. Mes données semblent indiquer que ce mécanisme implique le recrutement par HuR du miR-34a sur l'ARNm Bcl-2, conduisant à la mise en silence de ce dernier. A l'inverse, quand l'activité tyrosine- kinase de ALK est inhibée, l'interaction entre HuR et le transcrit Bcl-2 diminue, ce qui limite le recrutement de miR-34a et conduit à une restauration de l'expression de cette oncogène majeur dans les cellules lymphomateuses. Dans le contexte des essais cliniques d'inhibiteurs ciblant l'activité tyrosine kinase de ALK tels que le Crizotinib, la question de cette ré-expression de BCL-2 éclaire d'une lumière nouvelle certains échecs thérapeutiques subis par cette molécule pourtant prometteuse. Je me suis donc également consacré, pendant ma thèse, à l'étude des conséquences de cette ré-expression de BCL-2 sur les LAGC ALK+ traités par le Crizotinib. Les résultats que j'ai obtenus in vitro et in vivo montrent que contrecarrer, par interférence à l'ARN, l'élévation du taux de BCL-2 consécutive au traitement par le Crizotinib, permet de potentialiser les effets de la drogue : cela se traduit en particulier par une potentialisation de la mort par apoptose induite par le traitement mais aussi, de manière fascinante, par une conversion de la réponse autophagique initialement cytoprotectrice et pro-tumorale en une autophagie incontrôlée et délétère, qui participe alors à l'effet thérapeutique accru de la drogue. De manière globale, ce travail permet d'envisager de nouvelles combinaisons et alternatives thérapeutiques pour les patients souffrants de LAGC ALK+, et illustre la complexité des régulations croisées entre processus apoptotiques et autophagiques
Anaplastic large cell lymphoma (ALCL) are T/-null non-hodgkin lymphoma representing most of childhood T-cell lymphoma (up to 30%). More than 80% of cases bear reciprocal chromosomic translocation responsible for abnormal expression and constitutive activation of X-ALK type (Anaplastic Lymphoma Kinase) chimeric proteins (ALK+ ALCL). A striking characteristic of this lymphoma is that B-Cell Lymphoma-2 (BCL-2) remains undetectable in ALK+ cases compared to ALK- cases. This is all the more surprising as the BCL-2 oncogene, which is firmly established as a prototypic anti-apoptotic factor as well as a key autophagy regulator, has been shown to be overexpressed in a majority of lymphomas. On the other hand, the RNA-binding protein HuR (Human Antigen R) is overexpressed in ALCL (as in most cancers). It has been demonstrated that this protein was involved in the sustainability of the tumoral phenotype, and that its subcellular localization and functions were closely related to its phosphorylation status, which in turn heavily depends on ALK activity in ALK+ ALCL. In the cytoplasm, HuR has the ability to bind adenine and uridine-rich elements (ARE) located on the 3'-UTR of target mRNAs, and both protect them from degradation and increase their translation. From a general point of view, HuR is able to establish an interplay with microRNAs (miRNAs), either blocking them through competition, or actually cooperating with them and thus promote their function of negative regulators of gene expression on common target transcripts. The BCL-2 transcript, which expression seems to be silenced in ALK-expressing ALCL, has been described as a potential target of HuR. During my PhD work, I dedicated myself to understand the molecular mechanism at work in the silencing of BCL-2 expression with a focus on HuR and collaborating miRNA. The data I obtained point at a cooperation between HuR and miR-34a leading to the silencing of the BCL-2 transcript. However, when the ALK tyrosine kinase activity is inhibited, it appears the interaction between the BCL-2 mRNA diminishes, which limitates the miR-34a 's access to this transcript and ultimately results in a re-expression of the BCL-2 oncogene in these lymphoma cells. In the current context of clinical trials for ALK-targeting inhibitors, such as the Crizotinib, this BCL-2 re-expression observed upon ALK inhibition shed light on potential reasons behind some therapeutic failures that have recently been reported. Indeed, during my PhD work, I also studied the consequences of the BCL-2 re-expression observed in Crizotinib-treated cells. The data I obtained in vitro and in vivo show that, by blocking this re-expression using RNA interference, the Crizotinib anti-tumoral efficiency can be greatly potentiated. This potentiation took the form of an increase of apoptotic cell death induction and, interestingly, also affected the autophagic response triggered by the drug, making it switch from a cytoprotective- type, protumoral autophagic flux to an enhanced, deletary-type and tumor suppressive flux, adding to the therapeutic effect of the drug. This work in general provides insights for new therapeutic combinations that could potentially benefit to ALK+ ALCL patients, and illustrates the complex cross-regulations between apoptotic and autophagic pathway

De nouveaux traitements de l'aplasie médullaire radio-induite (RI) fondés sur la lutte in vitro, voire in vivo, contre l'apoptose des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) sont actuellement à l'étude. Ces approches sont en grande partie fondées sur le caractère hétérogène des irradiations accidentelles qui se traduit par une épargne relative des CSPH. Ainsi la thérapie cellulaire autologue (TCA) consisterait en la collecte puis la mise en culture (6-7 jours) des CSPH résiduels dans un but de greffe. Dans ce cadre notre travail a porté d'abord sur l'étude des mécanismes fondamentaux de l'apoptose RI des CSPH avant d'aborder l'optimisation de la TCA. Pour cette étude nous avons utilisé un modèle d'irradiation in vitro des cellules CD34+ de primate non humain. Concernant les mécanismes fondamentaux de l'apoptose RI, nos résultats confirment pour les CSPH la complexité des mécanismes de la réponse moléculaire et cellulaire à l'irradiation, notamment en terme de cycle cellulaire et d'apoptose. Les caspases 1 et 6 semblent jouer un rôle fondamental comme effecteurs terminaux. Concernant la culture de cellules CD34+ irradiées nos résultats montrent que 1) la sélection négative des CSPH résiduels apoptotiques avant mise en culture n'apporte pas de bénéfice en terme de rendement d'expansion 2) l'expansion de cellules CD34+ irradiées à la dose 4Gy peut être envisagée uniquement en présence d'un soutien stromal de type Dexter ou de cellules souches mésenchymateuses 3) l'addition séquentielle d'un inhibiteur de l'hématopoïèse, le TNF-a, à une combinaison activatrice réduit l'apoptose et favorise l'expansion ultérieure des cellules CD34+ irradiées
New treatments of radio-induced bone marrow aplasia were based on the apoptosis reduction (in vivo or in vitro) of the hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC). These approaches were founded on the heterogeneity of irradiation injury, which preserves some HSPC. The autologous cell therapy (ACT) is based on: the collect of residual HSPC and then on a phase of in vitro culture (6 to 7 days) ir the final goal to graft these expanded cells. Our work has consisted to study the fundamental mechanism of radio-induced apoptosis of HSPC before to optimise the ACT. We have used an in vitro model of irradiation of CD34+ cells come from non-human primate. Our results show a complexity of mechanisms that has been implicated in the molecular and cellular response, in case of cell cycle and apoptosis. But Caspases 1 and 6 was seen to play an important role in terms of final effectors. The cultures of irradiated cells show that 1 the negative selection of apoptotic residual HSPC before cell culture did not improve the expansion rate 2) the expansion of 4Gy irradiate CD34+ cells can only be considered with a support stromal has weil has Dexter or Mesenchymal Stem Cells 3) the sequential addition of an inhibitory of haematopoiesis (TNF-a) with a cocktail activation reduce apoptosis and increased expansion of CD34+ irradiated cells. Finally this study 1) suggest different molecular targets for new anti-apoptotic treatments and 2) show the difficulty to used the ACT in the case of an accidental irradiation

L’immunothérapie fait partie des traitements proposés pour les patients atteints de cancer pulmonaire. Cependant, des mutations générées par des changements épigénétiques peuvent induire une résistance thérapeutique. Les histones désacétylases (HDAC) contrôlent le taux d’acétylation des histones. L’inhibition des HDAC (HDACi) permet de pallier les changements épigénétiques et la résistance aux traitements. Grâce à une collaboration, nous avons pu étudier un nouvel HDACi multicible inhibant aussi la machinerie du splicéosome. En effet, l’inhibition du splicéosome peut engendrer des altérations d’épissage entraînant la production de néoépitopes. Notre hypothèse est que cette molécule multicible pourrait lever la résistance de l’immunothérapie anti-PD-1 dans un modèle murin de cancer pulmonaire TC-1.La molécule Ni313 a été évaluée comme spécifique de HDAC6 et augmentant l’expression de protéines impliquées dans l’apoptose, démontrant ainsi l’induction d’une mort cellulaire. Le pouvoir immunogénique de la mort cellulaire (ICD) induite par Ni313 à été vérifié in vivo. Le pouvoir thérapeutique de Ni313 a été testé par voie intratumorale sur des souris immunocompétentes. À une dose de 0.5mg/kg, 50 à 70% des souris sauvages traitées présentent une régression tumorale complète. Les souris en rémission présentent une protection à long terme, reflet de la mise en place d’une réponse mémoire et dépendante des lymphocytes T. Le phénotypage immunitaire intratumoral révèle une augmentation du taux de neutrophiles infiltrants chez les souris traitées, confirmant la mise en place de l’ICD. En parallèle, l’inhibition du splicéosome a été évaluée in vitro, montrant l’expression du peptide SIIN- FEKL contenu dans une séquence intronique.Après une étude peptidomique, aucune séquence immunogène spécifique du CMH-I n’a été identifiée sur les TC-1. Pour finir, une thérapie combinatoire Ni313/anti-PD-1 a été testée, ne démontrant pas le rétablissement de l’effet de l’immunothérapie. L’effet thérapeutique de Ni313 est efficace en monothérapie en agissant sur l’activité des HDAC induisant la mort cellulaire provoquant ainsi une réponse immuni- taire anti-tumorale médiée par les lymphocytes TCD4+
Lung cancer is the second most common cancer worldwide. Immunotherapy has been recently proposed as a treatment. However, several mutations generated by a high rate of epigenetic changes can induce resistance. Histone deacetylases (HDACs) control the acetylation rate of histone and thus modulate gene expression. Inhibition of HDACs by small molecules (HDACi) makes it possible to overcome epigenetic changes and resistance to treatments. Thanks to a collaboration, we were able to study a new multi-target HDACi, able to inhibit the spliceosome machinery, responsible for alternative splicing. In addition to their anti-angiogenic and pro-apoptotic property, inhibition of the spliceosome can lead to splicing alterations resulting in production of neoepitopes increasing the immunogenicity of tumors. Our hypothesis is that a molecule combining HDAC and spliceosome inhibition could overcome the resistance of anti-PD-1 immunotherapy in a murine lung cancer model TC-1.The molecule Ni313 was evaluated by proteomics as specific for HDAC6 and upregulating the expression of proteins involved in apoptosis, thus demonstrating the induction of cell death. The immunogenic power of cell death (ICD) induced by Ni313 on TC-1 was verified in vivo. The therapeutic power of Ni313 was tested intratumorally on immunocompetent mice. At a dose of 0.5 mg/kg, 50 to 70% treated wild-type mice show complete tumor regression. Mice in remission show long-term protection, reflecting the establishment of a memory and T cell- dependent response, analyzed by flow cytometry in the tumor infiltrate. Immune phenotyping reveals an increase in the level of infiltrating neutrophils in treated mice, confirming the establishment of the ICD. In parallel, spliceosome inhibition was evaluated in vitro, showing the expression of the SIINFEKL peptide contained in an intronic sequence. After a peptidomic study, no specific immunogenic sequence of MHC-I was identified on TC-1. Finally, a combination Ni313/anti-PD-1 therapy was tested, failing to demonstrate the restoration of the effect of immunotherapy. The therapeutic effect of Ni313 is effective as monotherapy by acting on the activity of HDACs inducing cell death by ICD thus provoking an anti-tumor immune response mediated by CD4+ T lymphocytes

La pharmaco-résistance est une complication évolutive fréquente de l'épisode dépressif majeur. La rTMS est une technique de stimulation cérébrale innovante dont l'efficacité antidépressive est maintenant établie.Le premier objectif de notre travail de thèse a été de caractériser les substrats fonctionnels de la dépression pharmaco-résistante à l'aide de la technique TEMP, afin d'identifier des patterns d'anomalies cérébrales qui leur sont propres. Dans un second temps, et sur la base des travaux existant sur les mécanismes d'action de la rTMS, nous avons étudié la valeur prédictive de marqueurs fonctionnels en neuro-imagerie TEMP et par EEG. Enfin, nous avons relié l'effet cérébral de la rTMS révélé par la neuro-imagerie fonctionnelle à son efficacité antidépressive, et de façon plus globale à la qualité de vie, comme recommandé actuellement.Nos résultats montrent l'existence d'un pattern de perfusion cérébrale commun aux patients pharmaco-résistants quel que soit le type de dépression, impliquant les régions fronto-temporales et le cervelet. L'étude TEMP de la perfusion cérébrale et de l'activité cérébrale en l'EEG dans sa bande alpha semble pouvoir prédire de façon satisfaisante, avant traitement, l'amélioration clinique individuelle des patients dépressifs pharmaco-résistants traités par rTMS. L'efficacité antidépressive de la rTMS apparait équivalente quel que soit le côté stimulé, entrainant des modifications de perfusion cérébrale comparables. Enfin, nos résultats ont permis d'identifier des régions cérébrales dysfonctionnelles distinctes et confirment l'interet d'une approche complémentaire de la dépression, par l'évaluation de la qualité de vie
Treatment-resistance is a common outcome of a major depressive episode. Repetitive transcranial magnetic stimulation has been put forward as a new technique to treat this debilitating illness. The first objective of our thesis was to characterize the functional substrates of treatment-resistant depression (TRD) using SPECT technique, in order to identify specific patterns of brain abnormalities. In a second part, based on existing work on the antidepressant mechanisms of rTMS, we investigated the predictive value of two neurofunctional biomarkers: SPECT and EEG. Finally, we studied brain SPECT perfusion changes underlying therapeutic efficiency and improvement of quality of life, as currently recommended. Our results showed the existence of a common pattern of brain perfusion in treatment-resistant patients involving the fronto-temporal regions and the cerebellum, regardless the type of depression. At baseline, SPECT brain perfusion and alpha EEG band power could predict individual clinical improvement in TRD-patients treated with rTMS. Regardless the stimulated side, the antidepressant efficacy of rTMS consisted in similar changes in cerebral perfusion. Finally, our results have identified distinct dysfunctional brain regions and confirm the interest of a complementary approach to depression, by assessing quality of life

Le traitement des leucémies myéloïdes et lymphoblastiques aiguës a connu des avancées importantes dans la dernière décennie. Malgré ces progrès, le taux de rechutes reste élevé et le besoin médical est réel. Ces leucémies sont caractérisées par une expression aberrante d’antigènes qui peuvent provenir de protéines mutées, mais aussi de séquences rapportées comme non codantes. Les réponses contre ces néoantigènes tumoraux « cryptiques » demeurent non caractérisées. Afin de définir l’existence d’un répertoire varié de récepteurs des lymphocytes T (TCR) qui reconnaitraient ces néoantigènes, des cellules mononuclées du sang périphérique de patients sains sont isolées puis enrichies en cellules T CD8+ naïves. L’expansion et l’activation de ces cellules sont ensuite réalisées avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l’antigène d’intérêt puis triées à l’aide de multimères HLA-peptides spécifiques. L’ARN des cellules avec TCR spécifiques aux antigènes spécifiques des tumeurs (TSA) leucémiques est isolé afin de réaliser un séquençage du TCR-bêta. L’expansion cellulaire a été réalisée de façon suffisante pour effectuer le séquençage des cellules identifiées comme positives par le marquage avec dextramères. Une réponse T est obtenue pour 50% des néoantigènes testés avec une réactivité montrée par ELISpot et se traduisant par une sécrétion de cytokines inflammatoires. Des lymphocytes T spécifiques aux TSA d’intérêt sont donc présents dans le sang périphérique de donneurs sains. Le séquençage de ces cellules a permis d’identifier les clonotypes pour lesquels une réponse anti-leucémique forte est possible. Il serait intéressant d’utiliser ces clonotypes spécifiques aux tumeurs cryptiques dans le développement de nouveaux traitements d’immunothérapie adoptive.
The treatment of acute myeloid and lymphoblastic leukemia has seen significant advances in the past decade. Despite this progress, the relapse rate remains high and the medical need is real. These leukemias are characterized by an aberrant expression of antigens, some from mutated proteins but also from sequences of DNA that were reported as non-coding. Responses against these “cryptic” neoantigens remains uncharacterized. In order to verify whether a diverse repertoire of T cell receptors (TCR) does recognize these neoantigens, mononuclear cells from peripheral blood of healthy patients are isolated and enriched with naive CD8+ T cells. The expansion and activation of these cells are then carried out with autologous dendritic cells loaded with the antigen of interest and then sorted using HLA-peptide specific multimers. RNA from cells with TCR specific for leukemic tumor-specific antigens (TSA) is isolated in order to perform TCR-beta sequencing. Cell expansion was sufficient to perform the sequencing of cells identified as positive by staining with dextramers. A T-cell response is obtained for 50% of the neoantigens tested with reactivity shown by ELISpot and resulting in a secretion of inflammatory cytokines. T lymphocytes specific to the TSA of interest are therefore present in the peripheral blood of healthy donors. Sequencing of these cells made it possible to identify clonotypes for which a strong anti-leukemic response can be expected. It would be interesting to use these cryptic tumor-specific clonotypes in the development of new adoptive immunotherapy treatments.