Dissertations / Theses on the topic 'Purificación de proteínas'

Memoria para la obtención de Título de Bioquímico
En esta Memoria de Título se purificó L-Ficolina humana. A nivel nacional, no hay esfuerzos reportados en este sentido. Esta purificación se realiza en el contexto de los intereses de una de las líneas centrales de investigación del Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile), relacionada con el rol del Sistema del Complemento humano en la infectividad de Trypanosoma cruzi, agente protozoario de la enfermedad de Chagas. Aunque con un rendimiento moderado, se logró la purificación de L-Ficolina recombinante, a través de cromatografía. Se sienta así la estandarización del protocolo en las condiciones locales, el que deberá ser escalado para cubrir las necesidades de futuros experimentos de infectividad parasitaria, a realizarse ya fuera del contexto de esta Memoria
In this dissertation, we describe the purification of human Complement L-Ficolin. At the national level, there are no reported efforts in this regard. This purification was performed within the context of the interests of one of the central lines of research in our laboratory, related to the role of the Complement System in Trypanosome cruzi (the agent of Chagas disease) infectivity. Although with a modest yield, chromatographic purification of L-Ficolin was achieved. Thus, we established the experimental basic conditions for the purification of this rather elusive molecule. Outside the context of this dissertation, this procedure, adequately scaled, may meet the needs of future experiments on parasite infectivity, mediated by this molecule
Conicyt; Fondecyt

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario
En este trabajo de investigación y, en el marco de un estudio estructural y funcional del citoesqueleto celular, se procedió a purificar las proteínas: tubulina, actina, tau y MAP-2. Las tres primeras proteínas se obtuvieron de cerebros de bovino frescos obtenidos en el matadero de SOFACAR S.A. Por otra parte, la actina fue purificada a partir de músculo de pollo. Una vez purificadas las proteínas y conocida su concentración, fueron caracterizadas por medio de electroforesis en PAGE, teñidos con azul de coomassie para ver su grado de pureza y también fueron inmunocaracterizadas, para su identificación molecular. Cada proteína se concentró y guardó a –80ºC hasta su uso. Posteriormente se realizaron experimentos de cinética de polimerización in vitro de microtúbulos y microfilamentos, en cuatro ensayos distintos, pero comparativos entre sí, utilizando para ello métodos turbidimétricos en los cuales se registraron las lecturas de los cambios de absorbancia bajo condiciones de pH y temperatura conocidas. Los dos primeros tenían como proteína base la tubulina (1,8mg/ml) a la cual se adicionó una de las diferentes MAPs. En un caso se incubó en presencia de tau (0,3mg/ml) y se registraron los cambios en absorbancia. En otro ensayo se adicionó MAP-2 (0,3mg/ml) a la tubulina pura incubada y se registró la cinética de polimerización. Ambas lecturas se realizaron a 340nm. Otros ensayos se realizaron con actina (0,4mg/ml), que fue incubada en primer lugar en presencia de tau y luego con MAP-2, registrándose los cambios de absorbancia a 232nm de longitud de onda constante. Los valores obtenidos en cada lectura fueron graficados en función del tiempo. Las curvas obtenidas fueron comparadas entre sí, para establecer las diferencias y semejanzas entre ellas. Durante los experimentos de cinética de polimerización, se tomaron alícuotas de cada ensayo a distintos tiempos, para luego procesar estas muestras y observarlas al microscopio electrónico, de modo de corroborar la curva de cinética respectiva con las estructuras formadas. Estas se analizaron comparativamente con los controles y entre sí. Por otra parte, se procedió a analizar las microfotografías obtenidas al incubar los microfilamentos con los microtúbulos preformados en presencia de tau o de MAP-2, para observar la presencia de interacciones macromoleculares entre las estructuras. Estos estudios se orientaron a reproducir in vitro un sistema de polimerización y depolimerización de las estructuras del citoesqueleto, de modo de aproximarse y comprender el proceso celular que ocurre normalmente en la célula, además de observar la participación de las MAPs en la formación y regulación de este sistema, y la interacción entre las macromoléculas que se forman, microtúbulos y microfilamentos. De lo expuesto, se verificó la reproducibilidad de la formación en condiciones in vitro de estructuras filamentosas y por medio del estudio comparativo de las MAPs se determinó que la proteína tau fue más eficiente que MAP-2 en promover la polimerización de estructuras del citoesqueleto, así como también se corroboró que ambas MAPs disminuyen fuertemente la concentración crítica necesaria tanto de tubulina como de actina en sus respectivos procesos de polimerización. En cuanto a las reacciones supramoleculares, al analizar las imágenes en microscopía electrónica se verifico la existencia de interacciones entre ambos componentes del citoesqueleto, observándose pequeños filamentos que conectan ambas macromoléculas, correspondientes a las MAPs estudiadas

Ingeniero Civil en Biotecnología
El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar la validez de los criterios de selección que se han establecido para la adición de extremos hidrofóbicos a proteínas para mejorar su purificación mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para esto se utilizó una enzima celulasa Cel5A de Bacillus Agaradherans y tres combinaciones de aminoácidos prolina (P), tirosina (Y) y triptófano (W): YYY (Y3), WPWP (WP2) y WPWPWPWP (WP4). Las secuencias fueron añadidas en el extremo carboxilo terminar de la enzima nativa mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se obtuvieron de forma exitosa las variantes recombinantes Celulasa-Y3, Celulasa-WP2 y Celulasa-WP4. Las variantes obtenidas fueron cultivadas e inducidas bajo las mismas condiciones preestablecidas, extrayéndose las fracciones extracelular y periplasmática a las cuales se les realizaron ensayos de actividad celulolítica y proteína total, para posteriormente calcular su actividad específica. La proteína total producida por las variantes mutantes fue similar a la obtenida por la cepa nativa, obteniéndose un nivel de proteína total con respecto a la cepa nativa de un 98% para la variante Cel-Y3, 88% para la variante Cel-WP2 y de un 75% para la variante Cel-WP4. En todos los casos se obtuvo una mayor parte de la proteína en la fracción extracelular con valores superiores al 56% del total de proteína producida. La variante Cel-WP2, mantuvo un 97% de la actividad celulolítica total de la enzima nativa, a diferencia de las variantes Cel-Y3 y Cel-WP4 que mantuvieron sólo un 18 y 14% respectivamente. Sin embargo, se obtuvo que todas las variantes presentaron una distribución similar de la actividad entre las distintas fracciones con aproximadamente un 87% de la actividad en la fracción extracelular, un 5% en la fracción de lavado con TES y un 8% en la fracción periplasmática. Fue posible evaluar la validez del criterio señala que: es recomendable la incorporación de prolina en los extremos a fin de evitar la formación de estructuras secundarias y asegurar la exposición del extremo , así como también de que: el valor de la hidrofobicidad del extremo debe ser menor a 500 para mantener la actividad de la enzima . Por el contrario se descartó el criterio de que: no es necesaria la presencia de prolina para mantener la actividad en enzima extracelulares , debido a que sólo la variante con prolina mantuvo una actividad específica alta. Por otra parte, se realizaron HIC para todas las variantes, pero no fue posible la determinación de los valores del tiempo de retención, debido que la enzima precipitaba al introducirla en un medio con alta concentración de sulfato de amonio, lo cual imposibilitaba la realización de ensayos de actividad en las fracciones, por lo cual se recomienda evaluar otras condiciones de operación para determinar estos tiempos de retención.

En la producción de proteínas una de las etapas más importantes es la de purificación, por lo que muchos estudios se enfocan en modificar esta etapa de manera de mejorar la pureza de la proteína de interés. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico corto (tag) a una xilanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para el estudio se escogieron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P) para formar la secuencia del extremo, y se realizaron mutaciones en la proteína para adicionar esta secuencia en el extremo C terminal de la misma por medio de la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las mutantes Xilanasa-(WP)2, Xilanasa-(YP)2Y, Xilanasa-Y3 y Xilanasa-(YP)3. Las cepas de la proteína modificada con estos extremos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo de la fracción periplasmática de la célula, se midió actividad enzimática y proteína total, y actividad específica. Para la cepa nativa y las mutantes, se observó una baja producción de proteína, como se indica en los resultados de proteína y actividad total. Debido a esto se sugiere hacer un estudio de las condiciones óptimas de crecimiento e inducción tanto para la proteína nativa como para las modificadas. En el caso de la xilanasa mutada con la secuencia (YP)3, se observó que en la fracción periplasmática obtuvo la menor cantidad de proteína total, pero la mayor actividad xilanolítica total, mientras que para el resto de las mutantes, se obtuvo una mayor actividad total en la fracción extracelular. Por esto, se recomienda hacer un estudio para analizar las causas de esta forma de expresión de la xilanasa en estudio. Las fracción periplasmática de la cepa nativa y las 4 cepas mutadas se analizó por HIC utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa y se calculó gráficamente los tiempos de retención adimensional (DRT) de a cuerdo a la fracción en que eluyó la proteína en cada caso. Para la xilanasa nativa y las 4 mutadas se observó una tendencia similar en los cromatogramas, y los DRT presentaron un aumento porcentual promedio respecto de la xilanasa nativa de 46,17 % y 31,82 % para las mutantes Xilanasa-(WP)2 y Xilanasa-(YP)2Y respectivamente, mientras que para la Xilanasa-Y3 se observó una disminución de la hidrofobicidad en un 16,6 %. El aumento de los DRT coincide con la presencia de prolinas en el extremo adicionado, mientras que la disminución del mismo se observa en ausencia de este aminoácido. La Xilanasa-(YP)3 se excluyó del estudio de los DRT, debido a que no presentó actividad en medio sólido en las fracciones de la cromatografía, por lo que no se pudo determinar en qué fracción eluyó dicha proteína. Esto se debe probablemente a la baja cantidad de proteína presente en el periplasma de esta cepa. Se calculó la hidrofobicidad superficial de la xilanasa nativa, y el aporte de cada cola a ella. Sin embargo, para esto se utilizó un modelo de xilanasa cuya secuencia posee aproximadamente un 38% de parecido, por lo que no es confiable, y se recomienda buscar un modelo que tenga un mayo porcentaje de similitud con la proteína de trabajo o modelar la misma. Es posible concluir que el aumento de hidrofobicidad superficial de la proteína xilanasa debida a la adición de una secuencia corta de aminoácidos hidrofóbicos, permite un aumento del DRT de las proteínas para el caso de las extremos que contienen prolina como la (WP)2 e (YP)2Y. En el caso del extremo que no tiene prolina (Y3), se observa una disminución de los tiempos de retención adimensional, por lo que se recomienda continuar el estudio de extremos hidrofóbicas sin prolinas, para confirmar la importancia de la presencia de este aminoácido en la secuencia de estos extremos.

Ingeniero Civil en Biotecnología
El presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.

En el presente trabajo de tesis se elabora un modelo matemático que predice el coeficiente de partición de proteínas en sistemas de dos fases acuosas (ATPS), a partir del efecto de hidrofobicidad de las proteínas y la diferencia de energía de solvatación electrostática entre las fases . Para esto, se utilizan los datos experimentales de partición de 11 proteínas, en los sistemas PEG+fosfato, PEG+sulfato, PEG+citrato y PEG+dextrano, cada uno con concentración alta (8.8% p/p), intermedia (0.6% p/p) y nula (0% p/p) de NaCl, definiendo un total de 12 sistemas de características diferentes. Se propusieron 26 modelos en el presente trabajo, obteniendo los mejores resultados con el modelo , el cual disminuye el error de predicción en 6 de los 12 sistemas estudiados, con respecto a los resultados obtenidos por Salgado et al. (2008), donde sólo se utiliza la hidrofobicidad de las proteínas como variable. Los sistemas más favorecidos con la inclusión simultánea de ambas variables corresponden a aquellos con alta (8.8% p/p) concentración de NaCl, donde disminuyó el error de predicción entre un 4.0% y un 34.1% con respecto a los resultados de Salgado et al. Por lo tanto, la adición de una alta concentración de NaCl constituye una fácil alternativa para aumentar la calidad predictiva del modelo, siempre que el diseño lo permita. Debido a que los fenómenos fisicoquímicos involucrados en la partición de proteínas en un sistema PEG+Dextrano (formado por dos polímeros) son distintos a los involucrados en los sistemas PEG+sal, se elaboró un modelo aplicable sólo al sistema PEG+Dextrano, con el cual disminuyó el error de predicción entre un 1.7% y un 29.5% con respecto al de Salgado et al. En este ATPS, no sólo se logró mejorar la predicción del coeficiente de partición para todas las concentraciones de NaCl consideradas, sino que fue posible disminuir el error de predicción con mayor frecuencia que en los demás ATPS, considerando los 26 modelos propuestos. La complejidad del fenómeno involucrado en la partición de proteínas en los sistemas PEG+sal, con la consecuente dificultad de mejorar modelos predictivos aplicados a estos sistemas, explica porqué los ATPS de soluciones poliméricas no han sido reemplazados a nivel industrial por los económicos sistemas salinos. El aporte del presente trabajo de tesis no sólo consiste en presentar una herramienta matemática para predecir el coeficiente de partición de proteínas en ATPS, sino que además, el modelo indica en qué proporción se debe modificar la hidrofobicidad de las proteínas y la diferencia de energía de solvatación electrostática para optimizar la separación.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
Trypanosoma cruzi, protozoo perteneciente a la familia Trypanosomatidae, es el agente causal de la enfermedad de Chagas. El principal mecanismo de transmisión de esta enfermedad es vectorial, por medio de insectos hemípteros hematófagos de la familia Reduviidae. Los tripomastigotes, formas infectantes del parásito, son capaces de resistir la acción del Sistema del Complemento (C) del hospedero, importante componente efector de la respuesta inmune innata. Se describen 3 vías de activación: clásica (VC), alterna (VA) y de las lectinas (VL), las cuales se activan en forma de cascada, por lo cual el C debe ser finamente regulado, impidiendo el daño en células del hospedero. En mamíferos, una proteínas reguladoras del C es el factor acelerador del decaimiento de la convertasa (DAF). DAF actúa inactivando las proteínas C3 y C5 convertasas de la VC y VA, acelerando su decaimiento. Se ha reportado que T. cruzi expresa factores reguladores del C similares a los del hospedero mamífero, inhibiendo su activación. Entre estos, se ha identificado la expresión de una proteína con función similar a DAF humana (T-DAF), de la cual sólo se han expresado parcialmente algunos fragmentos y se desconoce gran parte de sus funciones. En esta memoria de título se amplificó e insertó la secuencia nucleotídica codificante para la proteína de T. cruzi T-DAF en un vector de expresión de Escherichia coli. Utilizando bacterias transformadas con el plasmidio generado, se expresó y purificó en condiciones nativas la proteína recombinante T-DAF y se caracterizó su estructura tridimensional mediante un modelamiento in silico.
Trypanosoma cruzi, protozoan belonging to the Trypanosomatidae family, is the causative agent of Chagas disease. The main mechanism of transmission of this disease is through blood-sucking insects belonging to the Reduviidae family. Trypomastigotes, infectious forms of the parasite, are able to resist the action of the complement system (C), an important effector of the innate immune response in mammals. C has 3 activation pathways: classical (CP), alternative (AP) and lectin (LP) pathways. These 3 pathways are activated sequentially. For this reason, the activation of the C should be finely regulated in order to prevent damage on the host cells. In mammals, an important C regulatory proteins is the decay accelerating factor (DAF). DAF acts by inhibiting the C3 and C5 convertase proteins activation of the CP and AP, accelerating its decay. It has been reported that the parasite expresses C regulatory proteins similar to those present in the mammalian host, inhibiting C. One of these C regulatory proteins has a similar function of human DAF (T-DAF), however, it has only been expressed partially and most of their functions are unknown. In the present work, the nucleotide sequence coding for the protein of T. cruzi T-DAF was amplified and inserted into an expression vector for Escherichia coli. Using bacteria transformed with this vector, the recombinant protein T-DAF was expressed and purified under native conditions, and its three dimensional structure was characterized by an in silico modeling.
Financiamiento: Proyectos FONDECYT de Iniciación: Nð11110251 y Nð1130113.

The present study focuses on the initiation phase of protein synthesis and the generation of aptamers as candidates to reduce the physiological function of the isolated N terminal domain (NTD) of initiation factor 3 (IF-3). Through molecular biology techniques, the correct cloning of the gene coding for IF-3 NTD in plasmid pET24a was verified. This plasmid was used to transform the bacterial model organism Escherichia coli BL21 and thus the massive production of the IF-3 NTD was assessed. Using affinity chromatography techniques, the NTD of the IF-3 was isolated, obtaining high purity degrees and production yields. The purified NTD was used to generate aptamers with the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Five molecules with binding potential to the NTD of IF-3 were found. The present investigation provides the bases to study the interaction of the NTD of IF-3 with the aptamers in cell-free system and thus to evaluate their inhibitory potential. It is expected that these molecules behave as potential new drugs, and therefore they might contribute to cope for the need of new antibiotics.
Tesis

Memoria para optar al título de Ingeniero Civil Químico
Memoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología
En búsqueda de un sistema de expresión recombinante que reduzca los requerimientos de purificación respecto a los de alternativas existentes, se optó por desarrollar la secreción inducible. Para esto fue necesario definir los componentes del sistema junto con la variable operacional de control, cuya modificación activa la liberación de las proteínas producidas desde la célula hospedera al sobrenadante del cultivo. Las proteínas autotransportadoras poseen un sistema de secreción eficiente y constan de dos dominios distintivos en su forma madura: el dominio pasajero (DP), unidad funcional que se expone al medio extracelular, y la unidad de translocación (UT), que se inserta en la membrana externa para permitir el paso del DP desde el periplasma. Dentro de esta familia, el antígeno 43 (Ag43) de Escherichia coli K12 representa un candidato ideal como base para el sistema de expresión. El enlace peptídico que une al DP y la UT es clivado autoproteolíticamente y posteriormente ambos dominios permanecen asociados por interacciones no covalentes, por lo que se pueden separar fácilmente. Si en el corte o la asociación participan aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas, una modificación en el pH del medio podría alterar su interacción, cambiando la tasa de liberación del DP. Para identificar la zona dentro de la proteína que cataliza la proteólisis se diseñaron variantes de Ag43 nativa con distintos segmentos del DP y enhanced green fluorescent protein (EGFP) como módulo reportero. Se construyeron mediante Gibson Assembly en vectores pET22 y luego se indujo su expresión. Analizando proteínas quiméricas tanto de células enteras como lisadas se comprueba que el corte ocurre incluso cuando se elimina el sitio activo propuesto en literatura, correspondiente a un motivo aspartil-proteasa dentro del DP. Utilizando la fluorescencia de EGFP se monitoreó la localización del DP en función del tiempo paralelamente en medios con pH 7, 6 y 5, observándose una disminución en la liberación hacia el sobrenadante a medida que éste se acidifica. Se determinó que el segmento del DP necesario para la autoproteólisis son sus últimos 50 aminoácidos (extremo carboxilo), lo que refuta el supuesto de que el sitio identificado previamente es responsable del corte. Dado que el pH óptimo de cultivo para E. coli es de 7 y la liberación máxima en el sobrenadante se registró para el mismo pH, se descarta la acidificación del medio como método para inducir la secreción. Existe la posibilidad de mantener la secuencia nativa y estudiar el comportamiento del fenómeno frente a cambios en otras variables de operación o identificar con exactitud los aminoácidos clave para el corte y la asociación entre dominios con el fin de someterlos a Ingeniería de Proteínas.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Busca purificar exoproteasas de Pseudomonas sp. por el sistema acuoso bifásico PEG/citrato para obtener hidrolizados proteicos de las semillas de Lupinus mutabilis “Tarwi”. Busca purificar parcialmente las exoproteasas de Pseudomonas sp. mediante extracción líquido-líquido aplicando estudios de diseño factorial de las variables: peso molecular de PEG, concentración de PEG, concentración de citrato y pH. Evalúa la adición de 1% (w/w) de líquidos iónicos formados por 1-butil-3-metil imidazol con diferentes aniones y determinar su efecto en la eficiencia de extracción de exoproteasas de Pseudomonas sp. por sistemas acuosos bifásicos. Realiza la hidrolización de las proteínas de Lupinus mutabilis “Tarwi” con exoproteasas de Pseudomonas sp. purificada por ATPS.
Tesis

La acetilcolinesterasa (AChE) hidroliza el neurotransmisor acetilcolina. La enzima se presenta en distintas formas moleculares. Tetrámeros hidrofílicos de AChE de suero fetal bovino se purificaron, sometieron a un tratamiento químico desnaturalizante o reductor, y estudiaron mediante análisis de sedimentación, cromatografía, fluorescencia intrínseca y unión de sondas hidrofóbicas. La transformación de los tetrámeros hidrofílicos en dímeros y monómeros anfifílicos demostró la alta flexibilidad conformacional de las subunidades de AChE, lo que podría ser crucial en la síntesis del conjunto completo de sus formas moleculares, y aportó una explicación de cómo algunas de sus formas interaccionan con las membranas. Para entender la heterogeneidad molecular de la AChE, también se empleó el anticuerpo AE-1, que interaccionó de forma desigual con oligómeros y monómeros de AChE de distintas fuentes. Experimentos de Western blot demostraron que el epítopo de AE-1 es de naturaleza confor macional. Finalmente, los datos experimentales descartaron la fosforilación de la AChE con proteína quinasa A.
Acetylcholinesterase (AChE) hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine. The enzyme exists in several molecular forms. AChE hydrophilic tetramers from fetal bovine serum were purified, chemically denatured or reduced, and studied by sedimentation analysis, hydrophobic chromatography, intrinsic fluorescence spectra and binding of amphiphilic probes. Conversion of the hydrophilic tetramers into amphiphilic dimers and monomers showed that AChE subunits possess a flexible conformation, which may be important for generating a full set of molecular forms, and gave an explanation of the interaction of certain AChE forms with membranes. Another approach to determine the molecular basis for the structural heterogeneity of AChE was to use the antibody AE-1, which distinctly reacted with AChE oligomers and monomers from different sources. The results of Western blot revealed that the determinant for AE-1 consisted of a conformational domain, not a primary sequence region. Finally, the experimental data rejected the phosphorylation of AChE at non-consensus protein kinase A sites.

En este trabajo de tesis se estudió el efecto de la matriz en la generación y percepción de la principal característica que define la calidad del jamón curado, su aroma. Para ello, se analizó en las diferentes secciones de jamón curado de 7 y 12 meses la composición en proteínas, aminoácidos, ácidos grasos libres y compuestos volátiles. La principales diferencias entre las secciones del jamón se encontraron en la composición de aminoácidos y compuestos volátiles, siendo esta más elevada en el centro que en las otras secciones estudiadas, aunque la proporción de compuestos volátiles se vió modificada con el tiempo de curado. Asimismo, se analizó la interacción existente entre las proteínas de la matriz y determinados compuestos volátiles utilizando la técnica de microextracción en fase sólida (SPME) y la cromatografía de gases. En este sentido, la capacidad de interacción de las proteínas sarcoplásmicas de músculo porcino fue mayor que la capacidad que mostraron las proteínas de jamón de 7 y 12 meses. Además, se puso de manifiesto una menor capacidad de interacción de las proteínas miofibrilares. Por otra parte, se purificaron la actomiosina y actina de músculo porcino en estado post-rigor mediante un proceso simultáneo el cual, permitió conservar sus propiedades y obtener cantidad suficiente de proteína para estudiar su capacidad de interacción con los compuestos volátiles. En este sentido, se demostró que el efecto de la concentración y conformación de actomiosina y actina puras afectó a la capacidad de interacción con los compuestos volátiles aunque dicho efecto dependía del compuesto volátil estudiado. Estos resultados demuestran la existencia de interacciones entre la matriz proteica y los compuestos volátiles responsables del aroma además de demostrar el efecto que la concentración y conformación proteíca ejercen en dicha interacción. Todo ello, supone un aumento del conocimiento del proceso de interacción y su posible repercusión en la percepción del aroma del
Pérez Juan, M. (2006). Interacción de los compuestos aromáticos del jamón curado con la matriz proteica [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1887
Palancia

Esta tesis doctoral está centrada en el trabajo realizado sobre el regulador transcripcional de la resistencia a meticilina en Staphylococcus aureus, Mec1, y se ha concebido como la integración de tres trabajos publicados en revistas científicas. En primer lugar se desarrolla una introducción en la que, paulatinamente, se presenta la importancia biomédica de la proteína en cuestión y la complejidad del sistema de regulación del que forma parte. Posteriormente se describen los objetivos que nos planteamos para esta tesis doctoral. En el apartado de resultados se presentan las tres publicaciones derivadas del trabajo realizado sobre Mec1, precedidas cada una de una breve introducción y de un corto resumen de los resultados que describen. A continuación se realiza una discusión general de las informaciones concernientes a Mec1 que se desprenden del conjunto de publicaciones presentadas. La discusión va seguida de las conclusiones finales del trabajo. Finalmente, en los anexos 1 y 2 se muestran aquellos resultados para los que en los artículos científicos nunca hay espacio, pero que no por ello dejan de ser ilustrativos. Además, durante la duración de mi doctorado he participado en otros proyectos que han dado lugar a otros artículos científicos, y que incluyo en el anexo 3.

Heteromeric amino acid transporters (HATs) mediate the transport of amino acids through the plasma membrane. They are composed of two subunits (a heavy and a light one) linked by a conserved disulfide bridge. Genetic defects in the genes coding these HATs may affect its functionality or expression, leading to inherited aminoacidurias. Thus, solving the structure of the Eukaryotic HATs has become of great importance. However structural information about interactions between the heavy and light subunits of HATs is scarce. In this work, human 4F2hc/L-type amino acid transporter 2 (LAT2) first low resolution 3D model obtained by single particle negative-staining transmission electron microscopy (TEM) was validated. In order to assess the interaction between both subunits of the heterodimer, crosslinking experiments between cysteine residues in both moieties was tried. Namely, two chemical spacers of different length (10.5 and 14.3 Å) were tested and crosslinking was observed for those mutants with pairing positions between 8 and 17.5 Å. Indeed, specific residues that crosslinked 4F2hc and LAT2 nearly completely (>80%). As a result of the positive results (as compared to the appropriate controls) the idea that 4F2hc-ED almost completely covers the extracellular surface of the transporter subunit LAT2 is reasonable. Moreover, further varied evidences (TEM, SPA and docking experiments) were in line with the obtained results, revealing that the extracellular domain of 4F2hc interacts with LAT2, almost completely covering the extracellular face of the transporter. The interaction of 4F2hc with LAT2 gives insights into the structural bases for light subunit recognition and the stabilizing role of the ancillary protein in HATs. In addition, it has been demonstrated that the ectodomain of 4F2hc suffices the stabilization of the light subunit. The second goal of the thesis was to find a suitable HAT candidate to perform crystallization trials and posterior structure elucidation, since human 4F2h/LAT2 was not stable enough for this aim. Until now, only the human 4F2hc ectodomain atomic structure has been solved (Fort et al., 2007), and some low sequence amino acid identity prokaryotic homologues of LATs. In order to identify putative good eukaryotic light subunits for 3D crystallization the adopted GFP‐based Saccharomyces cerevisiae protocol for our transporters resulted successful since it allowed to find three putative good candidate eukaryotic light subunits for 3D crystallization studies. GFP technology allowed quick expression screening, membrane protein-detergent solubilization screening and finally another screening step including assessment of the stability by ultracentrifugation dispersity sedimentation. Once the candidates selected in the best conditions, further purification was required (size exclusion chromatography) before attempting crystallization. In this sense, further efforts were delivered in order to try to enhance the stability (and minimize aggregation). Thus, addition of lipids in the solubilization step and during protein purification was used to mimic the protein membrane environment and reduce the aggregation. Really interesting is the stabilizing effect that cholesterol has on almost all light subunits tested. This is in concordance with the fact that 4F2hc has been found located in lipid rafts where membrane are rich in cholesterol. Removal of reactive cysteine and generation of truncated versions of the protein in the C and N terminal were introduced to increase the crystallization probability. This work ended with the finding of 3 good candidates for crystallization screenings, and the best candidate was optimized in terms of stability and protein flexibility for crystallization studies. Just preliminary crystallization trials were done.
Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) median el transporte de aminoácidos a través de la membrana plasmática. Representan el único ejemplo de transportadores de solutos formado por dos subunidades distintas unidas por un puente disulfuro. Debido a su gran relevancia en fisiología (asociados a aminoacidurias, infección por virus, cáncer,…) el estudio de su estructura-función resulta clave. Debido a su naturaleza, son proteínas difíciles de cristalizar, de las que sólo se conoce la estructura atómica del ectodominio de 4F2hc humano. En este escenario la tesis se centró en la validación del primer modelo 3D a baja resolución de un HAT humano (4F2hc/LAT2), mediante experimentos de crosslinking entre subunidades, e identificación de nuevos candidatos para cristalización 3D. Para ello se seleccionaron 24 subunidades ligeras de distintas especies eucariotas y se testaron en un proceso de selección para determinar el/los mejores candidatos. El primer objetivo de la tesis concluyó con la determinación de residuos concretos en 4F2hc y LAT2 cercanos a una distancia de 3-14 Å mediante la utilización de crosslinkings de cisteínas. Finalmente, tres líneas distintas: el modelo 3D obtenido por microscopía electrónica de transmisión y tinción negativa de partículas individuales (en colaboración con Dr. Fotiadis), los experimentos de crosslinking, y el docking generado en colaboración con Dr. Fdz-Recio, demostraron que 4F2hc-ED cubre, casi completamente, la superficie extracelular de LAT2. Además, se demostró que el ectodominio de 4F2hc es suficiente para estabilizar LAT2. Como resultados del segundo objetivo, tres subunidades ligeras fueron seleccionadas, tras adaptar el protocolo desarrollado por Drew et al.,2008, como mejores candidatas para estudios de cristalización 3D. Posteriormente, distintas estrategias se siguieron para mejorar la estabilidad de la mejor candidata: eliminación de la cisteína reactiva, adición de lípidos a la muestra, cambio de sistema de expresión para aumentar su expresión a células de insecto Sf9. Además, se generaron mutantes delecionados en N y C terminal para reducir su flexibilidad y aumentar la probabilidad de cristalización. Se concluyó en encontrar un buen candidato para estudios de cristalización.

Aquesta tesi se centra en l’estudi de les possibles glicosiltransferases de Micoplasma genitalium involucrades en la síntesi de glicolípids. Aquests compostos formen part de la membrana plasmàtica del microorganisme, únic envolcall que el protegeix del seu entorn ja que no disposa de paret cel•lular. La hipòtesi sobre la qual s’ha desenvolupat el treball és la possibilitat que aquests glicolípids i els enzims encarregats de la seva producció, les glicosiltransferases, siguin essencials per a la viabilitat del micoplasma i per tant, la seva inhibició sigui una forma d’eradicar les infeccions causades pel patògen. De les tres seqüències classificades com a glicosiltrasferases en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 i mg517, s’ha determinat que mg025 és l’únic dels tres gens que no és essencial per al bacteri, tot i que s’ha observat que els tres s’expressen tant a la fase exponencial com a la fase estacionària del seu creixement. La funció de mg025 i mg060 és encara desconeguda, mentre que mg517 és la glicosiltransferasa encarregada de la síntesi dels dos principals glicolípids del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) i el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En aquesta tesi s’ha desenvolupat un protocol d’expressió per a la glicosiltransferasa codificada per mg517, anomenada GT-MG517, el qual fa ús d’una coexpressió amb xaperones i solubilitza la proteïna amb detergents, glicerol i una elevada força iònica. Aquesta metodologia ha estat necessària ja que GT-MG517 és una proteïna associada a membrana i la seva expressió recombinant en E.coli presenta dificultats. La proteïna s’ha purificat mitjançant cromatografia d’afinitat per Ni, tot i que el grau de puresa assolit no ha estat suficient per a intentar la seva cristal•lització. Les diverses proves realitzades usant cromatografia d’exclusió molecular han permès determinar que GT-MG517 forma oligòmers d’alt pes molecular. A partir de la proteïna purificada s’ha realitzat un estudi cinètic de la seva doble activitat glicosildiacilglicerolsintasa. D’aquest estudi s’extreu que GT-MG517 pot transferir un sucre, Glc o Gal, a una molècula principalment hidrofòbica, com és el DOG, i a una molècula molt més hidrofílica, com el MGlcDG. Ambdós compostos però posseeixen un alcohol primari sobre el qual té lloc la transferència creant l’enllaç (16). Amb qualsevol dels substrats acceptors provats, l’enzim presenta activitats específiques superiors si el substrat donador és UDP-Gal. L’acceptor preferit de GT-MG517 és el lípid DOG, però la glicosiltransferasa és capaç d’elongar, ja sigui amb una Glc o amb una Gal, glicolípids com el MGlcDG i el MGDEG, preferint en aquest cas el compost amb una Gal a l’extrem no reductor. Tot i això, l’afinitat de l’enzim és superior per a donadors amb Glc (KM inferiors a les dels donadors amb Gal). D’altra banda, s’ha demostrat que el lípid aniònic DOPG es comporta com a activador de l’activitat enzimática. GT-MG517 posseeix un teòric domini d’unió d’UDP-Glc a l’extrem N-terminal. Aquesta zona presenta similitud de seqüència amb altres glicosiltransferases i permet la classificació de GT-MG517 dins de la família GT-2. En canvi, el seu extrem C-terminal presenta una seqüència particular que no s’alinea amb altres proteïnes. En aquesta tesi es formula la hipòtesi que aquesta zona podria ser d’interacció amb la membrana i, a més, que aquesta interacció podria regular l’activitat enzimàtica. Per això es preparen diverses formes truncades de GT-MG517, en les quals s’eliminen alguns aminoàcids de l’extrem C-terminal, i una forma en la qual només es conserva l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc. Aquestes noves proteïnes s’expressen, solubilitzen i purifiquen aplicant el protocol establert per a la forma completa. Amb l’anàlisi dels glicolípids sintetitzats s’estableix que els deu últims aminoàcids de GT-MG517 són prescindibles per a la seva activitat, ja que les formes truncades corresponents continuen tenint la capacitat de sintetitzar glicolípids. No obstant, l’eliminació d’un nombre superior de residus, inactiva la proteïna. La purificació de l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc posa de manifest que forma oligòmers, de la mateixa forma que ho fa la proteïna completa.
Esta tesis se centra en el estudio de las posibles glicosiltransferasas de Mycoplasma genitalium involucradas en la síntesis de glicolípidos. Estas moléculas constituyen parte de la membrana plasmática del miroorganismo, única estructura de protección frente al entorno ya que los micoplasmas carecen de pared celular. La hipótesis sobre la cual se ha desarrollado el trabajo es la posibilidad que los mencionados glicolípidos y las enzimas encargadas de su producción, las glicosiltransferasas, sean esenciales para la viabilidad del micoplasma y, por tanto, su inhibición sea una forma de erradicar las infecciones causadas por el patógeno. De las tres secuencias clasificadas como glicosiltransferasas en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 y mg517, se determinó que mg025 es el único de los tres genes que no es esencial para la bacteria, aunque se observó que los tres se expresan tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de su crecimiento. Se desconoce todavía la función de mg025 y mg060. En cambio, se conoce que mg517 es la glicosiltransferasa responsable de la síntesis de los dos principales glicolípidos del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) y el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En esta tesis se desarrolló un protocolo de expresión para la glicosiltransferasa codificada por mg517, llamada GT-MG517, el cual emplea una coexpresión con chaperonas y solubiliza la proteína con detergentes, glicerol y una fuerza iónica elevada. Dicha metodología fue necesaria ya que GT-MG517 es una proteína asociada a membrana y su expresión recombinante en E.coli presenta dificultades. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad por Ni pero el grado de pureza obtenido no fue suficiente para intentar su cristalización. Distintas pruebas realizadas usando cromatografía d’exclusión molecular permitieron determinar que GT-MG517 forma oligómeros de alto peso molecular. Con la proteína purificada se realizó un estudio cinético de su doble actividad glicosildiacilglicerolsintasa. De este estudio se extrae que GT-MG517 puede transferir un azúcar, Glc o Gal, a una molécula principalmente hidrofóbica, como es el DOG, y a una molécula mucho más hidrofílica, como el MGlcDG. Pese a su diferencia, los dos compuestos poseen un alcohol primario sobre el que tiene lugar la transferencia creándose el enlace (16). Con cualquiera de los sustratos aceptores probados, la enzima presenta actividades específicas superiores si el sustrato dador es UDP-Gal. El aceptor preferido de GT-MG517 es el lípido DOG, aunque la glicosiltransferasa es capaz de elongar, ya sea con una Glc o con una Gal, glicolípidos como el MGlcDG y el MGDEG, prefiriendo en este caso el compuesto con una Gal en el extremo no reductor. Aún así, la afinidad de la enzima es superior para dadores con Glc (KM inferiores a las de los dadores con Gal). Por otro lado, se demostró que el lípido aniónico DOPG se comporta como activador de la actividad enzimática. GT-MG517 posee un dominio teórico de unión de UDP-Glc en su extremo N-terminal. Esta zona presenta similitud de secuencia con otras glicosiltransferasas y permite la clasificación de GT-MG517 dentro de la familia GT-2. En cambio, su extremo C-terminal presenta una secuencia particular que no se alinea con otras proteínas. En esta tesis se formula la hipótesis que dicha zona podría ser de interacción con la membrana y, además, que dicha interacción podría regular la actividad enzimática. Por eso se prepararon distintas formas trucadas de GT-MG517, en las cuales se eliminaron algunos aminoácidos del extremo C-terminal, y una forma en la cual sólo se conservó el hipotético dominio de unión de UDP-Glc. Las nuevas proteínas se expresaron, solubilizaron y purificaron aplicando el protocolo establecido para la forma completa. Con el análisis de los glicolípidos sintetizados se determinó que los diez últimos aminoácidos de GT-MG517 eran prescindibles para su actividad, ya que las correspondientes formas truncadas conservaban su capacidad de sintetizar glicolípidos. No obstante, la eliminación de un número superior de residuos inactiva la proteína. La purificación del hipotético dominio de unión de UDP puso de manifiesto que forma oligómeros, de la misma forma en que lo hace la proteína completa.
This thesis is focused on the glycolipid producing glycosyltransferases from Mycoplasma genitalium. Glycolipids are part of the microorganism plasma membrane, which is the external covering of mycoplasmas since they lack a cell wall. Our working hypothesis is that glycolipids and the enzymes responsible for their production are essential to mycoplasma. Thus, glycosyltransferase inhibition could be a way to eradicate this pathogen caused infections. There are three genes described as putative glycosyltransferases in Mycoplasma genitalium genome, mg025, mg060 and mg517. We determined that mg025 is the only one essential to the bacteria, although the three of them are expressed both during the exponential and stationary growth phases. The function of mg025 and mg060 still remains unknown, whereas mg517 codifies for the glycosyltransferase responsible for monoglycosyldiacylglycerol (MGlcDG) and diglycosyldiacylglycerol (DGlcDG) synthesis, main mycoplasma glycolipids. In this work an expression protocol for mg517 codified glycosyltransferase was designed. The protocol included chaperone coexpression and protein solubilization with detergents, glycerol and high ionic strength. This methodology was necessary since GT-MG517 is a membrane associated protein and its recombinant expression in E.coli presents some difficulties. GT-MG517 was purified by Ni affinity chromatography. However, a suitable purity degree to attempt protein crystallization was not achieved. Some experiments using size exclusion chromatography revealed that GT-MG517 forms high molecular weight oligomers. A kinetic study of the protein double glycosyldiacylglycerol synthase activity was performed. From this study we learned that GT-MG517 is able to transfer a sugar moiety, Glc or Gal, both to a hydrophobic molecule such as DOG or to a more hydrophilic compound such as MGlcDG. These acceptor substrates share a primary alcohol where the sugar transfer takes place forming a (16) bond. The enzyme presents higher specific activities when UDP-Gal acts as reaction donor, regardless of the acceptor tested. DOG is the preferred acceptor although the enzyme is able to transfer Glc or Gal moieties to glycolipids such as MGlcDG and MGDEG. In this case, the reaction is faster with acceptors with Gal in the non-reducing end. As for donor substrate, enzyme’s affinity is higher for Glc containing molecules, with lower KM values than for Gal donors. In addition, our study proved the anionic lipid DOPG to act as an enzymatic activity enhancer. GT-MG517 has a putative binding domain for UDP-Glc in the N-terminal end. This sequence is similar to other glycosyltransferases and allows its classification in Cazy’s GT-2 family. On the contrary, the C-terminal end has a particular sequence which does not match up with any other protein. Our hypothesis was that this C-terminal end of GT-MG517 could contain a membrane interaction sequence, which could at the same time modulate enzymatic activity. To test this hypothesis some truncated forms of GT-MG517, where C-terminal aminoacids had been removed, were prepared. Moreover, a form where only the putative UDP-Glc binding domain was conserved was also expressed. All these proteins were expressed, solubilized and purified with the same protocol used for the full-length form of GT-MG517. Glycolipids produced by truncated forms were analysed and results implied that the last ten aminoacids were not involved in the enzyme’s activity. Elimination of a higher number of aminoacids caused protein inactivation. When the putative UDP-binding domain was purified, it showed high molecular weight oligomers such as those developed by the complete form of the protein.

[EN] Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1), a 1462-residue mitochondrial enzyme, catalyzes the entry of ammonia into the urea cycle, which converts ammonia, the neurotoxic waste product of protein catabolism, into barely toxic urea. The urea cycle inborn error and rare disease CPS1 deficiency (CPS1D) is inherited with mendelian autosomal recessive inheritance, being due to CPS1 gene mutations (>200 mutations reported), and causing life-threatening hyperammonemia. We have produced recombinantly human CPS1 (hCPS1) in a baculovirus/insect cell expression system, isolating the enzyme in active and highly purified form, in massive amounts. This has allowed enzyme crystallization for structural studies by X-ray diffraction (an off-shoot of the present studies). This hCPS1 production system allows site-directed mutagenesis and enzyme characterization as catalyst (activity, kinetics) and as protein (stability, aggregation state, domain composition). We have revealed previously unexplored traits of hCPS1 such as its domain composition, the ability of glycerol to replace the natural and essential CPS1 activator N-acetyl-L-glutamate (NAG), and the hCPS1 protection (chemical chaperoning) by NAG and by its pharmacological analog N-carbamyl-L-glutamate (NCG). We have exploited this system to explore the effects on the activity, kinetic parameters and stability/folding of the enzyme, and to test the disease-causing nature, of mutations identified in patients with CPS1 deficiency (CPS1D). These results, supplemented with those obtained with other non-clinical mutations, have provided novel information on the functions of three non-catalytic domains of CPS1. We have introduced three CPS1D-associated mutations and one trivial polymorphism in the glutaminase-like domain of CPS1, supporting a stabilizing and an activity-enhancing function of this non-catalytic domain. Two mutations introduced into the bicarbonate phosphorylation domain have shed light on bicarbonate binding and have directly confirmed the importance of this domain for NAG binding to the distant (in the sequence) C-terminal CPS1 domain. The introduction of 18 CPS1D-associated missense mutations mapping in a clinically highly eloquent central non-catalytic domain have proven the disease-causing nature of most of these mutations while showing that in most of the cases they trigger enzyme misfolding and/or destabilization. These results, by proving an important role of this domain in the structural integration of the multidomain CPS1 protein, have led us to call this domain the Integrating Domain. Finally, we have examined the effects of eight CPS1D-associated mutations, of one trivial polymorphism and of five non-clinical mutations, all of them mapping in the C-terminal domain of the enzyme where NAG binds, whereas we have re-analyzed prior results with another four clinical and five non-clinical mutations affecting this domain. We have largely confirmed the pathogenic nature of the clinical mutations, predominantly because of decreased activity, in many cases due to hampered NAG binding. A few mutations had substantial negative effects on CPS1 stability/folding. Our analysis reveals that NAG activation begins with a movement of the final part of the ß4-¿4 loop of the NAG site. Transmission of the activating signal to the phosphorylation domains involves helix ¿4 from this domain and is possibly transmitted by the mutually homologous loops 1313-1332 and 778-787 (figures are residue numbers) belonging, respectively, to the carbamate and bicarbonate phosphorylation domains. These two homologous loops are called from here on Signal Transmission Loops.
[ES] La carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1), una enzima mitocondrial, cataliza la entrada del amonio en el ciclo de la urea, que convierte esta neurotoxina derivada del catabolismo de las proteínas en urea, mucho menos tóxica. El déficit de CPS1 (CPS1D) es un error innato del ciclo de la urea, una enfermedad rara autosómica recesiva, que se debe a mutaciones en el gen CPS1 (>200 mutaciones descritas) y que cursa con hiperamonemia. Hemos producido CPS1 humana recombinante (hCPS1) en un sistema de expresión de células de insecto y baculovirus, y la hemos aislado en forma activa, muy pura y en cantidad elevada. Este sistema de producción de hCPS1 permite la realización de mutagénesis dirigida y la caracterización de la enzima como catalizador (actividad, cinética) y como proteína (estabilidad, estado de agregación y composición de dominios). Hemos revelado características de la hCPS1 antes no exploradas como es la composición de dominios, la capacidad que tiene el glicerol para reemplazar al activador natural y esencial de la CPS1, N-acetil-L-glutamato (NAG), y la protección de la hCPS1 por NAG y por su análogo farmacológico N-carbamil-L-glutamato (NCG) (chaperonas químicas). Hemos utilizado este sistema para explorar los efectos en actividad, parámetros cinéticos y estabilidad/plegamiento de la enzima, y para comprobar la naturaleza patogénica de mutaciones identificadas en pacientes con CPS1D. Estos resultados, junto con los obtenidos con otras mutaciones no clínicas, han aportado información novedosa sobre tres de los dominios no catalíticos de CPS1. Las observaciones realizadas tras introducir en el dominio de tipo glutaminasa de la enzima tres mutaciones asociadas a CPS1D y un polimorfismo trivial, apoyan la contribución de este dominio no catalítico a la estabilidad y a aumentar la actividad de la enzima. Dos mutaciones introducidas en el dominio de fosforilación de bicarbonato han arrojado luz sobre el modo de unión del bicarbonato (un sustrato). Los resultados de estas mutaciones también han confirmado la contribución de este dominio para la unión de NAG, cuyo sitio de unión se encuentra en el dominio C-terminal de CPS1, bastante alejado (en la secuencia) del dominio de fosforilación de bicarbonato. Además, hemos introducido 18 mutaciones de cambio de sentido asociadas a CPS1D, las cuales están localizadas en un dominio no catalítico, central y de elevada elocuencia clínica. Estos resultados han demostrado la naturaleza patogénica de estas mutaciones, ya que en la mayoría de los casos estas mutaciones producen un mal plegamiento o/y desestabilización de la enzima. Debido a que estos resultados han puesto de manifiesto el importante papel de este dominio en la integración estructural de la proteína multidominio CPS1, lo hemos llamado Dominio Integrador. Finalmente, hemos examinado los efectos de 8 mutaciones asociadas a CPS1D, de un polimorfismo trivial y de 5 mutaciones no clínicas, todas localizadas en el dominio C-terminal de la enzima, donde se une NAG. Además, hemos reanalizado resultados anteriores con otras 4 mutaciones clínicas y 5 no clínicas afectando a este dominio. Hemos confirmado el carácter patogénico de las mutaciones clínicas, las cuales predominantemente causan una disminución en la actividad enzimática, en muchos casos debida a que la unión de NAG se encuentra obstaculizada. Unas pocas mutaciones mostraron efectos negativos en la estabilidad/plegamiento de CPS1. Nuestros análisis revelan que la activación por el NAG empieza con un movimiento de la parte final del bucle ß4-¿4 del sitio de NAG. La transmisión de la señal activadora a los dominios de fosforilación implica a la hélice ¿4 de este dominio y posiblemente se transmite a través de los bucles homólogos 1313-1332 y 778-787 (numeración de residuos) pertenecientes, respectivamente, a los dominios de fosforilación de carbamato y bicarbonato. Por ello, hemos llamado a ambos bucles Bucles de
[CAT] La carbamil fosfat sintetasa 1 (CPS1), un enzim mitocondrial, catalitza l'entrada d'amoni en el cicle de la urea, que convertix l'amoni, producte neurotòxic del catabolisme de les proteïnes, en urea, una molècula molt poc tòxica. El dèficit de CPS1 (CPS1D) és un error innat del cicle de la urea, una malaltia rara autosòmica recessiva, que es deu a mutacions en el gen CPS1 (>200 mutacions descrites) i que cursa amb hiperamonièmia. Hem produït CPS1 humana recombinant (hCPS1) en un sistema d'expressió de cèl·lules d'insecte i baculovirus, i l'hem aïllada en forma activa, molt pura i en gran quantitat. Això ha permés la cristal·lització de l'enzim per a estudis estructurals amb difracció de raios-X (treball no inclòs en esta tesi Aquest sistema de producció de hCPS1 permet la realització de mutagènesi dirigida i la caracterització de l'enzim com a catalitzador (activitat, cinètica) i com a proteïna (estabilitat, estat d'agregació i composició de dominis). Hem revelat característiques de la hCPS1 no explorades abans com és la composició de dominis, la capacitat que té el glicerol per a reemplaçar l'activador natural i essencial de CPS1, N-acetil-L-glutamat (NAG), i la protecció de la hCPS1 per NAG i pel seu anàleg farmacològic N-carbamil-L-glutamat (NCG) (xaperones químiques) . Hem utilitzat aquest sistema per a explorar els efectes en l'activitat, els paràmetres cinètics i l'estabilitat/plegament de l'enzim, i per a comprovar la naturalesa patogènica de mutacions identificades en pacients amb CPS1D. Aquestos resultats, junt amb els obtinguts amb altres mutacions no clíniques, han aportat informació nova sobre tres dels dominis no catalítics de la CPS1. Les observacions, després d'introduir tres mutacions associades a CPS1D i un polimorfisme trivial en el domini tipus glutaminasa de CPS1, recolzen la contribució d'aquest domini no catalític a l'estabilitat i a l'optimització de l'activitat enzimàtica. Dues mutacions introduïdes en el domini de fosforilació de bicarbonat han esclarit el mode d'unió de bicarbonat. Els resultats d'aquestes mutacions també han confirmat la contribució d'aquest domini per a la unió de NAG, el lloc d'unió de la qual es troba en el domini C-terminal de CPS1, prou allunyat (en la seqüència) del domini de fosforilació de bicarbonat. A més, hem introduït 18 mutacions de canvi de sentit associades a CPS1D, les quals estan localitzades en un domini no catalític, central i d'elevada eloqüència clínica. Aquestos resultats han demostrat la naturalesa patogènica d'aquestes mutacions, ja que, en la majoria dels casos produïxen un mal plegament o/i desestabilització de l'enzim. Pel fet que aquestos resultats han posat de manifest l'important paper d'aquest domini en la integració estructural de la proteïna multidomini CPS1, l'hem anomenat Domini Integrador. Finalment, hem examinat els efectes de huit mutacions associades a CPS1D, un polimorfisme trivial i cinc mutacions no clíniques, totes elles localitzades en el domini C-terminal de l'enzim, on s'unix NAG. A més, hem reanalitzat resultats anteriors amb altres quatre mutacions clíniques i cinc no clíniques que afecten aquest domini. Hem confirmat el caràcter patogènic de les mutacions clíniques, les quals predominantment causen una disminució en l'activitat enzimàtica, en molts casos pel fet que la unió de NAG es troba obstaculitzada. Unes poques mutacions van mostrar efectes negatius substancials en l'estabilitat/plegament de CPS1. Les nostres anàlisis revelen que l'activació de NAG comença amb un moviment de la part final del bucle ß4-¿4 del lloc de NAG. La transmissió del senyal activadora als dominis de fosforilació involucra l'hèlix ¿4 d'aquest domini i es transmet, possiblement, a través dels bucles homòlegs 1313-1332 i 778-787 (numeració dels residus), pertanyents, respectivament, als dominis de fosforilació de carbamato i bicarbonat. Per això, hem anomenat a ambd
Díez Fernández, C. (2015). USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTURE [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52855
TESIS

En la actualidad los procesos enzimáticos han ido reemplazando algunos de los procesos químicos tradicionales, por cuestiones económicas, ecológicas o por especificidad. Debido al potencial de la ramnosidasa alcalina de Acrostalagmus luteoalbus para la hidrólisis enzimática de flavonoides, para el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos: 1) Estudios de la producción de la α-L-ramnosidasa de A. luteo albus en medios complejos y semi-sintéticos. 2) Selección de un medio de cultivo adecuado para la producción de α-Lramnosidasa. 3) Estudio de represión catabólica por carbono. 4) Purificación de la proteína con actividad ramnosidasa empleando métodos de concentración por liofilización, sistemas cromatográficos y electroforéticos. 5) Determinación de las propiedades cinéticas y bioquímicas relevantes (pH y temperatura óptimos, efecto de cationes sobre la actividad enzimática, PM, pI, huella peptídica) 6) Determinación de la capacidad de las ramnosidasas para hidrolizar flavonoides como naringina, hesperidina y quercitrina en condiciones alcalinas. 7) Caracterización proteómica de la enzima. Secuenciación para su posterior clonado. 8) Obtener adiestramiento en el manejo de técnicas de laboratorio e integrarse adecuadamente a grupo de trabajo.