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Academic literature on the topic 'Purificación de proteínas'
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Journal articles on the topic "Purificación de proteínas"
1
Castellanos Cabrera, Roberto, Beatriz Lizárraga de Olarte, and Luz Doris Sánchez Pinedo. "PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS BÁSICAS DE ESPERMATOZOIDES DE Argopecten purpuratus LAMARCK, 1819." Ciencia & Desarrollo, no. 7 (April 16, 2019): 80–85. http://dx.doi.org/10.33326/26176033.2003.7.134.
Full textAbstract:
Los moluscos bivalvos presentan una gran variedad de proteínas específicas de diferentes pesos moleculares en las células espermáticas, con cantidades variables de los aminoácidos lisina, arginina, serina y alanina. Se han purificado y caracterizado cinco proteínas básicas en las células espermáticas del molusco bivalvo Argopecten purpuratus Lamarck 1819 que presentan características similares a las histonas somáticas de otras especies de invertebrados. El número de componentes de las proteínas y sus parámetros son variables entre las diferentes especies estudiadas; sin embargo, la composición química es muy similar en muchas de ellas. Se ha determinado la composición proteica nuclear específica del espermatozoide del molusco bivalvo Argopecten purpuratus Lamarck 1819, que consiste en uno mezcla heterogénea de histonas que poseen un set característico de proteínas de bajo peso molecular. Las proteínas nucleares específicas de A. purpuratus fueron purificadas por electroforesis preparativa, obteniéndose en forma bastante pura las fracciones denominadas H1, H2a-H2b, H3, H4 que presentan un alto contenido de lisina, arginina, serina y alanina; la fracción H3 presenta cantidades equimolares de arginina, serina, prolina, valina y glicina.
2
Garcés-Parada, Tatiana, and Luis Fernando Arbeláez-Ramírez. "Caracterización de la proteína no capsidal 3D, del virus de la fiebre aftosa y producción de anticuerpos policlonales." Infectio 23, no. 4 (September 9, 2019): 376. http://dx.doi.org/10.22354/in.v23i4.814.
Full textAbstract:
Las proteínas no capsidales del virus de la fiebre aftosa se utilizan como marcadoras en la evaluación de animales que han estado en contacto con el virus, a diferencia de los inmunizados, ya que la vacuna no debe tener estas proteínas, por lo tanto los animales no deben presentar anticuerpos contra ellas. El objetivo de esta investigación fue la caracterización de la proteína no capsidal 3D y la producción de anticuerpos policlonales in vivo. La proteína se purificó del cultivo de virus inactivo, por cromatografía de intercambio iónico. La elución de los picos fue sometida a electroforesis uni-bidimensional; demostrándose un alto grado de pureza (>90%) en el pico tres, donde se identifico la proteína 3D, por la técnica de MALDI-TOF y electroespray de trampa iónica. La proteína purificada, se inoculó en cabras y el suero hiperinmune fue precipitado y sometido a cromatografía de afinidad para la obtención de inmunoglobulinas; la reacción inmunitaria se confirmó por medio de inmunodifusión y Western blot. El proceso de purificación demostró ser eficiente y útil para la obtención de anticuerpos específicos, los cuales tendrán utilidad en la elaboración de un ensayo inmunoenzimático que mida la pureza de la vacuna frente al contenido de estas proteínas.
3
Cantero Guevara, Miriam Elena, Bárbara Cardinali, and Rita Marchi. "Purificación del fibrinógeno gamma A/gamma prima (γA/γ') por cromatografía líquida rápida de proteínas." Revista Colombiana de Química 47, no. 3 (September 1, 2018): 24–30. http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.quim.v47n3.68891.
Full textAbstract:
Una fracción del fibrinógeno circulante contiene una variante de la cadena γ que se origina por empalme alternativo del ARNm, denominada γ’ cuya concentración en plasma se ha relacionado con un incremento en el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue diseñar un método de purificación del fibrinógeno γA/γ’ más eficiente en relación a los descritos en la literatura, a partir de plasma humano. Se purificó el fibrinógeno γA/γ’ a partir del fibrinógeno total obtenido por precipitación con β-alanina, mediante la separación por cromatografía líquida rápida de proteínas. Se confirmó la presencia de fibrinógeno γA/γ’ mediante Western blot; su concentración fue determinada por ELISA. El método mostró ventajas en comparación con los métodos clásicos de separación, por ejemplo, que cantidades menores de muestra pudieron ser fraccionadas cuantitativamente en componentes puros en menor tiempo (30 min). Por tanto, se puede concluir que la técnica utilizada para la purificación de las variantes del fibrinógeno, correspondiente al Fg gA/gA y Fg gA/g’, es un método de separación eficiente que permite purificar el Fg gA/g’ libre de contaminantes principales, como lo confirma la inmunoelectroforesis.
4
Cordeiro, Tiago, Catalina Granados Acevedo, and Miquel Pons. "Incorporación química de la sonda fluorescente FlAsH en la proteína Hha: aplicación al estudio del complejo Hha/H-NS." Nova 7, no. 11 (June 15, 2009): 12. http://dx.doi.org/10.22490/24629448.412.
Full textAbstract:
El objetivo de esta investigación fue realizar estudios de incorporación de la sonda FlAsH como posible herramienta para el estudio <em>in vitro </em>e <em>in vivo </em>de la proteína Hha y de su interacción con H-NS. Se construyó una proteína con la secuencia específica “CCPGCC” capaz de unir la sonda fluorescente FlAsH; posteriormente se desarrollaron procesos de transformación, expresión y purificación, con los cuales se evidenció que a pesar de introducir una secuencia adicional no nativa a la proteína, se pudo obtener proteína en buena cantidad, estabilidad, rendimiento y con un alto nivel de pureza. La optimización del protocolo de incorporación del FlAsH se hizo teniendo en cuenta el rendimiento y el tiempo de reacción. El complejo FlAsH/HhaCCPGCC se caracterizó mediante fluorescencia y se comprobó mediante MALDI TOF. La incorporación HhaCCPGCC1/ FlAsH no se obtuvo en un alto porcentaje como se esperaba, por esta razón no se pudieron hacer los estudios de interacción entre el complejo de proteínas Hha y H-NS.
5
Ruiz Tapia, Tannya Elizabeth, Gonzalo Rafael Jácome Camacho, Marco Vinicio Sinche Serra, Juan Patricio Castillo Domínguez, Francesc Xavier Avilés Puigvert, and Martha Hernández de la Torre. "PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE INHIBIDORES DE PAPAÍNA PROVENIENTES DE SEMILLAS DE AMARANTO (Amaranthus caudatus) Y FRIJOL (Phaseolus vulgaris)." Agrociencia 54, no. 6 (November 11, 2020): 731–45. http://dx.doi.org/10.47163/agrociencia.v54i6.2179.
Full textAbstract:
Los inhibidores de proteasas vegetales con frecuencia son proteínas de baja masa molar, presentes en tejidos de almacenamiento y aéreos de las plantas. Su expresión se induce en respuesta al daño por insectos y microorganismos patógenos y el contenido de estos inhibidores puede ser alto en órganos de cereales y leguminosas. Bajo la premisa de que la combinación de técnicas de purificación de proteínas de baja y alta resolución permite incrementar la actividad específica de inhibidores de proteasas presentes en tejidos vegetales, el objetivo de este estudio fue aislar, purificar y caracterizar bioquímicamente inhibidores de papaína a partir de semillas de amaranto (Amaranthus caudatus) y frijol (Phaseolus vulgaris). El diseño experimental fue completamente al azar para seleccionar las técnicas de baja resolución que incrementan significativamente (p≤0.05) el grado de purificación de los extractos tratados. En todos los estudios se hicieron tres repeticiones y las mediciones se realizaron por triplicado. A partir de harinas de semillas de amaranto y frijol se obtuvieron extractos proteicos crudos que después se ultrafiltraron en membranas de 10 kDa. Las fracciones de baja masa molar se purificaron por cromatografía de afinidad en papaína-glioxil-sepharosa 6B-CL. El extracto crudo de amaranto presentó actividad inhibidora de 1.177 ± 0.067 mU·mL-1 y el de frijol 1.556 ± 0.542 mU·mL-1. Los extractos con purificación parcial de amaranto y frijol se purificaron por cromatografía de afinidad en papaína-glioxil-sepharosa 6B-CL, hasta 137.5 y 79.1 veces, respectivamente. La masa molar estimada fue 7.50 kDa para el inhibidor de amaranto y 8.20 kDa para el de frijol. El inhibidor de amaranto mostró inhibición competitiva con Ki de 0.872 µM, mientras que la del frijol fue no competitiva y con Ki de 0.058 µM. Esto evidencia la presencia de inhibidores de cisteíno proteasas en las semillas de amaranto y frijol.
6
Burgos, Luis C., Luz E. Cano, and Angela Restrepo. "Purificacion de antigenos somaticos del Paracoccidioides brasiliensis. Estudio preliminar." Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo 27, no. 2 (April 1985): 76–81. http://dx.doi.org/10.1590/s0036-46651985000200003.
Full textAbstract:
Se describen los procedimientos de purificación empleados para la separación de las fracciones antigénicas a partir de un material somático obtenido por rotura de células levaduras completas de P. brasiliensis. Dichas fracciones mostraron ser proteínas con pesos moleculares de 66 y 85 Kd; la primera de ellas reaccionó con sueros específicos produciendo una banda de precipitado idéntica a una de las 3 desarrolladas por el antígeno total. Los resultados señalan la posibilidad de obtener antígenos purificados, químicamente identificados y cuyo uso pudiera, en el futuro, representar ventajas para el diagnóstico serológico de la paracoccidioidomicosis, permitiendo separar, repetidamente, solo aquel componente reconocidamente activo.
7
Roustan-Espinosa, Lan, Douglas Guerrero, Ernesto Flores, and Jorge Huete-Pérez. "Enzimas de restricción de bacterias nativas de Nicaragua." Encuentro, no. 52 (January 28, 2000): 10–18. http://dx.doi.org/10.5377/encuentro.v0i52.3849.
Full textAbstract:
Los avances de la ingeniería genética y la biología molecular han propiciado la utilización de bacterias en la industria biotecnológica. En este trabajo se presenta la identificación y caracterización de enzimas de restricción presentes en bacterias recolectadas en medios acuosos de Nicaragua. Se encontró actividad de restricción en el 25% del total de bacterias analizadas. Se abordan los procesos de purificación de extractos de proteínas de bacterias con actividades de Sau961 y Pvull. Este trabajo es un esfuerzo dirigido a la implementación de técnicas modernas de biotecnología en Nicaragua.
8
Bermeo Berrones, Josselyn Gabriela, Iván Patricio Salgado Tello, Cesar Iván Flores Mancheno, and Tatiana Elizabeth Sánchez Herrera. "Evaluación físico-química, microbiológica y sensorial del queso fresco utilizando ficina como biocatalizador." ConcienciaDigital 3, no. 2.1 (May 8, 2020): 231–49. http://dx.doi.org/10.33262/concienciadigital.v3i2.1.1238.
Full textAbstract:
En la presente investigación se propuso efectuar un análisis comparativo realizado al queso elaborado con la enzima proteolítica ficina la cual es proveniente del látex de Ficus carica conocida como (higuera). ya que su actividad proteolítica se manifiesta al desnaturalizar sus proteínas sustrato mediante la ruptura de los enlaces disulfuro generados por aminoácidos sulfurados identificada como cisteína ya que pertenece al grupo de las tiol proteasas y es muy similar a la papaína que se extrae del látex de papaya, y al queso comercial, para lo cual se utilizó la prueba T-student, con tamaño de unidad de 4 litros con 5 repeticiones donde en el análisis físico-químico se obtuvo valores similares en % de humedad, Aw, pH a excepción de la proteína ya que existe una diferencia de 8,86%; Mientras que la actividad enzimática presenta valores de 14,87 U/mg de proteína con un tiempo de 58 segundos correspondientes a una eficaz velocidad enzimática y tiempo de coagulación. No se reportó presencia de microorganismos patógenos en el análisis microbiológico. En el análisis sensorial se utilizó la prueba de preferencia pareada donde el 100% de catadores prefirió el queso fresco comercial. Se recomienda realizar una purificación enzimática para mejorar el contenido de proteína.
9
Patiño González, Edwin, Isabel Andrea Patiño Márquez, and Juan Fernando Alzate. "Cristalización y predicción de la estructura tridimensional de la proteína homóloga del receptor activado para la quinasa c (lack) de leishmania." Revista Colombiana de Química 43, no. 3 (October 26, 2015): 17–23. http://dx.doi.org/10.15446/rev.colomb.quim.v43n3.53612.
Full textAbstract:
<p>Los parásitos del género Leishmania son<br />los causantes de la enfermedad conocida<br />como Leishmaniasis. Esta enfermedad es<br />endémica en 98 países. Veinte especies de<br />Leishmania sp han sido descritas como<br />patógenos en humanos y varias de ellas<br />presentan manifestaciones clínicas diferentes.<br />No se dispone de vacuna, a pesar del<br />considerable esfuerzo de muchos grupos de<br />investigación. Las alternativas para descubrir<br />nuevos medicamentos están basadas en el<br />diseño de compuestos que interaccionen<br />con blancos específicos, principalmente,<br />proteínas encargadas de procesos metabólicos<br />o celulares del patógeno, e.g. la parasitación<br />de las células del huésped vertebrado. La<br />eficiente parasitación del huésped vertebrado<br />por Leishmania depende de la expresión de<br />diferentes proteínas, incluyendo la proteína<br />Lack. Parásitos deficientes de Lack no<br />sobreviven internalizados en las células de<br />los vertebrados. Este artículo presenta las<br />condiciones de renaturalización, purificación<br />y cristalización de la proteína Lack del<br />patógeno humano Leishmania (Viannia)<br />panamensis. Además, los resultados de<br />modelación estructural de esta proteína<br />muestran una conformación proteica similar<br />a un ventilador organizado en 7 aspas, cada<br />una compuesta de 4 hojas β. La estructura de<br />la proteína Lack resultó similar a la proteína<br />asociada a ribosoma RACK1 de Trypanosoma<br />brucei y Saccharomyces cerevisiae, y a la<br />de otros eucariotas. Las características<br />estructurales de la proteína Lack podrían<br />ser usadas para la exploración de nuevos fármacos</p>
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Cañas Bermúdez, Omaira, Diego Andrés Rojas, and Luis Fernando Arbeláez Ramírez. "Determinación del tiempo de lisis del coágulo humano (in vitro) con el plasminógeno/plasmina de cuatro especies: humano, bovino, caprino y porcino." Revista de Medicina Veterinaria, no. 29 (May 18, 2015): 11. http://dx.doi.org/10.19052/mv.3442.
Full textAbstract:
Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en todo el mundo, entre las cuales las anomalías del sistema del plasminógeno/plasmina son un factor importante en la deficiente lisis de los coágulos sanguíneos. En esta investigación se estudió el sistema fibrinolítico en cuatro especies de mamíferos, entre las que se identificó el plasminógeno humano como el más eficiente en cuanto a su poder trombolítico. Se investigó y se identificó el plasminógeno entre cuatro especies (humano, bovino, caprino y porcino) más eficiente en la lisis del coágulo humano in vitro. Los plasminógenos fueron purificados de forma idéntica por cromatografía de afinidad. El fibrinógeno humano se purificó por fraccionamiento con etanol. Tanto la purificación del plasminógeno como la del fibrinógeno se caracterizaron por electroforesis unidimensional SDS-PAGE al 10 %. La formación del coágulo humano, in vitro, así como su disolución por el plasminógeno/plasmina consistió en la determinación del tiempo de lisis desde la formación del coágulo hasta su dilución. La purificación de las proteínas arrojó una pureza mayor al 95 %; el del plasminógeno humano demostró mayor capacidad de lisis del coágulo que los plasminógenos de los animales. Se determinó que la mayor catálisis y eficiencia corresponden al plasminógeno/plasmina humano, que disuelve el coágulo humano hasta tres veces más rápido que las especies irracionales.
Dissertations / Theses on the topic "Purificación de proteínas"
1
Vallejos, Silva Gerardo Raúl. "Purificación de L-Ficolina del sistema del complemento humano." Tesis, Universidad de Chile, 2016. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/142680.
Full textAbstract:
Memoria para la obtención de Título de BioquímicoEn esta Memoria de Título se purificó L-Ficolina humana. A nivel nacional, no hay esfuerzos reportados en este sentido. Esta purificación se realiza en el contexto de los intereses de una de las líneas centrales de investigación del Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile), relacionada con el rol del Sistema del Complemento humano en la infectividad de Trypanosoma cruzi, agente protozoario de la enfermedad de Chagas. Aunque con un rendimiento moderado, se logró la purificación de L-Ficolina recombinante, a través de cromatografía. Se sienta así la estandarización del protocolo en las condiciones locales, el que deberá ser escalado para cubrir las necesidades de futuros experimentos de infectividad parasitaria, a realizarse ya fuera del contexto de esta Memoria
In this dissertation, we describe the purification of human Complement L-Ficolin. At the national level, there are no reported efforts in this regard. This purification was performed within the context of the interests of one of the central lines of research in our laboratory, related to the role of the Complement System in Trypanosome cruzi (the agent of Chagas disease) infectivity. Although with a modest yield, chromatographic purification of L-Ficolin was achieved. Thus, we established the experimental basic conditions for the purification of this rather elusive molecule. Outside the context of this dissertation, this procedure, adequately scaled, may meet the needs of future experiments on parasite infectivity, mediated by this molecule
Conicyt; Fondecyt
2
Carmona, Guerra Lorena. "Efecto modulador de proteínas asociadas a microtúbulos en la formación de microtúbulos y microfilamentos." Tesis, Universidad de Chile, 2004. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/132155.
Full textAbstract:
Memoria para optar al Titulo
Profesional de Médico VeterinarioEn este trabajo de investigación y, en el marco de un estudio estructural y funcional del citoesqueleto celular, se procedió a purificar las proteínas: tubulina, actina, tau y MAP-2. Las tres primeras proteínas se obtuvieron de cerebros de bovino frescos obtenidos en el matadero de SOFACAR S.A. Por otra parte, la actina fue purificada a partir de músculo de pollo. Una vez purificadas las proteínas y conocida su concentración, fueron caracterizadas por medio de electroforesis en PAGE, teñidos con azul de coomassie para ver su grado de pureza y también fueron inmunocaracterizadas, para su identificación molecular. Cada proteína se concentró y guardó a –80ºC hasta su uso. Posteriormente se realizaron experimentos de cinética de polimerización in vitro de microtúbulos y microfilamentos, en cuatro ensayos distintos, pero comparativos entre sí, utilizando para ello métodos turbidimétricos en los cuales se registraron las lecturas de los cambios de absorbancia bajo condiciones de pH y temperatura conocidas. Los dos primeros tenían como proteína base la tubulina (1,8mg/ml) a la cual se adicionó una de las diferentes MAPs. En un caso se incubó en presencia de tau (0,3mg/ml) y se registraron los cambios en absorbancia. En otro ensayo se adicionó MAP-2 (0,3mg/ml) a la tubulina pura incubada y se registró la cinética de polimerización. Ambas lecturas se realizaron a 340nm. Otros ensayos se realizaron con actina (0,4mg/ml), que fue incubada en primer lugar en presencia de tau y luego con MAP-2, registrándose los cambios de absorbancia a 232nm de longitud de onda constante. Los valores obtenidos en cada lectura fueron graficados en función del tiempo. Las curvas obtenidas fueron comparadas entre sí, para establecer las diferencias y semejanzas entre ellas. Durante los experimentos de cinética de polimerización, se tomaron alícuotas de cada ensayo a distintos tiempos, para luego procesar estas muestras y observarlas al microscopio electrónico, de modo de corroborar la curva de cinética respectiva con las estructuras formadas. Estas se analizaron comparativamente con los controles y entre sí. Por otra parte, se procedió a analizar las microfotografías obtenidas al incubar los microfilamentos con los microtúbulos preformados en presencia de tau o de MAP-2, para observar la presencia de interacciones macromoleculares entre las estructuras. Estos estudios se orientaron a reproducir in vitro un sistema de polimerización y depolimerización de las estructuras del citoesqueleto, de modo de aproximarse y comprender el proceso celular que ocurre normalmente en la célula, además de observar la participación de las MAPs en la formación y regulación de este sistema, y la interacción entre las macromoléculas que se forman, microtúbulos y microfilamentos. De lo expuesto, se verificó la reproducibilidad de la formación en condiciones in vitro de estructuras filamentosas y por medio del estudio comparativo de las MAPs se determinó que la proteína tau fue más eficiente que MAP-2 en promover la polimerización de estructuras del citoesqueleto, así como también se corroboró que ambas MAPs disminuyen fuertemente la concentración crítica necesaria tanto de tubulina como de actina en sus respectivos procesos de polimerización. En cuanto a las reacciones supramoleculares, al analizar las imágenes en microscopía electrónica se verifico la existencia de interacciones entre ambos componentes del citoesqueleto, observándose pequeños filamentos que conectan ambas macromoléculas, correspondientes a las MAPs estudiadas
3
Becerra, Barra Pablo Andrés. "Validación de criterios para selección de extremos hidrofóbicos para purificación de proteínas." Tesis, Universidad de Chile, 2012. http://www.repositorio.uchile.cl/handle/2250/111990.
Full textAbstract:
Ingeniero Civil en BiotecnologíaEl presente trabajo tuvo por objetivo estudiar la validez de los criterios de selección que se han establecido para la adición de extremos hidrofóbicos a proteínas para mejorar su purificación mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para esto se utilizó una enzima celulasa Cel5A de Bacillus Agaradherans y tres combinaciones de aminoácidos prolina (P), tirosina (Y) y triptófano (W): YYY (Y3), WPWP (WP2) y WPWPWPWP (WP4). Las secuencias fueron añadidas en el extremo carboxilo terminar de la enzima nativa mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se obtuvieron de forma exitosa las variantes recombinantes Celulasa-Y3, Celulasa-WP2 y Celulasa-WP4. Las variantes obtenidas fueron cultivadas e inducidas bajo las mismas condiciones preestablecidas, extrayéndose las fracciones extracelular y periplasmática a las cuales se les realizaron ensayos de actividad celulolítica y proteína total, para posteriormente calcular su actividad específica. La proteína total producida por las variantes mutantes fue similar a la obtenida por la cepa nativa, obteniéndose un nivel de proteína total con respecto a la cepa nativa de un 98% para la variante Cel-Y3, 88% para la variante Cel-WP2 y de un 75% para la variante Cel-WP4. En todos los casos se obtuvo una mayor parte de la proteína en la fracción extracelular con valores superiores al 56% del total de proteína producida. La variante Cel-WP2, mantuvo un 97% de la actividad celulolítica total de la enzima nativa, a diferencia de las variantes Cel-Y3 y Cel-WP4 que mantuvieron sólo un 18 y 14% respectivamente. Sin embargo, se obtuvo que todas las variantes presentaron una distribución similar de la actividad entre las distintas fracciones con aproximadamente un 87% de la actividad en la fracción extracelular, un 5% en la fracción de lavado con TES y un 8% en la fracción periplasmática. Fue posible evaluar la validez del criterio señala que: es recomendable la incorporación de prolina en los extremos a fin de evitar la formación de estructuras secundarias y asegurar la exposición del extremo , así como también de que: el valor de la hidrofobicidad del extremo debe ser menor a 500 para mantener la actividad de la enzima . Por el contrario se descartó el criterio de que: no es necesaria la presencia de prolina para mantener la actividad en enzima extracelulares , debido a que sólo la variante con prolina mantuvo una actividad específica alta. Por otra parte, se realizaron HIC para todas las variantes, pero no fue posible la determinación de los valores del tiempo de retención, debido que la enzima precipitaba al introducirla en un medio con alta concentración de sulfato de amonio, lo cual imposibilitaba la realización de ensayos de actividad en las fracciones, por lo cual se recomienda evaluar otras condiciones de operación para determinar estos tiempos de retención.
4
Montecinos, Pavez Catalina Aurora. "Estudio del Efecto de la Adición de Extremos Hidrofóbicos en la Expresión y Purificación por HIC de Xilanasas Recombinantes." Tesis, Universidad de Chile, 2009. http://www.repositorio.uchile.cl/handle/2250/103516.
Full textAbstract:
En la producción de proteínas una de las etapas más importantes es la de purificación, por lo que muchos estudios se enfocan en modificar esta etapa de manera de mejorar la pureza de la proteína de interés. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico corto (tag) a una xilanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC).
Para el estudio se escogieron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P) para formar la secuencia del extremo, y se realizaron mutaciones en la proteína para adicionar esta secuencia en el extremo C terminal de la misma por medio de la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las mutantes Xilanasa-(WP)2, Xilanasa-(YP)2Y, Xilanasa-Y3 y Xilanasa-(YP)3.
Las cepas de la proteína modificada con estos extremos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo de la fracción periplasmática de la célula, se midió actividad enzimática y proteína total, y actividad específica. Para la cepa nativa y las mutantes, se observó una baja producción de proteína, como se indica en los resultados de proteína y actividad total. Debido a esto se sugiere hacer un estudio de las condiciones óptimas de crecimiento e inducción tanto para la proteína nativa como para las modificadas.
En el caso de la xilanasa mutada con la secuencia (YP)3, se observó que en la fracción periplasmática obtuvo la menor cantidad de proteína total, pero la mayor actividad xilanolítica total, mientras que para el resto de las mutantes, se obtuvo una mayor actividad total en la fracción extracelular. Por esto, se recomienda hacer un estudio para analizar las causas de esta forma de expresión de la xilanasa en estudio.
Las fracción periplasmática de la cepa nativa y las 4 cepas mutadas se analizó por HIC utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa y se calculó gráficamente los tiempos de retención adimensional (DRT) de a cuerdo a la fracción en que eluyó la proteína en cada caso.
Para la xilanasa nativa y las 4 mutadas se observó una tendencia similar en los cromatogramas, y los DRT presentaron un aumento porcentual promedio respecto de la xilanasa nativa de 46,17 % y 31,82 % para las mutantes Xilanasa-(WP)2 y Xilanasa-(YP)2Y respectivamente, mientras que para la Xilanasa-Y3 se observó una disminución de la hidrofobicidad en un 16,6 %. El aumento de los DRT coincide con la presencia de prolinas en el extremo adicionado, mientras que la disminución del mismo se observa en ausencia de este aminoácido. La Xilanasa-(YP)3 se excluyó del estudio de los DRT, debido a que no presentó actividad en medio sólido en las fracciones de la cromatografía, por lo que no se pudo determinar en qué fracción eluyó dicha proteína. Esto se debe probablemente a la baja cantidad de proteína presente en el periplasma de esta cepa.
Se calculó la hidrofobicidad superficial de la xilanasa nativa, y el aporte de cada cola a ella. Sin embargo, para esto se utilizó un modelo de xilanasa cuya secuencia posee aproximadamente un 38% de parecido, por lo que no es confiable, y se recomienda buscar un modelo que tenga un mayo porcentaje de similitud con la proteína de trabajo o modelar la misma.
Es posible concluir que el aumento de hidrofobicidad superficial de la proteína xilanasa debida a la adición de una secuencia corta de aminoácidos hidrofóbicos, permite un aumento del DRT de las proteínas para el caso de las extremos que contienen prolina como la (WP)2 e (YP)2Y. En el caso del extremo que no tiene prolina (Y3), se observa una disminución de los tiempos de retención adimensional, por lo que se recomienda continuar el estudio de extremos hidrofóbicas sin prolinas, para confirmar la importancia de la presencia de este aminoácido en la secuencia de estos extremos.
5
Sandoval, Hevia Gabriela Daniela. "Modelamiento y Simulación de Curvas de Elución de Proteínas en Cromatografías de Afinidad." Tesis, Universidad de Chile, 2011. http://www.repositorio.uchile.cl/handle/2250/102727.
Full text
6
Zúñiga, Ferrand Felipe Javier. "Estudio del efecto de la adición de extremos polipeptídicos hidrofóbicos en la expresión y purificación de proteínas recombinantes." Tesis, Universidad de Chile, 2013. http://www.repositorio.uchile.cl/handle/2250/113984.
Full textAbstract:
Ingeniero Civil en BiotecnologíaEl presente trabajo tuvo por objetivo realizar la adición del extremo polipeptídico WP4, de alta hidrofobicidad a tres enzimas recombinantes xilanasa, cutinasa y celulasa, bajo la hipótesis de aumentar su tiempo de adsorción en Cromatografía de Interacción Hidrofóbica, para optimizar su purificación utilizando dicha técnica. Para luego, estudiar el efecto de la adición de este extremo en su producción, recuperación, actividad y comparar estos parámetros con los obtenidos en las enzimas recombinantes con distintos extremos polipeptídicos adicionados en trabajos anteriores (Xil-(YP)2Y, Xil-Y3 y Xil-(YP)3; Cut-(WP)2, Cut-(YP)3 y Cut-Y3 y Cel-(WP)2, Cel-(WP)2, Cel-(YP)2Y, Cel-(YP)3 y Cel-Y3). Utilizando como templado el gen wt en cada una de las enzimas, se obtuvieron resultados positivos para cutinasa y celulasa, quedando las enzimas recombinantes Cut-wp4 y Cel-WP4. En el caso de xilanasa, no se obtuvo amplificación a ninguna temperatura en la reacción de PCR, por lo cual, no se logró sintetizar la enzima con el extremo polipeptídico WP4, posiblemente por la formación de hairpin y autoalineamiento de los partidores sense y antisense para la síntesis de xilanasa-WP4. Para el caso de la enzima celulasa se realizaron los análisis de actividad y cantidad de proteína producida para todas las variantes y se comparó estos resultados con la enzima nativa. Se observa que las enzimas mutadas, con excepción de la variable cel-YP2Y, presentaron el mismo comportamiento que la endoglucanasa nativa, donde la mayor actividad celulolítica, se obtiene en el medio extracelular. En el caso de cel-YP2Y, se sospecha quela baja actividad presentada en el medio extracelular se debió a la baja producción de enzima. Pero no se puede descarta que el extremo YP2Y afecta negativamente la migración de la misma al medio extracelular ya que es en este caso donde se encontró más actividad en el medio periplasmático y en el lavado con TES. Del estudio se concluyó que las endoglucanasas modificadas con extremos hidrofóbicos son activas. Los extremos polipeptídicos Cel-Y3, Cel-YP2Y, Cel-YP3, Cel-WP4 presentan valores superiores al 87% de actividad específica residual con respecto a la nativa. En el caso de cel-WP4 la actividad específica en el medio extracelular es un 74% de la enzima nativa. A partir de lo anterior se puede decir que el criterio cuantitativo de que el extremo de una hidrofobicidad mayor a 500 afecta de mayor manera la actividad de la enzima, resultó ser correcto en este estudio, ya que para el caso de Cel-WP4 que posee una hidrofobicidad de 878, la actividad específica fue solo de un 74% respecto a la enzima nativa. Y como criterio cualitativo se comprobó que no es necesaria la presencia del aminoácido Prolina (P) en el extremo, para que la enzima se activa.
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Riveros, Figueroa Nimia Carolina. "Predicción del Coeficiente de Partición de Proteínas en Sistemas de Dos Fases Acuosas a Partir de la Energía de Solvatación y la Hidrofobicidad." Tesis, Universidad de Chile, 2009. http://www.repositorio.uchile.cl/handle/2250/103568.
Full textAbstract:
En el presente trabajo de tesis se elabora un modelo matemático que predice el coeficiente de partición de proteínas en sistemas de dos fases acuosas (ATPS), a partir del efecto de hidrofobicidad de las proteínas y la diferencia de energía de solvatación electrostática entre las fases . Para esto, se utilizan los datos experimentales de partición de 11 proteínas, en los sistemas PEG+fosfato, PEG+sulfato, PEG+citrato y PEG+dextrano, cada uno con concentración alta (8.8% p/p), intermedia (0.6% p/p) y nula (0% p/p) de NaCl, definiendo un total de 12 sistemas de características diferentes.
Se propusieron 26 modelos en el presente trabajo, obteniendo los mejores resultados con el modelo , el cual disminuye el error de predicción en 6 de los 12 sistemas estudiados, con respecto a los resultados obtenidos por Salgado et al. (2008), donde sólo se utiliza la hidrofobicidad de las proteínas como variable.
Los sistemas más favorecidos con la inclusión simultánea de ambas variables corresponden a aquellos con alta (8.8% p/p) concentración de NaCl, donde disminuyó el error de predicción entre un 4.0% y un 34.1% con respecto a los resultados de Salgado et al. Por lo tanto, la adición de una alta concentración de NaCl constituye una fácil alternativa para aumentar la calidad predictiva del modelo, siempre que el diseño lo permita.
Debido a que los fenómenos fisicoquímicos involucrados en la partición de proteínas en un sistema PEG+Dextrano (formado por dos polímeros) son distintos a los involucrados en los sistemas PEG+sal, se elaboró un modelo aplicable sólo al sistema PEG+Dextrano, con el cual disminuyó el error de predicción entre un 1.7% y un 29.5% con respecto al de Salgado et al. En este ATPS, no sólo se logró mejorar la predicción del coeficiente de partición para todas las concentraciones de NaCl consideradas, sino que fue posible disminuir el error de predicción con mayor frecuencia que en los demás ATPS, considerando los 26 modelos propuestos.
La complejidad del fenómeno involucrado en la partición de proteínas en los sistemas PEG+sal, con la consecuente dificultad de mejorar modelos predictivos aplicados a estos sistemas, explica porqué los ATPS de soluciones poliméricas no han sido reemplazados a nivel industrial por los económicos sistemas salinos.
El aporte del presente trabajo de tesis no sólo consiste en presentar una herramienta matemática para predecir el coeficiente de partición de proteínas en ATPS, sino que además, el modelo indica en qué proporción se debe modificar la hidrofobicidad de las proteínas y la diferencia de energía de solvatación electrostática para optimizar la separación.
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Mendel, Reyes Yael Andrea. "Expresión y purificación del factor acelerador del decaimiento de la convertasa recombinante de Trypanosoma cruzi." Tesis, Universidad de Chile, 2016. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/142324.
Full textAbstract:
Memoria para optar al Título Profesional de Médico VeterinarioTrypanosoma cruzi, protozoo perteneciente a la familia Trypanosomatidae, es el agente causal de la enfermedad de Chagas. El principal mecanismo de transmisión de esta enfermedad es vectorial, por medio de insectos hemípteros hematófagos de la familia Reduviidae. Los tripomastigotes, formas infectantes del parásito, son capaces de resistir la acción del Sistema del Complemento (C) del hospedero, importante componente efector de la respuesta inmune innata. Se describen 3 vías de activación: clásica (VC), alterna (VA) y de las lectinas (VL), las cuales se activan en forma de cascada, por lo cual el C debe ser finamente regulado, impidiendo el daño en células del hospedero. En mamíferos, una proteínas reguladoras del C es el factor acelerador del decaimiento de la convertasa (DAF). DAF actúa inactivando las proteínas C3 y C5 convertasas de la VC y VA, acelerando su decaimiento. Se ha reportado que T. cruzi expresa factores reguladores del C similares a los del hospedero mamífero, inhibiendo su activación. Entre estos, se ha identificado la expresión de una proteína con función similar a DAF humana (T-DAF), de la cual sólo se han expresado parcialmente algunos fragmentos y se desconoce gran parte de sus funciones. En esta memoria de título se amplificó e insertó la secuencia nucleotídica codificante para la proteína de T. cruzi T-DAF en un vector de expresión de Escherichia coli. Utilizando bacterias transformadas con el plasmidio generado, se expresó y purificó en condiciones nativas la proteína recombinante T-DAF y se caracterizó su estructura tridimensional mediante un modelamiento in silico.
Trypanosoma cruzi, protozoan belonging to the Trypanosomatidae family, is the causative agent of Chagas disease. The main mechanism of transmission of this disease is through blood-sucking insects belonging to the Reduviidae family. Trypomastigotes, infectious forms of the parasite, are able to resist the action of the complement system (C), an important effector of the innate immune response in mammals. C has 3 activation pathways: classical (CP), alternative (AP) and lectin (LP) pathways. These 3 pathways are activated sequentially. For this reason, the activation of the C should be finely regulated in order to prevent damage on the host cells. In mammals, an important C regulatory proteins is the decay accelerating factor (DAF). DAF acts by inhibiting the C3 and C5 convertase proteins activation of the CP and AP, accelerating its decay. It has been reported that the parasite expresses C regulatory proteins similar to those present in the mammalian host, inhibiting C. One of these C regulatory proteins has a similar function of human DAF (T-DAF), however, it has only been expressed partially and most of their functions are unknown. In the present work, the nucleotide sequence coding for the protein of T. cruzi T-DAF was amplified and inserted into an expression vector for Escherichia coli. Using bacteria transformed with this vector, the recombinant protein T-DAF was expressed and purified under native conditions, and its three dimensional structure was characterized by an in silico modeling.
Financiamiento: Proyectos FONDECYT de Iniciación: Nð11110251 y Nð1130113.
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Loayza, Guzmán Mariana. "Purificación del dominio N-terminal del Factor de Iniciación 3 de Escherichia coli para la selección de Aptámeros." Bachelor's thesis, Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC), 2018. http://hdl.handle.net/10757/622962.
Full textAbstract:
The present study focuses on the initiation phase of protein synthesis and the generation of aptamers as candidates to reduce the physiological function of the isolated N terminal domain (NTD) of initiation factor 3 (IF-3). Through molecular biology techniques, the correct cloning of the gene coding for IF-3 NTD in plasmid pET24a was verified. This plasmid was used to transform the bacterial model organism Escherichia coli BL21 and thus the massive production of the IF-3 NTD was assessed. Using affinity chromatography techniques, the NTD of the IF-3 was isolated, obtaining high purity degrees and production yields. The purified NTD was used to generate aptamers with the SELEX technique (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Five molecules with binding potential to the NTD of IF-3 were found. The present investigation provides the bases to study the interaction of the NTD of IF-3 with the aptamers in cell-free system and thus to evaluate their inhibitory potential. It is expected that these molecules behave as potential new drugs, and therefore they might contribute to cope for the need of new antibiotics.Tesis
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Hartmann, Prieto Federico Patricio. "Estudio del mecanismo autoproteolítico nativo de AG43 para su aplicación en expresión de proteínas recombinantes de fácil purificación en Escherichia coli." Tesis, Universidad de Chile, 2018. http://repositorio.uchile.cl/handle/2250/168474.
Full textAbstract:
Memoria para optar al título de Ingeniero Civil QuímicoMemoria para optar al título de Ingeniero Civil en Biotecnología
En búsqueda de un sistema de expresión recombinante que reduzca los requerimientos de purificación respecto a los de alternativas existentes, se optó por desarrollar la secreción inducible. Para esto fue necesario definir los componentes del sistema junto con la variable operacional de control, cuya modificación activa la liberación de las proteínas producidas desde la célula hospedera al sobrenadante del cultivo. Las proteínas autotransportadoras poseen un sistema de secreción eficiente y constan de dos dominios distintivos en su forma madura: el dominio pasajero (DP), unidad funcional que se expone al medio extracelular, y la unidad de translocación (UT), que se inserta en la membrana externa para permitir el paso del DP desde el periplasma. Dentro de esta familia, el antígeno 43 (Ag43) de Escherichia coli K12 representa un candidato ideal como base para el sistema de expresión. El enlace peptídico que une al DP y la UT es clivado autoproteolíticamente y posteriormente ambos dominios permanecen asociados por interacciones no covalentes, por lo que se pueden separar fácilmente. Si en el corte o la asociación participan aminoácidos con cadenas laterales ácidas o básicas, una modificación en el pH del medio podría alterar su interacción, cambiando la tasa de liberación del DP. Para identificar la zona dentro de la proteína que cataliza la proteólisis se diseñaron variantes de Ag43 nativa con distintos segmentos del DP y enhanced green fluorescent protein (EGFP) como módulo reportero. Se construyeron mediante Gibson Assembly en vectores pET22 y luego se indujo su expresión. Analizando proteínas quiméricas tanto de células enteras como lisadas se comprueba que el corte ocurre incluso cuando se elimina el sitio activo propuesto en literatura, correspondiente a un motivo aspartil-proteasa dentro del DP. Utilizando la fluorescencia de EGFP se monitoreó la localización del DP en función del tiempo paralelamente en medios con pH 7, 6 y 5, observándose una disminución en la liberación hacia el sobrenadante a medida que éste se acidifica. Se determinó que el segmento del DP necesario para la autoproteólisis son sus últimos 50 aminoácidos (extremo carboxilo), lo que refuta el supuesto de que el sitio identificado previamente es responsable del corte. Dado que el pH óptimo de cultivo para E. coli es de 7 y la liberación máxima en el sobrenadante se registró para el mismo pH, se descarta la acidificación del medio como método para inducir la secreción. Existe la posibilidad de mantener la secuencia nativa y estudiar el comportamiento del fenómeno frente a cambios en otras variables de operación o identificar con exactitud los aminoácidos clave para el corte y la asociación entre dominios con el fin de someterlos a Ingeniería de Proteínas.