Dissertations / Theses on the topic 'Protéines NLR'

La Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 (RIPK2) est un médiateur crucial des voies de signalisation de l'immunité innée, en particulier celles initiées par les NOD-like receptors NOD1 et NOD2. Les voies inflammatoires NOD1/2 - RIPK2 ont suscité un grand intérêt en tant que cibles thérapeutiques pour diverses maladies inflammatoires. Compte tenu de l'expertise de notre équipe dans ce domaine, nous avons décidé de nous concentrer sur ces voies. Ce projet a été divisé en plusieurs tâches. La première a permis d'établir les relations structure-activité (RSA) de deux séries de petites molécules inhibitrices de RIPK2. Ces composés étaient pour la plupart actifs à l'échelle du nanomolaire sur la voie NOD1 et sélectifs de cette voie par rapport à la voie NOD2. La deuxième stratégie s'est concentrée sur le développement de dégradeurs par stratégie de marquage hydrophobe. La dégradation de kinases est une stratégie émergente ayant le potentiel d’améliorer la sélectivité par rapport aux inhibiteurs conventionnels, raison pour laquelle elle a été envisagée. Enfin, la dernière stratégie visait à identifier des inhibiteurs de l'interaction XIAP-RIPK2, essentielle à l’activation des voies inflammatoires, par le biais d'un criblage virtuel. Les composés recherchés ont été synthétisés (pour les deux premières tâches) et testés sur les essais biologiques de notre équipe. Pour la première série de composés, des études complémentaires ont été réalisées (structurales, ADMET, sélectivité, in vivo) et ont permis de confirmer le potentiel thérapeutique de nos composés en vue d’un traitement des maladies inflammatoires
The Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 (RIPK2) is a crucial mediator of innate immune signaling pathways, and particularly those initiated by NOD-like receptors (NLRs) NOD1 and NOD2. NOD1/2 - RIPK2 signaling pathways have garnered significant interest as therapeutic targets for various inflammatory diseases. In view of our team's expertise in the field, we decided to focus on these pathways. This project has been divided into several tasks. The first led to the establishment of structure-activity relationships (SAR) of series of small molecule RIPK2 inhibitors. These compounds were for the most part active at the nanomolar range on NOD1 pathway and selective toward this pathway vs NOD2. The second strategy was focused on the development of hydrophobic tagged degraders. Degrading kinases is an emerging strategy and has shown potential for providing greater selectivity compared to conventional inhibitors which is why it was investigated. Finally, the last strategy aimed at the identification of XIAP-RIPK2 interaction inhibitors, essential to the inflammatory pathways, through virtual screening. The desired compounds were synthesized (for the two first tasks) and tested on our team’s biological assays. For the first series of compounds, additional studies were carried out (structural, ADMET, selectivity, in vivo) and confirmed our compounds’ therapeutic potential in inflammatory diseases

L’inflammasome NLRP3 est un complexe multi-protéique responsable de la production d’IL-1β en réponse à des signaux de danger. Certaines mutations de NLRP3 étant responsables de maladies inflammatoires l’activation de ce complexe se doit d’être finement régulée. Dans cette étude je me suis intéressé à l’importance de la protéine de choc thermique HSP70 dans l’activation de l’inflammasome NLRP3. J’ai dans un premier temps mis en évidence que l’absence d’HSP70 entraine une amplification des symptômes de la péritonite chez la souris. Le manque d’HSP70 augmente également l’activation de la caspase-1 et la production d’IL-1β par les macrophages issus de la moelle osseuse de souris (BMDMs) à la suite d’un traitement par différents activateurs de NLRP3 in vitro. Ces phénomènes sont associés à une augmentation du nombre et de la taille des complexes ASC/NLRP3 dans la cellule. De manière correspondante, la surexpression d’HSP70 dans les BMDMs diminue l’activation de la caspase-1 et la production d’IL-1β après traitement par des activateurs de NLRP3. Une des explications possibles de l’effet inhibiteur d’HSP70 est son interaction avec NLRP3 que j’ai observé par PLA (Proximity Ligation Assay). J’ai également utilisé un choc thermique pour surexprimer HSP70 et observé une inhibition de l’inflammasome NLRP3 in vitro. Finalement, une hyperthermie in vivo inhibe également les symptômes de la péritonite chez la souris, soulignant la relevance physiologique de ces observations. Cette étude fournit donc des preuves de l’effet inhibiteur d’HSP70 sur l’inflammasome NLRP3 et met en lumière un possible nouvel outil de traitement des maladies inflammatoires
NLRP3 inflammasome is a multi-protein complex aimed at producing IL-1β in response to danger signals. Gain of function mutations of NLRP3 are responsible for inflammatory diseases, so NLRP3-dependent inflammation required tight regulation. Here we investigated the importance of the stress sensor, Heat Shock Protein 70 (HSP70) on the NLRP3 inflammasome activation. First, the lack of HSP70 leads to a worsening of NLRP3-dependent peritonitis in mice. HSP70 deficiency also enhances caspase-1 activation and IL-1β production by murine Bone Marrow-Derived Macrophages (BMDMs) under NLRP3 activators treatment in vitro. These phenomena are associated with an increase in the number and size of ASC/NLRP3 specks. At the opposite side, the overexpression of HSP70 in BMDMs decreases caspase-1 activation and IL-1β production under NLRP3 activators treatment in vitro. One possible explanation of the inhibitory effect of HSP70 is its interaction with NLRP3. A heat shock, used as a way to induce the expression of HSP70 also inhibits the NLRP3 inflammasome activation in vitro. Finally, in vivo hyperthermia also inhibits peritonitis features in mice, highlighting the physiological relevance of our observations. This study provides evidences on the inhibitory role of HSP70 on the NLRP3 inflammasome and on the possibility to treat inflammatory diseases by inducing its expression, mainly by hyperthermia

Les protéines 14-3-3 sont des protéines adaptatrices qui exercent leurs fonctions biologiques en modulant l’activité de centaines d’autres protéines. De part leur impressionnant interactome, les protéines 14-3-3 sont des acteurs qui influencent de nombreux événements cellulaires et, par conséquent, de maladies associées. La stabilisation ou l’inhibition sélective d’interactions protéine-protéine (IPP) de 14-3-3 sont considérées comme des approches prometteuses pour trouver des thérapies innovantes contre des maladies comme la maladie d’Alzheimer, certains cancers ou la maladie de Parkinson.Notre premier but afin de trouver des petites molécules capables de moduler ces cibles a été d’étudier au niveau moléculaire des IPP de 14-3-3. Dans ce but, nous avons utilisé la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) pour attribuer les déplacements chimiques des atomes du squelette de 14-3-3σ. Nous avons ensuite étudié l’interaction entre 14-3-3 et la protéine Tau phosphorylée. Nous avons découvert que Tau se lie strictement dans la cavité amphipathique de 14-3-3 et peut s’ancrer aux deux monomères du dimère de 14-3-3. Nous avons aussi étudié l’interaction 14-3-3/p53 et avons découvert, en utilisant la RMN, que l’affinité du peptide p53 envers 14-3-3 est liée à des interactions intramoléculaires au niveau du peptide. Nous nous sommes enfin focalisés sur l’optimisation d’expériences RMN visant le criblage et la caractérisation de l’activité des petites molécules qui se lient à 14-3-3 ou à des complexes de 14-3-3 avec des peptides phosphorylés. Nous avons aussi utilisé des peptides phospho-mimétiques pour inhiber l’interaction 14-3-3/Tau. D’autre part, nous avons criblé une bibliothèque de fragments contre 14-3-3σ et trouvé trois hits qui se lient à des régions différentes de la protéine. Des expériences RMN ont ensuite permis de caractériser l’activité de certaines petites molécules actives sur des complexes de 14-3-3 avec, par exemple des peptides de p53 ou p65, et nous avons aussi démontré la capacité de certains de ces composés à stabiliser les complexes
14-3-3 proteins are adapter proteins that exert their biological functions by modulating the activity of hundreds of proteins. This remarkable interactome makes 14-3-3 proteins influent actors in many cellular events and, by consequence, in several pathologies. The selective stabilization or inhibition of 14-3-3 protein-protein interactions (PPIs) are therefore seen as promising approaches for finding innovative therapies for a number of conditions like Alzheimer’s, cancer or Parkinson. Our first objective towards finding small molecule modulators of these targets was to obtain the molecular detail of 14-3-3 PPIs. To this end, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), we assigned the backbone chemical shifts of 14-3-3σ. We then studied the 14-3-3/phosphorylated Tau interaction and found that Tau binds strictly within the amphipathic binding grove of 14-3-3 and can anchor in both monomers of the 14-3-3 dimer. We also studied the 14-3-3/p53 interaction and showed by NMR, that intramolecular interactions within the peptide define a conformation that drives the affinity towards 14-3-3. 2019We then focused on the optimization of NMR assays for screening and characterization of the effect of small-molecules binding to 14-3-3 or 14-3-3 complexes with target’s phosphopeptides. We used, for example, phospho-mimetic peptides to inhibit the Tau/14-3-3 interaction. In a different strategy, we screened a fragment library against 14-3-3σ and found three hits binding to different regions of the protein. Using our NMR assays we further characterized small molecules binding 14-3-3 complexes with, for example, p53 and p65 peptides and demonstrated the stabilization capacity of some compounds

De nombreuses protéines ou domaines de protéines sont intrinsèquement non structurés/désordonnés (IUPs), mais possèdent néanmoins des fonctions diverses et importantes in vivo. La technique de choix pour étudier les IUPs est la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Cependant, pour obtenir de l'information à partir des différentes expériences de RMN possibles, les spectres doivent d'abord être attribués. Pour faciliter cette attribution, un outil graphique, semi-automatique qui utilise le concept des plans produit et somme a été développé. Cet outil a permis l'étude de deux IUPs individuelles, Tau et NS5A VHC. Les résonances RMN du squelette et des Cb ont été attribuées entièrement pour deux fragments de Tau (F3 et F5) et partiellement pour Tau entier P301L. Ces attributions RMN de Tau pourraient mener à davantage de compréhension sur le comportement structural de cette protéine quand elle se lie à, ou polymérise des microtubules. Aussi la formation des agrégés de Tau, qui est une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, pourrait être étudiée plus en détail. Dans un deuxième temps, la protéine non structurale 5A (NS5A) du virus de l'Hépatite C (VHC) a été étudiée. Les propriétés structurales du deuxième et troisième domaine (sur trois) de cette protéine ont été évaluées. De la structure hélice alpha résiduelle a été observée, ce qui pourrait indiquer des régions prédisposées à interagir avec d'autres partenaires cellulaires. On a également examiné l'interaction entre CypA et CypB et les domaines D2 et D3 de NS5A, car ces PPIases pourraient jouer un rôle dans la réplication de VHC
Many proteins and protein regions have been shown be intrinsically unstructured/disordered (IUPs) and still carry out diverse and important functions in vivo. The technique of choice for studying IUPs is Nuclear Magnetic Resonance (NMR). However, to be able to obtain information of many possible NMR spectra, these must first be assigned. This process is complicated in the case of IUPs by the increased amount of signal overlap. To facilitate the assignment, a graphical semi-automatic assignment tool using the concept of product and sum planes was developed. Using this tool, the study of individual IUPs by NMR became conceivable. A first considered IUP is human Tau. The backbone and Cb resonances have been fully assigned for two Tau fragments (F3 and F5) and partially assigned for full-length Tau P301L. These NMR assignments of Tau could eventually lead to more insight in the structural behaviour of the protein upon its binding to or polymerisation of microtubules, and in its aggregated form which is observed to be one of the hallmarks of Alzheimer's disease. Secondly, the Hepatitis C virus (HCV) non-structural protein 5A (NS5A) was considered. The structural properties of both the second and third domain (out of three) of this protein have been assessed and some residual a-helical structure was observed, which could be indicative of regions prone to interaction with other cellular partners. We have also examined the interaction between both CypA and CypB and the domains D2 and D3 of NS5A, as these PPIases might be involved in HCV replication

La compréhension de la fonction des protéines et des systèmes biologiques passe par une connaissance fine des mécanismes moléculaires sous-jacents. La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire permettent d'appréhender ces mécanismes au niveau atomique en fournissant des informations sur la structure et sur la dynamique des macromolécules biologiques. Nous nous sommes ainsi intéressés à deux protéines, la lipase lip2 de la levure Yarrowia lipolytica et la protéine membranaire OmpA de la bactérie Klebsiella pneumoniae. Nous avons recherché des conditions d'expression de la protéine lip2 marquée uniformément ou spécifiquement sur une boucle (appelée " lid ") afin d'en étudier la dynamique. Des conditions de marquage uniforme à l'azote 15 de lip2 recombinante dans Yarrowia lipolytica ont été mises au point, mais le marquage acide aminé spécifique n'a pu être réalisé à cause de phénomènes de dilution isotopique trop importants dans cette levure. Nous avons résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal de la protéine OmpA et étudié sa dynamique en solution par RMN (techniques de relaxation 15N). Nous avons caractérisé la dynamique de son domaine N-terminal membranaire reconstitué en liposomes par RMN du solide : en utilisant la rotation à l'angle magique à 60kHz et à la détection 1H sur un spectromètre 1 GHz, nous avons pu attribuer une majorité des résonances du tonneau ? et établir un profil de paramètre d'ordre des vecteurs NH. Des expériences de protéolyse ménagée ont révélé par ailleurs un site de coupure unique à la trypsine au sein de la boucle extracellulaire L3. Enfin, une première caractérisation de la protéine complète exprimée dans la membrane externe d'Escherichia coli a été entreprise par RMN du solide sur membranes externes natives
Understanding the function of proteins and biological systems requires an accurate knowledge of the underlying molecular mechanisms. Crystallography and nuclear magnetic resonance provide a detailed description of these mechanisms, with an atomic resolution, by providing data on both structures and motions. We investigated two proteins, the lip2 lipase from the yeast Yarrowia lipolytica and the membrane protein OmpA from the bacteria Klebsiella pneumoniae. We tried to produce lip2 with uniform and amino-acid specific stable isotope labelling on its functional loop (the lid) for NMR experiments. The homologous recombinant expression in Yarrowia lipolytica turned out to be the most efficient for uniform labelling but failed for specific labelling due to extensive isotope scrambling. We solved the structure of OmpA C-terminal domain by X-ray crystallography, and analyzed its dynamics in solution by NMR (15N relaxation techniques). We characterized its transmembrane N-terminal domain in proteoliposomes by solid state NMR: using state of the art ultra-fast MAS (60 kHz), 1H detection and a 1 GHz spectrometer, we could assign most ?-barrel resonances and establish a NH order parameter profile. In a complementary approach, we used proteolysis to reveal a unique trypsin cleavage site on the extracellular loop 3. Finally, a first characterization of the full-length protein expressed in the outer membrane of Escherichia coli was initiated by solid state NMR on intact outer membranes

Les TSPO forment une famille ancienne et hautement conservée à travers l’évolution de protéines à 5 domaines transmembranaires, que l’on retrouve aussi bien chez les animaux que les plantes, ou encore les bactéries. La TSPO animale (ou TSPO1), la plus étudiée des TSPO à ce jour, se trouve majoritairement dans les tissus stéroïdiens où sa fonction précise est controversée. Chez certaines espèces animales, il existe une isoforme, la TSPO2, localisée dans la membrane plasmique des globules rouges alors que la TSPO1 est mitochondriale. La fonction de la TSPO2 n’est pas bien caractérisée. La TSPO végétale, localisée dans le réticulum endoplasmique, possède une extension N-terminale que n’ont pas les TSPO animale et bactérienne. Elle semble être impliquée dans la régulation du stress, tout comme la TSPO bactérienne. Les études structure/fonction des différentes TSPO réalisées dans ce travail ont nécessité leur production par voie recombinante car elles sont naturellement peu abondantes.Nous avons produit la TSPO1 murine marquée 15N,13C par surexpression dans la bactérie E. coli. Puis la protéine purifiée en détergent (SDS et DPC) a été étudiée par différentes techniques (CD, fluorescence, RMN). L’ajout du ligand spécifique de la TSPO1, le PK11195, stabilise une conformation en DPC ce qui a permis en 2014 la résolution de sa structure, par RMN du liquide, par une équipe allemande. Afin d’étudier la TSPO1 dans un environnement plus proche de sa membrane native, nous l’avons reconstituée dans des liposomes DMPC/DMPE et étudiée par RMN du solide. Les 1ers résultats sont encourageants et ouvrent une nouvelle approche expérimentale pour la détermination de sa structure en présence et, plus particulièrement, en absence de ligand. La surexpression de la TSPO2 humaine dans la bactérie E. coli s’est avérée difficile et nous avons dû la réalisée par système acellulaire (cell-free). Les quantités obtenues par cette méthode permettent d’envisager le développement futur des études des relations structure/fonction.La production et la purification du Nter de la TSPO d’A. thaliana marqué 15N,13C ont permis la détermination de sa structure par RMN du liquide. Son interaction avec des lipides chargés mise en évidence par les études RMN, suggère une nouvelle fonction de l’AtTSPO dans le trafic lipidique
TSPO are five-transmembrane domain proteins that form a protein family highly conserved throughout evolution and that are found in animals as well as in plants and bacteria.Animal TSPO (referred to as TSPO1), the most studied TSPO, is highly expressed in tissues involved in steroid biosynthesis where its precise role remains controversial. In some animal species the presence of a less characterized TSPO isoform, TSPO2, has been reported. TSPO2 was found to be located in the plasma membrane of red blood cells whereas TSPO1 is located in mitochondrial outer membrane. Plant TSPO, which is located in the endoplasmic reticulum, possesses an N-terminal extension that is absent in bacterial and animal TSPO. This TSPO, along with the bacterial TSPO, seems to be involved in stress regulation.The structural and functional studies of TSPO proteins conducted in this work required their production through recombinant expression because they are naturally non-abundant proteins.We made use of E. coli to produce the recombinant 15N,13C-labelled mouse TSPO1. Then the protein purified in detergent was studied through several methods (CD, fluorescence, NMR). High-affinity binding of PK11195 to TSPO1 stabilizes a conformation in DPC, which made possible the structure determination of the protein in solution by NMR by a German team. We have incorporated TSPO1 into DMPC/DPME liposomes in order to provide a native-like environment and we then studied it by solid-state NMR. Preliminary results are encouraging and open up a new approach for TSPO1 structure determination in presence or in absence of ligand.Human TSPO2 overexpression in E. coli proved to be difficult and we therefore use the cell-free method. The amounts we obtained by this method allows us to consider future developments of structurefunction relationship studies.Production and purification of 13C,15N labelled N-terminal of A. thaliana TSPO have made it possible to determine its structure by liquid state NMR. Interaction of this peptide with charged lipids revealed by NMR, suggests a new fonction of AtTSPO in lipid trafficking

De nombreuses fonctions cellulaires essentielles telles que la traduction, l'épissage, la biogenèse des ribosomes et la réplication des télomères font appels aux particules RNP non codantes. La biogenèse de ces dernières chez les eucaryotes est un processus très complexes qui fait intervenir de nombreux facteurs cellulaires. La biogenèse du ribosome nécessite au moins 150 facteurs. Ceux-ci sont importants pour faciliter mais également contrôler la biogenèse de cette machinerie cellulaire essentielle qu'est le ribosome. Parmi ces facteurs, nous avons les snoRNP à boîtes C/D. Ces RNP sont impliqués dans la maturation des pré-ARNr (méthylation post-transcriptionnelle des riboses et clivages endonucléolytiques). Récemment notre laboratoire a participé à la découverte de facteurs d'assemblage de ces RNP. Il s'agit entre autre des protéines Rsa1p, du complexe R2TP (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p et Pih1p) et de Hit1p chez la levure Saccharomyces cerevisiae. En utilisant une approche de co-expression à haut débit, nos travaux ont révélé un réseau complexe d'interactions entre les protéines constitutives des snoRNP et leurs facteurs d'assemblage. Couplé à une stratégie de protéolyse ménagée, la co-expression nous a permis d'obtenir des sous-complexes protéiques Snu13p/Rsa1p et Rsa1p/Hit1p qui font actuellement l'objet d'une étude structurale par RMN. En collaboration avec l'équipe de F. Allain (ETH Zurich), nous avons également déterminé la structure tridimensionnelle de la protéine Tah1p, ainsi que de son complexe avec le peptide C-terminale de la protéine chaperonne Hsp90 à haute résolution. Ces travaux ont révélé un mode d'association particulier entre le domaine TPR de la protéine et le peptide
A lot of essential cellular functions like translation, splicing, ribosome biogenesis and telomere replication need the activity of non coding RNPs. The biogenesis of non coding RNPs in eukaryotes is a complex pathway involving numerous cellular factors. For instance, ribosome biogenesis requires more than 150 factors. They are important to facilitate and to control the biogenesis of this essential cellular machinery. These factors include the C/D box snoRNPs. These RNPs are involved in pre-rRNA maturation (post-transcriptional ribose methylation and endo-nucleolytic cleavages). Recently, our laboratory participated to the discovery of snoRNP assembly factors: the Rsa1p protein, R2TP complex (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p and Pih1p) and Hit1p in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using a high throughput co-expression approach, we deciphered a network of interactions between RNP core proteins and the assembly factors. Coupled with a limited proteolysis strategy, the co-expression method allowed us to obtain proteins sub-complexes Snu13p/Rsa1p and Rsa1p/Hit1p which are currently studied by NMR. In collaboration with the F. Allain team (ETH Zurich), we also determined the tridimensional structure of protein Tah1p and its complex with the chaperon Hsp90 C-terminal peptide at high resolution. The data obtained reveal a particular mode of association of the Tah1p TPR domain with the Hsp90 peptide

L’inflammation joue un rôle central dans la rupture des membranes fœtales (MF), que celle-ci ait lieu à terme ou prématurément, mais l’ensemble des mécanismes reste encore à élucider. Dans ce contexte, les études sur les inflammasomes, un des acteurs clés de l’inflammation, se sont récemment intensifiées. Ces plateformes intracellulaires, formées suite à un signal pro-inflammatoire, sont impliquées dans la mise en place et la propagation d’une réaction inflammatoire. Leur fonction au sein des MF commence à être décrite mais de nombreuses zones d’ombre persistent. L’objectif de ce travail a donc été de compléter la caractérisation des processus inflammatoires dépendant des inflammasomes dans les MF, en se focalisant sur les inflammasomes de type NLRP.Les inflammasomes NLRP sont constitués d’un récepteur NLRP, de l’adaptateur ASC et de la pro-caspase-1. Après avoir vérifié la présence de ces acteurs dans les MF à terme, un intérêt particulier a été porté à l’inflammasome de type NLRP7. En effet, sa fonction a déjà été étudiée dans la sphère placentaire mais jamais dans les MF. La stimulation de cellules épithéliales amniocytaires primaires avec un ligand spécifique de l’inflammasome NLRP7 a permis de montrer (i) l’augmentation du niveau protéique des trois acteurs de cet inflammasome (NLRP7, ASC et pro-caspase-1), (ii) la formation de l’inflammasome par co-localisation entre NLRP7 et ASC, (iii) l’activation de cet inflammasome montré par le clivage de deux effecteurs terminaux, la pro-caspase-1 et la gasdermine D. Ces résultats indiquent pour la première fois que les MF sont capables de mettre en jeu la signalisation de l’inflammasome NLRP7 en réponse à un signal pro-inflammatoire.En parallèle, deux activateurs naturels de l’inflammasome NLRP7 ont été identifiés pour la première fois dans les MF humaines à terme : il s’agit de Mycoplasma salivarium et Mycoplasma fermentans. Leur présence suggère le fait que l’inflammasome NLRP7 puisse jouer un rôle majeur dans les processus inflammatoires au sein des MF. L’ensemble de ce travail suggère donc fortement l’implication de l’inflammasome NLRP7 dans la physiopathologie de la rupture des membranes fœtales humaines, qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les ruptures prématurées des membranes fœtales
Inflammation plays a pivotal role in term or preterm fetal membranes (FM) rupture, but the detailed mechanisms remain unclear. In this context, studies on inflammasomes, one of the key inflammation actors, recently intensified. These intracellular platforms, formed following a pro-inflammatory signal, are involved in the establishment and propagation of an inflammatory reaction. Their functions in FM begin to be described but grey areas remain. Thus, the aim of this work was to complete the characterization of inflammasomes-dependent inflammatory processes, focusing on NLRP inflammasomes.NLRP inflammasomes are composed of a NLRP receptor, the adapter ASC and the pro-caspase-1. After verifying the presence of these actors in term human FM, we focused our interest on NLRP7 inflammasome. Indeed, its function has been studied in the placental area but never in FM. The stimulation of primary amnion epithelial cells with an NLRP7 inflammasome specific ligand demonstrated (i) an increased protein level of the three actors of this inflammasome (NLRP7, ASC and pro-caspase-1), (ii) the formation of this inflammasome by NLRP7 and ASC colocalization and (iii) the activation of this inflammasome, by cleavages of two end-effectors, pro-caspase-1 and gasdermin D. These results indicate for the first time that FM are able to activate NLRP7 inflammasome signalization in response to a pro-inflammatory signal. Moreover, two natural activators of NLRP7 inflammasome have been newly identified in term human FM: Mycoplasma salivarium and Mycoplasma fermentans. Their presence suggests that NLRP7 inflammasome could play an essential role in inflammatory processes in FM. All this work strongly suggests the involvement of NLRP7 inflammasome in pathophysiology of human FM rupture, which could be a potential therapeutic target to prevent premature rupture of FM

RMN à l'état solide est devenue un outil de premier plan pour la caractérisation morphologique, structurale et dynamique de protéines microcristallines, de matériaux polymères, synthétiques ou naturels, de petites molécules d’intérêt pharmaceutique ou des minéraux. Les progrès dans la compréhension de la structure et de la dynamique des systèmes moléculaires à l’état solide sont très fortement dépendants des méthodologies mises en œuvre dans leurs études. Cette thèse s’inscrit dans cette optique en portant l’effort principal sur certains aspects méthodologiques de la RMN à l’état solide, avec comme objectif de développer des nouvelles approches ou améliorer les méthodes déjà utilisées et ceci afin d’extraire de façon optimale des informations spécifiques sur le système de spins étudié. Les études fondamentales de systèmes solides d’intérêt biologique, la mise au point de nouvelles méthodologies ainsi qu’une analyse méthodologique approfondie forment l’essentiel de cette thèse ayant pour le dénominateur commun une amélioration de la sensibilité des expériences RMN à l’état solide. Le mémoire de thèse présente dans sa première partie de nouvelles approches dans les études structurales et dynamiques des protéines microcristallines, membranaires et fibrillaires ainsi qu’une étude dynamique et conformationnelle des chaines phospholipidiques dans les liposomes. La deuxième partie est essentiellement concentrée sur une analyse détaillée de certains aspects méthodologiques de la RMN du solide en relation avec le découplage dipolaire hétéronucléaire, indispensable dans l’obtention des spectres de haute résolution
NMR in the solid state has become a major tool for morphological characterization, structural and dynamic microcrystalline proteins, polymers, synthetic or natural materials, small molecules of pharmaceutical interest or minerals. Progress in understanding the structure and dynamics of molecular systems in the solid state are very heavily dependent on methodologies implemented in their studies. This thesis in this context carrying the main effort on certain methodological aspects of NMR in the solid state, with the goal of developing new approaches and improve the methods already used and in order to extract optimum specific information on the spin system under study. The fundamental studies of solid biologically relevant systems, the development of new methodologies and a thorough methodological analysis form the core of this thesis with the common denominator for an improvement of the sensitivity of NMR experiments in solid state. The thesis presents the first part of new approaches in structural and dynamic studies microcrystalline proteins, membrane and fibrillar and a dynamic study and conformational channels in phospholipid liposomes. The second part is mainly concentrated on a detailed analysis of some methodological aspects of solid state NMR related heteronuclear dipolar decoupling essential in obtaining high resolution spectra

Les chaperonines sont des chaperonnes moléculaires indispensables pour le repliement de certaines protéines dans les cellules. La taille et la complexité de ces machineries biologiques rendent complexes l'étude de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. La spectroscopie RMN permet de suivre des changements structuraux et dynamiques en temps réel avec une résolution atomique. Cependant, l'étude par RMN de protéines ou de complexes de haut poids moléculaires a été un challenge pendant de nombreuses années. Dans la première partie de cette thèse, il a été montré que la combinaison de marquage spécifique des groupements méthyles, d'expériences RMN optimisées et de microscopie électronique peut être utilisée pour suivre différents états du cycle fonctionnel d'une chaperonine de 1 MDa. Pour étudier ce mécanisme, la chaperonine native a été reconstituée avec un marquage des groupements méthyles des méthionines et valines. Les résidus méthionines ont pu être utilisés comme des sondes pour identifier les spectres RMN correspondant aux états intermédiaires et aux espèces actives du cycle fonctionnel. Grâce à ces sondes il a été possible de suivre en temps réel les réarrangements structuraux correspondant aux différentes conformations de la chaperonine durant son cycle fonctionnel. La seconde partie traite de la caractérisation de l'interaction de la chaperonine avec une protéine cliente dépliée. L'observation de la stabilisation de l'état déplié de la protéine par la chaperonine a permis de mettre en évidence une activité de "holdase" de la chaperonine. En utilisant une combinaison astucieuse de différents marquages de groupements méthyles et d'expériences RMN optimisés pour des assemblages de haut poids moléculaire, il a été possible d'observer le repliement de cette protéine par la chaperonine et les effets de la présence d'une protéine dépliée sur le cycle fonctionnel de la chaperonine en action
Chaperonins are essential molecular chaperons for the refolding of proteins in the cells. Size and complexity of these biological machineries make complex the study of their structural and functional properties. NMR spectroscopy offers an unique ability to monitor structural and dynamic changes in real-time and at atomic resolution. However, the NMR studies of large proteins and complexes has been a real challenge for a long time. In the first part of this thesis, it has been shown that the combination of methyl specific labeling, optimized NMR spectroscopy for large assemblies and electron microscopy can be used to monitor the different states of the functional cycle of a 1 MDa chaperonin. To study this mechanism, the native chaperonin was reconstituted with a labeling of the methionines and valines methyl groups. Methionines residues have been used as probes to identify the NMR spectra corresponding to intermediates states and active species of the functional cycle. Thanks to theses probes, it has been possible to follow in real time the structural rearrangements corresponding to the different conformations of the chaperonin during its functional cycle. The second part deals with the characterization of the interaction between the chaperonin and an unfolded protein. Observation of the stabilization of the unfolded protein by the chaperonin allowed to identify the holdase activity of the chaperonin. Using a clever combination of a differential methyl labeling and optimized NMR spectroscopy for large assemblies, it has been possible to follow the refolding of the unfolded protein by the chaperonin and the effects of the unfolded protein on the functional cycle of the chaperonin in action

Les chaperonines sont des machines moléculaires impliquées dans la protection des protéines contre le mauvais repliement et l’agrégation. Ces macromolécules de tailleimportante (environ 1 MDa) sont présentes dans tous les domaines du vivant et sontorganisées en deux anneaux concentriques et empilés l’un sur l’autre, possèdent chacun une cavité en leur centre. Les chaperonines sont particulièrement intéressantes car peu caractérisées par rapport aux autres chaperones, notamment dû à leur grande taille et à leur complexité intrinsèque. Leur mécanisme d’action reste donc assez flou.Ce travail de thèse est centré sur l’étude de PhCPN, la chaperonine de Pyrococcushorikoshii, et son interaction avec différentes protéines substrats, grâce à une combinaison d’outils biochimiques et biophysiques tels que la RMN. En effet, la spectroscopie RMN est un outil particulièrement adapté à l’étude des interactions moléculaires transitoires à l’échelle atomique. L’utilisation dans ce cadre du marquage isotopique spécifique des groupements méthyles permet d’étudier des ensembles protéiques de taille importante tels que PhCPN, tandis que la RMN plus classique reste limitée à des poidsmoléculaires inférieurs à 30 kDa. Afin d’étudier le repliement des protéines à l’intérieur des cavités de PhCPN, deux protéines substrats de taille hétérogène et d’activité différentes ont été sélectionnées.En particulier, l’un de ces deux substrats (laMalate Synthase G ou MSG), formedes agrégats amorphes lorsqu’elle elle chauffée tandis que la seconde (l’Amyline) est capable de s’auto associer de manière plus organisée, créant des fibres amyloïdes de haut poids moléculaire. J’ai observé lors de cette étude que PhCPN est capable d’empêcher l’agrégation de ces deux substrats.En effet, la Chaperonine PhCPN est capable de se lier de manière irreversible à laproteine MSG, dépliée par une augmentation de la temperature, dans un ratio stoechiométrique 1/1. Le complexMSG/PhCPN a été isolé et characterisé. En particulier, la surface d’interaction entre PhCPN et cette large protéine substrat a été déterminée grâce à la RMN et la mciroscopie électronique.De plus, l’inhibition de la formation de fibres amyloïdes issues de l’Amyline parla Chaperonine a été étudiée par RMN et fluorescence de la ThT. Il a été notammentmontré que la Chaperonine retarde l’apparition des fibres amyloïdes, quelque soit l’état oligomerique de PhCPN. Le rôle de la Chaperonine sur les méchanismes de nucléation et d’élongation des fibres amyloïdes de l’Amylin a également été étudié
Chaperonins are molecular machineries involved in the prevention of protein misfolding. These large macromolecules (approximately 1 MDa) are present in all domains of life and globally organized in two stacked rings on top of one another, hosting a cavity in their respective centers. By hydrolyzing ATP within their cavities, these rings can switch between twomajor structural states, an open and a closed conformation, to trap and refold misfolded proteins. Among the different types of molecular chaperones, chaperonins are of particular interest because their mechanism of action is not yet totally understood.This thesis focused on the study of PhCPN, the Chaperonin fromPyrococcus horikoshii,and its interaction with substrate proteins by various biochemical and biophysical techniques including NMR. In fact, NMR spectroscopy is a powerful tool to probe transient interactions in solution, at atomic resolution. Especially, specific isotope labeling of methyl groups is a technique of choice to study huge protein assemblies such as PhCPN chaperonin because they overcome the liquid-state NMR size limitation. To study the protein folding within the cavities of PhCPN, two different model substrate of various sizes and biological functions were selected. Particularly, one of these substrates (Malate Synthase G /MSG) forms amorphous aggregates when submitted to heat while the other (Amylin) is able to self-associate into amyloid fibrils. During this thesis, I have demonstrated that the Chaperonin PhCPN can prevent the aggregation of the chosen substrates.In fact, the PhCPN Chaperonin is able to irreversibly bind thermally unfoldedMSGin a 1/1 ratio. TheMSG/PhCPN complex was isolated and characterized. Especially, theinteraction surface between PhCPN and this large substrate protein was investigated using a combination of NMR and EM.In addition, the inhibition of the Amylin fibrillation by the Chaperonin was investigated using NMR and ThT fluorescence assays. It was shown that the Chaperonin delays the fibrils formation, no matter its oligomeric state. The role of the Chaperonin on the Amylin nucleation and fibril elongation mechanisms was investigated

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) à l'état solide permet d'étudier la structure et la dynamique d'échantillons protéiques. En premier lieu nous expliquons les mécanismes entrant en jeu lors d'une expérience INADEQUATE (Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiement) refocalisée à 3 spins. Nous proposons une méthode basée sur des filtres z permettant d'éliminer les cohérences à zéro quanta afin d'obtenir des spectres purement en phase. Puis, nous utilisons l'expérience SPECIFIC CP (SPEctrally Induced FILtrering in Combination with Cross polarization) sélective, qui combinée à la rotation ultra-rapide à l'angle magique et à des puissances faibles pour les étapes de CP nous permet d'acquérir des spectres haute résolution d'échantillons microcristallins des protéines SOD et GB1. Dans une deuxième partie, nous développons le modèle théorique de diffusion dans un cône pour la liaison NH afin de déterminer quantitativement les paramètres d'amplitude et de temps du mouvement de ce mouvement par relaxation. Dans une troisième partie, nous mesurons la dynamique dans régime temporel intermédiaire étudiés grâce à la mesure de couplages dipolaires résiduels. Enfin, l'hypothèse de mouvements corrélés est explorée, et la contribution éventuelle de tels mouvements à la relaxation nucléaires est simulée. Grâceà des comparaisons avec les modèles de mouvements issus de la cristallographie, des amplitudes de mouvements sont prédites, et différentes simulations montrent que la présence de ces mouvements aurait une contribution non négligeable sur les mesures de relaxation en solide
Solid-State Nuclear magnetic Resonance (SSNMR) requires advanced experimental methods for structural and dynamic investigations of proteins. In this thesis, first we describe the behavior of a three-spin system during the refocused INADEQUATE (Incredible Natural Abundance Double Quantum Transfer Experiment) experiment and propose a method that leads to pure in-phase spectra, with the help of z-filters. We also demonstrate a method for achieveing high-resolution heteronuclear correlations of microcrystalline samples by employing the band-selective 1H-13C SPECIFIC CP (SPEctrally Induced FILtrering in Combination with Cross-Polarization), and taking advantage of ultraé-fast (>60 kHz) Magic-Angle Spinning (MAS) and low Cross-Polarization (CP). Moreover, site-specific longitudinal relaxation is used as a direct probe of local dynamics. We present a theoretical model to describe the contribution of the 15N-1H dipolar interactions and the 15N CSA to the spin-lattice relaxation. We estimate quantitatively local dynamics from longitudinal relaxation measurement. The influence of MAS rate on the longitudinal relaxation is investigated on a model protein. Crh. In a third part, we analyze intermediate timescale measurement by comparison between relaxation and residual dipolar coupling studies. Finally, contribution of anisotropic collective motions (ACM) to spin-lattice relaxation in the crystal is investigated with a newly developed model. Simulations show that ACM can contribute significantly to longitudinal relaxation and that the development of a new model combining local and collective motions in microcrystalline proteins is needed

Chez les eucaryotes, le noyau, contenant l'information génétique est délimité par l'enveloppe nucléaire. Au cours du cycle cellulaire, l'enveloppe nucléaire se désintègre puis se reforme autour des chromosomes. Les mécanismes responsables de la reformation de l'enveloppe nucléaire peuvent être étudiés en utilisant des extraits d'œufs de Xénope. Nous avons étudié le rôle de l'Importine alpha, molécule impliquée dans l'import de protéines contenant un signal de localisation nucléaire (NLS), dans ce processus. L'addition en excès de cette protéine ou de son substrat BSA-NLS inhibe la formation d'une enveloppe nucléaire autour de la chromatine. Ces résultats suggèrent un rôle de l'Importine alpha dans ce processus. De plus, le retrait de la protéine endogène des extraits d'œufs de Xénope inhibe l'assemblage de l'enveloppe nucléaire. Trop ou trop peu d'Importin alpha dans le système inhibe la reformation de l'enveloppe nucléaire in vitro. L'équilibre entre la quantité d'Importine alpha et de ses substrats NLS semble crucial pour ce processus. Nous avons démontré que l'Importine alpha pouvait s'associer aux membranes et que cette association était régulée par phosphorylation. L'Importine alpha cytosolique est plus phosphorylée que l'Importine alpha liée aux membranes. La phosphorylation de l'Importine alpha liée aux membranes induit la dissociation de celle-ci des membranes. L'utilisation de formes mutantes de l'Importine alpha qui soit ne lient pas les membranes, soit ne sont pas relarguées des membranes par phosphorylation, a permis de démontrer un rôle direct de la forme membranaire de l'Importine alpha dans la reformation de l'enveloppe nucléaire in vitro
In eukaryotes, the nucleus, containing the genetic information, is delimited by the nuclear envelope (NE). During the cell cycle, the NE disassembles and then re-assembles around the chromosomes. The molecular mechanisms underlying NE formation can be studied using a nuclear assembly reconstitution assay based on Xenopus laevis egg extract. We analysed the role of Importin alpha, adaptor molecule involved in the import of NLS-containing proteins. Addition of excess Importin alpha or BSA-NLS substrate to a nuclear assembly reaction inhibits the formation of a NE around chromatin, suggesting a direct or indirect role for the protein in this process. Moreover, addition of affinity purified antibodies directed against Importin alpha or depletion of the endogenous protein from Xenopus egg cytosol inhibits NE formation. Thus, too much or too little Importin alpha negatively affects nuclear assembly in vitro. The balance of Importin apha and NLS proteins in the system is of critical importance. An unexpected finding of our study was that Importin alpha can associate with membranes and that this association is regulated by phosphorylation. We could show that cytosolic Importin alpha is highly phosphorylated as compared to membrane-bound Importin alpha. Phosphorylation of membrane-associated Importin alpha leads to its release from membranes. Phosphopeptide mapping and mutagenesis analysis allowed us to identify some of the phospho-residues within Importin alpha. Using mutant forms of Importin alpha that either do not bind membranes or are not released from them by phosphorylation, we provide evidence that membrane-bound Importin alpha functions in NE formation in vitro

Le bactériophage T5, qui infecte la bactérie Escherichia coli, est constitué d’une capside icosaédrique renfermant un ADN double brin et d’une queue permettant le transfert de son ADN dans le cytoplasme de la cellule hôte. Au cours de la morphogénèse, la capside et la queue sont assemblées séparément puis connectées pour former les particules infectieuses. La capside de T5 est d'abord assemblée sous forme d'une procapside vide constituée de 775 copies d’une protéine unique qui s'organise en hexamères et pentamères pour former respectivement les faces et les sommets de l’icosaèdre. Un des sommets est occupé par la protéine portale qui constitue un pore d’entrée pour l’ADN. L’encapsidation du génome à travers le canal portal, assurée par un moteur moléculaire, provoque l’expansion de la procapside. La capside pleine d'ADN est ensuite décorée par la protéine pb10 qui se fixe sur sa surface externe, au centre des 120 hexamères, et elle est fermée par la protéine p144 qui constitue le point d'ancrage pour la queue.Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer la structure, la fonction et le mécanisme de fixation à la capside des deux protéines pb10 et p144. J’ai produit et purifié la protéine de fermeture p144 dont la structure et les caractéristiques de fixation sur la capside seront prochainement étudiées. J’ai résolu la structure de la protéine de décoration pb10 en solution par résonance magnétique nucléaire (RMN), ce qui a révélé une protéine formée de deux domaines. Le domaine N-terminal structuré en hélices alpha se fixe à la capside, alors que le domaine C-terminal, de type immunoglobuline, est exposé au solvant. La détermination des constantes cinétiques d'association et de dissociation par résonance plasmonique de surface (SPR) a permis de montrer que pb10 se fixe sur la capside de T5 de manière quasi-irréversible, avec une affinité de l’ordre du picomolaire. Des expériences de mutagenèse dirigée sur le domaine de fixation de pb10 indiquent que cette forte affinité repose sur un réseau d’interactions électrostatiques et hydrophobes. J’ai démontré que pb10 participe à la stabilisation de la capside de T5 par des techniques de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et thermo-fluorescence (FTSA). Par ailleurs, j'ai démontré qu’il était possible de fusionner des protéines de grande taille au domaine C-terminal de pb10 sans affecter sa haute affinité pour la capside. J’ai ainsi pu fonctionnaliser des capsides avec une protéine d’intérêt fusionnée à pb10. Ces résultats ouvrent la voie vers diverses applications, dont la présentation d’antigènes en vue de créer de nouveaux vaccins
Bacteriophage T5, a lytic phage which infects the bacterium Escherichia coli, is composed of an icosahedral capsid containing a double stranded DNA and a tail responsible for DNA transfer into the host cell cytoplasm. The capsid and the tail are assembled separately and then connected to form infectious viruses. The T5 capsid is first assembled as an empty procapsid composed of 775 copies of the major head protein organized in hexamers on the faces and pentamers on the vertices of the icosahedron. A single vertex is occupied by the portal protein which forms an entry channel for DNA. DNA is packaged through the portal channel by a molecular motor thus triggering procapsid expansion. The DNA-filled capsid is then decorated by the protein pb10 which binds on the outer surface in the center of each hexamer, and closed by the connector protein p144 needed for tail attachment.The goals of my PhD were to characterize the structure, function and mechanisms of capsid binding of both pb10 and p144 proteins. I have produced and purified the head completion protein p144 for future exploration of its structure and capsid binding properties. I have solved the solution structure of the decoration protein pb10 by nuclear magnetic resonance (NMR), thus unravelling that pb10 has two domains. The alpha-helical N-terminal domain binds to the capsid and the immunoglobulin-like C-terminal domain is exposed to the environment. Surface plasmon resonance (SPR) showed that that pb10 attachment to the T5 capsid is quasi-irreversible with a picomolar affinity. Site-directed mutagenesis of the binding domain of pb10 suggested that the decoration mechanism is driven by both hydrophobic and electrostatic interactions. Differential scanning calorimetry (DSC) and fluorescence thermal shift assays (FTSA) demonstrated the role of the decoration protein in capsid stabilization. I have also demonstrated that a large protein can be fused to the C-terminal end of pb10 without affecting its high affinity for the T5 capsid. Capsids can thus be functionalized with a protein of interest fused to pb10. Possible applications of this work include antigen presentation for new vaccines

Les métaux lourds, et en particulier les actinides, sont toxiques pour l'homme. La compréhension des mécanismes responsables de leur toxicité constitue un champ d'investigation important dans le domaine de la toxicologie. La compréhension des interactions de l’uranyle à l’échelle moléculaire est nécessaire pour prédire sa toxicité et pour concevoir des agents décorporants efficaces. Ce travail a pour objectif de contribuer à la caractérisation des sites d’interaction protéine-uranyle et à l’identification des facteurs clés gouvernant ces interactions. Pour obtenir des données thermodynamiques et structurales sur ces sites, deux stratégies ont été adaptées à l’étude des deux protéines humaines prédites comme cibles majeures de l’uranyle et dont les propriétés et structures sont très différentes. Les deux domaines structurés de la fétuine-A, ont été produits puis étudiés indépendamment par des méthodes physico-chimiques complémentaires incluant la spectroscopie RMN multidimensionelle afin d’obtenir des informations structurales sur les sites de liaison du métal dans la protéine. Afin d’élucider les interactions entre l’uranyle et l’ostéopontine, une protéine phosphorylée intrinsèquement désordonnée, nous avons conçu des peptides préorganisés en feuillet β comme modèles de sites de liaison de l’uranyle. Des acides aminés phosphorylés ont été introduits dans ces structures, permettant ainsi de reproduire l’environnement de coordination du métal dans la protéine. Les différences de structures et de propriétés entre biomolécules peuvent représenter un frein aux études d’affinité. Une sonde fluorescente non naturelle a donc été développée pour mettre au point une méthode de hiérarchisation des cibles de l’uranyle s’affranchissant de ces différences
Heavy metals, especially actinides, are toxic for humans. Understanding the mechanisms responsible for their toxicity is an important field of research in toxicology. Uranyl toxicity is still not well understood. The understanding of uranyl interactions at the molecular level is necessary to predict its chemical toxicity and to develop efficient chelating agents. This work aims at identifying uranyl binding sites in proteins and key factors that govern these interactions. To obtain thermodynamic and structural data, strategies were developed to study two proteins predicted as major uranyl targets which present different structures and properties. We took advantage of fetuin-A structure and studied the two structured domain of the protein by complementary physico-chemical methods including multidimensional NMR spectroscopy to acquire structural information on uranyl binding sites in this protein. In order to elucidate interactions between the metal and disordered phosphorylated proteins such as osteopontin, we designed peptides preorganized in β-sheet optimized to coordinate uranyl cation. We introduced amino acids containing phosphate groups and demonstrated that these peptides are relevant models to mimic uranyl binding sites found in phosphorylated proteins. Biomolecules display different structures and properties which may constitute an obstacle to affinity studies. A tool based on a non-natural fluorescent probe was developed to investigate and compare uranyl targets affinities

L'objectif de cette thèse est de développer la Résonance Magnetique Nucléaire en Rotation à l'Angle Magique (MAS NMR) pour caractériser la structure et la dynamique d' échantillons biologiques complexes, avec un accent particulier sur le rôle des ions métalliques dans les enzymes et les canaux transmembranaires. MAS NMR est une technique performante qui permet d'extraire des informations au niveau atomique, de caractériser la dynamique sur de larges échelles de temps, et d'étudier les états fonctionnels dans des échantillons en conditions natives, une exigence particulièrement importante pour les protéines transmembranaires dans les bicouches lipidiques, par exemple. Néanmoins, un certain nombre de difficultés empêchent son application généralisée en biologie structurelle.Dans mon travail, j'ai développé et appliqué des techniques basées sur des champs magnétiques élevés (fréquence de Larmor du 1H 800 MHz et 1 GHz ) et des sondes MAS avec des rotors de diamètre inférieur au millimètre, tournant à des vitesses supérieures à 100 kHz, ce qui a contribué à faire progresser les capacités de cette technique : i) en augmentant la taille moléculaire des systèmes qui peuvent être étudiés avec un détail du niveau du résidu ; ii) en réduisant les exigences en termes de marquage isotopique, notamment la deutération ; iii) en accélérant les processus laborieux d'attribution de résonance et d'acquisition de paramètres dynamiques ; iv) en enrichissant la palette des paramètres mesurables liés à la dynamique. Tout au long de cette thèse, les méthodes ont été évaluées sur des échantillons microcristallins du domaine modèle GB1, et appliquées à la Cu,Zn-superoxyde dismutase (une métalloenzyme dimérique de Cu de 2x16 kDa) sous forme microcristalline et fonctionnelle, ainsi qu'à deux canaux transmembranaires reconstitués en bicouches lipidiques, CorA (un canal cationique pentamérique bactérien de 5x40 kDa) et l'Aqp-1 humaine (aquaporin-1, canal d'eau tétramérique de 4x25 kDa). Les résultats obtenus éclaircissent d'avantage la relation entre la dynamique interne et la fonction des protéines
The aim of my thesis is to develop Magic-Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance (MAS NMR) to characterize structure and dynamics in complex biological samples, with a particular focus on the role of metal ions in enzymes and channels.MAS NMR is a powerful technique that allows to extract atomic level information, characterize broad timescales of motions, and investigate functional states in native-like sample conditions, a particularly important requirement e.g. for transmembrane proteins in lipid bilayers. Nonetheless, a number of bottlenecks prevents its widespread application in structural biology.In my work I developed and applied tailored techniques based on high magnetic fields (800 MHz and 1 GHz 1H Lamor frequency) and MAS probes with sub-mm diameter rotors spinning at rates above 100 kHz, which contributed to push forward the capability of this technique: i) by enlarging the molecular size of the systems that can be investigated with site specificity; ii) by reducing the requirements in terms of isotopic labeling, notably deuteration; iii) by speeding up the tedious processes of resonance assignment and acquisition of dynamical parameters; iv) by enriching the palette of measurable parameters connected to dynamics.All along this thesis, the methods were benchmarked on microcrystalline samples of the model domain GB1, and applied to Cu,Zn-superoxide dismutase (a dimeric 2x16 kDa Cu metalloenzyme) in functional microcrystalline form, as well as to two transmembrane channels reconstituted in lipid bilayers, bacterial CorA (a pentameric 5x40 kDa cation channel) and human Aqp-1 (tetrameric 4x25 kDa aquaporin-1 water channel). The data obtained shed new light on the relation between internal dynamics and function

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est devenue une des techniques spectroscopiques les plus puissantes et polyvalentes de la chimie analytique avec des applications multiples dans des différents domaines de la recherche. Cependant, un des inconvénients majeurs de la RMN est le processus fastidieux d'analyse de donnée qui nécessite fréquemment des interventions humaines. Ces dernières font diminuer non seulement l'efficacité et l'objectivité des études mais également renferment les champs d'applications potentielles de la RMN pour les non-initiés. Par conséquent, le développement des méthodes computationnelles non supervisées se trouve nécessaire. Les travaux réalisés ici représentent des nouvelles approches dans le domaine de la métabolomique et de la biologie structurelle. Le défi ultime de la RMN métabolomique est l'identification complète de l'ensemble des molécules constituant les échantillons biologiques complexes. Cette étape est vitale pour toute interprétation biologique. Dans la première partie de cette thèse, une nouvelle méthode numérique a été développée pour analyser des spectres à deux dimensions HSQC et TOCSY afin d'identifier les métabolites. La performance de cette nouvelle méthode a été démontrée avec succès sur les données synthétiques et expérimentales. La RMN est une des principales techniques analytiques de la biologie structurale. Le processus conventionnel de détermination structurelle est bien établie avec souvent une attribution explicite des signaux. Dans la seconde partie de cette thèse, une nouvelle approche computationnelle est présentée. Cette nouvelle méthode permet de déterminer les structures RMN sans attributions explicites des signaux. Ces derniers proviennent de données spectrales tridimensionnelles TOCSY et NOESY. Les structures ont été résolues en appliquant cette nouvelle méthode aux données spectrales d'une protéine de 12kDa
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) has become one of the most powerful and versatile spectroscopic techniques in analytical chemistry with applications in many disciplines of scientific research. A downside of NMR is however the laborious data analysis workflow that involves many manual interventions. Interactive data analysis impedes not only on efficiency and objectivity, but also keeps many NMR application fields closed for non-experts. Thus, there is a high demand for the development of unsupervised computational methods. This thesis introduces such unattended approaches in the fields of metabonomics and structural biology. A foremost challenge to NMR metabolomics is the identification of all molecules present in complex metabolite mixtures that is vital for the subsequent biological interpretation. In this first part of the thesis, a novel numerical method is proposed for the analysis of two-dimensional HSQC and TOCSY spectra that yields automated metabolite identification. Proof-of principle was successfully obtained by evaluating performance characteristics on synthetic data, and on real-world applications of human urine samples, exhibiting high data complexity. NMR is one of the leading experimental techniques in structural biology. However the conventional process of structure elucidation is quite elaborated. In this second part of the thesis, a novel computational approach is presented to solve the problem of NMR structure determination without explicit resonance assignment based on three-dimensional TOCSY and NOESY spectra. Proof-of principle was successfully obtained by applying the method to an experimental data set of a 12-kilodalton medium- sized protein

Comme le nucléole joue un rôle fondamental dans l’expression des protéines, via la synthèse des ARN ribosomiques, il n’est donc pas surprenant que des études aient révélé un lien étroit, entre des dysfonctionnements nucléolaires et l’origine de certaines maladies humaines. La découverte, il y a plusieurs années, d’un taux anormalement élevé de protéines nucléolaires dites argyrophiles ou AgNORs, dans les cellules tumorales, a permis d’envisager leur utilisation comme outil diagnostique ou pronostique du cancer. Détectées, de manière in vitro grâce à leur affinité pour l’argent, l’identification de quelques protéines AgNORs n’a pourtant pas permis d’établir une caractéristique commune à toutes les protéines argyrophiles détectées dans les extraits nucléolaires. Ainsi, bien que le test colorimétrique AgNOR soit utilisé dans de nombreux laboratoires académiques, l’absence d’identification de protéines AgNORs spécifiques du processus de cancérisation, a limité son utilisation en laboratoire clinique. Comme certaines limites technologiques et expérimentales ont limité leur caractérisation chez l’humain, nous avons donc décidé de reprendre les recherches sur ce sujet et de le réactualiser grâce aux avancées technologiques et scientifiques. Les protéines AgNORs étant étroitement liées à la biogenèse des ribosomes, nous avons donc décidé d’amorcer nos recherches chez la levure Saccharomyces cerevisiae, dans laquelle, la voie de biosynthèse des ribosomes a été particulièrement bien décrite. Devant l’intérêt biologique et médical de ces protéines, l’objectif de ce projet a donc été triple :

1-identifier des protéines AgNORs chez la levure

2-caractériser les propriétés physico-fonctionnelles et physico-chimiques de ces protéines AgNORs.

3-utiliser ces caractéristiques physico-chimiques pour rechercher de nouvelles AgNORs humaines, spécifiques de processus de cancérisation et potentiellement utilisables comme marqueurs tumoraux./The nucleolus is a subnuclear compartment that organized around ribosomal gene (rDNA) repeats NORs, which encode for ribosomal RNA. A peculiar group of acidic proteins which are highly argyrophilic are also localized at the same sites as NORs, thus allowing NORs to be very clearly and rapidly visualized by silver nitrate staining procedures. However, if three human argyrophilic proteins, UBF, C23 (nucleolin) and B23 (nucleophosmin), have been associated for staining of NOR, the exact number of AgNOR proteins and their intrinsic biochemical feature are unclear. Here, we have performed an heterologous screen in a genetically tractable eukaryotic organism (budding yeast) for the identification of novel AgNOR proteins and in vitro characterized an intrinsic feature that underlies silver binding and offers a strong predictive value for the identification of novel human AgNOR proteins.
Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes composés de lipides variés qui interagissent avec les protéines pour accomplir une fonction. Leur adressage spécifique dans la cellule est crucial pour le fonctionnement cellulaire. Les vésicules COP (coat protein) sont impliquées dans leur transport dans les premières étapes de la voie de sécrétion. Récemment, une interaction très spécifique a été identifiée entre le domaine transmembranaire de la protéine p24 (p24TMD) abondante dans la membrane des vésicules COP et la sphingomyéline C18:0. Cette spécificité a été identifiée dans le cas d’interaction protéine-protéine et protéine-acide nucléique comme impliquée dans la régulation de fonctions cellulaires, C’est pourquoi nous avons décidé d'étudier sur cette interaction. A cet effet, le p24TMD a été obtenu par synthèse chimique et sa structure étudiée par RMN du solide en présence de la sphingomyèline avec pour but ultime de comprendre la fonction
Cell membranes are complex systems composed of variety of lipids that interacts with proteins to trigger cellular function. The delivery of these lipids to the right compartment is crucial for cells to work efficiently. The coat protein (COP) complex vesicles are involved in lipids traffic in the early stages of the secretory pathway. Recently, a highly specific interaction has been found between the transmembrane domain of p24 protein (p24TMD) abundant in COPI membrane and sphingomyelin C18:0. As such highly specific interaction have been reported for protein-protein and protein-nucleic acid interactions to be involved in regulation of cell functions, we decide to investigate this specific interaction. The p24TMD was obtained chemically and investigated by solid state NMR in presence of sphingomyelin with the ultimately goal to understand the function behind

Un des buts de la recherche pharmaceutique est l'inhibition de protéines avec l'aide de petites molécules (ligands). L'une des phases clefs de ce procédé est la détermination du mode d'interaction entre un ligand et son récepteur. Cette tâche peut être entravée par l'absence de structure du complexe protéine-ligand. C'est pour répondre à ce besoin que nous présentons dans ce travail de thèse, une méthode capable de déterminer la structure de complexes protéine-ligands. Dans la méthode INPHARMA (Inter-ligands Nuclear Overhauser Effect for Pharmacophore Mapping), les inter-ligands NOEs (INPHARMA NOEs) sont utilisés pour déterminer l'orientation relative de deux ligands qui interagissent de manière compétitive avec un même récepteur. Cette nouvelle approche ouvre la voie à des applications pharmaceutiques, également au stade initial du développement, quand l'information structurale via la cristallographie par Rayons X est difficile d'accès
In the process of structure-based drug design, the provision of the binding mode of ligands to the cellular receptor of interest is essential. This can suffer from limited access to protein/ligand structures, especially for the low affinity ligands that are commonly obtained from high throughput screening or fragment based lead discovery. In a common scenario crystal structures are available for one or several ligands but not for all chemical series of actual interest. Here, we present a new, NMR-based approach that allows overcoming this limitation. In the INPHARMA method interligand NOEs (Nuclear Overhauser Enhancement) are utilized to determine relative orientations of different chemical fragments binding competitively to a common receptor site. This novel methodology opens the way to the application of structure-based drug design already in an early stage of drug development, when structural information via crystallography is of difficult access

Les chaperons moléculaires, une famille de protéines diverses en structure et taille, sont dédiés à accompagner, replier et protéger d’autres protéines afin qu’elles atteignent leur conformation finale et leur emplacement dans la cellule. Dans ce but, les chaperons moléculaires doivent être hautement spécialisés dans l’exécution de tâches spécifiques, telles que le repliement, le transport ou la désagrégation, et polyvalents dans leur motifs de reconnais- sance, afin de pouvoir interagir avec un grand nombre de protéines di érentes. Di érents chaperons moléculaires collaborent au sein de la cellule, formant ainsi un réseau complexe qui assure le contrôle de la qualité du protéome. Les interactions entre les di érents partenaires de ce réseau et entre les chap- erones et leurs substrats sont souvent dynamiques, ce qui rend leur obser- vation structurale particulièrement di cile pour les techniques de biologie structurale. Par conséquent, il y a à ce jour peu d’information sur les struc- tures et mécanismes d’interaction au sein des complexes chaperon-substrate. Dans cette thèse, je présente des études sur la structure, la dynamique et les interactions entre les substrats de deux chaperons moléculaires, en utilisant diverses méthodes biophysiques et in vivo.Dans la première partie, je montre que la chaperone TIM910, située dans l’espace inter-membranaire des mitochondries, lie ses substrats, des protéines membranaires destinées aux deux membranes mitochondriales, d’une manière très dynamique. Non seulement le complexe TIM910 est en échange constant entre les espèces monomèriques et hexameriques, mais aussi le substrat lié échange entre mulitples conformations à une échelle de millisecondes. Sur la base de la résonance magnétique nucléaire (RMN), de small-angle X-ray scat- tering (SAXS), de l’ultracentrifugation analytique (AUC) et des expériences mutationnelles in vivo et des tests fonctionnels d’import dans les mitochon- dries, je propose un modèle structurale de l’interaction entre le chaperon et la protéine membranaire. TIM910 lie ses substrats dans une poche hydrophobe à l’extérieur du chaperon. Cette interaction est modulaire et se fait avec un ou deux hexamères de TIM910, en fonction de la longueur du substrat.Dans la deuxième partie, nous avons étudié le comportement du récepteur N-terminal du unfoldase ClpC1 de M. tuberculosis en présence d’antibiotiques et de ligands di érents. Le domaine N-terminal de ClpC1 est le site de liai- son de divers antibiotiques nouveaux contre M. tuberculosis. L’antibiotique Cyclomarin A supprime complètement la dynamique induite par le ligand arginine-phosphate. Nous proposons que cette suppression de la dynamique soit le principe fondamental du mécanisme d’action de cet antibiotique.Dans les deux cas, les structures X-ray des chaperons dans leur état apo et la structure de ClpC-NTD liée à des antibiotiques étaient disponibles, mais ces structures statiques ne su sent pas pour expliquer le mécanisme d’action. La structure X-ray de TIM910 n’a pas fourni d’ indication sur l’endroit ou la façon dont les substrats sont liés. De même, les structures X-ray du domaine N-terminal de apo et de Cyclomarine A de ClpC1 ne présentent que des di érences de structure mineures. Les deux exemples montrent que les données structurelles statiques souvent ne permettent pas d’expliquer le fonctionnement d’un système moléculaire, donc la combinaison de di érentes techniques et le développement de nouvelles méthodes pour étudier les complexes chaperon-substrat sont primordiaux pour comprendre leur fonction
The diverse group of molecular chaperones is dedicated to accompany, fold and protect other proteins until they reach their final conformation and loca- tion inside the cell. To this end, molecular chaperones need to be specialized in performing specific tasks, like folding, transport or disaggregation, and versatile in their recognition pattern to engage many di erent client pro- teins. Moreover, molecular chaperones need to be able to interact with each other and with other components of the protein quality control system in a complex network. Interactions between the di erent partners in this network and between the substrate and the chaperone are often dynamic processes, which are especially di cult to study using standard structural biology tech- niques. Consequently, structural data on chaperone/substrate complexes are sparse, and the mechanisms of chaperone action are poorly understood. In this thesis I present investigations of the structure, dynamics and substrate- interactions of two molecular chaperones, using various biophysical and in vivo methods.In the first part I show that the mitochondrial membrane protein chap- erone TIM910 binds its substrates in a highly dynamic manner. Not only is the TIM910 complex in constant exchange between monomeric and hex- americ species, but also the bound substrate samples multiple conformations on a millisecond timescale. Based on nuclear magnetic resonance (NMR), small-angle X-ray scattering (SAXS), analytical ultracentrifugation (AUC) and in vivo mutational experiments I propose a structural model of the chap- erone/membrane protein interaction. TIM910 binds its substrates in a hy- drophobic pocket on the exterior of the chaperone in a modular fashion, where the number of TIM910 complexes bound depends on the length of the substrate.In the second part I studied the behavior of the N-terminal receptor do- main of the ClpC1 unfoldase from M.tuberculosis in the presence of di erent antibiotics and ligands. The N-terminal domain of ClpC1 is the binding site for various new antibiotics against M.tuberculosis. The antibiotic cyclomarin completely abolishes dynamics induced by the ligand arginine-phosphate. We propose that this suppression of dynamics is the underlying principle for the mechanism of action of this antibiotic.In both cases X-ray structures of the apo or antibiotic bound form were available, but not su cient to explain the mechanism of action. The X- ray structure of TIM910 provided no evidence on where or how substrates are bound. Likewise, X-ray structures of the apo and cyclomarin-bound N-terminal domain of ClpC1 show only minor di erences in structure.Both examples show that static structural data is often not enough to explain how a molecular system works, and only the combination of di er- ent techniques, including newly developed methods enable the atomic-level understanding of chaperone/substrate complexes

HU est une protéine bactérienne qui est impliquée dans de nombreuses fonctions liées à l'ADN. Elle est présente sous forme de trois dimères chez E. coli (deux homodimères et un hétérodimère). Lorsque les deux homodimères sont mélangés in vitro, ils échangent leurs chaînes pour former l'hétérodimère. Mon travail a consisté à caractériser, structuralement et cinétiquement, ce mécanisme d'échange qui peut être décrit comme une réaction d’ordre 2 se déroulant en 3 étapes : d'une conformation native (N2) de chaque homodimère à une conformation intermédiaire (I2, partiellement dissociée et déstructurée), puis la formation d'un tétramère transitoire (étape limitante) qui se dissocie finalement en deux hétérodimères. Les résidus considérés comme étant les déterminants structuraux permettant la transition entre N2 et I2 ont pu être déterminés. Ces résidus, enfouis dans N2, forment un patch hydrophobe sur la surface de I2. Ce patch peut être impliqué dans la reconnaissance des chaînes de HU et permettrait la formation du tétramère. MC1 participe à l'organisation du génome de plusieurs archées, à la transcription de l'ADN et à la division cellulaire par des mécanismes inconnus. Nous présentons la structure d'un complexe formé par MC1 avec un ADN de 15 paires de bases. Alors que la protéine a besoin d'adapter sa conformation légèrement, l'ADN subit une courbure dramatique et une torsion impressionnante. Une telle conformation en V du complexe et un modèle structural de MC1 avec un ADN plus long nous ont amené à proposer un nouveau mode de liaison de la protéine en tant qu’« enrouleur ». Des expériences de diffraction RX et de SAXS ont été réalisées sur ce complexe. Malheureusement, la structure n'a pas pu être résolue en raison du manque de données de diffraction et les données SAXS ont invalidé le modèle. Ces résultats confirment que MC1 est une protéine atypique, qui stabilise de multiples conformations en V de l'ADN de manière flexible et dynamique
HU is an essential bacterial protein that is involved in many functions related to DNA. It is present as three dimers in E.coli (two homodimers and one heterodimer). If the two homodimers are mixed in vitro, they exchange their chains to spontaneously form the heterodimer. My work was to characterize, structurally and kinetically, this exchange mechanism that can be described as a second order reaction of three successive steps : from a native conformation of each homodimer into an intermediate homodimer conformation (partially unfolded and dissociated), followed by the formation of a transient tetramer (limiting step) which finally dissociates into two heterodimers. The key residues allowing the protein to switch from the native to the intermediate state has been determined. Whereas, there are buried in the native conformation, they are forming a hydrophobic patch at the surface of the intermediate one. This patch could mediate the association of the intermediate conformation in order to form the tetramer.MC1 participates in the genome organization of several archaea and in DNA transcription and cellular division through unknown mechanisms. We discuss the solution structure of a complex formed by MC1 with a strongly distorted 15 base pairs DNA. While the protein just needs to adapt slightly its conformation, the DNA undergoes a dramatic curvature and an impressive torsion. Such a V-turn conformation of the complex lead us to propose a new binding mode for the protein as a wrapper and a structural model of MC1 with a longer DNA. XR diffraction and SAXS experiments were then carried out on this new complex. Unfortunately, the structure could not be solved due to the lack of diffraction data and the SAXS data invalidated the model. These results confirm that MC1 is an atypical protein, which stabilizes multiple V-turn conformations of the DNA in a flexible and dynamic manner

Malgré sa diffusion rapide dans le domaine des biomolécules, plusieurs problèmes restent à résoudre avant que la RMN du solide à haute résolution soit prête à faire face à des applications complexes. Afin d’étendre ses capacités, les objectifs de cette thèse sont de deux ordres: a) établir un nouveau système modèle, plus complexe que les petites protéines globulaires et b) développer de nouvelles expériences de RMN afin d'améliorer la sensibilité et la résolution des méthodes pour l'attribution de résonances. Le domaine N-terminale de l’unité de l'ADN polymérase III de E. coli a été choisi comme système cible. Les conditions de préparation de l’échantillon sont obtenues grâce aux processus de screening à haut débit, et l'attribution quasi exhaustive des résonances est effectuée par l'application des expériences bien établies basées sur les irradiations rf à haute puissance et la rotation à l'angle magique (MAS) à basse fréquence. Nous montrons que l'utilisation de vitesses à l'angle magique "ultra-rapides" (60 kHz) rend possible l'usage d'expériences aux "puissances faibles" affichant une augmentation extraordinaire de résolution et sensibilité, et permettant l'acquisition des transferts par polarisation croisée, des corrélations entre les liaisons chimiques et des corrélations détectées par 1H. Des faibles largeurs de pics sur les spectres 1H sont obtenues pour des échantillons de protéines entièrement protonées à l’état solide sans qu'une dilution dans un milieu deutéré soit nécessaire. La dernière partie de la thèse concerne l’étude de phases cristaux liquides (LX) thermotropes d'un smectogen de Vries , le dérivé (S)-hexyl-lactate, abrégé 9HL, sélectivement deutéré
Despite the rapid diffusion of solid-state NMR (ssNMR) in the area of biomolecules, its application is far away of being systemic, and many problems remain however tobe solved before it is applied to the study of challenging solid protein assemblies. In order to extend the capabilities of ssNMR to larger substrates, the objectives of this thesis are twofold: a) to establish a new, large and more complex model system, and b) to develop new, sophisticated NMR experiments in order to improve the sensitivity and the resolution of the currently existing schemes for resonance assignment. The N-terminal domain of the Polymerase subunit III of E. coli was chosen as a target system. Sample preparation conditions are obtained, notably in combination with automated screening processes, and almost complete resonance assignment is performed based on high-power rf irradiations and slow magic-angle spinning (MAS. We show that the use use of MAS at so-called ultra-fast spinning rates (60 kHz makes possible the use of "totally low power" experiments. This yields an extraordinary increase in resolution and sensitivity, enabling the acquisition of selective cross polarization (CP) transfers, through-bond correlations and 1H-detected correlations. Narrow 1H NMR line widths and robust backbone assignment can be obtained for fully protonated medium-size protein samples in the solid state under ultra-fast magic-angle spinning, without any need for dilution against a deuterated background. The final part of this thesis concerns the study of thermotropic liquid crystals (LX) phases of a de Vries smectogen, the (S)-hexyl-lactate derivative abbreviated as 9HL, selectively deuterated
Nonostante la rapida diffusione della RMN allo stato solido (ssNMR) nell’ambito delle biomolecule, molti problemi rimangono da risolvere prima che quest’ultima possa essere applicata ad applicazioni più complesse. Allo scopo di estendere le sue potenzialità, gli obiettivi di questa tesi sono duplici. a) stabilire un nuovo sistema modello, più complesso delle semplici proteine globulari e b) sviluppare nuovi e piu sofisticati esperimenti NMR al fine di migliorare la sensibilità e la risoluzione dei metodi attualmente esistenti per l'assegnazione delle risonanze. Il dominio N-terminale dell’unita ε della DNA Polimerasi III di E.Coli è stato scelto come sistema bersaglio. Le condizioni di preparazione del campione sono ottenute grazie a processi di screening ad alta capacita, e l’assegnazione quasi complete delle risonanze è effettuata tramite l’applicazione di esperimenti routinari basati su irradiazioni RF a alta potenza e rotazioni all’angolo magico a bassa frequenza. Mostriamo che l’utilizzo di rotazioni all’angolo magico “ultra-MAS” (60 kHz) rende possibile l’uso di esperimenti “a basse potenze” mostrando uno straordinario aumento di risoluzione e sensibilità, e permettendo l’acquisizione di trasferimenti di polarizzazione selettivi, di correlazioni scalari attraverso i legami chimici e di correlazioni acquisite al protone. Larghezze di linea sottili al protone sono ottenute per campioni di proteine interamente protonate allo stato solido senza che sia necessaria diluizione in ambiente deuterato. L’ultima parte della tesi riguarda lo studio di fasi liquido-cristalline termotropiche di uno smettogeno de Vries, il derivato dello (S)-esil-lattato, abbreviato come 9HL, selettivamente deuterato

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X
The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments

La RMN à l’état solide est une méthode de choix pour l’étude des protéines insolubles et des complexes protéiques de haut poids moléculaire. L’insolubilité intrinsèque des protéines fibrillaires, ainsi que leur architecture complexe, rendent difficile leur caractérisation structurale par la cristallographie et par la RMN en solution. La RMN à l‘état solide n’est pas limitée par le poids moléculaire et constitue donc un outil puissant pour l’étude des protéines fibrillaires. L’attribution des résonances RMN est le prérequis pour obtenir des informations structurales à résolution atomique. La première partie de ce travail de thèse décrit le développement de méthodes en RMN à l’état solide pour l’attribution des résonances. Nous avons appliqué ces méthodes afin d’attribuer le domaine C-terminal du prion Ure2 (33 kDa), qui est à ce jour la plus grande protéine attribuée par RMN à l’état solide. Nos résultats fournissent les bases pour l’étude de protéines à haut poids moléculaire à l’échelle atomique. Ceci est démontré dans la seconde partie de ce travail de thèse avec les premières études RMN à l’état solide des fibrilles des prions Ure2 et Sup35. Nous avons caractérisé la structure de ces prions pour les fibrilles entières ainsi que pour les domaines isolés. La troisième fibrille étudiée est l’α- synuclein, fibrille associée à la maladie de Parkinson, pour laquelle nous présentons l’attribution des résonances RMN ainsi que la structure secondaire d’un nouveau polymorphe. Les études présentées ici fournissent de nouvelles clés pour comprendre la diversité des architectures de fibrilles, en considérant les fibrilles comme entités individuelles d’un point de vue structural
Solid-state NMR is the method of choice for studies on insoluble proteins and other high molecular weight protein complexes. The inherent insolubility of fibrillar proteins, as well as their complex architecture, makes the application of x-ray crystallography and solution state NMR difficult. Solid-state NMR is not limited by the molecular weight or by the absence of long-range structural order, and is thus a powerful tool for the 3D structural investigation of fibrillar proteins. The assignment of the NMR resonances is a prerequisite to obtain structural information at atomic level. The first part of this thesis describes the development of solid-state NMR methods to assign the resonances in large proteins. We apply these methods to assign the 33 kDa C-terminal domain of the Ure2p prion which is up to now the largest protein assigned by solid-state NMR. Our results provide the basis to study high molecular weight proteins at atomic level. This is demonstrated in the second part with the first high-resolution solid-state NMR study of Ure2 and Sup35 prion fibrils. We describe the conformation of the functional domains and prion domains in the full-length fibrils and in isolation. The third fibrillar protein addressed in this work is the Parkinson’s disease related α-synuclein whereof we demonstrate the NMR resonance assignment and the secondary structure determination of a new polymorph. Thus, the studies described here provide new insights in the structural diversity of fibril architectures, and plead to view fibrils as individuals from a structural point of view, rather than a homogenous protein family

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), constituent la plus grande famille de protéines membranaires dans le génome humain. Les RCPGs sont des protéines de signalisation, qui exercent leur action à la surface des cellules, en réponse à une grande variété de stimuli extérieurs. Ils jouent un rôle primordial dans de nombreuses fonctions physiologiques et sont donc impliqués dans une multitude de pathologies comme les maladies cardiovasculaires, métaboliques, neurodégénératives, psychiatriques et oncologiques. L'attribution du prix Nobel de chimie 2012 aux professeurs Robert Lefkowitz et Brian Kobilka pour leurs travaux et avancées spectaculaires dans le champ de recherches des RCPGs, souligne encore leur importance. Les RCPGs constituent également la plus importante cible thérapeutique, avec 30% des médicaments actuellement disponibles sur le marché qui exercent leur action via un RCPG. Cependant, la découverte de nouveaux ligands reste un chalenge. Le but est de développer des approches basées sur la RMN à l’état liquide, qui auront un impact positif sur la recherche de ligand de RCPGs, grâce à l’étude et la caractérisation de récepteur pleine taille, solubilisés en micelles de détergents ou enchâssés en bicouches lipidiques natives
G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of membrane proteins in the human genome. GPCRs act as cell surface signalling proteins and respond to a variety of external signals. They play a pivotal role in many physiological functions and are therefore associated with a multitude of diseases, including cardiovascular, metabolic, neurodegenerative, psychiatric, and oncologic diseases. The 2012 noble Prize in Chemistry was awarded jointly to Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka for studies of GPCRs, highlighting the importance of this protein superfamily. GPCRs constitute also the most important family of drug targets in the human body, with 30% of current drugs acting on GPCRs. However, drug discovery targeting GPCRs remains difficult, owing to the restricted structural information on GPCRs related to the instability of these proteins when isolated from their cell membrane environments. There is also a lack of knowledge for the structural and functional consequences of the interactions of small-molecule compounds with GPCR. The aim is to develop methods to study and characterize a full GPCR solubilized in detergents or in native lipid bilayers, both in its free form and in small molecule bound forms, using liquid-state NMR experiments. The aim is to develop NMR-based approaches that will strongly impact the structure-based drug discovery process for the GPCR family

La fonction des protéines est intimement liée à leur structure et à leur dynamique. La Résonance Magnétique Nucléaire est une technique de choix permettant d'étudier ces deux aspects à une résolution atomique. La relaxation du spin des noyaux d'azote-15 permet de quantifier ces mouvements aux échelles de temps pico- nanosecondes grâce à la determination de la fonction de densité spectrale, décrivant les mouvements du vecteur NH amide. Il est essentiel de mesurer les vitesses de relaxation à des champs magnétiques faibles pour mieux décrire les mouvements nanoseconde. De telles mesures sont possibles grâce à la relaxométrie haute-résolution et ont été réalisées sur l'ubiquitine. Celles-ci ont permis la caractérisation de mouvements nanoseconde dans les parties flexibles de l'ubiquitine. L'interprétation des données de relaxation pour des protéines désordonnées requiert le développement de modèles spécifiques à ces protéines. Nous avons développé une approche, appelée IMPACT, permettant une reconstruction mathématique de la fonction de densité spectrale. Appliquée au facteur de transcription Engrailed 2, cette approche a permis d'accéder à la distribution d'échelles de temps ps-ns à partir de données de relaxation à haut champ. Cette approche, combinée à des mesures de relaxométrie sur la région C-terminale de la protéine Artemis, devrait permettre d'obtenir une représentation fidèle et précise de la dynamique d'une protéine désordonnée. De plus, nous avons étudié la cinétique et la thermodynamique de l'interaction entre Artemis et la Ligase IV. Nos travaux ont permis de développer de nouvelles approches pour l'analyse de larges ensembles de données de relaxation
The intimate relation between the structure, dynamics and function of biomolecules is widely recognized. NMR is a unique technique to extract information on both structure and dynamics at atomic resolutions. Measurements of nitrogen-15 nuclear spin relaxation allow a quantitative description of motions on pico-nanosecond timescales through the characterization of the spectral density function (SDF), which describes the motions of amide bonds in proteins. The SDF has to be sampled at low magnetic fields, inappropriate for protein NMR, in order to obtain a better description of motions. Such measurements are possible by the use of high-resolution relaxometry. Such measurements on Ubiquitin highlight the sub- and low-nanosecond motions in flexible regions. The classical models for the interpretation of relaxation data in proteins are not well suited for intrinsically disordered proteins (IDPs) and require the development of new approaches. We developed a new approach, called IMPACT, based on a mathematical reconstruction of the distribution of correlation times from the experimental SDF. We have applied IMPACT to the transcription factor Engrailed 2. Our method allowed an unprecedented description of the distribution of pico- to nanosecond motions in IDPs. The IMPACT approach will be combined with high-resolution relaxometry measurements on the C-terminal region of the protein Artemis to provide information on an IDP. In addition, we have described the kinetics and thermodynamics of the interaction of Artemis with the DNA Binding Domain of Ligase IV.Overall, this work contributes to the development of new concepts for the interpretation of extensive nuclear spin relaxation data in proteins

Ce travail présente une étude théorique des spectres RMN de molécules biologiques. Dans la première partie, les calculs DFT des paramètres RMN (déplacements chimiques et constantes de couplage spin-spin) pour les protons liés à des atomes de carbone ont été réalisés pour quatre métabolites de la prostate: la putrescine, la spermidine, la spermine, et la sarcosine, et trois métabolites du cerveau: l'acétate, l'alanine et la sérine. Une étude théorique systématique, dans l'approche DFT, des paramètres de RMN des métabolites a montré que la méthode B3LYP/6-311++G** est un bon compromis entre la précision et les coûts. Les contributions du solvant ont été évaluées en utilisant le modèle PCM, les effets des isomères, pondérés dans l'approximation de Boltzmann, ont été pris en compte, et les corrections de vibration de point zéro ont été estimées en utilisant une approche perturbative au second ordre. La comparaison avec l'expérience a démontré que tous ces effets sont nécessaires pour améliorer l'accord entre les données calculées et expérimentales, aboutissant à des résultats de grande précision. Dans la deuxième partie, nous avons développé un nouveau modèle, BioShift, qui permet la prédiction des déplacements chimiques des différents noyaux (H, N, C ...) pour des molécules biologiques (protéines, ADN, ARN, polyamine ...). Il est simple, rapide, et comporte un nombre limité de paramètres. La comparaison avec des modèles sophistiqués conçus spécialement pour la prédiction des déplacements chimiques des protéines a montré que Bioshift est concurrentiel avec de tels modèles.

Les protéines intrinsèquement désordonnées sont caractérisées par un manque de structure 3D stable et sont biologiquements actives dans cet état. La spectroscopie RMN est la méthode de choix pour leurs études à une résolution atomiques, car la cristallographie aux rayons X ne permet pas leur étude en raison de leur caractère hautement dynamique.Cependant, l'étude par spectroscopie RMN de ces protéines est difficiles à cause du grand nombre de recouvrement entre les signaux dans le spectre résultant de l'absence d'un réseau de liaison hydrogène qui pourrait stabiliser la structure et permettre d'obtenir une dispersion des signaux plus élevé. Un autre problème est la sensibilité expérimentale car souvent le temps de mesure est limité en raison de leur prédisposition à la dégradation protéolytique. Dans la première partie de cette thèse les protéines intrinsèquement désordonnées sont introduites. La deuxième partie porte sur la spectroscopie RMN des protéines intrinsèquement désordonnées, des expériences RMN de type BEST-TROSY sont présentées et sont montrées comme étant bien adapté pour l'étude de protéines intrinsèquement désordonnées, en particulier pour celle avec une grande étendue de structure résiduelle. Des expériences 3D BEST-TROSY sont présentées pour leur attribution, une version proline-éditée permet d'aider à l'identification de ce type d'acide aminé et enfin l'expérience HETex-BEST-TROSY qui permet une mesure rapide des taux de change de solvants. Dans la troisième partie de cette thèse ces expériences RMN sont appliquées pour l'étude de la région intrinsèquement désordonnés (domaines 2 et 3) de la protéine NS5A du virus de l'hépatite C (VHC). La structure secondaire résiduel présente dans le fragment de la protéine est analysée. La comparaison des données RMN sur trois constructions de la protéine de différentes longueurs ainsi que les données de SAXS permettent l'identification des interactions transitoires à longue portée entre les différentes régions de cette protéine. En outre, les modes de liaison de ce fragment de protéine à Bin1 domaine SH3 sont analysés. Enfin, les résultats préliminaires obtenus sur l'étude de la phosphorylation de NS5A du VHC par certaines kinases, qui ont été montrées comme biologiquement pertinents, sont présentés
Intrinsically disordered proteins are characterized by a lack of a stable, 3D structure and fulfill their biological role as such. NMR spectroscopy is the method of choice for their atomic resolution studies, as X-ray crystallography is not amenable to them due to their highly dynamic character.However, NMR spectroscopic studies of these proteins are challenging, because of the high extent of signal overlap in the spectra, resulting from the absence of a hydrogen-bonding network that would lead to structuring and higher signal dispersion. A further problem is experimental sensitivity as often measurement time is limited due to their predisposition for proteolytic degradation. In the fist part of this thesis intrinsically disordered proteins are introduced. The second part focuses on NMR spectroscopy of IDPs, BEST-TROSY-type NMR methods are presented and are shown to be well suited for large IDPs, especially for those with high extent of residual structure. 3D BEST-TROSY experiments are presented for assignment, a proline-edited version for aiding amino acid-type identification, and the HETex-BEST-TROSY experiment that allows rapid measurement of solvent exchange rates. In the third part of this thesis NMR methods are applied for study of the entire intrinsically disordered region (domains 2 and 3) of NS5A protein of hepatitis C virus. The residual secondary structure in this protein fragment is analyzed. Comparison of NMR data on three protein constructs of different lengths together with SAXS data allows identification of transient long range interactions between different regions of this protein. Furthermore, the binding modes of this protein fragment to Bin1 SH3 domain are analyzed. Finally, the preliminary results obtained on investigation of phosphorylation of NS5A of HCV by certain kinases, reported to be biologically relevant, are presented

Nous montrons que la structure RMN, en solution, du domaine N-terminal de DsbD de Neisseria meningitidis (nDsbD) présente, à l’état réduit, un repliement de type immunoglobuline avec un site actif adoptant une conformation fermée. Toutefois, l’analyse des mouvements internes du squelette peptique de nDsbD montre que la région dite « couvercle » de la protéine et qui protège les résidus actifs dans les formes réduite et oxydée, est dotée de mouvements internes. Cela démontre les capacités intrinsèques d’ajustement structural de nDsbD. Nous montrons aussi que les structures RMN, en solution, du domaine N-terminal de PilB de N. meningitidis (NterPilB) sous ses deux formes, réduite et oxydée, présentent un repliement de type thiorédoxine. Ces deux formes, très proches d’un point de vue structural, apparaissent comme étant globalement rigides. Par conséquent, la boucle FLHE, caractéristique de NterPilB et bordant le site actif de la protéine, ne dévoile pas de nouveaux indices structuraux et/ou dynamiques traduisant son implication dans la spécificité de substrat. Finalement, nous montrons, grâce à l’étude structurale et dynamique, en solution, d’un complexe entre nDsbD et NterPilB de N. meningitidis, que nDsbD fait preuve d’une grande adaptabilité à l’état complexé. La région « couvercle » s’ouvre pour venir se positionner au dessus de l’hélice a qui contient les cystéines actives de NterPilB. Par contre, la boucle FLHE de NterPilB ne semble pas intervenir dans la stabilisation du complexe. Nous proposons que des phénomènes dynamiques puissent faciliter d’une part, l’adaptabilité relative des deux partenaires dans le complexe, et d’autre part, la dissociation finale de ces derniers
We show, on one hand, that the NMR solution structure of DsbD N-terminal domain from Neisseria meningitidis (nDsbD) displays, in its reduced state, an immunoglobulin fold with a closed conformation of its active site. Nonetheless, our backbone dynamics study shows that the cap-loop region of the protein, which covers active residues in both oxidized and reduced forms, displays internal motions. This illustrates the inner structural adjustment capacities of nDsbD. On the other hand, we show that NMR solution structures of the oxidized and reduced forms of N. meningitidis NterPilB display a thioredoxin-like fold. These two structures appear to be very similar and globally rigid. Consequently, the NterPilB characteristic FLHE loop, which covers one edge of the active site, does not reveal new structural and/or dynamics properties for its involvement in the substrate specificity. Finally, we point out, from the structural and dynamics study of a complex between nDsbD and NterPilB from N. meningitidis, that nDsbD exhibits a powerful adaptability in its complex state. Its cap-loop region opens and comes over the a helix containing the NterPilB active cysteines. In contrast, the NterPilB FLHE loop does not seem to play a role in the complex stabilization. We propose that internal dynamics should facilitate, on one hand, the relative adaptability between the two partners of the complex and, on the other hand, their subsequent dissociation

L’hépatite B est une maladie du foie qui pose un problème majeur de santé publique. Il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir complètement de l’infection, et de nouvelles thérapies ont besoin d’être développées. Étant donné son rôle clé dans le cycle de vie du virus de l’hépatite B (VHB), la protéine core qui forme la capside virale est aujourd’hui l’une des cibles avec le plus grand potentiel thérapeutique. Nos recherches sont focalisées sur la caractérisation des capsides du VHB dans différents états conformationnels en utilisant des techniques de biochimie et de RMN du solide, afin de révéler leur conformation précise sous différentes conditions, incluant l’interaction des capsides avec des antiviraux, et la relation entre la conformation de la capside et la maturation du virus. Un système d’expression bactérienne ainsi qu’un système acellulaire de synthèse de protéine à base de germes de blé ont été établis au laboratoire pour produire les capsides, et des protocoles pour désassembler puis réassembler les capsides en présence de différents types d’ARN ont été implémentés. Des échantillons de capsides formées dans E. coli et réassemblées in vitro ont été analysés par RMN. Les différentes formes de capsides observées incluent les protéines tronquées Cp140 et Cp149, la protéine entière Cp183, phosphorylée P-Cp183, et enfin des mutants. Dans un premier temps, nous avons préparé des échantillons pour l’attribution séquentielle de la protéine core par RMN du solide. L’utilisation de la détection carbone en RMN requiert plusieurs dizaines de milligrammes d’échantillon, qui ont pu être produits en utilisant l’expressions bactérienne en milieu minimum contenant des isotopes marqués. Les attributions séquentielles ont été réalisées sur la protéine tronquée Cp149, qui donne des spectres très similaires à Cp183. Cet échantillon a également été utilisé pour identifier les différences conformationnelles entre les 4 monomères de la capside, qui sont provoquées par la symétrie icosaédrale T=4. Ensuite, l’objet principal de cette thèse a été l’investigation et la comparaison d’une large variété de capsides, dans leur forme autoassemblée dans les bactéries E. coli, ainsi que dans leur forme réassemblée. Pour le réassemblage de la protéine entière, qui requiert la présence d’acides nucléiques, nous avons testé différents types d’ARN y compris l’ARN viral prégénomique. Nous avons étudié différentes symétries (T=3 et T=4), ainsi que les états d’oxydation de la capside, et comparé les différences de conformation grâce aux perturbations de déplacements chimiques observées dans les spectres RMN. Nous avons pu identifier les acides aminés impliqués dans les changements conformationnels majeurs entre les différentes préparations. La RMN du solide en détection proton à 100 kHz a récemment émergé comme un outils important pour l’analyse de protéines produites en quantités moindres. Nous avons appliqué cette stratégie à l’analyse des capsides de Cp149 afin d’obtenir l’attribution des protons amides. La détection proton par RMN du solide peut être combinée avec succès à la synthèse des protéines en système acellulaire, qui donne de faibles rendements par rapport aux cultures en bactéries. Cette approche est particulièrement intéressante pour analyser la modulation de l’assemblage des capsides induite par la présence de drogues. Bien que nous ayons commencé à étudier l’impact de modulateurs d’assemblage par RMN en détection carbone sur des capsides formées dans E. coli et réassemblées (données préliminaires non montrées dans ce manuscrit), la détection proton ouvre la voie vers l’analyse de l’impact de ces modulateurs sur l’assemblage des protéines core directement à la sortie du ribosome
Hepatitis B is a widely spread liver disease which causes a heavy burden for human health, with 257 millions of people affected by chronic infection and about 780,000 deaths per year. Yet, infected patients can not be completely cured by current treatments using notably nucleos(t)ide analogues and interferons. In order to achieve the goal of the World Health Assembly (WHA), who wishes to eliminate hepatitis B by 2030, new therapies need to be developed. Given its critical role for the Hepatitis B virus (HBV) life cycle, the core protein (Cp) is today one of the antiviral targets with the highest potential. Our research focuses on the characterization of HBV capsids in different conformational states using biochemistry and solid-state NMR, aiming at revealing their precise conformation under different conditions, including the interaction of capsids with antivirals, and the correlation between capsid conformation and viral maturation. For sample preparation, both a bacterial expression system and a wheat germ cell-free protein synthesis system have been established in the laboratory to produce HBV capsids, and protocols to disassemble and reassemble capsids with different nucleic acids have been implemented. Both capsids preformed in E. coli and capsids reassembled in vitro were addressed to NMR studies. Different capsids forms include the truncated versions Cp140 and Cp149, the full length protein Cp183, the phosphorylated P-Cp183 and mutant forms. First, we have prepared samples for the sequential assignment of the protein using solid-state NMR. The use of carbon-13 detection asks for several tens of milligrams of sample, which were produced using labeled isotopes and bacterial expression in minimal media. Sequential assignments were performed using the truncated capsid Cp149, which showed highly similar spectra to Cp183. This sample was also used to identify conformational differences between the four different monomers in the capsid, which are due to the T=4 icosahedral symmetry. Then, the main body of the thesis is the investigation and comparison of a variety of different capsid forms, including Cp183, P-Cp183, Cp149, Cp140, another truncated form resulting in mainly T=3 icosahedral assemblies, and Cp140 C61A and Cp183 F97L mutants. We investigated all samples in both the E. coli-produced and reassembled forms, which needs for the full-length protein the presence of nucleic acids, of which we tested several, including the viral pregenomic RNA. We investigated different symmetries, as well as oxidation states of the capsid, and compared the differences via chemical shift perturbations observed in NMR spectra. We reported in a site-specific manner the major conformational changes observed between the different preparations. Proton-detected solid-state NMR at 100 kHz has recently emerged as a tool for analyzing proteins with the need of less sample amount. We have applied this strategy to the analysis of the Cp149 capsids, in order to obtain sequential assignments of the amide proton resonances. For this, deuteration of the protein in bacteria was used as well, needing adaptation of sample preparation protocols. Proton detection can be successfully combined with cell-free protein synthesis, which gives low yields compared to bacterial expression. This approach is of potential interest to analyze capsid assembly modulation induced by the presence of drugs. While we have started in the framework of this thesis to analyze the capsid in presence of different capsid assembly modulators by carbon-13 detected NMR on E. coli and reassembled capsids (preliminary results not reported here), proton detection opens the way to an analysis of the impact of capsid modulation directly on the exit of the core proteins from the ribosome, on assembly. We showed that cell-free expression combined with proton-detection solid-state NMR can be used to analyze capsid chemical shifts, and thus in future work the conformational modulations

Au cours du développement du système nerveux, les neurones établissent des connexions entre eux selon des règles topographiques précises. C'est notamment le cas dans le système olfactif où les neurorécepteurs de l'épithélium olfactif se projettent sur le bulbe olfactif selon une carte réceptotopique précise. Mon travail de thèse a porté sur les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la croissance et le guidage des axones olfactifs. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel du couple ligand/récepteur Nogo-A/NgR. Nous avons pu montrer, grâce à des analyses menées in vivo et in vitro, que la protéine Nogo-A était présente au sein des axones olfactifs en croissance au cours du développement ainsi que chez l'animal adulte. Nous avons également mis en évidence une expression transitoire de Nogo-A dans les dendrites des neurones relais bulbaires. Cette expression apparaît restreinte à la première semaine post-natale, période de mise en place des connexions synaptiques au sein des glomérules olfactifs. Notre étude a ensuite porté sur la localisation de NgR, le récepteur de Nogo-A, et de ses deux homologues, NgR2 et NgR3. Ces trois récepteurs sont exprimés par les neurorécepteurs olfactifs au cours du développement et localisés préférentiellement dans les axones olfactifs. Nos résultats permettent de proposer de nouvelles fonctions pour Nogo-A et NgR, en conditions phyiologiques, indépendamment l'un de l'autre ou en couple. Ces nouvelles fonctions font intervenir l'expression de Nogo-A, au sein du neurone lui-même, et pourraient concerner la croissance des neurites et l'établissement des connexions synaptiques épithélio-bulbaires. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'implication des protéines STOP (Stable Tubule Only Polypeptide), protéines connues pour leur rôle stabilisateur des microtubules. Nous avons mené une étude exhaustive de l'expression des protéines STOP dans le système olfactif du rat au cours du développement. Les deux isoformes neuronales de STOP (E- et N-STOP) sont détectées dans les axones olfactifs, l'isoforme adulte (N-STOP) n'apparaissant que port-natalement. Au sein de la couche des nerfs du bulbe olfactif, il existe un gradient de distribution des protéines STOP qui varie selon les isoformes. Ces différents gradients suggèrent un rôle des protéines STOP dans la dynamique du cytosquelette qui sous-tend les processus de défasciculation et refasciculation des axones olfactifs au sein de la couche des nerfs ainsi que l'adressage final des axones au sein du glomérule. Nous n'avons cependant pas identifié de défauts majeurs de la croissance des axones olfactifs STOP-/- in vitro ni de l'organisation de la couche des nerfs et de la couche glomérulaire du buble ofactif des souris STO-/- in vivo

Lors de la dégustation des vins rouges, une sensation de sécheresse nommée astringence peut avoirlieu. Cette sensation est causée par l’interaction des tanins du vin et des protéines salivairescorrespondant à un phénomène d’une extrême complexité. Cinq tanins représentatifs des vins B1, B2,B3, B4 et C2, et trois peptides représentatifs des protéines de la salive IB714, IB937 et l’histatine 3 ontété synthétisés et étudiés par des approches de physico-chimie et de biologie structurale telles que laRMN, le dichroïsme circulaire et la modélisation moléculaire. Après une étude structurale, lesparamètres de l’interaction ont été déterminés pour l’ensemble des systèmes permettant de construiredes échelles d'affinités montrant l’influence de la structure tridimensionnelle des tanins et de leurnature (degrés de polymérisation), de la longueur du peptide et la meilleure affinité des tanins pour lesPRP comparées aux PRH. Ces études ont également mis en évidence l’importance de la concentrationen tanin sur le phénomène de précipitation. En dessous de leur CMC, les tanins forment des colloïdesavec les peptides par le biais de liaisons hydrogènes, et au-dessus de leur CMC, les interactionshydrophiles restent préférentielles mais des interactions hydrophobes interviennent dans un deuxièmetemps
During tasting of red wines, a sensation of dryness named astringency may occur. This sensation iscaused by the interaction between wine tannins and salivary proteins corresponding to an extremelycomplex phenomenon. Five representative wine tannins B1, B2, B3, B4 and C2, and threerepresentative peptides IB714, IB937 and histatin 3 from saliva were synthesized and studied byphysical chemistry and biology structural tools, such as NMR, circular dichroism and molecularmodeling. After a structural study, the parameters of the interaction were determined for all systemsallowing to build affinities scales, showing the influence of three-dimensional structure of tannins andtheir nature (degree of polymerization), the influence of the peptide length and the higher affinity oftannins for PRP than HRP. These studies have also highlighted the importance of concentration oftannin on the phenomenon of precipitation. Below their CMC, tannins bind specifically to salivaryproteins. Above the CMC, the specific interactions are still present, but tannins can also form micellesand create hydrophobic interactions

Gelatina Hidrolisada (GH), Glúten de Trigo (GT) e Isolado Protéico de Soja (IPS) foram misturados em diferentes proporções com o objetivo de substituir proteínas lácteas em uma formulação alimentícia utilizada em programas institucionais de alimentação escolar, buscando-se uma redução de custos sem alterações significativas das propriedades nutricionais e sensoriais do produto final. A qualidade nutricional das misturas foi avaliada de acordo com os métodos \"Escore Químico corrigido pela Digestibilidade PDCAAS\" e \"Razão de Eficiência Protéica - NPR\". As misturas, aplicadas àformulação de uma bebida láctea, foram avaliadas sensorialmente através do método de \"Diferença Escalar do Controle\". Os resultados obtidos experimentalmente pelo delineamento simplex-centróide foram utilizados para modelar equações canônicas de Scheffé que pudessem descrever o efeito da proporção de cada componente na qualidade final. Todos os resultados foram correlacionados através de análise multivariada e representados na forma de Análise de Componente Principal (ACP). Uma \"solução de compromisso\" contendo 25% de GH, 15% GT e 60% de IPS foi selecionada na otimização conjunta das respostas nutricional, sensorial e econômica, resultando na redução média de 6% do custo do produto final sem alteração significativa de qualidade (p < 0,01). Estes resultados revelaram a eficiência da utilização de técnicas estatísticas multivariadas na otimização simultânea e na visualização das interações que ocorrem em processos complexos como sistemas biológicos.
Hidrolizated Gelatin (HG), Wheat Gluten (WG) and Soybean Protein Isolate (SPI) were mixed at different proportions in order to partially replace milk proteins in food formulation utilized in Food Programs to reduce its cost without significant decrease in its nutritional and sensorial properties. The nutritional quality of the mixtures was evaluated by the \"Protein DigestibilityCorrected Amino Acid Score (PDCAAS)\" and \"Net Protein Ratio (NPR)\"methods. The sensorial quality of the mixtures was evaluated by the \"Scale Difference of Control\". The results obtained experimentally by simplex design were used to elaborate Scheffé\'s canonical equations that would describe the effect of the proportion of each component on the final nutritional quality of the product. Ali the results were correlationed by Multivariate Analysis and represented by Principal Component Analysis (PCA). A \"compromise solution\" containing 25% HG, 15% WG and 60% SPI was selected as multiresponse optimization. This mixture was applicated in food formulation and submitted to the evaluations of nutrition and sensorial quality. The final product showed about 6% of cost reduction without any significant change in its quality (p< 0,01). These results demonstrated the statistics multivariate methods efficiency in simultaneous optimization and visualization of interactions which are present in complex process like biological systems.

L’un des obstacles majeurs à l’éradication du VIH-1 est sa capacité à faire évoluer rapidement son matériel génétique. Ceci lui permet de contourner le système immunitaire de l’hôte ainsi que la pharmacologie antirétrovirale due à l’émergence de formes mutantes et résistantes des enzymes ciblées. A l’origine de ses recombinaisons génétiques, se trouvent d'une part les erreurs commises par la RT lors de l’étape de transcription inverse et d'autre part les processus de transfert de brins qui sont facilités par la protéine de nucléocapside (NC). Notre objectif est de mieux comprendre les propriétés chaperon de la NC pendant le premier transfert de brin ; au cours de celui-ci, la NC déstabilise les structures secondaires des acides nucléiques impliqués ARN et ADN afin de les hybrider pour former un duplex ARN/ADN. Nous souhaitons notamment savoir si la NC est capable de reconnaître la polarité des chaines d’acides nucléiques selon leur nature et si cette capacité module ses propriétés déstabilisatrices. Nos travaux sur la dynamique interne de la protéine ont permis de montrer que certains mouvements étaient corrélés avec les modalités de fixation sur l’ARN. Nous avons ainsi pu montrer, en comparant les propriétés des différentes formes maturées de la NC au cours du cycle viral, que les domaines p1 et p6 présents dans les formes immatures (NCp9 et NCp15) modulaient les propriétés d’interaction comparé à la forme mature (NCp7). Ceci nous amène à reconsidérer le rôle des différentes parties de la polyprotéine Gag sur les propriétés du domaine NC au sein de ce précurseur Gag. Ce domaine apparaissant largement responsable de la reconnaissance et de la sélection du génome viral ARN pour l’encapsidation dans les particules néosynthétisées. Pour réaliser cette étude, nous avons étudié différents complexes entre la NC avec différents acides nucléiques (ARN et ADN), ce en utilisant principalement la résonance magnétique nucléaire couplée à d’autres méthodes biophysiques et biochimiques dans le but d’obtenir des informations à l’échelle atomique. Ce travail peut également être utile dans la conception d’une nouvelle classe d’inhibiteurs dirigés contre la NC sachant que celle-ci représente une cible thérapeutique attrayante vu qu’elle est très conservée et très importante pour l’infectiosité
One of the major difficulty in the eradication of HIV-1 is its ability to evolve rapidly its genome. This permit to the virus to escape the host immune response and the antiretroviral pharmacology due to the emergence of mutant and resistant forms of the target enzymes.The origin of these genetic recombination is, in one hand the errors commited by the RT during the reverse transcription stage and in the other hand the strand transfer processes facilitated by the nucleocapsid protein (NC).Our goal is to understand the chaperonnig properties of NC protein during the first strand transfer ; where NC destabilizes the involved RNA and DNA secondary structures to anneal them and form a hybrid RNA/DNA duplex.In order to determine this mecanism, we seek, if NC protein have the property to recognize the polarity of nucleic acids chains and if this modulates its destabilization properties. Also, our work on the internal dynamic of the protein showed that some motions are correlated to its binding to RNA.We compared the properties of different maturated forms of NC protein during the viral life cycle and we concluded that p1 and p6 domains present within the immature forms (NCp9 and NCp15) adjusted differently the interaction properties to nucleic acids compared to the mature form (NCp7). It leads us to reconsider the role of the different parts of the Gag polyprotein on the properties of the NC domain within this Gag precursor. This domain appears to be largely responsible for the recognition and selection of the viral genomic RNA in order to package it in the newly formed viral particles.To permform this study, we studied different complexes between NC and nucleic acids sequences (RNA and DNA) using mainly NMR spectroscopy and biophysical or biochemical methods to obtain informations at the atomic scale. This work can also be useful in the design of a new class of inhibitors against NC protein which is an attractive therapeutic target due to its conservation and importance in viral infectivity

Ce travail de thèse ce concentre sur l’étude des protéines par l’usage de haute pression. Les articles présentés ici sont précéder d’une introduction présentant les différents modèles physiques utilisés pour décrire le repliement des protéines, une introduction posant les bases de la thermodynamique, ainsi que l’origine de la stabilité thermodynamique des protéines dans leur état plies. Il y a trois sujets principaux aborder dans ce mémoire. Le premier est l’étude de la coopérativité du repliement et du paysage de repliement de la protéine à répétition PP32 (Anp32a) a travers l’utilisation de la pression a différentes températures. La seconde étude concerne l’investigation de l’origine de l’expansivité thermique des protéines pliées grâce à l’utilisation de RMN haute pression et de la protéine très bien caractérisée Staphylococcal Nuclease (SNase) et de certaine de ses mutantes. Finalement, un dernier article sur la stabilité sous pression de la variant TC5b de la mini protéine model tryptophan-cage grâce une combinaison de RMN et de simulations moléculaires tout-atomes en « replica exchange »
This thesis work focuses on the study of protein though the use of high pressure. There are three main points subject that are being inquired here. The first is the study of cooperativity and folding landscape of a repeat protein (Anp32a) though the use high pressure denaturation at different temperatures. The second concerns the investigation of the determinant of thermal expansivity in the folded state of protein using high pressure NMR, and the well characterized Staphylococcal Nuclease (SNase) and some of its mutants. Finally, a last article on the pressure stability of the model mini protein Tryptophan cage variant Tc5b by a combination of high pressure NMR and full atomic replica exchange simulations

Les transporteurs à ATP binding cassette (ABC) peuvent transporter une grande variété de substrats utilisant l'ATP-Mg2+ comme source d'énergie. Ces transporteurs sont présents dans toutes les formes de vie et sont impliqués dans la résistance aux médicaments, comprenant les anticancéreux et les antibiotiques. Mes travaux de thèse se concentrent sur le transporteur BmrA (130 kDa) de Bacillus subtilis utilisé en tant que système modèle et homologue de la P-glycoprotéine humaine impliquée dans la multirésistance aux anticancéreux. Dans ces travaux nous montrons que la reconstitution de cette protéine dans les lipides de Bacillus subtilis répond aux deux exigences centrales pour RMN: haut rapport signal sur bruit et la stabilité de l'échantillon sur une période de plusieurs années. Les spectres obtenus indiquent une protéine bien repliée et une préparation très homogène, comme en témoignent les lignes de résonance étroites et la dispersion du signal typique de la distribution de structure secondaire attendue de la protéine membranaire. Nous avons adapté la méthode GRecon utilisée dans les études de microscopie électronique pour la reconstitution des protéines membranaires pour la RMN à l'état solide. Nous avons suivi en détail la reconstitution du transporteur ABC BmrA par dialyse comme référence, et établi des conditions optimales de reconstitution en utilisant un gradient combiné de saccharose / cyclodextrine / lipide caractérisant GRecon. Les spectres RMN de l‘échantillon reconstitué par GRecon sont très similaire à ceux obtenus précédemment sur des échantillons reconstitués par dialyse. La préparation d'échantillons par GRecon présente un gain de temps de près d'un ordre de grandeur. Afin d'étudier les états ouvert vers l'intérieur (inward-facing IF) et ouvert vers l'extérieur (outward-facing OF) du transporteur, nous avons développé un protocole reproductible et quantitatif induisant l'état OF. Nous avons enregistré des spectres bidimensionnels RMN à l'état solide avec différents temps de mélange (20 et 200 ms) afin de suivre les changements des déplacements chimiques et d'identifier les résidus par des corrélations séquentielles. L'apparition très apparente de nouveaux signaux concomitants à la grande amplitude des perturbations de déplacement chimique (CSP) met en évidence l'importante flexibilité et les changements conformationnels de la protéine en présence d'ATP: Mg2+. Afin d'identifier les résidus apparaissant dans les spectres, nous avons utilisé le remplacement paramagnétique du co-facteur Mg2+ par du Mn2+. Cette méthode a révélé que les acides aminés apparaissant dans les spectres sont situés à proximité du site de liaison de l'ATP. En outre, les mesures EPR ont confirmé l'état fermé de la protéine en identifiant la distance correspondant à 1,8 nm entre deux atomes de Mn2+. Nous avons étudié les différences conformationnelles entre l'état IF et OF de BmrA. L'observation de nombreux CSP, ainsi que l'apparition de nouveaux signaux sont observés pour un mutant ne pouvant pas hydrolyser l'ATP, indiquant que l'hydrolyse n'est pas nécessaire pour la transition IF à OF dans BmrA. Nous avons également analysé le mécanisme lié au motif X-loop décrit comme étant impliqué dans la communication entre deux domaines de la protéine. Nous avons observé pour une protéine mutante dans laquelle le transport est aboli mais qui reste ATPase active, une transition incomplète puisque seul un sous-ensemble de CSPs est observé, ainsi qu'un manque de rigidification. Ces mesures suggèrent que la flexibilité semble être le point central dans la transmission des changements conformationnels nécessaires de la partie motrice à la partie d'exportation de molécules. Ces observations montrent que ce système serait semblable à un moteur tournant à plein régime qui ne serait pas connecté de manière rigide à un arbre de transmission le reliant au système de transport
ATP binding cassette (ABC) transporters can translocate a variety of molecules by coupling drug/lipid efflux with an ATP-Mg2+ fuelled engine. They are found in all forms of life and they are involved in a number of drug resistances including anti-cancer drugs and antibiotics. My studies focus on the drug exporter BmrA (130 kDa) from Bacillus subtilis as a model system and homologue of the human P-glycoprotein that is involved in multidrug resistance in cancer. We show that the reconstitution of this protein in lipids from Bacillus subtilis at a lipid-protein ratio of 0.5 m/m allows an optimal protein insertion into lipid bilayer as well as it complies with the two central NMR requirements: high signal-to-noise in the spectra and sample stability over a time period of years. The obtained spectra point to a well-folded protein and a highly homogenous preparation, as witnessed by the narrow resonance lines and the signal dispersion typical of the expected secondary structure distribution of the membrane protein. In the same time, we adapted the GRecon method used in electron microscopy studies for membrane protein reconstitution to the needs of solid-state NMR sample preparation. We followed in detail the reconstitution of the ABC transporter BmrA by dialysis as a reference, and established optimal reconstitution conditions using the combined sucrose/cyclodextrin/lipid gradient characterizing GRecon. NMR spectra recorded on a sample produced by GRecon showed a highly similar fingerprint as those recorded previously on samples reconstituted by dialysis. GRecon sample preparation presents a gain in time of nearly an order of magnitude for reconstitution. In order to study the inward-facing (IF) and the outward-facing (OF) state of the transporter, we developed a reproducible and quantitative protocol of ATP:Mg2+:VO43- addition inducing the OF state. We used selectively labelled samples obtained by the addition of natural abundance residues in the bacterial medium in order to reduce the number of signals in the spectra of this large protein. We recorded solid-state NMR two-dimensional spectra with different mixing times (20 and 200 ms) in order to follow chemical shift changes and identify residues by sequential correlations. The very noticeable apparition of new signals concomitant with the large amplitude of chemical shift perturbations (CSPs) highlight the important flexibility and conformational changes of the protein in presence of ATP:Mg2+:VO43- substrate. In order to identify the residues appearing in the spectra, we use paramagnetic replacement by Mn2+ of the Mg2+ acting as a co-factor in the active site. The paramagnetic relaxation enhancements caused the Mn2+ revealed that the amino acids appearing in the spectra are located in proximity to the ATP binding pocket. Besides, EPR measurements confirmed the closed state of the protein by identifying the corresponding 1.8 nm distances between two Mn2+. We investigate on the conformational differences identified between the IF and OF state in the ABC transporter BmrA reconstituted in its natural lipids. The observation of numerous CSPs, as well as the apparition new signals are observed for a hydrolysis-incompetent mutant on addition of ATP, indicating that hydrolysis is not required for the IF to OF transition in BmrA. We also analyze the mechanistic of the X-loop motif described to be involved in the communication between two domains of the protein. We observe for a mutant protein in which transport is abolished, but which remains ATPase active, an incomplete transition since only a subset of CSPs is observed, as well as lack of rigidification. This suggests that the change in dynamics might be central for transmitting the relevant conformational changes to the part of the protein driving transport, concomitant of an engine which is turning an input shaft, but which fails to connect in a rigid manner, trough adequate gears, with the output shaft driving the pump

La résonance magnétique nucléaire (RMN) fournit des informations structurelles et dynamiques précieuses à l'échelle atomique, cependant, la faible sensibilité et résolution des signaux empêchent l’étude d'objets moléculaires plus importants. Nous présentons 3 stratégies de marquage isotopique pour différentes expériences RMN des protéines en solution et démontrons leur potentiel pour l'étude structurale des biomolécules. Parmi les stratégies envisagées, 2 utilisent l'expression in vitro pour obtenir des protéines marquées sélectivement sur un groupe chimique et/ou acide aminé dans un environnement perdeutéré. Avec l’utilisation de séquences d'impulsions TROSY, ces échantillons ont permis des gains spectraux importants lorsque ils étaient spécifiquement marqués sur des groupes amide ou sur le méthylène des glycines tout en maintenant un taux de deutération élevé sur les autres fonctions chimiques des protéines. La troisième stratégie de marquage protéique utilise des protocoles in vivo pour des applications RMN innovantes: l'hyperpolarisation de noyaux en solution qui augmente leur sensibilité de plusieurs ordres de grandeur. La durée de vie de cette hyperpolarisation est régie par le temps de relaxation longitudinale des noyaux, qui est réduit pour les protéines à température ambiante. En isolant les noyaux d'intérêt dans un environnement perdeutéré, les interactions dipolaires créées par les protons voisins sont éliminées et les noyaux hyperpolarisés relaxent beaucoup plus lentement. L'hyperpolarisation d'un petit domaine protéique a été entreprise avec succès mais les conditions de dissolution doivent encore être améliorées pour conserver une phase aqueuse homogène
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) provides valuable structural and dynamic information at the atomic scale, however, the low sensitivity and resolution of signals rapidly preclude investigations of larger molecular objects. We present three isotopic labeling strategies for different protein-solution NMR experiments and demonstrate their potential for the structural study of biomolecules in solution. Among the strategies considered, two are based on the use of in vitro protein expression to obtain selectively labeled proteins of a certain chemical group and/or amino acid in a perdeuterated environment. Perdeuteration is essential for the optimal use of Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy pulse sequences. They allowed significant spectral gains when samples were specifically labeled on amide groups or on the methylene of glycines while maintaining a very high rate of deuteration on the other chemical functions of the proteins. The third protein labeling strategy employed is based on in vivo protocols but used in innovative NMR applications: a technique of hyperpolarization of nuclei in solution which increases their sensitivity by several orders of magnitude. The lifetime of this hyperpolarization is governed by the longitudinal relaxation time of nuclei, which are reduced for proteins at room temperature. By isolating the nuclei of interest in a perdeuterated environment, dipolar interactions created by neighboring protons were eliminated and hyperpolarized nuclei relaxed much more slowly. Hyperpolarization of a small protein domain was successfully undertaken at 1K but the dissolution conditions need to be improved in order to preserve a homogeneous aqueous phase

Les tanins jouent un rôle clé dans les qualités organoleptiques du vin rouge. Ils sont à l’origine de l'Astringence, une sensation de sècheresse perçue en bouche lors de la dégustation. Cette sensation est la conséquence d'une interaction spécifique entre des tanins et des protéines salivaire, principalement les Protéines Riches en Prolines (PRPs). Une première partie de ce travail a consisté à étudier l'influence de divers sucres sur le processus d'auto-association des tanins ainsi que sur les interactions tanins-protéines. Le comportement colloïdal d’un tanin (l’Epigallocatechine Gallate – EGCG), ainsi que son interaction avec un peptide modèle IB9-14 représentatif des PRPs, ont été étudiés en présence de différents sucres simples et polysaccharides. Les paramètres de l’interaction ont été déterminé pour l’ensemble des systèmes, mettant en évidence l’existence d’une interaction entre EGCG et sucres dont l’affinité semble dépendre du degré de polymérisation du sucre. Cette interaction ne perturbe pas, dans les conditions expérimentales testées, l’association entre les tanins et le peptide. Une deuxième partie de ce travail correspond à la synthèse complète de la protéine IB9 incluant la séquence peptidique d’IB9-14, et à l’étude de son interaction avec deux procyanidines : l’EGCG et le dimère B3. Cette étude a permis d’observer et de confirmer une influence de la longueur de la chaîne peptidique sur les interactions avec les tanins
Tannins play a key role in the organoleptic qualities of red wine. They are responsible for wine astringency, a dry, rought and puker sensation perceived in the mouth while tasting. This sensation is the consequence of a specific interaction between tannins and saliva proteins, mainly Proline Rich Protein (PRPs). The first part of this work was to study the influence of various sugars on the self-association of tannins process as well as tannins - proteins interactions. The colloidal behavior of a tannin (the epigallocatechin gallate - EGCG), as well as its interaction with a representative peptide IB9-14 of PRPs was studied in the presence of various simple sugars and polysaccharides. The parameters of the interaction were determined for all systems, highlighting the existence of an interaction between EGCG and sugars whose affinity seems to depend on the sugar polymerization degree. This interaction does not interfere, under the experimental conditions tested, on the association between tannins and peptide. The second part of this work was to realize the full synthesis of the protein IB9 including the peptidic sequence of IB9-14, and to study its interaction with two procyanidins: EGCG and dimer B3. The results show and confirm the influence of the length of the peptide chain interactions with tannins

Dans la premiere partie de ce travail, nous avons propose le principe de dimensionalite reduite dans des experiences heteronucleaires multidimensionnelles sur des proteines marquees #1#5n/#1#3c. Deux experiences (3d-mq-hncoca et 3d-mq-noesy doublement filtree #1#5n/#1#5n et/ou #1#5n/#1#3c) utilisant ce principe ont ete mises au point et en ont montre l'interet pour l'attribution et le calcul de structure tridimensionnelle preliminaire. La majeure partie de ce travail concerne l'etude de la dynamique des proteines dans la gamme ps-ms par la mesure de parametres de relaxation. Dans un premier temps, les parametres de relaxation des noyaux #1#5n contenant l'information sur la mobilite des vecteurs n-h du cytochrome c#2 de rhodobacter capsulatus ont ete interpretes en parametres dynamiques grace a l'approche de lipari et szabo. Les mouvements internes sont caracterises par un parametre d'ordre et un temps de correlation interne et sont superposes a un mouvement de reorientation isotrope caracterise par un temps de correlation global. La qualite des parametres dynamiques extraits nous ont incite a considerer un mouvement global anisotrope, caracterise par un tenseur de diffusion d. Celui-ci a pu etre caracterise avec une excellente precision et les parametres de mobilite interne ont pu ensuite etre extraits par cette approche hybride avec une plus grande fiabilite, mettant en evidence la nature relativement compacte de cette proteine meme si une plus grande flexibilite est observee dans certaines boucles. Enfin, l'etude du vecteur ca-co a ete entreprise dans l'optique de caracteriser l'anisotropie des mouvements locaux, a cote de l'information issue du vecteur n-h. Des simulations de dynamique moleculaire ont permis de proposer des modeles de mouvements du plan peptidique pour certains residus et une experience rmn triple-resonance destinee a la mesure de la vitesse de relaxation croisee ca-co a ete mise en place. Ce parametre a finalement pu etre converti en parametre d'ordre.

A técnica de espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (NMR) de alta resolução foi utilizada para estudos estruturais em duas biomoléculas: a proteína HPr da bactéria Staphylococcus aureus, e o peptídeo C da insulina humana. Ambas estão relacionadas com a regulação da absorção de glicose pelas células, no primeiro caso em procariontes, e no segundo em organismos superiores. A proteína HPr (\"Histidine-containing protein\") de Staphylococcus aureus é uma das componentes centrais do sistema PTS (fosfoenolpiruvato:açúcar-fosfotransferase) de translocação grupal, responsável pelo transporte ativo de açúcar para o interior da célula bacterial. Nesse processo, a His15 do sítio ativo de HPr é fosforilada pela enzima EI, transferindo, a seguir, o grupo fosfato para a enzima EUA A mutação His15→Ala interrompe a transferência do grupo fosfato; apesar disso, a afinidade entre HPr(H15A) e as enzimas EI/EIlA se mostrou semelhante à da nativa. Utilizando técnicas de NMR bidimensionais (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) etridimensionais (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) foi determinada a estrutura da mutante His15→Ala de HPr de S. aureus. Sua estrutura consiste de um sanduíche-aberto, composto de 3 hélices-a paralelamente empacotadas contra uma folha formada por 4 fitas-β anti-paralelas. Esse padrão é encontrado em todas as proteínas HPr já determinadas em diversas espécies, divergindo, porém, significativamente da estrutura previamente publicada para a proteína nativa de S. aureus com relação à orientação relativa de alguns elementos de estrutura secundária. Através de uma análise detalhada dos espectros NOESY das proteínas HPr mutante e nativa puderam ser encontradas diferenças conformacionais na região em tomo do sítio-ativo. Uma comparação com as outras estruturas de HPr já publicadas revelou uma maior semelhança entre a proteína mutante de S. aureus e a proteína no complexo HPr/EI de E. coli, fornecendo evidências de que a estrutura encontrada para a mutante represente a conformação assumida pela proteína HPr no momento de sua interação com a enzima EI, assim explicando a sua afinidade inalterada. O peptídeo-C da proinsulina é importante para a biosíntese da insulina, tendo sido considerado, por muito tempo, biologicamente inerte. Estudos recentes em pacientes diabéticos retomaram a discussão quanto a sua possível atividade reguladora. Utilizando a técnica de espectroscopia de NMR bidimensional (COSY, TOCSY, NOESY), foram realizados estudos estruturais no peptídeo-C da proinsulina humana. Quando dissolvido em 50%/50% água e TFE, o peptídeo-C apresentou 3 regiões centrais (9-12, 15-18, 22-25) com tendência à formação de dobras, uma região N-terminal (2-5) com 2 conformações em voltas-β tipo I e I, e uma região Cterminal (26-31), de conformação extremamente bem definida, incluindo uma volta-β tipo III\' (27-30). Em estudos descritos na literatura já foi demonstrada a atividade do pentapeptídeo C-terminal (EGSLQ), na forma de interações quirais com um receptor ainda desconhecido. Estudos anteriores por NMR prevêem a existência de uma estrutura na região C-terminal, a qual foi denominada de \"CA-Knuckle\". Nossa proposta é que a estrutura aqui obtida para o pentapeptídeo C-terminal seja justamente o \"CA-Knuckle\", representando o sítio-ativo do peptídeo-C da proinsulina humana.
High resolution Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy has been used for structural studies on two biological macromolecules; the HPr protein from the bacterium Staphylococcus aureus, and the Cpeptide from human proinsulin. Both are related to the regulation of glucose absorption by celIs, the former case in prokaryotes and the latter in higher organisms. The HPr protein (Histidine Containing Protein) from S. aureus is one of the central components of the PTS (Phosphoenolpyruvate;sugar-phosphotransferase) system responsible for the active transport of sugars into the bacterial celI. During this process, His15 of the HPr active site is phosphorylated by enzyme I (EI), and then subsequently transfers this phosphate onto enzyme lIA (EIIA). The His15→Ala mutant of HPr, whilst unable to participate in phosphate transfer, nevertheless retains similar affinities for both EI and EIIA. Using two-dimensional (COSY, TOCSY, NOESY, HSQC) and three-dimensional (HNCA, HNCO, NOESY-HSQC) NMR techniques, the structure of the His15Ala mutant of the HPr protein from S. aureus was determined. Its structure consists of an open β-sandwich, composed of three α-helices packed against a four-stranded anti-parallel β-sheet. This pattern has been seen in all other HPr proteins from other species so far determined but is markedly different from the previously published native structure from S. aureus with respect to the relative orientations of some of the elements of secondary structure. A detailed comparison of the native and mutant structures revealed differences in the conformation of the active site loop. The latter assumes a conformation similar to that seen in the structure of the complex between E. coli HPr and EI. This may explain the normal affinities of the mutant protein for EI and EIIA despite the absence of the active site histidine. The C-peptide of proinsulin is important for the biosynthesis of insulin but has been considered for a long time to be biologically inert. Recent studies in diabetic patients have stimulated a new debate concerning its possible regulatory role. Structural studies of the C-peptide were performed using two dimensional NMR spectroscopy (COSY, TOCSY and NOESY). ln the presence of 50% TFE three central regions of the molecule (residues 9-12, 15-18 and 22-25) showed tendencies to form ~-bends. The N terminal region (residues 2 to 5) was present in the form of either a type I or I\' β-turn, whilst the C terminal region (26-31) presented the most welI-defrnedstructure of the whole molecule which included a type III\' β-turn. The C-terminal pentapeptide (EGSLQ) has been described in the literature as being responsible for chiral interactions with an as yet uncharacterized receptor. Previous NMR studies have predicted the existence of a well-defined structure at the C-terminus of the C-peptide, kwown as the CAknuckle. We propose that the structure described here for the C-terminal pentapeptide is the CA-knuckle and represents the active site of the C-peptide of human proinsulin.

NOR-1 appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires qui regroupe une variété de facteurs de transcription, dont les récepteurs des hormones thyroïdiennes, des hormones stéroïdiennes, des acides rétinoïques, de la vitamine D. Ces protéines produisent une multitude de réponses biologiques via la régulation de gènes cibles. Ils régulent différentes fonctions cellulaires, dont la prolifération, la différentiation, l’apoptose et l’homéostasie. Ils peuvent également être impliqués dans la tumorigénèse. NOR-1, NGFI-B et NURR1 forment une sous-famille de récepteurs nucléaires orphelins. Ces protéines sont plus spécifiquement associées au développement et à l’homéostasie du système nerveux central. Elles sont codées par des gènes de réponse précoce, dont la transcription est rapidement induite, dans différents types cellulaires, lorsque stimulée par des facteurs de croissance. NGFI-B et NOR-1 exerceraient une fonction importante dans le processus de sélection négative des cellules T lors de l’apoptose induite par l’activation des récepteurs TCR. De plus, NGFI-B, NOR-1 et NURR1 seraient impliqués dans le contrôle de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien. L’inactivation du gène NURR1 chez la souris a permis de révéler son rôle essentiel dans le développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale. Aucun phénotype majeur n’a été observé à ce jour chez la souris homozygote mutante pour NGFI-B. La fusion des gènes EWS et NOR1 a été mise en évidence dans des tumeurs osseuses de type chondrosarcome myxoïde extrasquelettique. Cette translocation chromosomique est à l’origine de la synthèse d’une protéine hybride formée de l’extrémité N-terminale de EWS et de la séquence de NOR-1 complète. Cette protéine de fusion, appelée EWS/NOR-1, jouerait un rôle crucial dans le développement tumoral. EWS n’est pas l’unique partenaire de NOR-1 dans les chondrosarcomes myxoïdes estrasquelettiques. Trois autres protéines liées au récepteur nucléaire selon le même patron ont été identifiées, soit TAF 2N, TCF12 et TFG. Nous avons comparé l’activité transcriptionnelle des protéines NOR-1 et EWS/NOR-1. Le domaine d’activation AF2 du récepteur nucléaire NOR-1 serait essentiel à l’activité transcriptionnelle de l’oncogène EWS/NOR-1. Ces résultats suggèrent le recrutement de coactivateurs spécifiques à NOR-1 lors du processus tumoral menant au développement des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques. Au moment d’initier nos travaux, aucune souris déficiente pour le récepteur NOR-1 n’avait encore été produite. Afin de mieux comprendre le rôle du récepteur nucléaire orphelin NOR-1, plus particulièrement chez les mammifères, nous avons inactivé le gène chez la souris. Au préalable, l’analyse de la structure du gène, de son patron d’expression ainsi que des différentes isoformes de la protéine a été effectuée. Nos résultats montrent une absence de phénotype majeur qui pourrait découler en partie d’une redondance fonctionnelle exercée par NGFI-B et/ou NURR 1.
NOR-1 appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires qui regroupe une variété de facteurs de transcription, dont les récepteurs des hormones thyroïdiennes, des hormones stéroïdiennes, des acides rétinoïques, de la vitamine D. Ces protéines produisent une multitude de réponses biologiques via la régulation de gènes cibles. Ils régulent différentes fonctions cellulaires, dont la prolifération, la différentiation, l’apoptose et l’homéostasie. Ils peuvent également être impliqués dans la tumorigénèse. NOR-1, NGFI-B et NURR1 forment une sous-famille de récepteurs nucléaires orphelins. Ces protéines sont plus spécifiquement associées au développement et à l’homéostasie du système nerveux central. Elles sont codées par des gènes de réponse précoce, dont la transcription est rapidement induite, dans différents types cellulaires, lorsque stimulée par des facteurs de croissance. NGFI-B et NOR-1 exerceraient une fonction importante dans le processus de sélection négative des cellules T lors de l’apoptose induite par l’activation des récepteurs TCR. De plus, NGFI-B, NOR-1 et NURR1 seraient impliqués dans le contrôle de l’axe hypothalamo/hypophyso/surrénalien. L’inactivation du gène NURR1 chez la souris a permis de révéler son rôle essentiel dans le développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale. Aucun phénotype majeur n’a été observé à ce jour chez la souris homozygote mutante pour NGFI-B. La fusion des gènes EWS et NOR1 a été mise en évidence dans des tumeurs osseuses de type chondrosarcome myxoïde extrasquelettique. Cette translocation chromosomique est à l’origine de la synthèse d’une protéine hybride formée de l’extrémité N-terminale de EWS et de la séquence de NOR-1 complète. Cette protéine de fusion, appelée EWS/NOR-1, jouerait un rôle crucial dans le développement tumoral. EWS n’est pas l’unique partenaire de NOR-1 dans les chondrosarcomes myxoïdes estrasquelettiques. Trois autres protéines liées au récepteur nucléaire selon le même patron ont été identifiées, soit TAF 2N, TCF12 et TFG. Nous avons comparé l’activité transcriptionnelle des protéines NOR-1 et EWS/NOR-1. Le domaine d’activation AF2 du récepteur nucléaire NOR-1 serait essentiel à l’activité transcriptionnelle de l’oncogène EWS/NOR-1. Ces résultats suggèrent le recrutement de coactivateurs spécifiques à NOR-1 lors du processus tumoral menant au développement des chondrosarcomes myxoïdes extrasquelettiques. Au moment d’initier nos travaux, aucune souris déficiente pour le récepteur NOR-1 n’avait encore été produite. Afin de mieux comprendre le rôle du récepteur nucléaire orphelin NOR-1, plus particulièrement chez les mammifères, nous avons inactivé le gène chez la souris. Au préalable, l’analyse de la structure du gène, de son patron d’expression ainsi que des différentes isoformes de la protéine a été effectuée. Nos résultats montrent une absence de phénotype majeur qui pourrait découler en partie d’une redondance fonctionnelle exercée par NGFI-B et/ou NURR 1.
NOR-1 is a member of the nuclear receptor superfamily which comprises a great diversity of transcription factors. The steroid, thyroid, retinoid, and vitamin D receptors represent some widely-know members of this superfamily. The nuclear receptors induce a vast number of biologic responses by the regulation of target genes. They are involved in the control of different cell functions like growth, differentiation, metabolism and apoptosis. They also play roles in tumorigenesis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 form a subfamily of orphan nuclear receptors. They are associated to the central nervous system development and homeostasy. These proteins are coded by immediate-early genes which are rapidly induced by growth factors in different cell types. NOR-1 and NGFI-B have an important function in T-cell receptor (TCR)-mediated apoptosis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 could be involved in neuroendocrine control at the level of the hypothalamic/pituitary/adrenal axis. A NURR1 knock-out mouse has been created and shows the essential role of this nuclear receptor in the development of mesencephalic dopamine neurons. The NGFI-B knock-out mouse shows no significant phenotype both at the level of thymocyte apoptosis and on the regulation of the adrenocortical function. The EWS and NOR-1 gene fusion was discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcoma bones tumors. This chromosom translocation is at the origin of a hybrid protein composed of the N-terminal of EWS fused to the full length nuclear receptor NOR-1. It is presumed that the EWS/NOR-1 fusion protein plays a central role in the tumoral process. Threes other NOR-1 fusion partners were discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcomas. TAF2N, TCF12 and TFG are fused to the nuclear receptor by a similar pattern. We have compared the NOR-1 and EWS/NOR-1 transcriptional activity in different chondrocyte cell lines. The AF2 domain of NOR-1 is essential for the transcriptional activity of the EWS/NOR-1 fusion protein. This result suggests that some NOR-1 specific co-activators participate to the tumorigenic process involved in the development of extraskeletal myxoid chondrosarcomas development. In order to better understand the orphan nuclear receptor NOR-1, we have created a NOR-1 knock-out mouse. Analysis of this mouse indicate an absence of significant phenotype. These observations suggest functional redundancy between NGFI-B or NURR1 (or both) and NOR-1.
NOR-1 is a member of the nuclear receptor superfamily which comprises a great diversity of transcription factors. The steroid, thyroid, retinoid, and vitamin D receptors represent some widely-know members of this superfamily. The nuclear receptors induce a vast number of biologic responses by the regulation of target genes. They are involved in the control of different cell functions like growth, differentiation, metabolism and apoptosis. They also play roles in tumorigenesis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 form a subfamily of orphan nuclear receptors. They are associated to the central nervous system development and homeostasy. These proteins are coded by immediate-early genes which are rapidly induced by growth factors in different cell types. NOR-1 and NGFI-B have an important function in T-cell receptor (TCR)-mediated apoptosis. NOR-1, NGFI-B and NURR1 could be involved in neuroendocrine control at the level of the hypothalamic/pituitary/adrenal axis. A NURR1 knock-out mouse has been created and shows the essential role of this nuclear receptor in the development of mesencephalic dopamine neurons. The NGFI-B knock-out mouse shows no significant phenotype both at the level of thymocyte apoptosis and on the regulation of the adrenocortical function. The EWS and NOR-1 gene fusion was discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcoma bones tumors. This chromosom translocation is at the origin of a hybrid protein composed of the N-terminal of EWS fused to the full length nuclear receptor NOR-1. It is presumed that the EWS/NOR-1 fusion protein plays a central role in the tumoral process. Threes other NOR-1 fusion partners were discovered in extraskeletal myxoid chondrosarcomas. TAF2N, TCF12 and TFG are fused to the nuclear receptor by a similar pattern. We have compared the NOR-1 and EWS/NOR-1 transcriptional activity in different chondrocyte cell lines. The AF2 domain of NOR-1 is essential for the transcriptional activity of the EWS/NOR-1 fusion protein. This result suggests that some NOR-1 specific co-activators participate to the tumorigenic process involved in the development of extraskeletal myxoid chondrosarcomas development. In order to better understand the orphan nuclear receptor NOR-1, we have created a NOR-1 knock-out mouse. Analysis of this mouse indicate an absence of significant phenotype. These observations suggest functional redundancy between NGFI-B or NURR1 (or both) and NOR-1.

Ma thèse a pour buts l'élucidation fonctionnelle et l'étude structurale de nanomachines biologiques en utilisant principalement la RMN du solide : (i) La protéine SesB trouvée chez Nectria haematococca, dont l'assemblage en fibrilles amyloïdes, serait impliquée dans les mécanismes de signalisation de mort cellulaire programmée. En utilisant la RMN du solide avec rotation à l’angle magique, un nouveau modèle structural de cet amyloïde a été établi pour les fibrilles amyloïdes SesB de Nectria haematococca. (ii) Des protéines appelées TasA, TapA et CalY dont l'assemblage en fibrilles amyloïdes est impliqué dans la formation et l'intégrité des biofilms bactériens chez Bacillus subtilis et Bacillus cereus. Des différences structurales ont été observées entre ces deux espèces. Bacillus subtilis et quelques mutants (mutations de gènes impliqués dans la formation de biofilms) ont été étudiés en utilisant la RMN du solide sur cellules entières pour comprendre l'impact de la délétion de ces composants sur la paroi cellulaire globale et la composition de la matrice. (iii) HET-s, l'amyloïde fonctionnelle fongique aujourd’hui très étudié, est utilisé ici comme système modèle dans une stratégie visant à utiliser les avantages combinés de la DNP, de la rotation très rapide à l’angle magique et de la dilution de spin dans le contexte d'études de biologie structurale. Il a été prouvé qu'une utilisation pertinente de ces techniques constitue une stratégie potentiellement robuste pour la caractérisation structurale des assemblages supramoléculaires pour augmenter la sensibilité des analyses par RMN. (iv) Des polymères protéiques inhabituels, en forme de ruban, appelés R-bodies (« refractile bodies » de type 51), que l'on trouve chez de nombreuses espèces bactériennes, comme Caedibacter et Pseudomonas. Une attribution complète des signaux RMN des R-bodies a été réalisée en utilisant la RMN du solide avec rotation à l’angle magique à très grande vitesse. Un modèle structurel des monomères est établi et tient compte de leur changement conformationnel en fonction du pH, ainsi que de leur capacité à relarguer des biomolécules
I have worked on elucidating and studying biological nanomachines using mainly solid-state NMR (SSNMR): (i) The protein SesB found in Nectria haematococca whose assembly into amyloid fibrils is thought to be involved in programmed-cell death signalling mechanisms. Using magic-angle spinning SSNMR, a novel structural amyloid fold model for Nectria haematococca amyloid fibrils was established. (ii) Proteins called TasA, TapA, and CalY found in Bacillus subtilis and Bacillus cereus whose assembly into amyloid fibrils is involved in biofilm formation and integrity. Bacillus subtilis and its mutants have been studied using whole-cell SSNMR to understand the impact of biofilm matrix components deletion in the overall cell wall, and matrix composition. The protein TasA found in Bacillus subtilis has been observed to perturb liposomes as membrane models. (iii) HET-s, the well documented fungal functional amyloid, used here as a model system in a scheme to use the combined advantages of DNP, fast MAS, and spin dilution in the context of structural biology studies. A relevant use of DNP in combination with fast MAS and specific labelling has been proven to be a potential robust strategy for structural characterization of supramolecular assemblies. (iv) Unusual, ribbon-like protein polymers called R-bodies (Type 51 refractile bodies) found in many bacterial species, such as Caedibacter and Pseudomonas. A complete resonance assignment of R- bodies was achieved using very fast MAS SSNMR. A structural model of the monomers was established and accounts for their interesting pH-dependent switch, as well as the ability to deliver biomolecules

Chez les eucaryotes, les pores nucléaires (NPCs), ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN), régulent les échanges nucléocytoplasmiques. Ces complexes, très conservés, sont composés d’une trentaine de protéines appelées nucléoporines (Nups) présentes en multiples copies au sein de chaque NPC. Chez la levure S. cerevisiae, seules quatre Nups, dont la protéine Pom33, possèdent des domaines transmembranaires. Une étude réalisée en amont de ce projet a permis de caractériser Pom33 et de montrer que le mutant pom33∆ est viable et ne présente pas de défaut apparent de transport nucléocytoplasmique mais se caractérise par un défaut de distribution des NPCs. Pom33 joue également un rôle dans l’assemblage des pores nucléaires au sein de l’EN (biogenèse de novo des NPCs). POM33 appartient à une famille de gènes très conservés. Il possède un paralogue chez S. cerevisiae, PER33, qui code pour une protéine localisée majoritairement au réticulum endoplasmique et minoritairement aux NPCs et qui n’est pas impliquée dans la biogenèse des NPCs. Chez les mammifères, il n’existe qu’un homologue de Pom33/Per33, TMEM33. Dans le cadre de ce doctorat, nous nous sommes demandés quels étaient les déterminants contribuant à l’adressage spécifique de Pom33 au niveau des NPCs et à sa fonction dans la biogenèse de ces structures. La purification de Pom33-ProtA, suivie de spectrométrie de masse, nous a permis d’identifier un nouveau partenaire de Pom33, le facteur d’import Kap123. Des approches in vitro ont montré une interaction directe entre Kap123 et le domaine C-terminal (CTD) de Pom33, qui est perturbée en présence de RanGTP. Par ailleurs, des prédictions in silico ont révélé la présence dans ce domaine CTD de deux hélices amphipathiques, conservées chez l’humain. Des analyses par dichroïsme circulaire et flottaisons ont confirmé la capacité du CTD à s’organiser en hélice en présence de membranes lipidiques et à interagir préférentiellement avec les membranes très courbées. L’expression d’une version mutée de Pom33-CTD, incapable de se lier aux membranes et couplée à la GFP, a révélé la capacité de ce domaine à agir comme un NLS, importé spécifiquement dans le noyau par Kap123. Alors que la délétion du domaine CTD affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs, la mutation des résidus basiques impliqués dans l’interaction avec Kap123 ou des résidus permettant sa liaison aux membranes lipidiques ne récapitule pas ce phénotype. En revanche, la perte combinée de ces deux déterminants affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs ainsi qu'une interaction génétique avec le mutant nup133∆, impliqué dans la biogenèse de novo des NPCs. Les résultats obtenus lors de cette étude indiquent donc que l’adressage de Pom33 est un mécanisme actif et multifactoriel, qui met en jeu au moins deux déterminants dans son domaine CTD. Ces données indiquent également un rôle de ce domaine dans la biogenèse de novo des NPCs, qui pourrait néanmoins n’être qu’un effet indirect de son rôle dans l’adressage de Pom33 aux NPCs. Au cours de cette étude, nous avons également mis en évidence d’autres partenaires potentiels de Pom33, en particulier Myo2, une localisation de Pom33 au niveau du bourgeon lors de la division et une interaction génétique entre POM33 et KAP123. Ces observations préliminaires ouvrent de nouvelles pistes de réflexion quant au rôle de Pom33 lors de la division cellulaire
In eukaryotic cells, nucleocytoplasmic exchanges take place through the nuclear pores complexes (NPCs). These conserved macromolecular assemblies are embedded in the nuclear envelope (NE) and composed of ~30 distinct proteins called nucleoporins (Nups), each presents in multiple copies. In the budding yeast Sacharomyces cerevisiae, there are only four transmembrane Nups, including Pom33. A previous study leds to the characterization of Pom33 and revealed that pom33∆ mutant cells, although viable and without apparent alteration in nucleocytoplasmic transport, display NPCs distribution defect. Pom33 also contributes to the biogenesis of NPCs into the intact NE (de novo biogenesis). Pom33 is highly conserved among species and has a paralogue in S. cerevisiae, Per33, which can associate with NPCs but is mainly localized at the endoplasmic reticulum (ER) and NE. Unlike Pom33, Per33 is not involved in NPCs distribution and biogenesis. In mammalian cells, there is a unique homologue of Pom33/Per33, named TMEM33. In the context of this thesis, we aimed to identify the determinants involved in the specific targeting of Pom33 to NPCs and in its function in pore biogenesis. To characterize these determinants, we first performed affinity-purification experiments followed by mass spectrometry analyses. This identified a novel Pom33 partner, the nuclear import factor Kap123. In vitro experiments revealed a direct interaction between Pom33 C-terminal domain (CTD) and Kap123 that involves positively-charged residues within Pom33-CTD and is altered in the presence of Ran-GTP. Moreover, in silico analyses predicted the presence of two evolutionarily-conserved amphipathic ~-helices within Pom33-CTD. Circular dichroism studies and liposome co-floatation assays confirmed that this CTD domain is able to fold into ~-helices in the presence of liposomes and revealed its preferential binding to highly curved lipid membranes. When expressed in yeast, under conditions abolishing Pom33-CTD membrane association, Pom33-CTD behaves as a Kap123-dependent nuclear localization domain. While deletion of Pom33 C-terminal domain (Pom33-∆CTD-GFP) impairs Pom33 NPC targeting and stability and leads to a NPC distribution phenotype, mutants affecting either Kap123 binding or the amphipathic properties of the ~-helices do not display any detectable defect. However, combined impairment of lipid and Kap123 binding affects Pom33 targeting to NPCs and leads to an altered NPC distribution and a genetic interaction with the deletion of NUP133, a gene coding for a nucleoporin involved in NPCs biogenesis. Together, these results indicate that Pom33 targeting to NPCs is an active and multifactorial process that requires at least two determinants within its CTD. They also suggest a role of Pom33-CTD in the de novo NPCs biogenesis process, which could however only be an indirect consequence of its requirement for Pom33 targeting to NPCs. Our mass spectrometry analysis also identified other partners of Pom33, in particular Myo2, a molecular motor required for the cell cycle-regulated transport of various organelles and proteins and for correct alignment of the spindle during mitosis. Our studies also revealed a specific localization of Pom33 at the bud tip during mitosis and a genetic interaction between POM33 and KAP123. Taken together, these preliminary observations open new perspectives regarding additional functions of Pom33 during cell division

L'attribution des frequences rmn aux differents noyaux constitue la premiere partie d'une etude structurale et dynamique d'une proteine par rmn. La majeure partie des developpements methodologiques presentes dans ce travail contribue a l'optimisation de cette tache souvent laborieuse, dont la strategie generale est maintenant bien etablie. Dans le cas des proteines non enrichies en isotopes stables (#1#5n, #1#3c), ce sont les experiences de la rmn du #1h (tocsy, cosy et noesy) qui permettent d'effectuer l'attribution des resonances. Un nouveau schema d'edition de frequences a bande selective est presente et applique dans les differentes experiences de correlation #1h-#1h. Puis, une nouvelle experience hosqc est proposee pour obtenir des pics de correlation de type cosy en phase. Ensuite, l'apport d'une experience de correlation #1h-#1#3c pour une attribution #1h plus complete et plus fiable est demontre. Pour l'etude de proteines de taille intermediaire (100-150 residus) enrichies en isotopes stables #1#5n et #1#3c, nous avons developpe une serie d'experiences triple-resonance (#1h, #1#5n, #1#3c) a deux dimensions fournissant la meme information que les versions 3d initialement proposees en un temps reduit et/ou avec une meilleure resolution digitale. De plus, un programme d'attribution automatique (alps) a ete concu pour leur interpretation. Cette nouvelle approche permet d'accomplir l'attribution des resonances de la chaine peptidique en quelques semaines. Pour l'etape suivante la determination de contraintes experimentales dans le but d'une modelisation de la structure tridimensionnelle en solution nous avons developpe de nouvelles experiences 3d-mq noesy doublement filtrees par les deplacements chimiques de deux heteronoyaux (#1#3c, #1#5n). Un jeu de distances interprotons permettant le calcul ab initio d'une premiere structure du ferrocytochrome c#2 de rhodobacter capsulatus a pu en etre extrait de maniere semi-automatique

Les microARNs sont une classe de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes via un mecanisme d'interference par ARN. Les microARNs humains sont produits par une série de réactions enzymatiques. En particulier, dans le cytoplasme le precurseur de miRNA (pre-miRNA) est reconnu et clivé par un complexe contenant l'enzyme RNAse III Dicer et plusieurs cofacteurs protéiques. La proteine TRBP (HIV TAR RNA binding protein) est l'un de ces cofacteurs et augmente la stabilité du complexe, influe sur la cinétique, la position du clivage et a role potentiel dans la reconnaissance du substrat et dans le transfet du produit vers le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) effecteur de l'interference par ARN. TRBP est composé de 3 domaines de liaison aux ARN doubles brin (dsRBDs). La région d'interaction de TRBP avec les ARNs est composé des deux premiers dsRBDs liés par une région interdomaine non charactérizée. La présente étude rapporte la caractérisation biophysique in vitro de la région d'interaction avec les ARNs de TRBP dans l'état apo de TRBP ou dans l'état lié avec les deux precurseurs cytoplasmique successifs du microARN oncogène miR-155 comprenant la tige boucle pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* résultat du clivage de pre-miR-155 par Dicer. L'étude montre que la région d'intéraction de TRBP avec les ARNs est monomerique, est composée de deux dsRBDs independants en solution et que la région interdomaine de 60 résidus est flexible. Le premier dsRBD, non caractérisé précédement en solution est le siège d'un equilibre plié/déplié integral dans une grande gamme de conditions physico-chimiques. Les deux premiers dsRBDs de TRBP peuvent interagir avec un même precurseur de microARN et deux régions d'interaction de TRBP avec les ARNs peuvent interagir avec un même precuseur. La région d'interaction de TRBP avec les ARNs interagit avec pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* avec des affinités très similaires. Dans le complexe avec une région d'interaction de TRBP avec les ARN liée à pre-miR-155 ou au duplexe miR-155/miR-155*, aucune indice de contact entre les deux dsRBDs n'a été detecté et la protéine interagit avec les deux precurseurs par la même surface d'interaction. Les informations récoltées suggèrent que TRBP peut jouer un rôle avant et après le clivage des pre-miARN par Dicer, notamment dans le complexe de chargement de RISC.

La Beta-2-microglobuline est une protéine de 12kDa, impliquée dans une maladie dûe à un mauvais repliement: l'amylose liée à la dialyse. Elle constitue donc un modèle pour la formation de fibrilles amyloides et pour le repliement des protéines. La B2M est un objet à la fois difficile et fructueux à étudier. La production de B2M est complexe et demande une optimisation important pour obtenir une protéine correctement repliée et atteindre des rendements approprié pour des études de RMN et SAXS. Le repliement de la B2M est sensible au solvent, à la température, à la concentration et souvent aux conditions de préparation. Pourtant notre étude, à l'aide de plusieurs méthodes biophysiques, a pu révéler plusieurs faits essentiels de son mécanisme de repliement et de la structure et propriétés des intermédiaires. Un premier résultat est que le repliement et l'oligomérisation sont deux processus concourants. Une découverte majeure est l'existence d'un équilibre monomère oligomère entre deux états I1 et I2 intermédiaires du repliement. Détecté indirectement à l'aide de RMN temps réel comme SOFAST, I2 a été directement charactérisé en SAXS: Il s'agit probablement d'un dimère. Les états intermédiaires de repliement de B2M avaient été pointés comme favorisant la formation de fibrilles: cela s'explique facilement avec l'existence d'un intermédiaire dimérique. Une combinaison de méthodes biophysiques permet la caractérisation de cet équilibre monomère-oligomère. En SAXS, puis confirmé en RMN, la stoichiométrie de l'équilibre est celle d'un monomère-dimère. Des travaux complémentaires utilisant les techniques développées pour cette étude pourront servir à caractériser plus finement cet équilibre. L'étude approfondie du repliement de B2M pousse les techniques biophysiques dans leurs retranchements: la sensibilité et le temps d'acquisition pour la RMN, la polydispersité pour le SAXS. Pourtant dans les deux cas un grand oligomère I3, qui disparait en quelques minutes, a pu être détecté, ce qui fut confirmé par UV-Fluo. La caractérisation d'I3 demandera des dévelopements méthodologiques supplémentaires, ainsi qu'un nouveau plan d'expérience. D'autres méthodes comme la spectrométrie de masse nano-ESI pourraient représenter des sources d'information utiles. S'attaquer aux limites des méthodes biophysiques pousse au développement méthodologique. Ainsi pour étudier la structure et dynamique d'I1, la méthode d'acquisition continue des données a permis l'attribution des résonnances de cette espèce qui a une demi vie de quelques dizaines de minutes. Un échange conformationnel a été découvert pour l'état I1 du mutant W60G, en développant une méthode de relaxation RMN: R2-BEST-TROSY. Les méthodes développées pour cette étude pourront servir des études sur le repliement d'autres protéines, mais aussi dans d'autres contextes où la demi-vie des objets étudiés est courte, comme dans les expérience RMN intracellulaires. Cette étude est évidemment éloignée d'une application directe dans le combat contre les maladies du mauvais repliement des protéines. Pour autant, la découverte d'états intermédiaires oligomériques souligne que l'oligomérisation et le repliement ne devraient pas être étudiés séparément, mais sont des processus liés. Les développements méthodologiques de cette étude pourront aussi être appliqués à d'autres protéines comme à d'autres contexte. Il est donc permis d'espérer que ces questionnements et développements permettront d'avancer vers une meilleure compréhension de ces maladies.

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) à l’état solide avec rotation à l’angle magique (MAS) est une technique de choix pour l’étude de la structure et de la dynamique de molécules biologiques peu ou non solubles. Un grand nombre d’approches ont été développées pour la reconstitution de structures tridimensionelles à partir de mesures précises de proximités internucléaires, ainsi que pour la détection de mouvements moléculaires avec une résolution atomique sur des échelles de temps couvrant plusieurs ordres de grandeur. Malgré d’impressionnants progrès, les études par RMN MAS sont cependant loin d’être réalisées en routine. Les déterminations structurelles et de dynamique sont souvent démontrées sur des préparations microcristallines modèles, mais sont encore rares pour des systèmes plus complexes tels que les fibrilles amyloïdes non cristallines ou les protéines trans-membranaires insérées dans des bi- couches lipidiques. Mon travail a pour objectif d’étendre les possibilités de la RMN MAS pour l’étude de systèmes biomoléculaires complexes dans différents états d’agrégation. Pour cela, j’ai exploité les possibilités uniques offertes par les hauts champs magnétiques (fréquence de Larmor du 1H 700, 800 et 1000 MHz) combinés avec les sondes MAS de dernières générations capables d’atteindre des vitesses de rotations supérieures à 60 kHz. Ces conditions expérimentales per- mettent d’augmenter la sensibilité de la RMN MAS à l’aide de la détection 1H à haute résolution et d’enrichir la palette de paramètres RMN rapporteurs de la dynamique des protéines. La première partie de cette thèse décrit le développement de nouvelles stratégies pour l’attribution des résonances du squelette de protéines, pour l’élucidation de structures, et pour l’étude de la dynamique du squelette peptidique et des chaînes latérales. Les méthodes présentées réduisent significative- ment les besoins en termes de temps expérimental, de quantités d’échantillon et de marquage isotopique, et permettent d’analyser par RMN des systèmes de plus hauts poids moléculaire. La seconde partie décrit l’application de la RMN MAS avec détection en 1H pour l’évaluation du rôle de la dynamique des protéines dans des processus tels que la formation de fibrilles amyloïdes et le fonctionnement de protéines membranaires. Une première application est l’étude de la tendance de la β-2 microglobuline humaine à former des fibrilles amyloïdes. Une comparaison de la dynamique du squelette peptidique de la protéine sauvage et du mutant D76N dans leur forme cristalline, ainsi que la détermination de propriétés structurales de la forme fibrillaire m’ont permis d’identifier la présence de repliements pathologiques et de formuler des hypothèses sur le mécanisme de formation des fibrilles. Finalement, la dynamique locale et globale de protéines membranaires dans des bicouches lipidiques a été étudiée. En particulier, le mécanisme d’action d’un transporteur d’alkanes, AlkL, de P. putida a été examiné dans un environnement lipidique. La détermination de paramètres pour la dynamique rapide (ps-ns) et lente (μs-ms) du squelette peptidique de la protéine en présence ou en absence de substrat met en évidence des acheminements possibles pour le transfert de molécules vers la membrane et jette les bases pour une meilleure compréhension du processus
Solid-state NMR with magic angle spinning (MAS) has emerged as a powerful technique for investigating structure and dynamics of insoluble or poorly soluble biomolecules. A number of approaches has been designed for reconstructing molecular structures from the accurate measurement of internuclear proximities, and for probing motions at atomic resolution over timescales spanning several orders of magnitude. Despite this impressive progress, however, MAS NMR studies are still far from routine. Complete determinations, which are often demonstrated on model microcrystalline preparations, are still rare when it comes to more complex systems such as non-crystalline amyloid fibrils or transmembrane proteins in lipid bilayers. My work aimed at extending the possibilities of MAS NMR for applications on complex biomolecular systems in different aggregation states. For this, I exploited the unique possibilities provided by high magnetic fields (700, 800 and 1000 MHz 1H Larmor frequency) in combination with the newest MAS probes capable of spinning rates exceeding 60 kHz. These experimental conditions al- low to boost the sensitivity of MAS NMR through 1H detection at high resolution and to enrich the palette of probes for protein dynamics. The first part of the thesis reports on my contribution to the development of new strategies for backbone resonance assignment, for structure elucidation, and for investigation of backbone and side-chain dynamics. These methodologies significantly reduce the requirements in terms of experimental time, sample quantities and isotopic labeling, and enlarge the molecular size of systems amenable to NMR analysis. The second part describes the application of 1H detected MAS NMR to evaluate the role of protein dynamics in problems such as amyloid fibril formation and membrane protein function. I first addressed the amyloid fibril formation propensity of human beta-2 microglobulin, the light chain of the major histocompatibility complex I. I performed comparative studies of backbone dynamics of the wild type protein as well as a D76N mutant in crystals, and determined some of the structural features of the fibrillar form. This allowed to identify the presence of pathological folding intermediates and to formulate hypotheses on the mechanism of fibrils formation. Finally, I studied the local and global dynamics of membrane proteins in lipid bilayers. In particular, I investigated the mechanism of action of the alkane trans- porter AlkL from P. putida in lipid bilayers. The measurement of parameters for fast (ps-ns) and slow (μs-ms) backbone dynamics of the protein in presence or in absence of a substrate highlights possible routes for molecular uptake and lays the basis for a more detailed mechanistic understanding of the process

Le cuivre est un microélément essentiel puisqu’il participe à de nombreux processus cellulaires. Il peut également être une arme cytotoxique s’il se retrouve en excès par rapport aux besoins cellulaires. Il est nécessaire et vital pour les organismes de réguler sa concentration cellulaire. CopI est une protéine de 15 kDa qui a été identifiée chez Rubrivivax gelatinosus. Cet organisme est dépourvu du mécanisme de résistance au cuivre qui implique la cuivre oxydase CueO et le système CusCFBA et a donc développé un nouveau mécanisme de résistance. Il a été montré que CopI est impliquée dans ce nouveau mécanisme. Elle est aussi retrouvée dans des bactéries pathogènes pour l’Homme qui ne possède pas le système de résistance classique, et d'autres qui possède les deux systèmes. Cette protéine appartient à la famille des cuprédoxines et peut fixer trois ions Cu(II) dans : un site N-terminal de géométrie plan-carrée, un site cuprédoxine, et un site supposé localisé dans une région très conservée riche en histidines et méthionines. La délétion de ces derniers sites induit la perte de la résistance au cuivre tandis que la délétion du site N-terminal n’a pas d’effet. Cependant le mécanisme d’action et la structure de cette protéine ne sont pas connus. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la fixation du Cu(I) et du Cu(II) à la protéine sauvage et à différents mutants et les transferts d’électron possibles. Mes résultats suggèrent que CopI joue un rôle dans l’oxydation du Cu(I) périplasmique très toxique. Je me suis également attelée à la détermination de la structure en solution de CopI par RMN ainsi qu’à l’étude de la géométrie locale du site cuprédoxine par spectroscopie RPE avancée
Copper is an essential microelement as it participates in many cellular processes but can also be a cytotoxic weapon if found in concentrations higher than the cellular needs. It is therefore necessary and vital for organisms to control its cellular concentration. CopI is a 15 kDa protein that was identified in a photosynthetic purple proteobacterium, Rubrivivax gelatinosus. This organism lacks the well-known copper resistance mechanism involving the copper oxidase CueO and the export system CusCFBA and therefore has developed a new resistance mechanism. It was shown that CopI is directly involved in this new mechanism. CopI is also found in human pathogenic bacteria such as Vibrio cholerae, which also lacks the classical resistance system, and Pseudomonas aeruginosa, which has both systems. It has been shown that this protein belongs to the cupredoxin family and can bind up to three Cu(II) ions in: a cupredoxin site, a N-terminal site with square-planar geometry and a site assumed to be located in the highly conserved histidine/methionine rich region. The deletion of the cupredoxin or the His/Met site induces the loss of copper resistance in the bacterium while the deletion of the N-terminal site has no effect. However, the mechanism of action and the structure of the protein remain unknown. During my PhD, I studied the Cu(II) and Cu(I) binding on the native protein and different mutants and the possible electron transfers. My results suggest that CopI plays a role in the oxidation of periplasmic Cu(I). I have also worked on determining the structure of CopI in solution by NMR as well as studied the local geometry of the cupredoxin site by advanced EPR spectroscopy