Academic literature on the topic 'Protéines fluorescentes – Propriétés mécaniques'

Depuis la découverte de la protéine fluorescente verte (GFP), celle des protéines fluorescentes photoactivables (PAFPs) a initié une révolution dans le domaine de la technologie des FP. Certaines PAFPs sont capables d'être irréversiblement photo converties d'une couleur à une autre alors que d'autres peuvent être réversiblement commutées entre des formes allumées ou éteintes. Ces protéines son intensivement employées dans les techniques de microscopie optique, particulièrement en "nanoscopie" qui permet d'atteindre une résolution optique 1 0 fois meilleure que la limite d'Abbe. Afin de développer plus en avant ces techniques, la nécessité d'obtenir des sondes fluorescentes plus lumineuses pouvant se photoconvertir ou se photocommuter efficacement est cruciale. En même temps, les marqueurs fluorescents doivent être monomériques et photostables. Pour mieux comprendre les mécanismes des phototransformations des PAFPs, trois membres de la famille ont été étudiés: EosFP, Dendra2 et IrisFP. Le phénomène de photoconversion du vert au rouge de photocommutation réversible et de photoblanchiment ont été étudiés grâce à une combinaison de cristallographie des rayons X et dl microspectrophotométrie, en utilisant le laboratoire Cryobench de l'ESRF/IBS. Les résultats nous ont permis de proposer un mécanisme de photoconversion pour EosFP et Dendra2 et de découvrir et caractériser IrisFP, première PAFP combinant à la fois les propriétés de photoconversion et de photocommutation. Les modifications structurales du chromophore associées à la formation d'un état radicalaire induit par les rayons X, probablement impliqué dans la voie de photoblanchiment des P AFPs, ont aussi été caracterisées<br>Since the discovery of the green fluorescent protein (GFP), the one of photoactivatable fluorescent proteins (P AFPs), notably from Anthozoan species, triggered a revolution in the field of FP technology. Sorne PAFPs are capable of being irreversibly photoconverted from a green- to a red-emitting form while other ones can be reversibly switched on and off, depending on specific excitation wavelengths. These proteins are being extensively used in optical microscopy techniques, particularly in "nanoscopy", which pro vides optical resolution 10 fold beyond the Abbe limit. Ln order to further develop these techniques, notably in term of time-resolution, the need to obtain brighter fluorescent probes that photoconvert or photoswitch efficiently is crucial. At the same time, fluorescent highlighters generally need to be monomeric and photostable. Ln order to better understand the mechanisms of phototransformations in PAFPs, three members of the family have been studied: EosFP, Dendra2 and IrisFP. The phenomena of green-to-red photoconversion, reversible photoswitching and non-reversible photobleaching have been studied by a combination of X-ray crystallography and microspectrophotometry using the Cryobench laboratory of the ESRF/IBS. Together, the results have a\lowed us to propose a mechanism for the photo conversion of EosFP and Dendra2 and to discover and characterize IrisFP, the first PAFP combining both properties of photoconversion and photoswitching. The structural modifications of the chromophore associated with an X-ray induced radical state, likely to be involved in thé photobleaching pathway of PAFPs, were also characterized

Les protéines fluorescentes sont très largement utilisées dans les études de biologie moléculaire depuis maintenant une vingtaine d’année. Pour autant, l’origine de leurs propriétés photophysiques n’est pas totalement élucidée. Dans cette thèse, nous avons essayé d’améliorer la compréhension de la photophysique de deux protéines fluorescentes particulières : Padron et EosFP.Dans la protéine Padron, nous avons étudié l’isomérisation du chromophore et cherché à déterminer si la protonation et l’isomérisation sont simultanées ou successives. Pendant l’isomérisation, le donneur de proton potentiel est le résidu Tyr159. Nous avons d’abord montré que dans le vide, le transfert de proton est peu probable quelle que soit la géométrie du chromophore. Dans la protéine (où l’effet de l’environnement n’est pas négligeable) nous avons mis en évidence par dynamique moléculaire que, durant l’isomérisation, le transfert de proton n’est presque jamais favorable et reste donc un marginal.Par ailleurs, ces mêmes dynamiques ont montré que, à la fin de l’isomérisation, il apparaît de nombreux chemins de molécules d’eau reliant le chromophore au solvant et pouvant permettre un transfert de proton. On conclut doncque l’isomérisation et la protonation ne sont pas simultanées mais successives.Dans le cas de la protéine EosFP, nous avons analysé l’effet d’une molécule d’eau présente dans une partie des structures cristallines. Les dynamiques avec le chromophore à l’état fondamental ont montré que cette molécule ne joue pas de rôle, que ce soit sur le réseau de liaison hydrogène ou sur le spectre d’absorption. Par contre, à l’état excité, les dynamiques ont montré que l’extinction de fluorescence est beaucoup plus rapide sans la molécule d’eau qu’en sa présence.Par ailleurs, ces dynamiques ont mis en évidence que la protéine bloque souvent le chromophore dans des géométries où il ne peut pas retourner à l’état fondamental ni par fluorescence, ni par conversion interne. Ces géométries « noires» jouent un rôle important dans la photophysique.Pour tenir compte de ces géométries, nous avons calculé le rendement quantique et le temps de vie de fluorescence par intégration directe le long des trajectoires et par cinétique chimique. Dans les deux cas, nous avons obtenu un accord qualitatif avec l’expérience<br>Fluorescent proteins are widely used in biology studies since 20 years. Yet, the origin of their photophysical properties aren’t totally explained. Here, we try to improve the understanding of two particular fluorescent proteins: Padron and EosFP.In the protein Padron, we work on the isomerization of chromophore and try to determine whether isomerization and protonation are simultaneous or successive processes. During the isomerization, the potential donor is Tyr159.First, we show that, in vacuum, the proton transfer is quite unlikely whatever the chromophore geometry.In the protein (where the environment effect isn’t negligible) we evidence with molecular dynamics that, during isomerization, proton transfer stays marginal.In addition, these dynamics shown the appearance, at the end of isomerization, of a lot of water molecules channel between the chromophore and the solvent allowing a proton transfer. We conclude that isomerization and protonation are successive processes.In the case of the protein EosFP, we first analyze the effect of a water molecule which is found only in some of the crystallographic structures.Molecular dynamics of the protein with the chromophore in the ground state show that the water molecule doesn’t play any role neither in the hydrogen bond network nor in the absorption spectra.On the contrary, in the excited state, dynamics without this water show a significant faster decay of fluorescence that those with the molecule.In addition, those dynamics have demonstrate that during long period, the protein retains the chromophore in geometries in which it is unable to convert to the ground state, neither by fluorescence nor by internal conversion. Those “dark” geometries play a crucial role in the photophysics.To take them into account, we calculate the quantum yield and the fluorescence lifetime by direct integration along trajectories and by a kinetic scheme. We obtain a good qualitative agreement with the two methods

Du fait de leur importance pour la fonction, les propriétés mécaniques des protéines font aujourd'hui l'objet d'une attention toute particulière. Nous avons utilisé divers outils de la modélisation moléculaire afin d'améliorer notre compréhension de ces propriétés. Nous avons étudié, par le biais de simulations de dynamique moléculaire, la dynamique de molécules d'adhésion cellulaire, les E-cadhérines. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à l'influence des ions calcium sur la flexibilité de la molécule et sur la dimérisation. Nous avons également étudié les trois formes dimériques observées expérimentalement et discuté leur rôle potentiel dans les phénomènes d'adhésion. Nous avons par ailleurs développé divers outils méthodologiques pour l'étude des protéines. Le premier consiste en une nouvelle mesure de la flexibilité des protéines à l'échelle du résidu, obtenue par des minimisations d'énergie sous contrainte. Cette méthode permet en outre de repérer des domaines dynamiques au sein des architectures protéiques par l'étude des déformations engendrées lors de l'application des contraintes. Nous avons également développé un nouveau modèle de représentation des protéines à mi-chemin entre la représentation "tout-atome" et les représentations "gros grains", qui devrait permettre l'étude de systèmes de grande taille en conservant une précision atomique dans les zones les plus importantes de la protéine<br>Due to their importance for function, the mechanical properties of proteins are the subject of great attention. We have used molecular modeling techniques to gain a better understanding of these properties. We have notably used molecular dynamics simulations to study the dynamics of E-cadherin molecules which are involved in cellular adhesion. The influence of the presence of calcium ions has been monitored in the context of the change in flexibility and dimerisation. We have also examined three dimeric conformations observed experimentally and discussed their potential involvement in adhesion. We have also developed various methodological tools for the theoretical study of proteins. The first is a new index to measure protein flexibility at the single amino acid level, via the use of restrained energy minimisations. This method also allows us to determine dynamical domains within protein structures by analyzing the deformations caused by the restraints. We have also developed a new multi-scale representation of proteins, containing both coarse-grained and all-atom residues. This representation should allow us to study large Systems while keeping atomic precision within the most important parts of the protein

La bêta-lactoglobuline est une protéine globulaire présente dans le sérum du lait. Quand une solution de bêta-lactoglobuline est chauffée les protéines se dénaturent ce qui conduit à leur agrégation. Si la concentration de protéines est plus grande qu'une valeur critique un gel est formé. Le processus d'agrégation et de gélification dépend beaucoup des conditions externes comme la concentration de sel ajouté ou le pH. Cette influence peut être expliquée par des interactions électrostatiques. En effet la bêta-lactoglobuline comme les protéines en générales est un polyélectrolyte dont la densité de charges dépend du pH. Par conséquent les interactions électrostatiques dépendent du pH, mais également de la concentration en sel puisque celui-ci peut les écranter. L'objective de cette thèse est d'étudier l'influence des interactions électrostatiques sur la structure des agrégats et des gels de bêta-lactoglobuline et sur leurs propriétés mécaniques. Cette étude revêt un aspect fondamental parce que la bêta-lactoglobuline peut être considérée comme une protéine globulaire modèle. Mais l'étude a aussi un but applicatif puisque la bêta-lactoglobuline est le composant protéique majeur du lactosérum et est de ce fait beaucoup utilisée dans l'industrie agro-alimentaire. La structure des agrégats et des gels a été caractérisée par diffusion de rayonnement et microscopie confocale. Les résultats principaux sont que la structure des agrégats est peu influencée par les interactions électrostatiques, mais que la structure du gel en dépend très fortement. Par exemple l'aspect visuel des gels change de transparent comme l'eau à pH 6. 2 à opaque comme le lait à pH 5. 8. La diminution de la répulsion électrostatique via la diminution du pH ou via l'augmentation de la concentration en sel rend la structure des gels plus hétérogènes. Elle influence aussi leur module élastique. Par contre, la variation des propriétés mécaniques des gels ne peut pas être corrélée à la variation de leur structure.

Mes travaux de recherche portent sur le développement de modèles gros-grains et d'algorithmes pour l'étude des propriétés mécaniques des protéines et des interactions protéine-protéine. Sur le plan mécanique, le programme ProPHet (Probing Protein Heterogeneity) permet de sonder la rigidité protéique à l'échelle du résidu et d'étudier la réponse d'un système moléculaire soumis à une déformation anisotrope. Cette réponse mécanique peut être mise en rapport avec les propriétés structurales de la protéine concernée (notamment j'agencement de ses différents éléments de structure secondaire), mais aussi avec son fonctionnement biologique (comme l'activité enzymatique. Du point de vue des interactions protéine-protéine, l'analyse des résultats des calculs effectués avec le programme MAXDo (Macromolecular Association via Cross-Docking) sur une grille d'internautes )(WorldCommunityGrid) permet mieux comprendre la spécificité des phénomènes de reconnaissance protéique

La Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) est un variant spectral de la Green Fluorescent Protein extraite de la méduse Aequaria Victoria (GFPav). La ECFP, émettant dans le cyan, est un des donneurs les plus utilisés dans les études de transfert résonnant d'énergie d'excitation et est integré dans de nombreuses constructions de biosenseurs. Pourtant, elle souffre de nombreux inconvenients. Notamment elle pésente des propriétés photophysiques complexes et une forte sensibilité environnementale qui sont des freins à une interprétation quantitative de ses signaux de fluorescence en imagerie cellulaire. Notre objectif vise à mettre au point, grâce à l'introduction d'un minimum de mutations, un dérivé de la ECFP présentant des propriétés d'émission simplifiées et performantes ainsi qu'une faible sensibilité environementale. Des mutations ont été introduites, par mutagenèse dirigée, à deux positions clefs de la séquence peptidique de la ECFP ce qui a permis de générer des dérivés présentant des propriétés photophysiques et une sensibilité au pH modulées. En particulier, nous avons réussit à générer une protéine fluorescente, l'Aquamarine, aux propriétés photophysiques quasi-idéales caractérisée par un rendement quantique de l'ordre de 0,9 et des déclins d'émission de fluorescence quasi-monexponentiels. Elle présente également une sensibilité au pH fortement réduite avec un pH de demi-transition acide de 3,3.Ce manuscrit présente l'étude détaillée des propriétés d'émission de fluorescence des diverses protéines générées. Plusieurs paramètres présentant un intérêt particulièrement important pour une utilisation adéquate en imagerie de fluorescence ont été évalués. Outre la sensibilité au pH établie sur une large gamme de pH (2,5-11), une attention particulière a été portée sur les performances photophysiques (monoexponentialité du déclin d'émission de fluorescence, durée de vie moyenne, rendement quantique, brillance,...) de ces dérivés. De plus, grâce à des expériences de dichroïsme circulaire, des informations sur les changements structuraux, dont ces dérivés sont le siège à pH très acide, ont été obtenues. Enfin, l'examen détaillé des données spectroscopiques stationnaires et résolues en temps a permis de mettre en lumière l'existence de plusieurs espèces émissives contribuant à la photophysique de ces protéines et à l'origine de leur transition acide. L'ensemble de ces résultats constitue une première approche pour une meilleure compréhension de la relation structure-photophysique-dynamique de la ECFP et de ces dérivés.

Le diabète est associé à divers types de complications au niveau vasculaire affectant la micro et la macro-vasculature, ce qui contribue à l'augmentation de l'incidence d'infarctus du myocarde, d'ACV, de néphropathie et de rétinopathie. Parmi les mécanismes expliquant l'apparition de ces complications, la glycation des protéines joue un rôle important. En effet, il est connu que la glycation des protéines de la matrice extracellulaire (élastine, collagène) affecte les propriétés mécaniques des tissus constitués de celles-ci. Nous pensons que la glycation des protéines du cytosquelette peut également affecter les propriétés mécaniques de cellules présentes au niveau de la vasculature, telles que la cellule du muscle lisse vasculaire ou la cellule endothéliale, et ainsi affecter les fonctions cellulaires dépendantes d'une réorganisation du cytosquelette, telles que la contraction cellulaire. Le glyoxal (GO) est un composé hautement réactif de la famille des oxoaldéhydes, considéré comme un puissant agent de glycation au niveau cellulaire, puisqu'il réagit rapidement avec les groupements amines des protéines de façon à former des produits de glycation avancés (PGA). L'étude présentée dans cette thèse démontre d'une part que l'exposition à cet agent de glycation entraîne une augmentation de la rigidité cellulaire ainsi qu'une augmentation de la réponse contractile cellulaire générée par la machinerie actomyosine, en réponse à l'AngII. À la lumière de ces résultats, nous proposons qu'une exposition au GO peut induire des modifications post-traductionnelles de type non-enzymatique des protéines impliquées dans la machinerie contractile et ainsi altérer la fonction contractile cellulaire. C'est pourquoi nous avons en second lieu évalué la glycation de trois protéines impliquées dans la machinerie contractile (actine, ROCK, gelsoline) par un essai basé sur la réaction d'une sonde fluorescente et perméable à la membrane cellulaire, soit le carboxyfluorescéine diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE), avec les amines primaires des protéines. Par cet essai, nous avons observé une augmentation de la glycation de l'actine et de ROCK, de même qu'une augmentation de l'interaction entre l'actine et la GSN. Cette thèse montre également l'implication de l'activité kinase de ROCK dans l'amplification de la réponse contractile, suggérant que la glycation de ROCK pourrait moduler son activité. En conclusion, la modification des protéines cellulaires par le GO pourrait affecter leurs fonctions et propriétés mécaniques, notamment par la modulation d'importantes interactions protéine-protéine impliquées dans la contraction cellulaire et dans l'organisation du cytosquelette.

Les canaux mécanosensibles de large conductance (MscL) sont des protéines membranaires intégrales permettant à la bactérie de survivre lors de chocs hypo-osmotiques. Leur principale caractéristique est de s'ouvrir en réponse à un stress mécanique : une tension de la membrane. La compréhension de leur mode d'activation est un prérequis pour élaborer un modèle global de la sensibilité à la tension membranaire. Nous avons étudié les premières étapes du mécanisme d'ouverture du MscL induites par une diminution de l'épaisseur membranaire, ainsi que les interactions gouvernant ces changements conformationnels par des simulations de dynamique moléculaire. La comparaison des analyses en composantes principales des trajectoires et en modes normaux nous a permis de mettre en évidence l'influence de la membrane sur la dynamique intrinsèque du canal. Nous avons ensuite étudié des canaux MscL issus de différents organismes et présentant des sensibilités mécaniques différentes. Des différences significatives de comportement des deux systèmes plongés dans des membranes d'épaisseur variable ont été mises en évidence. Ces différences nous ont conduits à exploré le rôle des différentes régions et notamment le rôle des boucles périplasmiques en construisant des canaux hybrides par combinaison de régions provenant d'organismes différents. Les résultats obtenus confirment le rôle primordial des boucles périplasmiques dans la sensibilité du MscL<br>Mechanosensitive channels of large conductance are integral membrane proteins that permit the bacterium to survive when hypo-osmotic shock occurs. Their principal characteristic is to open in response to a mechanical stress : a tension of the membrane. Understanding their mode of activation is necessary to work out a global model of the mechanism of sensitivity to membrane tension. We studied the first stages of the gating mechanism of MscL induced by membrane thinning, as well as the interactions controlling these conformational changes by moleculardynamics simulations. The comparison of principal component analysis of the trajectories and the directions given by the normal modes enabled us to highlight the influence of the membrane on the intrinsic dynamics of the channel. We then studied MscL channels from various organisms and having different sensitivities. Significant differences between the behaviours of the two Systems plunged in membranes of variable thickness were highlighted. These differences led us to explore the role of the various domains and in particular the role of the periplasmic loops by building hybrid channels by combination of domains from different organisms. The results obtained confirm the fundamental role of the periplasmic loops in the sensitivity of the MscL

Le gluten de blé est une ressource protéique renouvelable et abondante pouvant être utilisée pour la fabrication de matériaux thermoplastiques biodégradables. L'objectif de cette thèse était de voir dans quelle mesure les paramètres de l'environnement physico-chimique du gluten (température, cisaillement, plastifiant, agent de charge, agent réducteur de ponts disulfure et protéase) permettent de modifier sa réactivité et les propriétés fonctionnelles des matériaux. L'influence du temps et de la température d'un traitement thermomécanique sur le degré de réticulation et de dégradation des protéines de gluten a été bien caractérisée et reliée à l'évolution rhéologique de tan ô, dans le domaine linéaire. Une diminution de la taille moyenne des protéines par rupture des liaisons covalentes (disulfure ou peptidique) entraîne un ralentissement de la cinétique de réticulation. Dans le cas de la protéolyse, il contribue également à diminuer le potentiel de réactivité par formation d'espèces non réactives. La réticulation du réseau de gluten par liaisons covalentes sous l'action d'un traitement thermomécanique est enfin en grande partie inhibée en conditions acides. L'étude de différentes natures de plastifiants a montré que leur effet plastifiant était essentiellement relié à la formation de liaisons hydrogènes et nous a permis de les classer en trois familles selon leur potentiel d'interaction avec le gluten. La vitesse de plastification du gluten semble conditionnée par l'efficacité de son mouillage par le plastifiant, facilité en conditions hydratées. Un mécanisme de plastification du gluten a pu être proposé. Les propriétés mécaniques des matériaux à base de gluten varient fortement avec l'état thermoplastique des protéines. L'augmentation du degré de réticulation du réseau de gluten permet d'augmenter les résistances mécanique et à l'eau des matériaux. La résistance à l'eau est également accrue par plastification dans un environnement hydrophobe. Enfin, un comportement collant a pu être caractérisé pour certains matériaux, pouvant donner lieu à des applications dans le domaine des auto-adhésifs<br>Wheat gluten is a renewable and abundant protein resource that can be used to make biodegradable thermoplastic materials. The aim of this thesis was to investigate in which extent parameters of gluten physico-chemical environment (temperature, shear, plasticizer, filler, disulfure bonds reducing agent, protease) could modify gluten reactivity and materials functional properties. Influence of the time and temperature of a thermo mechanical treatment on gluten proteins aggregation and degradation degree was characterized and related to the rheological evolution of tan ô, in the linear domain. A decrease in protein mean molecular size by breaking of covalent bonds (disulfure or peptidic) leads to a slowing down of gluten aggregation kinetic. In the case of proteolysis, it also contributes to decrease the reactivity potential by creation of non-reactive species. Finally, gluten network cross linking by covalent bonds induced by a thermo mechanical treatment is mostly inhibited in an acidic environment. Study of plasticizers of different natures showed that their plasticizing effect is mainly related to the formation of hydrogen bonds and enabled us to classify them in three groups according to their potential of interactions with gluten. Gluten plasticization speed rate seems to be governed by the efficiency of gluten wetting by the plasticizer. This wetting is improved in hydrated conditions. A gluten plasticization mechanism was proposed. Mechanical properties of gluten-based materials greatly change with the thermoplastic state of proteins. Increase in cross linking degree of gluten network enables to improve mechanical and water resistance of materials. Using a hydrophobic plasticizer also increases water resistance. Finally, an adhesive behaviour was characterized for some materials for which an application as pressure sensitive adhesives could be possible