Academic literature on the topic 'Protéines de signalisation YAP'

Les récepteurs couplés aux protéines G ou RCPG sont les récepteurs membranaires les plus abondants de notre génome avec environ 800 membres. Ils jouent un rôle essentiel dans la plupart des phénomènes physiologiques et physiopathologiques. De plus, ils constituent 30 % des cibles de médicaments actuellement commercialisés et restent un réservoir important pour de nouvelles thérapies innovantes. Leurs principaux effecteurs sont les protéines G hétérotrimériques. Celles-ci sont composées de 3 sous-unités, α, β et γ qui, lors du couplage avec un RCPG, se dissocient en Gα et Gβγ pour activer de nombreuses voies de signalisation. Cet article décrit certaines des avancées récentes dans la compréhension du fonctionnement et du rôle des protéines G hétérotrimériques. Après une courte introduction sur les RCPG, l’historique de la découverte des protéines G est décrit succinctement. Ensuite, les mécanismes fondamentaux de l’activation, la signalisation et la régulation des protéines G sont passés en revue. Les nouveaux paradigmes qui concernent la signalisation intracellulaire, la reconnaissance spécifique des protéines G par les RCPG ainsi que la signalisation biaisée sont également abordés.

La stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) induit des réponses biologiques à un large éventail de signaux extracellulaires. Les protéines G hétérotrimériques, qui sont recrutées aux RCPG actifs, conduisent à la génération de divers seconds messagers diffusibles. En plus des protéines G, seules deux familles de protéines présentent également la caractéristique remarquable de reconnaître la conformation active de la majorité des RCPG et de s’y lier : les kinases spécifiques des RCPG (GRK) et les β-arrestines. Ces deux familles de protéines ont initialement été identifiées en tant qu’acteurs clefs de la désensibilisation de l’activation des protéines G par les RCPG. Au fil des années, les β-arrestines ont été impliquées dans un nombre croissant d’interactions avec des protéines non réceptrices, élargissant le panel des fonctions cellulaires dans lesquelles elles sont impliquées. Il est maintenant bien établi que les β-arrestines, en échafaudant et en recrutant des complexes protéiques de manière dépendante de l’agoniste, régulent directement le trafic et la signalisation des RCPG. Des avancées remarquables ont été réalisées au cours des dernières années qui ont permis i) d’identifier des ligands biaisés capables, en stabilisant des conformations particulières d’un nombre croissant de RCPG, d’activer ou de bloquer l’action des β-arrestines indépendamment de celle des protéines G, certains de ces ligands présentant un intérêt thérapeutique ; ii) de mettre en évidence le rôle des β-arrestines dans la compartimentalisation de la signalisation des RCPG au sein de la cellule, en particulier depuis les endosomes, et, iii) de comprendre les détails moléculaires de leur interaction avec les RCPG et de leur activation grâce à des approches structurales et biophysiques.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires avec 800 membres chez l’Homme qui sont exprimés à la surface de la cellule où ils répondent à un large panel de stimuli extracellulaires. Des avancées récentes indiquent que les RCPG sont également exprimés dans des compartiments intracellulaires où ils remplissent des fonctions importantes. Dans cette revue, nous nous intéresserons à la localisation et à la fonction des RCPG exprimés dans les mitochondries.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires. Classiquement, il était admis que la signalisation des RCPG, résultant de leur couplage aux protéines G, provenait exclusivement du pool de récepteurs présents à la surface cellulaire et, qu’une fois internalisés, les RCPG devenaient « silencieux ». À l’heure actuelle, il existe des preuves expérimentales montrant que des RCPG internalisés continuent à produire un signal via les protéines G. Dans notre travail, nous avons démontré, qu’une fois internalisé et présent dans la membrane des endosomes précoces, le récepteur du peptide insulinotrope dépendant du glucose (RGIP) continue de stimuler la production d’AMPc et d’activer la protéine kinase-A (PKA). En plus de preuves indirectes montrant que les cinétiques de production d’AMPc et d’activation de la PKA sont dépendantes de l’internalisation du RGIP et de son trafic intracellulaire, nous avons identifié la forme active de Gαs dans les endosomes précoces contenant le RGIP et détecté un signal au moyen d’une sonde par RET d’AMPc démontrant une production d’AMPc à la surface des endosomes contenant le GIP.

Pour la troisième année, dans le cadre du module d’enseignement « Physiopathologie de la signalisation » proposé par l’université Paris-sud, les étudiants du Master « Biologie Santé » de l’université Paris-Saclay se sont confrontés à l’écriture scientifique. Ils ont sélectionné 8 articles scientifiques récents dans le domaine de la signalisation cellulaire présentant des résultats originaux, via des approches expérimentales variées, sur des thèmes allant des relations hôte-pathogène aux innovations thérapeutiques, en passant par la signalisation hépatique et le métabolisme. Après un travail préparatoire réalisé avec l’équipe pédagogique, les étudiants, organisés en binômes, ont ensuite rédigé, guidés par des chercheurs, une Nouvelle soulignant les résultats majeurs et l’originalité de l’article étudié. Ils ont beaucoup apprécié cette initiation à l’écriture d’articles scientifiques et, comme vous pourrez le lire, se sont investis dans ce travail avec enthousiasme ! Deux de ces Nouvelles sont publiées dans ce numéro, les autres le seront dans les prochains numéros de m/s.

Les protéines paralogues YAP et TAZ sont les effecteurs de la voie Hippo chez les Mammifères. Elles sont connues pour favoriser la prolifération cellulaire et décrites eni ^ant qu'oncogènes dans de nombreux cancers. Peu de choses sont connues sur le statut de la voie Hippo dans la pathologie du mélanome cutané. Nous avons donc entrepris une vaste analyse de l'expression des membres de la voie Hippo dans des lignées cellulaires de mélanomes et des tumeurs de patients, puis caractérisé la capacité de YAP et TAZ à contrôler le comportement de cellules de mélanome. Les immunomarquages de YAP et TAZ ont révélé une localisation cytoplasmique et nucléaire des deux protéines aussi bien dans le naevus bénin que dans les lésions mélanocytaires humaines. Les PCR quantitatives et les analyses protéiques ont permis l'identification d'expressions variables des kinases de la voie Hippo et de leurs effecteurs dans un panel de lignées cellulaires de mélanome humain, indiquant une signalisation Hippo fonctionnelle. De plus, la répression stable de TAZ dans quatre lignées cellulaires de mélanome, réduit considérablement leur croissance indépendante de l'ancrage, leur capacité à envahir le Matrigel et le derme de peaux reconstruites in vitro, ainsi que l'expression du gène cible de la voie Hippo : le CTGF. Celle de YAP mène à des effets similaires, mais en moindre mesure. Inversement, la surexpression de YAP augmente le pouvoir invasif des cellules de mélanome, la transcription dépendante des facteurs de transcription TEADs et donc l'expression du CTGF. Ainsi, ces résultats indiquent que les effecteurs YAP et TAZ exercent tous les deux des activités oncogéniques dans les cellules de mélanome
YAP and its paralog protein TAZ are downstream effectors of the Hippo pathway in mammals. Both are amplified in many human cancers and promote cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition. To date, little is known about the status of the Hippo pathway in cutaneous melanoma. Then, we undertook a broad analysis of Hippo pathway component expression in human melanoma cell lines and tumors, and! characterized the capacity of YAP and TAZ to control melanoma cell behavior. YAP and TAZ immunostaining revealed mixed cytoplasmic and nuclear staining for both proteins in benign nevi as well as in human melanoma samples. Variable expression of Hippo kinases LATS1/2 and MST1/2 and their effectors YAP1/2 and TAZ was found across a panel of human melanoma cell lines, irrespective of their BRAF mutation status. TAZ was the most predominantly expressed in ail cell lines. Western analysis revealed constitutive phosphorylation of LATS, MST, YAP and TAZ in several cell lines, indicating functional Hippo signaling. Stable knockdown of YAP or TAZ expression in four distinct |cell lines dramatically reduced the expression of CTGF, a classical Hippo target, as well |as anchorage-independent growth, and capacity to invade Matrigel and form lung! métastases in mice. YAP knockdown in 1205Lu cells also reduced invasion in a model of skin reconstruct. Inversely, YAP overexpression increased melanoma cell invasiveness, associated with increased TEAD-dependent transcription and CTGF expression. Together, these results indicate that both YAP and TAZ contribute to the invasive capacity in melanoma cells

Les papillomavirus humains (HPV) constituent l’archétype des virus à ADN oncogènes. Les HPV muqueux à haut risque (principalement HPV16) sont les principaux agents étiologiques du cancer du col utérin. Les protéines virales E6 et E7 sont des acteurs cruciaux de la cancérogenèse induite par HPV. Nous avons construit une ressource composée de 600 ADNc codant les effecteurs humains du système ubiquitine-protéasome (UPS) et identifié de nouvelles cibles potentielles des protéines E6 et E7 en utilisant une méthode basée sur la complémentation protéique de la Gaussia princeps luciférase (GPCA). HPV16 E6 lie les motifs LxxLL présents dans E6AP et IRF3. Nous avons résolu la structure cristallographique des complexes E6/LxxLL de E6AP/p53 et E6/LxxLL de IRF3. Par ailleurs, nous avons montré que les HPV ciblent une nouvelle voie suppresseur de tumeurs, la voie Hippo, avec ses deux médiateurs clef YAP et TAZ. Nous avons généré une banque d’ADNc codant 265 domaines PDZ humains et identifié de nouveaux partenaires potentiels des protéines YAP/TAZ en utilisant la méthode GPCA. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre la biologie des HPV et leur pouvoir oncogène
The human papillomavirus (HPVs) are the archetype of DNA oncogenic viruses. High-risk mucosal HPVs (mainly HPV16) are the main causative agents of cervical cancer and are also involved in other cancers. HPV oncogenic properties are mainly due to the expression of E6 and E7 proteins. We built a resource composed of 600 cDNA encoding the human ubiquitin-proteasome system (UPS) effectors and identified novel E6 and E7 potential targets by using a method based on the complementation of the Gaussia princeps luciferase (GPCA). HPV16 E6 binds to specific LxxLL motifs present in E6AP and IRF3. We have solved the crystallographic structure of the E6/E6AP LxxLL/p53 and E6/IRF3 LxxLL complexes. Furthermore, HPV may target a novel tumour suppressor pathway, the Hippo signalling pathway with its two main mediators YAP and TAZ. We have built a cDNA library dedicated to the 265 human PDZ domains and identified news potential partners of YAP and TAZ proteins by using the GPCA. The results provide novel insights on HPV biology and their oncogenic property

Des études épidémiologiques et expérimentales suggèrent que la progression de la maladie rénale chronique (MRC) après une lésion initiale est génétiquement déterminée, mais les réseaux génétiques qui contribuent à cette prédisposition restent inconnus. Parmi les voies moléculaires potentielles impliquées dans la MRC, cette étude s'est concentrée sur la voie Hippo, une cascade de signalisation conservée au cours de l'évolution et cruciale pour la régulation de la taille des organes et de la prolifération cellulaire. Les protéines paralogues YAP et TAZ, deux coactivateurs transcriptionnels de la voie Hippo, ont récemment été identifiées comme étant également des mécanosenseurs, capables de détecter un large éventail de signaux mécaniques et de les traduire en programmes transcriptionnels spécifiques aux cellules. L'activation de YAP et TAZ a été impliquée dans la progression de plusieurs maladies rénales et dans la transition de la lésion rénale aiguë (LRA) à la MRC . Cependant, les mécanismes sous-jacents restent obscurs et leur rôle dans des conditions physiologiques n'est pas encore bien compris. L'objectif de ce projet est d'élucider le rôle de YAP et TAZ dans les tubules rénaux. Tout d'abord, en utilisant la combinaison de modèles de souris transgéniques et de néphrectomie comme modèle de MRC, nous avons étudié l'effet de l'inactivation sélective du gène Yap ou Taz dans les cellules tubulaires rénales dans ce contexte de maladie. Nos résultats ont révélé une redondance potentielle entre ces deux protéines dans les cellules épithéliales tubulaires. Il est intéressant de noter que nos souris déficientes à la fois en YAP et en TAZ ont développé spontanément un phénotype rénal sévère avec des lésions tubulaires, de la fibrose et de l'inflammation, qui a été décrit en détail dans ce travail. Grâce à l'analyse transcriptomique, nous avons identifié une nouvelle signature moléculaire qui pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régulés par YAP et TAZ dans les cellules tubulaires. Paradoxalement, dans notre modèle de double knock-out, nous avons observé une aggravation de l'expression et de l'activation de YAP et TAZ, parallèlement à la progression des lésions. Ceci semble être le résultat d'une expansion des cellules « non recombinées », montrant les rôles complexes de YAP et TAZ dans la communication avec les cellules voisines. Ces données démontrent le rôle essentiel de YAP et TAZ dans le maintien de l'homéostasie tubulaire et l'équilibre complexe nécessaire à leur régulation. Cette complexité peut avoir des implications pour les stratégies thérapeutiques ciblant l'inhibition de YAP et TAZ dans les maladies rénales, surtout si l'on considère les effets secondaires potentiels qui pourraient rendre ces approches plus difficiles
Epidemiological and experimental studies suggest that the progression of Chronic Kidney Disease (CKD) after an initial injury is genetically determined, but the genetic networks that contribute to this predisposition remain unknown. Among the potential molecular pathways involved in CKD, this study focused on the Hippo pathway, an evolutionarily conserved signaling cascade crucial for regulating organ size and cell proliferation. The paralogs proteins YAP and TAZ, two transcriptional coactivators of the Hippo pathway, have recently been identified also as mechanosensors, capable of detecting a wide range of mechanical cues and translating them into cell-specific transcriptional programs. Activation of YAP and TAZ has been implicated to the progression of several kidney diseases and in the transition from acute kidney injury (AKI) to CKD. However, the underlying mechanisms remain unclear and their role under physiological conditions is still not well understood. The aim of this project is to elucidate the role of YAP and TAZ in the renal tubules. First, using the combination of inducing transgenic mouse models and nephrectomy as a model of CKD, we investigated the effect of the selective inactivation of Yap or Taz gene in renal tubular cells in this disease context. Our findings revealed a potential redundancy between these two proteins in tubular epithelial cells. Interestingly, our mice deficient in both YAP and TAZ developed a spontaneous severe renal phenotype with tubular injury, fibrosis and inflammation, which was described in detail in this work. Through transcriptomic analysis, we identified a new novel molecular signature that may provide further insight into the mechanisms regulated by YAP and TAZ in tubular cells. Paradoxically, in our double knock-out model, we observed a worsening of YAP and TAZ expression and activation, in parallel with the lesion progression. This appeared to be the result of an expansion of the "non-recombined" cells, showing the complex roles of YAP and TAZ in the cross-talk with the neighbouring cells. These data demonstrated the essential role of YAP and TAZ in maintaining tubular homeostasis and the intricate balance required for their regulation. This complexity may have implications for therapeutic strategies targeting the inhibition of YAP and TAZ in kidney disease, especially considering the potential side effects that could make such approaches more challenging

Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur primitive de la plèvre, rare, très agressive, avec un pronostic sombre. Nous avons souhaité au cours de ce travail de thèse, identifier de nouveaux biomarqueurs du MPM en testant l’influence de l’inactivation des membres de la famille RASSF/Hippo sur la survie des 448 patients inclus dans l’essai clinique MAPS (IFCT-GFPC-0701). Nous souhaitions également comprendre quelles fonctions et signalisations essentielles à l’homéostasie cellulaire, auxquelles participe la voie de signalisation RASSF/Hippo, sont perturbées lors du processus de transformation des cellules mésothéliales. L’inactivation des membres de la voie a été étudiée par PCR spécifique de méthylation (MS-PCR) et leur influence sur la survie des 448 patients inclus dans l’essai clinique MAPS testée en analyse uni- et multivariée avant d’être validée par boostrap. D’autre part, nous avons mimé in cell, l’inactivation par ARN interférence de plusieurs membres de la voie Hippo dans des cellules de lignées mésothéliales humaines (MSTO-211H, H2452, H28 et H2052). Nous avons pu identifier plusieurs biomarqueurs du MPM : i) la kinase MST1 dont l’inactivation est un facteur de mauvais pronostic, ii) l’amphiréguline dont l’expression cytoplasmique est au contraire un facteur de bon pronostic et enfin iii) le CD44 dont l’expression élevée constitue un outil diagnostique du MPM. Les approches in cell, nous ont permis de démontrer que les altérations de la voie RASSF/Hippo induisent une activité inappropriée de l’effecteur terminal YAP : le moins bon pronostic des patients présentant une inactivation de MST1 s’explique ainsi par le fait qu’en régulant l’activité de YAP, MST1 contrôle la balance apoptose/prolifération et prévient l’invasion et la croissance sans adhésion. En son absence, ces processus cellulaires sont dérégulés. Ce travail démontre l’importance de l’axe CD44/RASSF1A/MST1 dans le contrôle d’une activité appropriée de YAP et de l’homéostasie des cellules mésothéliales. La compréhension des désordres cellulaires induits par la dérégulation de le voie RASSF/Hippo, désigne YAP comme cible thérapeutique potentielle chez les patients atteints de MPM et présentant des altérations de cette voie de signalisation
Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare, very aggressive, primary tumor with a poor prognosis. During this thesis, we wanted to identify new biomarkers of MPM by testing the influence of the RASSF/Hippo pathway inactivation on the survival of the 448 patients included in the clinical trial MAPS (IFCT- GFPC-0701). We also wanted to understand which functions and signals essential to cellular homeostasis, linked to RASSF/Hippo signaling pathway, are disturbed during the mesothelial cell transformation process. Inactivation of RASSF/Hippo members was studied by methylation-specific PCR (MS-PCR) and their influence on the survival of the 448 patients included in the MAPS clinical trial tested in uni- and multivariate analysis before being validated by bootstrap. We also mimed in cell, by RNA interference, several members of the Hippo pathway inactivation in human mesothelial cells lines (MSTO-211H, H2452, H28 and H2052). We have identified several biomarkers of MPM: i) MST1 kinase whose inactivation is a factor of poor prognosis, ii) amphiregulin whose cytoplasmic expression is on the contrary a factor of good prognosis and finally iii) CD44 whose high expression is a diagnostic tool for MPM. In cell we demonstrate that RASSF/Hippo pathway alterations induce an inappropriate activity of YAP, one Hippo end effector: the poorer prognosis of patients with inactivation of MST1 is thus explained by the fact that, by regulating YAP activity, MST1 controls the apoptosis/proliferation balance and prevents invasion and growth without adhesion from mesothelial cells. In its absence, these cellular processes are deregulated. This work finally demonstrates the importance of the CD44/RASSF1A/MST1 axis in controlling appropriate YAP activity and mesothelial cell homeostasis. The understanding of the cellular disorders induced by the of the RASSF/Hippo pathway deregulation designates YAP as a potential therapeutic target in patients with MPM and presenting alterations of this signaling pathway

L’hépatite alcoolique (HA) est une maladie complexe de mauvais pronostic. L’arsenal thérapeutique se limite souvent au traitement par corticoïde. Cependant, 40% des patients ne répondent pas au traitement et la transplantation hépatique est la dernière issue pour leur survie. L’HA est caractérisé par une importante infiltration de polynucléaires neutrophiles (PNN), et paradoxalement l’infection de ces patients est fréquente et liée à la mortalité. D’autre part, notre groupe a démontré un important défaut de régénération hépatique caractérisé par une diminution de la prolifération des hépatocytes dans l’HA. Le but de notre étude était de déterminer les mécanismes cellulaires à l’origine du défaut de régénération hépatique dans l’HA, d’explorer les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’interaction du PNN et de l’hépatocyte, et d’évaluer la capacité migratoire des PNN circulants au cours de l’HA.Notre étude a mis en évidence la voie Hippo/YAP comme étant profondément altérée dans l’HA. L’activation de l’effecteur YAP était anormalement induite dans les hépatocytes de patients HA. Cette activation hépatocytaire induisait une dédifférenciation et une perte de fonctionnalité des hépatocytes. L’inhibition de YAP par la dobutamine dans des hépatocytes primaires isolés de patients HA était capable de limiter le processus de dédifférenciation. Ces données suggèrent que cibler YAP représente une stratégie thérapeutique innovante pour la prise en charge de l’HA. Nos travaux ont aussi permis d’identifier la voie NOD1 comme acteur principal dans l’interaction PNN/hépatocytes par le biais de l’expression de molécules d’adhésion. Nos résultats suggèrent cette voie comme cible thérapeutique pour limiter les lésions hépatiques induite par le PNN. De plus, au cours de l’HA, une dérégulation de la voie IL33/sST2 était impliquée dans la migration des PNN. Nous avons démontré une diminution de la capacité migratoire des PNN circulant au cours de l’HA. Le traitement des PNN par l’IL33 était capable de compenser ce défaut migratoire, ce qui représente outil intéressant pour prévenir les risques infectieux dans l’HA
Alcoholic hepatitis (AH) is a complex disease associated to a poor prognosis. The therapeutic arsenal is limited to corticosteroid treatment. However, 40% of patients do not respond to the treatment and liver transplantation represents the last option for their survival. AH is characterized by a large infiltration of polymorphonuclear neutrophils (PMN), and paradoxically the infection of these patients is a frequent event related to mortality. On the other hand, our group has demonstrated in AH an important defect of hepatic regeneration characterized by a decrease in hepatocytes proliferation, and the formation of ductular reaction. The aim of our study was to determine the cellular mechanisms causing the defect of liver regeneration in AH, to explore the pathophysiological mechanisms involved in the interaction of the PMN and hepatocytes, and to evaluate the migratory capacity of the PMN.Our work has highlighted the Hippo/YAP pathway as profoundly altered during AH. The effector YAP was aberrantly activated in AH hepatocytes. This led to the dedifferentiation and the loss of function of hepatocytes. The treatment of AH-isolated hepatocytes by the YAP inhibitor, dobutamine, limited the dedifferentiation process. Targeting YAP appears as an innovative strategy for AH management. Our work also identified the NOD1 pathway as a major actor in the PNN/hepatocyte interaction through expression of adhesion molecules. Our results suggest that NOD1 is an interesting target to limit PMN-induced liver injury. In addition, during AH, deregulation of the IL33 / sST2 pathway was involved in PNN migration. We have demonstrated a decrease in the migratory capacity of circulating PMNs. The treatment of PMN by IL33 was able to compensate for this migratory defect, which represents an interesting tool to prevent infectious risks during AH

L'ostéosarcome (OS) est la tumeur osseuse primitive maligne la plus fréquente chez les enfants et les adolescents dont le pronostic reste mauvais, surtout lorsque des métastases sont présentes au diagnostic. Des analyses transcriptomique de biopsies de patients atteint d’OS révèlent la présence d’une signature génique de la voie de signalisation Hippo dans l’OS. Son principal effecteur, YAP, est connu pour son rôle oncogène dans un certain nombre de cancer. Afin d’étudier son rôle dans le développement de l’OS, nous avons développé une approche moléculaire en surexprimant une protéine YAP capable ou non d’interagir avec son facteur de transcription TEAD. Des expériences in vitro et in vivo révèlent le rôle crucial de TEAD dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale médiée par YAP. De plus nous avons montré que la surexpression de YAP augmente la migration cellulaire in vitro et la dissémination métastatique in vivo, indépendamment de son interaction avec TEAD. Des analyses transcriptomique ont montré un enrichissement de gènes liés à la transition épithéliaux-mésenchymateuse, à la migration cellulaire et au TGF-β dans les cellules surexprimant YAP, quel que soit sa capacité à interagir avec TEAD. Des expériences de PLA et d’immunoprécipitation montrent une interaction YAP/Smad3, le principal effecteur de la voie du TGF-β. A l’aide d’un inhibiteur spécifique du TGF-β, le SD-208, nous montrons le rôle essentiel de la signalisation TGF-β/Smads dans la dissémination métastatique médiée par YAP. Ces résultats ont défini le rôle spécifique de TEAD et Smad3 dans la progression tumorale de l’OS, et identifié YAP comme un acteur central du développement de l’OS. Ainsi, YAP pourrait être une cible thérapeutique prometteuse dans l’OS
Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant bone tumour in children and adolescents for whom the prognosis remains poor, especially when metastases are present at diagnosis. Transcriptomic analyses of biopsies from OS patients reveal the presence of an Hippo signalling pathway gene signature in the OS. Its main effector, YAP, is known for its oncogenic role in a number of cancers. In order to study its role in the development of OS, we developed a molecular approach by overexpressing YAP that could or not interact with its transcription factor TEAD. In vitro and in vivo experiments revealed the crucial role of TEAD in cell proliferation and tumor growth mediated by YAP. In addition, we showed that overexpression of YAP increases cell migration in vitro and metastatic dissemination in vivo, regardless of its interaction with TEAD. Transcriptomic analysis showed a genes enrichment related to epithelial-mesenchymal transition, cell migration and TGF-β in cells overexpressing YAP, regardless of its ability to interact with TEAD. PLA and immunoprecipitation experiments showed YAP/Smad3 interaction, the main effector of the TGF-β pathway. Using a specific inhibitor of TGF-β, SD-208, we demonstrated the essential role of TGF- β/Smads signalling in YAP-mediated metastatic dissemination. These results defined the specific role of TEAD and Smad3 in the tumor progression of OS, and identified YAP as a central actor in the development of OS. Thus, YAP could be a promising therapeutic target in OS

Une cellule souche est capable de s’auto-renouveler et de générer des cellules différenciées après division cellulaire. La duplication complète de son génome doit être exempte d'erreurs afin d'éviter la propagation aux cellules filles de mutations délétères. Chez les eucaryotes, il a été montré que des segments d’ADN sur les chromosomes se répliquent de manière coordonnée et à des moments définis pendant la phase de synthèse, un processus appelé programme spatio-temporel de réplication de l'ADN (RT). Des changements majeurs dans le RT sont corrélés avec les changements de détermination des cellules souches et associés à l'organisation et à l’expressivité du génome. Malgré ce rôle central, les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du RT restent méconnus. Mon laboratoire a mis en évidence que YAP, l'effecteur en aval de la voie de signalisation Hippo impliquée dans la croissance cellulaire, régule la vitesse et la chorégraphie de la réplication de l’ADN des cellules souches rétiniennes chez l’amphibien xénope. Ces données révèlent YAP comme un nouvel acteur moléculaire dans le contrôle du RT. Pour tester l’implication directe de YAP dans la dynamique de réplication de l’ADN, nous avons tiré profit du système in vitro d’extraits d'œufs de xénope dans lequel toutes les étapes du processus sont reproduites de manière synchrone. Nous montrons que YAP est recruté à la chromatine pendant la réplication et que ce processus se produit seulement après la phase d’initiation des origines de réplication. Des extraits déplétés de la protéine YAP présentent une accélération de la vitesse de réplication et une augmentation du nombre de sites d’activation de la synthèse de l’ADN. Par ailleurs, nous avons identifié RIF1 (Rap1-Interacting Factor 1 ou Replication Timing Regulatory Factor 1), un des rares régulateurs connus du RT, comme un nouveau partenaire de YAP. Comme pour YAP, la perte de fonction de RIF1 dans les embryons de xénope conduit à un phénotype de petit œil et à la dérégulation du RT dans les cellules souches rétiniennes.Dans l'ensemble, nos résultats montrent l’implication de YAP dans le contrôle de la dynamique de réplication de l’ADN et révèlent RIF1 comme un nouveau partenaire dans ce processus. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives d’étude quant à l’importance biologique de cette interaction YAP-RIF1 dans le contrôle du RT et sa pertinence comme cible pour influencer le devenir des cellules souches
Stemness could be defined as a state in which a cell is able to self-renew and/or to differentiate after cell division. Before this happens, exhaustive duplication of the genome free of errors must occur in order to avoid deleterious mutations, a hallmark of cancer. Thus, DNA replication is particularly important to stem cells because of their continuous division capacities. Regarding DNA replication in eukaryotes, it was discovered that segments of chromosomes close in space, replicate in a coordinated manner during S phase, a process called replication timing. Moreover, major changes in replication timing correlate with cell differentiation, 3D chromatin architecture and transcription. However, the molecules that govern its regulation are poorly understood. Previously, my laboratory found that YAP, the downstream effector of the Hippo pathway, regulates S phase progression of retinal stem cells in Xenopus laevis. To test YAP function in the direct control of replication timing, we took advantage of the powerful in vitro DNA replication system of X. laevis egg extracts. Briefly, we discovered that YAP is recruited to replicating chromatin dependently of origin licensing. In addition, YAP depleted extracts showed increased DNA synthesis and origin activation; revealing that YAP normal function is to slow-down replication by limiting origin firing. Interestingly, we found Rif1, a major regulator of replication timing, as a novel partner of YAP. In vivo, Rif1 expression overlaps that of Yap within the stem cell compartment of the Xenopus retina. Knockdown of Rif1 leaded to a small-eye phenotype and alterations in replication foci of retinal stem cells, resembling the effect observed in YAP deficient cells. Finally, early-embryonic depletion of both molecules resulted in a strikingly acceleration of cell division.Altogether, our findings unveil YAP implication in the regulation of replication dynamis and show Rif1 as a novel partner. Further investigation to analyze this interaction would help us to understand the biological relevance in the control of replication timing and whether it could be used as a target in regenerative medicine

Contrairement aux mammifères adultes, la rétine des amphibiens possède la particularité de croître durant toute la vie de l'animal grâce à l'activité continue d'une population de cellules souches localisée au sein d'une niche bien délimitée, la zone marginale ciliaire (ZMC). Ce modèle offre ainsi la possibilité d'étudier in vivo les mécanismes moléculaires à l'origine du maintien et de la prolifération des cellules souches neurales à des stades post-embryonnaires. Dans ce but, l'identification et la caractérisation des différentes voies de signalisation présentes au sein de la niche biologique des cellules souches rétiniennes est une première étape indispensable. Mon projet de thèse a été divisé en deux objectifs principaux: l'étude des interactions entre les voies Wnt et Hedgehog au sein de la ZMC chez le xénope et la réalisation de l'étude fonctionnelle de Yap, l'effecteur principal de la voie de signalisation Hippo dans ce modèle. Par des approches génétiques et pharmacologiques, la première partie de ce projet a permis de mettre en évidence un antagonisme inattendu entre les signaux Wnt et Hedgehog au sein de la ZMC qui régule l'activité proliférative des cellules souches et des progéniteurs rétiniens. Ce travail nous a conduit à proposer un modèle dans lequel ces deux voies réguleraient la balance prolifération/différenciation dans la rétine post-embryonnaire. Dans un deuxième temps, les expériences de gain et de perte de fonction du gène Yap ont montré que ce dernier joue un rôle essentiel dans la régulation du programme temporel de la phase de réplication de l'ADN des cellules souches rétiniennes. En effet, l'inhibition de Yap entraîne une importante réduction de la durée de la phase S du cycle cellulaire associée à une instabilité génomique. Une surexpression de c-Myc et de la voie p53-p21 semble impliquée dans ce phénotype. Nos travaux nous ont également permis d'identifier un nouveau partenaire de YAP, le facteur de transcription PKNOX1. L'ensemble de ces données nous a ainsi conduit à proposer un modèle selon lequel le complexe YAP/PKNOX1 pourrait être nécessaire au bon déroulement de la phase de réplication des cellules souches, indispensable à la maintenance de l'intégrité du génome de ces cellules et de leur descendance
In contrast to the adult mammals, the retina of amphibians shows continuous growth during adulthood through active neural stem cells localized in the defined niche called ciliary marginal zone (CMZ). This model offers an exceptional tool to study in vivo the molecular mechanisms involved in the maintenance and proliferation of neural stem cells during post-embryonic stages. In this order, the identification and the characterization of the signaling pathways acting in biological retinal stem cell niche is an essential step.My PhD research was divided in two main parts: the study of the interaction between the Wnt and Hedgehog pathways within the CMZ and the functional study of Yap, the downstream effector of the Hippo pathway in this model. By using genetic and pharmacological tools, the first part of this project demonstrated an unexpected antagonism between the Wnt and the Hedgehog signaling in the CMZ that regulates proliferative activity of retinal stem and progenitor cells. In this article, we propose a model in which an antagonistic interplay of Wnt and Hedgehog pathways may regulate the balance proliferation/differentiation in the post-embryonic retina. Second, gain and loss of function experiments of Yap have shown that this factor plays a key role in the regulation of temporal replication of DNA retinal stem cells. Indeed, inhibition of Yap leads to strong reduction of the S-phase length during the cell cycle associated with genomic instability. c-Myc and p53-p21 overactivation seems to be involved in this phenotype. This work also allowed us to identify a novel YAP partner, the transcriptional factor PKNOX1. We indeed propose a model in which the YAP/PKNOX1 complex may be required for the successful convening of the replication phase on stem cells, essential for the maintenance of genome integrity on the cells and their progeny

La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée, requise dès le développement embryonnaire et contrôlant le choix du destin cellulaire au cours de nombreux processus. Elle est basée sur l’activité du récepteur transmembranaire Notch qui est activé lors de contacts intercellulaires par ses ligands également transmembranaires. Le récepteur subit alors deux clivages protéolytiques, par une métalloprotéase ADAM puis par le complexe multi-protéique γ-secrétase, qui libèrent le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, forme qui est ensuite transportée dans le noyau où elle active la transcription de ses gènes cibles. Le récepteur Notch est régulé par divers processus d’ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé contrôle sa dégradation lysosomiale. L’ubiquitination est réversiblement contrôlée par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n’a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases – enzymes catalysant la déubiquitination – impliquées dans les deux processus d’ubiquitinationde Notch, en utilisant deux cribles permettant de tester une banque de shRNA qui cible l’expression des 91 déubiquitinases humaines. Le premier m’a permis d’identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d’initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle déubiquitinase qui agit sur Notch activé avant le clivage γ-secrétase. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs candidates, parmi lesquelles USP12 dont le rôle dans la régulation du trafic de Notch non activé est en cours de validation

La réponse cellulaire aux stimuli extracellulaires est souvent médiée par des voies de signalisation qui agissent en aval des récepteurs transmembranaires, comme les récepteurs tyrosine kinases (RTK). Avec quatorze membres, la famille des récepteurs Eph représente la plus grande famille de RTK chez l'humain. Contrairement aux autres RTK, les ligands des récepteurs Eph, les éphrines, sont des protéines associées à la membrane cellulaire. La signalisation Eph-éprhines est donc principalement impliquée dans des événements de communication qui impliquent des contacts cellule-cellule comme la migration cellulaire, la répulsion et l'adhésion cellule-cellule. Ces événements sont cruciaux pour certains processus biologiques tels le guidage axonal et l'organisation tissulaire dans l'organisme en développement et chez l'adulte. Les récepteurs Eph sont fréquemment surexprimés ou dérégulés dans divers cancers, en particulier dans les plus agressifs et mortels. Récemment, la signalisation Eph-éphrines est devenue une nouvelle cible émergente pour le traitement du cancer. Bien que les fonctions biologiques des récepteurs Eph aient été largement étudiées, notre compréhension des mécanismes moléculaires grâce auxquels les récepteurs Eph régulent des phénotypes cellulaires précis demeure incomplète. Pour mieux comprendre le système de signalisation impliquant les Eph, mes travaux ont porté sur l'identification de nouvelles protéines effectrices en aval des récepteurs Eph et sur l'étude de leurs implications dans les fonctions régulées par les récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les complexes de signalisation associés aux récepteurs Eph dans des conditions natives, j'ai appliqué une approche basée sur la spectrométrie de masse (MS), le marquage de proximité BioID. Cela m'a permis de surmonter les limites de l'utilisation d'approches conventionnelles de purification par affinité pour cartographier les interactions protéine-protéine liées aux récepteurs transmembranaires. J'ai obtenu un réseau de signalisation dépendant des récepteurs EphA4, - B2, -B3 et -B4, qui comprend 395 protéines, dont la plupart n'avaient jamais été liées à la signalisation Eph-dépendante. Pour tester la pertinence biologique des partenaires identifiés, j'ai examiné la contribution de 17 candidats en utilisant une approche de perte de fonction dans une expérience de tri cellulaire dépendante des récepteurs Eph. J'ai pu montrer que la déplétion de quelques candidats, incluant la protéine Par3, bloque le tri des cellules. En utilisant la purification par affinité combinée à la MS, j'ai aussi identifié un complexe de signalisation impliquant la kinase C-terminal SRC (CSK), dont le recrutement aux complexes Par3 dépend des signaux des récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les interactions protéiques suivant la liaison Eph-éphrine, j'ai effectué des expériences de TurboID. Ces études m'ont permis d'identifier des complexes protéiques associés au récepteur EphA4 lorsqu'il est lié à l'éphrine-B2. J'ai également étudié les interactions protéine-protéine dépendantes de la liaison du récepteur EphB2 aux éphrines-B1 et -B2. Pour explorer si l'interaction d'EphB2 avec ces deux ligands peut mener à une réponse de signalisation inverse différente, j'ai identifié les partenaires de des ephrin-B1/-B2 lorsque stimulés par EphB2. Enfin, j'ai cartographié les réseaux de signalisation dépendants des récepteurs EphA4 et EphB2 sauvages ou kinase-inactifs, ce qui m'a permis de conclure que la perte de leur activité catalytique a conduit à des changements majeurs dans les interactomes dépendants de ces récepteurs. L'ensemble de mes résultats a permis de mieux définir les complexes protéiques dépendants des récepteurs Eph. Mes études ont mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux récepteurs Eph et de leur contribution dans le processus de délimitation des tissus, un processus souvent perturbé dans des maladies comme le cancer.
The cellular response to extracellular stimuli is often mediated by signaling pathways that act downstream of transmembrane receptors, such as receptor tyrosine kinases (RTKs). With fourteen members, the Eph family of RTKs is the largest in humans. In contrast to other RTKs, Eph receptor cognate ligands, ephrins, are tethered to the cell surface. This results in Eph receptor-ephrin signaling being mainly involved in short-range cell-cell communication events that regulate cell migration, repulsion and cell-cell adhesion. These events are crucial in biological processes such as axon guidance and tissue boundary formation in the developing and adult organisms. Eph receptors are frequently overexpressed or deregulated in a variety of human tumors, especially in the more aggressive and lethal ones. In recent years, the Eph-ephrin signaling system became an emerging new target for cancer treatment. Although a plethora of Eph receptor biological functions have been extensively studied, we still have a vague idea on the molecular mechanisms of Eph receptor signal transduction, underlying how Eph receptors regulate precise cellular phenotypes. To better understand the Eph receptor signaling system, my studies focused on the identification of novel Eph receptor downstream effector proteins and the determination of their requirement for Eph receptor-regulated functions. To unravel Eph receptor-associated signaling complexes under native conditions, I applied a mass spectrometry (MS)-based approach, namely BioID proximity labeling. This allowed me to overcome the limitations of conventional affinity purification approaches for mapping protein-protein interactions of transmembrane receptors. I obtained a composite signaling network from EphA4, -B2, -B3 and -B4 receptors that comprises 395 proteins, most of which not previously linked to Eph signaling. To test the biological relevance of the identified Eph receptor proximity interactors, I examined the contribution of 17 candidates using a loss-of-function approach in an Eph receptor-dependent cell sorting assay. I showed that depletion of a few candidates, including the signaling scaffold Par3, blocks Eph receptordependent cell sorting. Using affinity purification combined with MS, I further delineated a signaling complex involving C-terminal SRC kinase (CSK), whose recruitment to Par3 complexes is dependent on Eph receptor signals. To further elucidate Eph receptor-centric signaling complexes that are formed upon ephrin binding and are affected by Eph receptor catalytic activity I performed TurboID experiments. I systematically mapped ligand stimulation-dependent signaling networks downstream of EphA4 and EphB2 receptors. I dissected the impact of ephrin-B2 stimulation on the formation of EphA4- nucleated proximal protein complexes. Moreover, I showed the differential recruitment of EphB2 partners upon receptor binding to the same subclass of ligands, ephrin-B1 and ephrin-B2. To explore whether the EphB2 interactions with these two ephrin-B ligands elicit different reverse signaling responses, I delineated ephrin-B1/-B2 proximity partners recruited upon EphB2 stimulation. I also determined that the kinase domain of EphA4/-B2 plays a major role in determining the composition of signaling networks around the receptors, as a loss of catalytic activity led to a drastic decrease in a number of interactors with the receptors. Collectively, my definition of Eph receptor signaling networks sheds light on physiologically relevant Eph receptor-centered protein complexes that occur in living cells. These studies will lead to a better understanding of the mechanisms by which Eph receptors transmit signals at the membrane and give insight into how Eph receptor-mediated signaling pathways contribute to boundary formation, a process often disrupted in diseases like cancer.