Dissertations / Theses: 'Protéines de liaison à l'ARN messager'

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Bourdeau-Julien, Isabelle. "ALS-associated RNA-binding protein FUS and mRNA translation regulation." Master's thesis, Université Laval, 2020. http://hdl.handle.net/20.500.11794/68742.

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Abstract:

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique.
Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

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Lamaa-Mallak, Assala. "Rôle de la protéine de réparation de l'ADN Ku dans la régulation traductionnelle de l'ARNm p53." Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30291.

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Abstract:

L'augmentation des taux cellulaires de p53 en réponse aux dommages à l'ADN a été largement attribuée à une augmentation de la demi-vie de la protéine. Il est maintenant bien établi que la régulation traductionnelle de l'ARNm de p53 est également critique à la fois pour la répression de l'accumulation de p53 dans des conditions normales, et l'induction de la protéine en réponse aux dommages de l'ADN. Nos travaux se sont accès sur l'étude du rôle de facteur de réparation de l'ADN Ku dans la régulation traductionnelle de l'ARNm P53. Nous avons montré que Ku réprime la synthèse de la protéine p53 et l'apoptose p53-dépendante via la liaison à une structure en tige-boucle dans la 5'UTR de l'ARNm. Cependant, la répression traductionnelle exercée par Ku est levée après un stress génotoxique. Le mécanisme sous-jacent implique l'acétylation de Ku qui perturbe les interactions Ku-ARNm p53. Ces résultats suggèrent que la répression traductionnelle de p53 par Ku constitue un nouveau mécanisme cytoprotectif liant la réparation de l'ADN et la traduction des ARNm
Increases in p53 protein levels after DNA damage have largely been attributed to an increase in the half-life of the p53 protein. It is now well accepted that translational regulation of p53 mRNA is also critical for both repression of p53 accumulation in unstressed conditions and induction of the p53 protein in response to DNA damage. Our work focused on studying the role of DNA repair factor Ku in the regulation of P53 mRNA translation. We showed that Ku represses p53 protein synthesis and p53-mediated apoptosis by binding to a stem-loop structure within the p53 5'UTR. However, Ku-mediated translational repression is relieved after genotoxic stress. The underlying mechanism involves Ku acetylation which disrupts Ku-p53 mRNA interactions. These results suggest that Ku-mediated repression of p53 mRNA translation constitutes a novel cytoprotective mechanism linking DNA repair and mRNA translation

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Benoît, Perrine. "Contrôle traductionnel au cours de l'ovogenèse de Drosophila melanogaster : étude de Wispy, une poly(A) polymérase cytoplasmique de type GLD-2 et de Bicaudal-C, une protéine de liaison à l'ARN." Montpellier 1, 2008. http://www.theses.fr/2008MON1T022.

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Abstract:

Le contrôle traductionnel par la régulation de la taille des queues poly(A) est essentiel durant le développement précoce de nombreux organismes. Deux types de régulation de la taille des queues poly(A) peuvent exister : la polyadénylation cytoplasmique, qui consiste en l'ajout de résidus adénylés à l'extrémité 3' d'un ARNm et qui va activer sa traduction, et la déadénylation, qui consiste au raccourcissement de la queue poly(A) d'un ARNm cible et qui conduit à sa déstabilisation et/ou sa répression traductionnelle. Les poly(A) polymérases non canoniques de type GLD-2 ont été mises en évidence chez différents organismes. Elles sont impliquées dans la polyadénylation cytoplasmique. Chez les vertébrés, elles interagissent avec CPEB (Cytoplasmic polyadenylation element binding protein). Chez la drosophile, nous avons étudié un homologue de GLD-2, Wispy (Wisp). Des expériences in vivo et in vitro montrent que Wisp est une poly(A) polymérase cytoplasmique et mettent en évidence son interaction physique avec l'homologue de CPEB, Orb. Wisp et Orb agissent dans la polyadénylation cytoplasmique lors de l'ovogenèse tardive, notamment pour l'arrêt en métaphase I et la progression de la méiose après ce stade, et lors de l'embryogenèse précoce. La poly(A) polymérase canonique (PAP) est aussi impliquée dans la polyadénylation cytoplasmique avec Orb, lors des étapes plus précoces de l'ovogenèse. En conclusion, deux poly(A) polymérases, la PAP et Wisp, sont requises de façon séquentielle pour la polyadénylation cytoplasmique pendant l'ovogenèse de drosophile. Chez la drosophile, le mécanisme de déadénylation est étudié lors de l'embryogenèse précoce, pendant laquelle de nombreux ARNm maternels sont dégradés. Cette déadénylation est réalisée par le complexe de la déadénylase CCR4 qui est recruté de façon spécifique sur des ARNm cibles grâce à des protéines de liaison à l'ARN, telles que Smaug et Pumilio. Nos résultats mettent en évidence un rôle de la protéine de liaison à l'ARN, Bicaudal-C (Bic-C), dans la déadénylation, lors de l'ovogenèse précoce. Elle recrute le complexe de déadénylation de CCR4. Des cibles de Bic-C sont identifiées, dont l'ARNm Bic-C lui-même, qui est autorégulé par déadénylation. De plus, des résultats montrent que Bic-C pourrait avoir un double rôle à la fois dans la déadénylation et dans la polyadénylation cytoplasmique.

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Lavrynenko, Kyrylo. "The interaction of Caprin1 and G3BP1, major proteins in stress granule assembly, promotes the messenger RNA recruitment by G3BP1." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL133.

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Abstract:

Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle majeur dans la régulation de la traduction de l'ARN messager et l'adaptation du métabolisme cellulaire à divers signaux environnementaux. La présence dans de nombreuses RBP d'une combinaison unique de domaines fonctionnels structurés et de régions intrinsèquement désordonnées, leur permet de générer des condensats riches en ARN par le processus de séparation de phase liquide-liquide. G3BP1 est une RBP centrale dans le processus de protection de l'ARNm lorsque les cellules sont exposées à des stress environnementaux via la formation des granules de stress - des condensats de ribonucléoprotéines qui s'assemblent en réponse au stress. Les granules de stress (SG) pourraient servir de point de contrôle dans la destinée des ARNm : stockage de l'ARNm pour éviter l'expression de protéines inutiles à la survie cellulaire, transfert des transcrits d'ARNm vers les p-bodies pour dégradation ou transfert dans des polysomes pour traduction de protéines essentielles à la survie cellulaire. G3BP1 est un élément central dans l'assemblage des SGs car elle possède des domaines de liaison à l'ARN et une activité hélicase, et interagit spécifiquement avec plusieurs protéines présentes dans les SG comme Caprin1.Le but de cette étude est d'analyser la coopération entre G3BP1 et Caprin1 dans la liaison à l'ARN et la formation de condensats. Des études antérieures mettent en évidence le caractère central de G3BP1 dans l'assemblage de SG, mais G3BP1 ne possède pas de domaine de type prion contrairement aux nombreuses protéines impliquées dans la nucléation des SG et son affinité pour l'ARNm est assez faible. On propose que Caprin1, en tant que partenaire de G3BP1 à travers le domaine NTF2L et également une protéine impliquée dans la formation de stress granules, favorise la liaison de G3BP1 à l'ARNm et son recrutement dans les granules de stress. De plus, on a décortiqué la fonction des différents domaines de G3BP1 dans cette interaction.Pour démontrer l'interaction G3BP1-Caprin1-ARNm, nous avons utilisé plusieurs méthodes de biologie structurale et cellulaire. Nous proposons que Caprin1, qui est à la fois un partenaire connu de G3BP1 via le domaine NTF2-L de G3BP1 et une protéine de liaison à l'ARNm via son domaine de faible complexité riche en RGG, puisse améliorer l'interaction entre ARNm et G3BP1 et favoriser le recrutement de l'ARNm dans les SGs. L'analyse de l'influence des différents domaines de G3BP1 dans cette interaction démontre que l'amélioration du recrutement de l'ARNm via l'interaction avec Caprin1 ne fonctionne que si G3BP1 conserve ses domaines de liaison à l'ARNm. La coopération entre Caprin1 et G3BP1 permet de mieux comprendre la centralité de G3BP1 dans l'assemblage des SGs et ouvre des perspectives sur le recrutement d'ARNm spécifiques lors d'épisodes de stress
RNA-binding proteins play major role in regulation of messenger RNA translation and the adaptation of cellular metabolism to various environmental signals. This is accomplished due to RBPs possessing unique combination of structured functional domains and non-structured intrinsically disordered regions, which allows them to undergo liquid-liquid phase separation and form separate condensates with mRNA. G3BP1 is a central protein in a network of RBPs that participate in protection of mRNA from environmental stress by forming stress granules - ribonucleoprotein condensates that assemble in response to stress. Stress granules (SGs) might function as checkpoint for mRNA fate: storage of translationally silent mRNA, transfer of mRNA transcripts to P-bodies for degradation or transfer back into polysomes for translation. G3BP1 possesses RNA-binding domains, helicase activity and recruits several proteins into SGs, with some of them considered central nucleators in SG assembly, Caprin1 among them. The aim of this study is to investigate the cooperation between G3BP1 and Caprin1 in RNA-binding and condensate formation. Previous studies evidence the centrality of G3BP1 in SG assembly but, unlike other SG-nucleating proteins, G3BP1 lacks a prion-like domain and its direct mRNA binding is not clear. We propose that Caprin1, which is a known G3BP1 partner through the NTF2L domain of G3BP1 and a SG protein, may promote the G3BP1 mRNA binding and improve the mRNA recruitment in SG. In addition, we analyzed the function of the different G3BP1 domains in this interaction To demonstrate G3BP1-Caprin1-mRNA interplay, we used several methods of structural and cellular biology. We confirmed that G3BP1 and Caprin1 can co-localize and recruit mRNA in vivo, moreover, NTF2L-domain of G3BP1 is needed for this interaction. The mRNA recruiting capabilities of G3BP1 are improved in presence of Caprin1, and the RNA-binding domains of G3BP1 are of fundamental importance. Similarly, the enhanced mRNA recruitment of G3BP1-Caprin1 complex to SGs is at play only when full length G3BP1 is present. The consequence of G3BP1-Caprin1 interaction explain the centrality of G3BP1 in SG assembly and complement the model in which the shift RNA concentration triggers the conformational switch of G3BP1 at the heart of SG assembly by liquid-liquid phase separation

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Elatmani, Habiba. "Caractérisation du rôle d'Unr, une protéine de liaison à l'ARN, dans les cellules souches embryonnaires murines." Thesis, Bordeaux 2, 2009. http://www.theses.fr/2009BOR21681/document.

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Abstract:

Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’auto-renouveler c’est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu’elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d’Unr. La restauration de l’expression d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l’épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif
Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state

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Samsonova, Anastasiia. "Structural and functional insights into YB-1 and Lin28 interplay in mRNA regulation." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL037.

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Abstract:

La régulation de l'ARNm dans les cellules humaines est l'un des mécanismes essentiels permettant aux cellules de s'adapter à un nouvel environnement et de répondre aux signaux entrants. En effet, il est bien plus efficace pour une cellule de réguler l'homéostasie protéique au niveau de la traduction des ARNm plutôt qu'en jouant sur la transcription ou les mécanismes de dégradation des protéines. Dans les mécanismes de régulation de la traduction de l'ARNm, les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle clé.Au cours de ce travail de recherche, nous avons démontré que Lin28, une RBP humaine avec un domaine de choc froid peut interagir avec l'ARNm en coopération avec YB1, une protéine très abondante contenant aussi un domaine de choc froid, essentielle dans la constitution des mRNPs. L'interaction entre ces deux protéines est basée sur leur haute similitude de structure, et permet potentiellement à Lin28a de réguler la traduction nombreux mRNPs en utilisant YB-1 comme «badge d'entrée» au mRNP.Pour étudier l'interaction entre Lin28 et YB-1, différentes méthodes de biologie structurale et cellulaire ont été utilisées. D'abord, l'oligomérisation des domaines de choc froid de Lin28 et YB-1 en présence d'ARNm a été démontrée in vitro, et les résidus d'acides aminés impliqués dans ce processus ont été mis en évidence par spectroscopie RMN. Ensuite, la colocalisation dans le cytoplasme de Lin28 et YB-1 a été démontrée dans un contexte cellulaire. Finalement, nous avons révélé les conséquences fonctionnelles de cette interaction, par exemple dans le cadre de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Ces résultats éclairent un nouveau rôle de Lin28 dans le développement et l'adaptation des cellules cancéreuses à leur environnement
The mRNA regulation in human cells is one of the key mechanisms allowing the cells to adapt to a new environment and to respond to incoming signals. In terms of protein synthesis, the regulation of mRNA translation is a preferable process for cells compared to a more rigid mechanism of transcription or degradation. The RNA-binding proteins (RBPs) play a key role in the mRNA translation regulation.In the present work, we made an effort to demonstrate that a human RBP containing a cold shock domain, Lin28a, can act in cooperation with another cold shock protein YB-1, a core protein of mRNPs. The interplay between two cold shock proteins is based on their high structure similarity, that potentially gives Lin28 an opportunity to regulate the mRNA target translation in a general way using YB 1 as an “entry badge” to the mRNP.To demonstrate the interplay between Lin28 and YB 1, several methods of structural and cellular biology were used in the present study. The oligomerization of Lin28-CSD and YB-1-CSD upon RNA binding was shown in vitro, and the amino acid residues responsible for that were highlighted by NMR spectroscopy. Then, the colocalization of Lin28 and YB-1 was demonstrated in cell cytoplasm. Also, the protein interplay was shown to have functional consequences, e.g. for cell proliferation and differentiation

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Mure, Fabrice. "Rôle de la protéine EB2 du virus d'Epstein-Barr dans le métabolisme des ARN messagers." Thesis, Lyon, 2016. http://www.theses.fr/2016LYSEN071/document.

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Abstract:

La régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique est basée sur un réseau complexe et dynamique d’interactions ARN-protéines. Un défi important est de comprendre les mécanismes par lesquels ces protéines de liaison à l’ARN (RBPs) influencent chaque étape du métabolisme des ARNm. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont permis de caractériser de nouvelles fonctions de la RBP virale EB2 qui est indispensable à la production du virus d’Epstein-Barr (EBV). Des travaux antérieurs ont montré qu’EB2 favorise l’accumulation cytoplasmique de la majorité des ARNm viraux, dont la caractéristique est d’être transcrit à partir de gènes sans intron. Nous montrons que le rôle d’EB2 ne se limite pas à celui de facteur d’export des ARNm car cette RBP stabilise aussi ses ARNm cibles dans le noyau en les protégeant de la dégradation par l’exosome. Nos résultats indiquent qu’en absence d’EB2 : (i) certains ARNm viraux sont instables car ils contiennent des sites cryptiques d’épissage ; (ii) le facteur d’épissage SRSF3 déstabilise ces ARNm en interagissant à la fois avec l’exosome et le complexe NEXT, un des cofacteurs nucléaires de l’exosome. Par ailleurs, nous montrons également qu’EB2 est associée aux polysomes et stimule efficacement la traduction de ses ARNm cibles, en interagissant avec les facteurs d’initiation de la traduction eIF4G et PABP. Le développement d’un nouveau système de traduction in vitro nous a permis de montrer que l’effet d’EB2 sur la traduction nécessite le passage nucléaire de ses ARNm cibles. Ainsi, l’ensemble de nos travaux démontre le rôle clé d’une RBP virale dans le couplage entre les étapes nucléaires et cytoplasmiques de la biogenèse des ARNm
Post-transcriptional regulation of gene expression is based on a complex and dynamic network of RNA-proteins interactions. A major challenge is to understand the precise contribution of these RNA-binding proteins (RBPs) to each step of mRNA metabolism. During this thesis, we have characterized new functions of the EB2 viral RBP which is essential for the production of the Epstein-Barr virus (EBV). Previous works have shown that EB2 promotes cytoplasmic accumulation of most intronless viral mRNAs. Here, we show that EB2 is not just an mRNA export factor because this RBP also stabilizes its target mRNAs in the nucleus by protecting them from RNA exosome degradation. Our results indicate that in the absence of EB2 : (i) some viral mRNAs are unstable because they contain cryptic splice sites ; (ii) the splicing factor SRSF3 destabilizes these mRNAs by interacting with both the RNA exosome and the Nuclear EXosome Targeting (NEXT) complex. Moreover, we also show that EB2 is associated with polysomes and it strongly stimulates translation of its target mRNAs through interactions with the eIF4G and PABP initiation factors. Interestingly, the development of a new in vitro translational assay allowed us to show that EB2’s translation stimulation requires that EB2 binds its target mRNAs in the nucleus. Taken together, our works demonstrate the key function of a viral RBP in the coordination of the nuclear and cytoplasmic steps of mRNA biogenesis

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Argüelles, Camilla. "Étude du rôle de la protéine de liaison aux ARN messagers Smaug dans la voie Hedgehog chez la drosophile." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCC053.

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Abstract:

Les protéines signal Hedgehog (HH) sont des acteurs majeurs du développement animal et de la carcinogenèse. Leur transduction requiert la protéine à 7 domaines transmembranaires Smoothened (SMO) dont l’activité est régulée par Patched (PTC), un récepteur et antagoniste d’HH. PTC et HH régulent le trafic, la phosphorylation et l’accumulation de SMO mais de nombreux aspects de sa régulation restent incompris. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur Smaug, un nouveau partenaire de SMO chez la drosophile identifié au laboratoire dans un crible double-hybride. Smaug est connue pour lier et réprimer de nombreux ARNm au cours de l’embryogenèse chez la mouche. Durant ma thèse j’ai étudié comment Smaug agit sur SMO et la voie HH et aussi comment elle est régulée par HH. J’ai montré que Smaug était un régulateur positif de la voie HH et ce très probablement via sa capacité à fixer des ARNm. J’ai également montré que SMO et Smaug colocalisaient dans des foci cytoplasmiques en absence de signal et que Smaug était relocalisée à la membrane plasmique avec SMO en réponse à HH. Enfin j’ai mis en évidence un effet de SMO et d’HH sur la phosphorylation de Smaug suggérant une potentielle régulation en retour sur l’activité de Smaug. Ce travail m’a permis de proposer à la fois un nouveau rôle de la protéine de liaison aux ARN Smaug dans un processus de signalisation cellulaire ainsi que l’implication jusqu’ici insoupçonnée, d’une possible régulation post-transcriptionnelle d’ARNm dans la voie HH
Hedgehog Proteins (HH) are major players of animal development and carcinogenesis. Their transduction requires the 7 transmembrane protein Smoothened (SMO) whose activity is regulated by Patched (PTC), the HH receptor and antagonist. PTC and HH regulates SMO trafficking, phosphorylation and accumulation but numerous aspects of these regulations remain poorly understood. During my thesis, I focused on Smaug, a new partner of SMO in drosophila which was identified in the laboratory in a yeast two-hybrid screen. Smaug is known to bind and repress numerous mRNA during embryonic development in fly. I analyzed how it acts on SMO and HH signaling and also how is it regulated by HH. I have shown that Smaug is a positive regulator of the HH pathway and that it probably acts via its capacity to bind mRNA. I have also demonstrated that SMO and Smaug colocalise in cytoplasmic foci in absence of signal and that SMO is sufficient to localized Smaug to the plasma membrane in response to HH. Finally, I highlighted an effect of SMO and HH on the phosphorylation of Smaug suggesting the existence of a regulatory loop

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Meznad, Koceila. "Interaction entre l’oncoprotéine E6 d’HPV16 et le métabolisme des ARN messagers." Thesis, Bourgogne Franche-Comté, 2018. http://www.theses.fr/2018UBFCE012.

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Abstract:

Les papillomavirus humains (HPV) sont des virus à ADN double brin qui infectent la peau et les muqueuses. Les infections par les HPV, bien que majoritairement asymptomatique, provoquent des défauts de prolifération cellulaire pouvant parfois générer des cancers. Selon leur pouvoir carcinogène, on distingue les HPV à bas risque oncogène (HPV-BR) provoquant des lésions bénignes, et les HPV à haut risque (HPV-HR) responsables de l’apparition de nombreux cancers ano-génitaux et de certains cancers des voies aéro-digestives supérieures. Parmi les HPV-HR, HPV16 est le plus prévalent. La carcinogenèse induite par les HPV-HR est corrélée à l’expression des protéines virales E6 et E7, qui dérégulent de nombreux processus cellulaires. L’expression des gènes viraux, réalisée par la machinerie de la cellule hôte, est finement régulée particulièrement au niveau posttranscriptionnel. En outre, l’épissage alternatif génère une vingtaine de transcrits viraux, permettant l’expression des protéines virales. L’épissage au sein de la région codante E6 permettant de former l’isoforme E6*I est présent uniquement chez les HPV-HR, mais pas chez les HPV-BR, ce qui suggère son implication dans la carcinogenèse induite par les HPV-HR. Toutefois, le rôle biologique de la protéine E6*I produite par les HPV-HR est encore controversé.Afin de mieux appréhender les mécanismes de la carcinogenèse induite par les HPV-HR, nous nous sommes intéressés à : (i) l’étude des fonctions biologiques de l’isoforme E6*I, et (ii) aux mécanismes impliqués dans la régulation de l’expression de E6 et E7.Pour appréhender le rôle biologique d’E6*I d’HPV16, nous avons utilisé le séquençage de l’ARN afin d’identifier des cibles dérégulées par son expression ectopique. L’expression des isoformes E6 et E6*I d’HPV16 dans des cellules HPV négatives dérégule des transcrits impliqués dans des processus biologiques relatifs à l’expression des gènes viraux, la carcinogenèse virale, la transduction du signal et la traduction. L’expression d’E6*I seule, dérégule des transcrits impliqués dans l’organisation de la matrice extracellulaire, des voies de signalisation et d’adhérence cellulaire. De façon intéressante, il a été montré que ces gènes dérégulés par l’expression d’E6*I sont communément affecté par le niveau intracellulaire de ROS (espèces réactives de l’oxygène). Cela corrobore le rôle d’E6*I dans l’augmentation de la production de ROS. Le stress oxydatif associé aux ROS pourrait favoriser l’intégration du génome viral à celui de la cellule hôte, caractéristique de carcinogenèse associée aux HPV-HR. En somme, E6*I pourrait avoir un rôle oncogénique indépendant de celui d’E6, et interviendrait dans la carcinogenèse associée aux HPV-HR.Nous avons aussi étudié le rôle du complexe de jonction des exons (EJC), dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression d’E6 et E7. L’EJC est un complexe multiprotéique déposé sur les ARNm via l’épissage influençant ainsi leur devenir. Nous avons montré qu’un facteur de l’EJC, eukaryotic initiation factor 4A3 (eIF4A3), se liait aux ARNm viraux. Par ailleurs, nous avons observé que les composants de l’EJC affectent, certes de différentes façons, l’expression d’E6 et E7. Enfin, nous avons aussi étudié l’effet du nonsense-mediated mRNA decay (NMD), un mécanisme lié à l’EJC, sur l’expression d’E6 et E7. Non seulement nos résultats suggèrent que le NMD inhibe l’expression d’E6 et E7, mais nous avons aussi observé que la protéine E6 d’HPV16 réduit l’activité du NMD. Cette inhibition permettrait à HPV16 d’avoir un contrôle sur ses transcrits mais d’affecter aussi des cibles cellulaires du NMD. Etant donné l’implication des gènes régulés par le NMD dans le maintien de l’homéostasie et l’adaptation cellulaires, il serait intéressant d’appréhender le rôle de cette nouvelle activité d’E6 dans la carcinogenèse associée aux HPV-HR
Human papillomaviruses (HPV) are double strand DNA viruses that infect skin and mucosa. HPV infections, although mostly asymptomatic, cause cell proliferation defects that can sometimes give rise to cancer. According to their carcinogenic potential, we distinguish low-risk HPVs (lr-HPV) causing benign lesions, and high-risk HPV (hr-HPV) responsible for the appearance of numerous anogenital and some head and neck squamous-cell cancers. Among the hr-HPV, HPV16 is the most prevalent. Hr-HPV-induced carcinogenesis is correlated with the expression of the viral oncoproteins, E6 and E7, which deregulate many cellular processes. Viral gene expression, performed by the host cell machine, is finely regulated particularly at the post-transcriptional level. Besides, alternative splicing generates about twenty viral transcripts, leading to the expression of viral proteins. The splicing within the E6 open reading frame that generates an E6*I mRNA only in hr-HPV, but not in the lr-HPV, suggests its involvement in hr-HPV-induced carcinogenesis. However, the biological role of E6*I protein produced by HPV-HR is still controversial.In order to better understand the mechanisms of hr-HPV-induced carcinogenesis, we have interested in: (i) the study of the biological functions of the E6*I isoform, and (ii) the mechanisms involved in the regulation of E6 and E7 expression.To get insight the biological role of HPV16 E6*I, we used RNA sequencing to identify targets deregulated by its ectopic expression. Expression of HPV16 E6 and E6*I isoforms in negative HPV cells deregulate several transcripts involved in biological processes related to viral gene expression, viral carcinogenesis, signal transduction and translation. The expression of E6*I alone, deregulates transcripts involved in the organization of the extracellular matrix, signaling pathways and cell adhesion. Interestingly, it was shown that the genes deregulated by E6*I expression are commonly affected by the intracellular level of ROS (reactive oxygen species). These results support the role of E6*I in increasing ROS production. The ROS-associated oxidative stress could favor viral genome integration with that of the host cell, a characteristic of hr-induced carcinogenesis. In sum, E6*I may have an oncogenic role independent of E6, and intervene in the carcinogenesis associated with hr-HPV.We also studied the role of the exon junction complex (EJC) in the posttranscriptional regulation of E6 and E7 expression. EJC is a multiprotein complex deposited on mRNAs via splicing, thus influencing their fate. We have shown that a factor of EJC, eukaryotic initiation factor 4A3 (eIF4A3), binds to viral mRNAs. Moreover, we have observed that the components of the EJC affected, in different ways, the expression of E6 and E7. Finally, we also studied the effect of nonsense-mediated mRNA decay (NMD), a mechanism linked to the EJC, on the expression of E6 and E7. Our results suggest that not only NMD inhibits the expression of E6 and E7, but we have also observed that HPV16 E6 protein reduces NMD activity. This inhibition would allow HPV16 to have control over its transcripts but also to affect NMD cellular targets. Given the involvement of NMD-regulated genes in the maintenance of cellular homeostasis and adaptation, it would be interesting to understand the role of this new E6 activity in carcinogenesis associated with HPV-HR

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Budkina, Karina. "The role of an mRNA-binding protein YB-1 in formation of stress granules and translation." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASL006.

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Abstract:

Au cours de la vie de l'ARNm dans la cellule, l'ARNm existe en complexe avec des protéines et n'est jamais libre. Dans le cytoplasme, l'ARNm actif est associé aux ribosomes pour former les polyribosomes tandis que les ARNm réprimés s’associent avec certaines protéines de liaison à l'ARN (RBP) pour former des mRNP. Les mRNP réprimés sont généralement isolés dans le cytoplasme mais ils peuvent également être trouvés dans des compartiments appelés granules d’ARN, notamment lors d'un stress cellulaire. Ces granules d’ARN sont des organelles non membranaires contenant principalement de l'ARNm inactif et coexistent avec des polysomes. Selon les conditions environnementales, il y a un changement dans le ratio des ARNms trouvés dans les granules d’ARN ou dans les polysomes. De plus, il existe des différences dans la teneur en ARNm des différents types de ces organelles en fonction de leur localisation et de leurs fonctions. Actuellement, les granules de stress présentent un grand intérêt pour les chercheurs en raison de leur relation avec certaines maladies neurologiques. Les mutations trouvées dans certaines protéines de liaison à l'ARN telles que TDP43 et FUS sont directement liées à certaines maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (FTLD) et la maladie d'Alzheimer (MA). Dans les neurones affectés, TDP-43 et FUS forment des agrégats cytoplasmiques alors que ces protéines se trouvent généralement dans le noyau dans des conditions physiologiques. Comme elles ont également été trouvées dans les granules de stress cytoplasmiques, les granules de stress peuvent servir d'intermédiaires pour la formation d'agrégats de FUS et TDP-43. En outre, FUS et TDP-43 contiennent des régions intrinsèquement désordonnées (IDR) qui contribuent à leur agrégation.La formation de granules de stress est stimulée par l'exposition à différents facteurs internes et / ou externes. Les granules de stress servent de lieu de stabilisation des ARNm et à les maintenir inactifs jusqu'à ce que les facteurs de stress disparaissent. On considère que les structures secondaires de l'ARNm jouent un rôle important dans l'assemblage des granules de stress. De telles structures servent aussi de sites de liaison pour les RBP, qui les stabilisent davantage (par exemple G3BP). La protéine de liaison Y-box 1 (YB-1) a également été identifiée comme un marqueur pour les granules de stress. YB-1 est une protéine de liaison à l'ARN qui accompagne l'ARNm dès sa synthèse dans le noyau jusqu’à sa dégradation dans le cytoplasme. YB-1 contient un domaine de choc froid (CSD) avec deux motifs de reconnaissance d'ARN (RNP-1 et RNP-2), ainsi qu'un domaine CTD non structuré similaire aux IDR. Pour la plupart des protéines impliquées dans la formation des granules de stress, leur activité stimulante de l'IDR dans ce processus a été démontrée. Dans le même temps, il existe quelques controverses concernant le rôle de YB-1 dans l'assemblage des granules de stress. Selon certains modèles, il y a lieu de le considérer comme un régulateur négatif dans la formation des granules de stress. Selon d'autres, YB-1 présente les propriétés d'un agent favorisant de l'assemblage de granules de stress. Par ailleurs, peu de travaux ont n'a été faits pour déchiffrer l'action de la protéine sur la traduction sous stress oxydatif. Ici, notre objectif était de démêler les mécanismes structuraux par lesquels YB-1 peut réguler négativement la formation de granules de stress et de clarifier son influence sur la traduction dans des conditions de stress
During mRNA life in cell mRNA exists in complex with proteins and is never free. In the cytoplasm, active mRNA is associated with ribosomes to form polyribosomes while repressed mRNAs in association with RNA-binding proteins forms mRNPs. Repressed mRNPs are generally isolated in the cytoplasm but they can also be found in compartments called mRNP granules, notably during cellular stress. Such mRNP granules are non-membrane organelles contains mostly translationally inactive mRNA and coexist with polysomes. Depending on the environmental conditions, there is a change in the ratio of mRNA found in these types of granules or in polysomes. In addition, there are differences in the mRNA content of the different types of such organelles depending on their localization and functions. Currently, stress granules are of great interest to researchers due to their relation to some neurological diseases. Mutations of some RNA-binding proteins such asTDP43 and FUS are directly linked to some neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), frontotemporal dementia (FTLD), and Alzheimer's disease (AD). In the affected neurons, TDP-43 and FUS form cytoplasmic aggregates while these proteins are generally found in the nucleus under physiological conditions. As they were also found in cytoplasmic stress granules, stress granules may serve as intermediates for the formation of FUS and TDP-43 aggregates. In addition, FUS and TDP-43 contain intrinsically disordered regions (IDRs) which contribute to their aggregation. The formation of stress granules is stimulated by exposure to different internal and/or external factors. Stress granules serve as a place for mRNA stabilization and keeping it inactive until stress factors disappear. It is considered that secondary structures of mRNA play a significant role in the assembly of stress granules. Such structures serve as binding sites for RBPs, which further stabilize them (e.g. G3BP). The Y-box binding protein 1 (YB-1) was also identified as a marker for stress granules. YB-1 is an RNA-binding protein that accompanies mRNA from its synthesis in the nucleus to degradation in the cytoplasm. YB-1 contains a cold shock domain (CSD) with two RNA-recognition motifs (RNP-1 and RNP-2), as well as an unstructured CTD domain similar to IDRs. For most of the proteins involved in the formation of stress granules, their stimulating activity of IDR in this process has been shown. At the same time, there are some controversies regarding the role of YB-1 in the assembly of granules. According to some sources, there is reason to consider it as a negative regulator. According to others, YB-1 exhibits the properties of an inducer during the assembly of stress granules. At the same time, no attempts were made to decipher the mechanism of action of the protein under oxidative stress.Here our aim was to unravel the structural mechanisms by which YB-1 can negatively regulate the formation of stress granules and to clarify its influence on translation in stress conditions

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Moreau, Kevin. "Etude génomique des mécanismes nucléaires de contrôle qualité et dégradation de l'ARN." Thesis, Orléans, 2019. http://www.theses.fr/2019ORLE3012.

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Abstract:

La transcription des ARN messagers (ARNm), chez les eucaryotes est un processus complexe nécessitant de nombreuses étapes. En parallèle de ce mécanisme fondamentale, de nombreuses protéines vont se fixer à l’ARNm naissant afin de le maturer et de l’empaqueter pour former une particule ribonucléoprotéique (mRNP) compétente pour l’export vers le cytoplasme, où aura lieu la traduction. Les étapes de biogénèse de cette mRNP sont soumises à la surveillance par un système de contrôle qualité (QC) qui détectera tout évènement conduisant à une mauvaise formation de la particule. Les transcrits aberrants sont retenus au noyau pour y être dégradés par l’exosome. Afin de provoquer l’apparition massive d’ARNm aberrants dans le noyau de notre modèle d’étude, la levure S. cerevisiae, nous utilisons le facteur bactérien Rho. L’hélicase translocase Rho, une fois exprimée, va venir perturber l’assemblage co-transcriptionnel des mRNPs et ainsi générer des transcrits aberrants qui seront substrats de la machinerie de QC et dégradation. La présente étude étend les précédentes observations faites par l’équipe quant à l’implication de certaines protéines dans le système de QC par des approches globales (RNA-seq, ChIP-seq). De plus, l’étude du complexe THO, impliqué dans l’empaquetage et le transport de la mRNP, révèle l’implication d’une de ses sous-unités dans le marquage des ARNm aberrants ainsi qu’un lien de première importance dans le recrutement de l’exonucléase Rrp6 sur ces cibles à dégrader. Enfin, nous montrons, de manière globale l’existence, au sein du noyau des levures, d’une seconde voie de dégradation des ARNs aberrants distincte de la voie canonique passant par Rrp6
Eukaryotic transcription of messenger RNAs (mRNAs) is a complex multistep process. In parallel with this fundamental mechanism, many proteins will bind to the nascent mRNA in order to process and package it to form an export competent ribonucleoprotein particle (mRNP). These mRNP biogenesis steps are under the surveillance of a quality control system (QC) that will detect all the faulty events that can lead to the formation of an aberrant particle. Aberrant transcripts will be retained in the nucleus and degraded. To study the QC mechanisms, we previously implemented a powerful assay based on the global perturbation of mRNP biogenesis by the bacterial Rho factor. When expressed in the yeast nucleus, Rho will interfere with co-transcriptional mRNP assembly and generates aberrant transcripts which will be substrates for the QC and degradation system. This study extend the previous observations made by the team about implication of some proteins in the QC pathway by genome-wide methods (RNA-seq, ChIP-seq). Moreover, study of the THO complex, which is a packaging and export factor, shows that the Tho2 subunit is involved in the tagging of aberrant transcripts and in recruitment of the exonuclease Rrp6 on its targets. Finally, we are giving insights about the presence, in yeast, of a second degradation pathway for aberrant mRNPs different from the canonical pathway involving Rrp6

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Le, Borgne Maïlys. "Étude in vivo de la fonction biologique de la protéine de liaison aux ARN Mex-3B." Thesis, Lyon 1, 2012. http://www.theses.fr/2012LYO10141.

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Abstract:

La protéine de liaison aux ARN MEX-3 est un régulateur essentiel du développement embryonnaire chez le nématode Caenorhabditis elegans. Une famille de quatre gènes homologues à hMex-3 (dénommés hMex-3A, 3B, 3C et 3D) a été identifiée chez les mammifères par notre équipe. Afin de mieux comprendre la fonction physiologique in vivo des protéines Mex-3, nous avons invalidé le gène Mex-3B chez la souris. Cette approche expérimentale a révélé que Mex-3B est un acteur majeur de la spermatogenèse. Les souris mâles nullizygotes présentent une obstruction des tubes séminifères conduisant à une réduction importante du nombre des spermatozoïdes produits. L’ablation de Mex-3B ciblée à la cellule de Sertoli, cellule somatique essentielle à la fonction de l’épithélium séminifère, a permis d’établir que le phénotype testiculaire a pour origine une perturbation des propriétés biologiques de cette cellule. En effet, les cellules de Sertoli déficientes pour Mex-3B présentent des défauts de la phagocytose qui conduisent à une élimination défectueuse des corps résiduels au cours de la spemiogenèse. L’exploration des mécanismes moléculaires impliqués a montré que Mex-3B contrôle la phagocytose via la régulation de l’activité et de la localisation membranaire de Rap1GAP, une protéine qui régule négativement la petite protéine G Rap1. En accord avec ces données, l’absence de Mex-3B provoque une déstabilisation de la barrière hémato-testiculaire due à un défaut de localisation à la membrane plasmique des molécules de jonction connexine 43 et N-Cadhérine, protéines dont la translocation et la stabilité dépendent de Rap1. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence un rôle clé de Mex-3B dans le contrôle spatial de la voie de signalisation Rap1 au cours de la spermatogenèse
The RNA binding-protein MEX-3 is a post-transcriptional regulator involved in early embryogenesis of the nematode Caenorhabditis elegans. We have recently reported the characterization of a novel family of four mammalian genes homologous to hMex-3 (called hMex-3A, 3B, 3C and 3D). To gain insight into the biological functions of these proteins in vivo, we disrupted the Mex-3B gene in mice. Using this experimental approach, we found that Mex-3B is as a major regulator of spermatogenesis. We observed that male Mex-3B null mice hypofertile and present an obstruction of seminiferous epithelium. Phagocytic properties of Sertoli cells were impaired, thus impeding the clearance of residual bodies released during spermiogenesis. Exploration of the underlying molecular mechanisms revealed that Mex-3B regulates phagocytosis through the activation and the transport at the peripheral membrane of Rap1GAP, a protein that downregulates the small G protein Rap1. Consistently, the Rap1-dependent recruitment of the junction proteins, connexin 43 and N-Cadherin at the cell surface was compromised in Mex-3B deficient mice. In conclusion, my work highlights a key role gor Mex-3B in the spatial control of Rap1 signaling during spermatogenesis

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Bittencourt, Danielle. "Coupling between gene expression steps in mammalian cells : role of transcriptional coregulators and physio-pathological impact." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077124.

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Abstract:

J'ai étudié la régulation de l'expression génique en réponse à une hormone stéroïde, l'estradiol, pour trois gènes modèles en prenant en compte fensernbte des étapes impliquées, J'ai pu montrer que l’épissage co-transcriptionnelle est plus efficace dans le cas de la cyctîne 01 par rapport à pS2 et potentialise la production de l’ARNrn de la cycline D1. Ce travail montre que, in vivo, la coordination entre la transcription et l’épissage est nécessaire à la production efficace d’ ARNm en réponse à un stimulus transcriptionnel. Afin de déterminer les acteurs moléculaires responsables du couplage entre là transcription et l’épissage, j’ai réalisé un crible basé sur l'Inhibition de l'expression de plusieurs corégulateurs transcriptionnels par la technique de siRNA, En effet plusieurs corégulateurs transcriptionnels, qui sont des protéines recrutées sur le promoteur de leurs gènes cibles et qui modulent leur transcription, peuvent aussi affecter leur épissage. J'ai identifié le coregulateur transcriptionel EWS en tant que régulateur de l'expression du gène de la cycllne D1. De façon intéressante, EWS est altéré dans les sarcomes d’Ewing où une translocation chromosomique résulte en la fusion du gène EWS avec le gène codant le facteur de transcription Fli-1. J'ai montré que EWS favorise l'élongation tandis que EWS-Fli l’inhibe ce qui aboutit à la production d'un variant d’épîssage oncogénique de la cycline D1 dans les sarcomes d'Ewing. De plus, j'ai montré que le corégulateur transcriptionnel p68 contrôle le devenir et régule l’export des ARNm de c-fos. Ce résultat est important car il étend la fonction jusqu’ici connue des corégulateurs dans la régulation de l'expression génique
In order to investigate the biological significance of coupling between the different steps of the gene expression process in vivo, I studied the regulation of gene expression in response to a steroid hormone, estradiol, for three gene models by taking into account all the steps involved, I showed that the efficiency of co-transcriptional splicing was higher in the of cyclin D1 when compared to pS2 and potentiated the cyclin D1 mRNA production rate, This work shows that, in vivo, efficient coupling between transcription and splicing is necessary for efficient mRNA production in response to a transcriptional stimulus, In order to investigate the molecular actors of coupling between transcription and splicing, I conducted a siRNA-based approach to downregulate the expression of several transcriptional coregulators, I firstly identified the EWS transcriptional coregulator as a regulator of cyclin D1 expression, interestingly, EWS is altered in Ewing sarcomas where a chromosomal translocation results in the fusion of the EWS gene with the Fl-1 gene encoding a transcription factor, EWS-FB. Remarkably EWS favors transcription elongation whereas EWS-Fli inhibits elongation thus favoring the production of an oncogenic cyclin D1 splice variant in Ewing sarcomas; In addition, I showed that the p68 transcriptional coregulator and splicing factor controls the fate and regulates the export of c-fos mRNAs. This result is important because it expands the known functions of coregulators in gene expression regulation

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Andric, Vedrana. "Study of the mechanisms of sexual differentiation in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe Formation of S. pombe Erh1 homodimer mediates gametogenic gene silencing and meiosis progression A scaffold lncRNA shapes the mitosis to meiosis switch." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL056.

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Abstract:

Chez la levure fissipare Schizosaccharomyces pombe, un sous-ensemble de gènes méiotiques est transcrit de manière constitutive au cours de la mitose. Afin d’éviter l'expression prématurée du programme méiotique et l'initiation de la différenciation sexuelle, les cellules ont développé un système de dégradation de l'ARN qui élimine sélectivement les transcrits méiotiques correspondants. Ce processus nécessite la protéine de liaison à l'ARN Mmi1 (à domaine YTH), qui reconnaît en cis les molécules d'ARN (motifs UNAAAC) et les cible pour la dégradation par l'exosome nucléaire. Au début de la méiose, Mmi1 est séquestrée au sein d’une particule ribonucléoprotéique composée de la protéine de liaison à l'ARN Mei2 et du long ARN non-codant (lncRNA) meiRNA, permettant ainsi l'expression des gènes méiotiques et le déroulement de la méiose. Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes par lesquels Mmi1 assure la dégradation des transcrits méiotiques et qui régulent son activité au cours des cycles mitotiques et méiotiques. Pendant la croissance végétative, Mmi1 s'associe étroitement à la protéine conservée Erh1 pour former le complexe hétérotétramérique Erh1-Mmi1 (EMC) qui est essentiel pour la dégradation des transcrits méiotiques. Par des approches de biologie structurale et de biochimie, nous avons montré qu'Erh1 s'assemble en homodimère in vitro et in vivo, en accord avec des analyses récentes. Des mutations qui empêchent l'homodimérisation d'Erh1 mais préservent son interaction avec Mmi1 entraînent l'accumulation de transcrits méiotiques en raison d'un défaut de liaison de Mmi1 à ses cibles ARN. L'homodimérisation d’Erh1 est également nécessaire pour séquestrer Mmi1 dans le complexe Mei2-meiRNA et assurer la progression de la méiose. Ainsi, l'assemblage d’EMC est essentiel pour la reconnaissance et la dégradation des transcrits méiotiques par Mmi1 dans les cellules mitotiques et contribue à l'inactivation de cette dernière au début de la méiose. Des travaux antérieurs ont montré que, pendant la croissance végétative, Mmi1 recrute le complexe Ccr4-Not pour ubiquitinyler et limiter l’accumulation de son propre inhibiteur Mei2, maintenant ainsi son activité dans la dégradation des ARNs méiotiques. Nous avons identifié un lncRNA, différent de meiRNA et appelé mamRNA (Mmi1- and Mei2-associated RNA), qui sert de plateforme à Mmi1 pour cibler Mei2 vers le complexe Ccr4-Not. Réciproquement, lorsque cette régulation négative de Mei2 est défectueuse, mamRNA est nécessaire pour l'inactivation de Mmi1 par les niveaux élevés de Mei2. Des expériences d’hybridation in situ par fluorescence en molécules uniques (smFISH) ont également montré que mamRNA est localisé dans un corps nucléaire contenant Mmi1, suggérant que le contrôle mutuel de Mmi1 et Mei2 est confiné dans l’espace. mamRNA peut également relayer meiRNA pour inhiber Mmi1 et favoriser la progression de la méiose. mamRNA apparait donc comme un régulateur critique des activités de Mmi1 et Mei2 pour ajuster la dégradation des ARNs méiotiques et modeler la transition de la mitose vers la méiose
In the fission yeast S. pombe, a subset of meiosis-specific genes is constitutively transcribed during the mitotic cell cycle. To prevent untimely expression of the meiotic program and premature initiation of sexual differentiation, cells have evolved an RNA degradation system that selectively eliminates the corresponding meiotic transcripts. This process requires the YTH-family RNA-binding protein Mmi1, which recognizes cis-elements within RNA molecules (UNAAAC motifs) and targets them for degradation by the nuclear exosome. At the onset of meiosis, Mmi1 is sequestered in a ribonucleoparticle composed of the RNA-binding protein Mei2 and the long non-coding RNA (lncRNA) meiRNA, thereby allowing expression of meiotic genes and meiosis progression. My PhD work consisted in studying the mechanisms by which Mmi1 promotes the degradation of meiotic transcripts and how its activity is regulated during both the mitotic and meiotic cell cycles. During vegetative growth, Mmi1 tightly associates with the evolutionarily conserved Erh1 protein to form the heterotetrameric Erh1-Mmi1 complex (EMC) that is essential for the degradation of meiotic transcripts. Using biochemical and structural approaches, we have shown that Erh1 assembles as a homodimer in vitro and in vivo, consistent with recent analyses. Mutations that disrupt Erh1 homodimerization but preserve interaction with Mmi1 result in the accumulation of meiotic transcripts due to inefficient binding of Mmi1 to its RNA targets. Erh1 homodimerization is also required for Mmi1 luring by the Mei2-meiRNA complex and meiosis progression. Thus, EMC assembly is essential for the recognition and degradation of meiotic transcripts by Mmi1 in mitotic cells and contributes to Mmi1 inactivation at meiosis onset. Previous work showed that, during vegetative growth, Mmi1 recruits the conserved Ccr4-Not complex to ubiquitinylate and downregulate a pool of its own inhibitor Mei2, thereby maintaining its activity in meiotic RNA degradation. We have identified a lncRNA, different from meiRNA and termed mamRNA (Mmi1- and Mei2-associated RNA), to which Mmi1 associates to target Mei2 to the Ccr4-Not complex. Conversely, when Mei2 downregulation is impaired, mamRNA is necessary for Mmi1 inactivation by increased Mei2 levels. Single molecule RNA FISH experiments also indicated that mamRNA localizes to a nuclear body enriched in Mmi1, suggesting that the mutual control of Mmi1 and Mei2 is spatially confined. mamRNA can also take over meiRNA to inhibit Mmi1 and promote meiosis progression. Therefore, mamRNA emerges as a critical regulator of Mmi1 and Mei2 activities to fine tune meiotic RNA degradation and shape the mitosis to meiosis transition

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Gaudin, Cyril. "Nouvelles caractérisations structurales de l'ARN transfert-messager." Rennes 1, 2004. http://www.theses.fr/2004REN10023.

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Abstract:

La "trans-traduction" est un mécanisme bactérien qui permet la libération de ribosomes bloqués en cours de synthèse protéique. Ce mécanisme fait intervenir l'ARN transfert-messager (ARNtm), comportant un domaine ARNt et un cadre ouvert de lecture, et la protéine SmpB. Chez certaines espèces, le gène codant pour l'ARNtm a subi une permutation circulaire dont la transcription aboutit à un ARN précurseur maturé sous la forme de deux ARN distincts. Nous avons caractérisé par cartographie chimique et enzymatique la structure secondaire de cet ARNtm en deux parties. D'autre part, nous avons déterminé, par résonance magnétique nucléaire, le degré de similarité structurale entre le domaine assurant la fonction ARNt de la molécule (TLD) et les ARNt standards. Nous avons montré que ce domaine interagit avec SmpB. Afin d'obtenir des informations supplémentaires sur l'initiation de la trans-traduction, nous avons entrepris de résoudre la structure du complexe TLD/SmpB par RMN.

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Bédard, Mikael. "Caractérisation du domaine de liaison à l'ARN de p54nrb." Thesis, Université Laval, 2011. http://www.theses.ulaval.ca/2011/28423/28423.pdf.

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Labourier, Emmanuel. "Mise en évidence de l'activité kinase de l'ADN topoisomérase I humaine et caractérisation fonctionnelle de RSF1, un répresseur de l'épissage chez la drosophile." Montpellier 2, 1998. http://www.theses.fr/1998MON20157.

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Abstract:

L'epissage des arn pre-messagers nucleaires est une des voies de regulation de l'expression genetique chez les metazoaires. Ce processus implique cinq particules ribonucleoproteiques et de nombreux facteurs caracterises par un domaine de liaison a l'arn (domaine rrm) et un domaine riche en residus arginine et serine (domaine rs). Parmi ces facteurs, les proteines sr definissent une famille de phosphoproteines nucleaires qui jouent un role central en tant que facteur constitutif et regulateur de la selection des sites d'epissage 5 et 3. Nous nous sommes interesses aux mecanismes gouvernant la regulation de cette selection. Nos travaux ont montre que : 1/ l'adn topoisomerase i humaine possede une activite kinase specifique des proteines sr in vitro et in vivo ; elle fixe l'atp dans sa region c-terminale et interagit avec les proteines sr par sa region n-terminale ; les mecanismes impliques dans la coupure de l'adn et la phosphorylation des proteines sr sont distincts ; son activite kinase pourrait constituer une cible de choix pour le developpement de nouveaux agents anticancereux. 2/ la proteine rsf1, identifiee chez la drosophile, interagit avec le domaine rs des proteines sr par son domaine riche en glycine, arginine et serine (domaine grs) et avec des sequences activatrices de l'epissage par son domaine rrm ; elle est un regulateur negatif de la reconnaissance des sites d'epissage 5 in vitro ; elle est un represseur de l'epissage in vitro et in vivo ; elle est un antagoniste fonctionnel des proteines sr in vitro et au cours du developpement de la drosophile.

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Glorian-Schmitt, Valérie. "Contribution à la compréhension de la régulation de la traduction sélective des ARNm sous stress, par l'étude de la régulation traductionnelle de l'ARNm de la GTPase rhoB sous UV." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/1281/.

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Abstract:

Lors de stress génotoxiques, une programmation rapide, spécifique et hautement contrôlée de l'expression des gènes est nécessaire, pour permettre aux cellules de s'adapter aux nouvelles conditions environnementales. La traduction des ARNm, l'étape finale de l'expression de l'information génétique est un processus finement régulé. Ainsi, sous différents stress, bien que la traduction de la plupart des ARNm soit inhibée, certains ARNm, codant des protéines impliquées dans le contrôle de la mort cellulaire, de la réparation de l'ADN ou du cycle cellulaire, sont préférentiellement traduits. Afin d'étendre la compréhension de ces mécanismes, nous nous sommes intéressés à la régulation de la traduction de l'ARNm de la GTPase rhoB sous UV. RhoB est un gène de réponse précoce, qui est induit sous UV pour participer à la réponse apoptotique. De plus, au cours de l'oncogénèse rhoB a un rôle suppresseur de tumeur et son expression protéique est diminuée dans plusieurs cancers. Nos résultats montrent que la traduction de l'ARNm codant rhoB est réprimée par l'action interdépendante du microARN miR-19 et de la protéine de liaison aux ARNm HuR. Nous mettons en évidence un nouveau mécanisme par lequel l'ARNm de rhoB résiste à l'inhibition générale de la traduction sous UV. Cet effet n'est pas associé à une variation de l'expression de miR-19 sous UV, mais implique la dissociation de HuR et de miR-19 de l'ARNm de rhoB, levant ainsi la répression traductionnelle de l'ARNm de rhoB exercée par ces facteurs. Nos travaux démontrent également que cette régulation contribue au rôle anti-apoptotique de RhoB sous UV. En conclusion, cette étude suggère que la régulation de la traduction par des microRNAs et des protéines de liaison aux ARNm puisse être déterminante dans de nombreux processus cellulaires et plus particulièrement dans la réponse au stress
When confronted with genotoxic stress, a highly specific and controlled gene expression program is necessary to allow cells to adapt rapidly to environmental changes. MRNA translation, the final step of gene expression, is finely regulated. Although global protein synthesis is inhibited by different cell stresses, mRNAs encoding some stress response proteins are preferentially translated. To study stress-dependent regulation of translation, we have investigated the translational regulation of the immediate-early response gene rhoB upon UV exposure. UV-induced RhoB expression contributes to the regulation of keratinocyte cell survival after UV exposure. RhoB has also been proposed to act as a tumor suppressor and its expression is often down-regulated in several cancers. We have shown that miR-19 and HuR bind to rhoB mRNA in an interdependent manner to inhibit RhoB expression. We have identified a novel mechanism by which the rhoB mRNA evades global repression of translation upon UV exposure. This effect is not associated with UV-dependant regulation of miR-19 expression but involves the loss of the interdependent binding of HuR and miR-19 on the rhoB mRNA upon UV exposure. Thus, inhibition of rhoB mRNA translation mediated by those factors is relieved. Furthermore, we have shown that this regulation contributes to the anti-apoptotic function of RhoB. This work suggests that the regulation of translation by microRNAs and mRNA binding proteins may be determinant in several cellular processes including the response to stress

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Le, Mée Gwenn. "Protéines de liaison à l'ARN et toxicité des ARN portant des expansions CUG chez la drosophile." Montpellier 1, 2007. http://www.theses.fr/2007MON1T010.

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Abstract:

La DM1 est une maladie génétique liée à des expansions de triplets CTG dans la région 3'UTR du gène de la myotonine protéine kinase (le gène dmpk). Le nombre de répétitions, inférieur à 37 chez un sujet sain, peut atteindre plusieurs milliers dans les formes sévères. L'ARN dmpk muté portant les expansions CUG, sous forme de structure double brin, s'accumule dans les noyaux sous forme de foyers. Plusieurs arguments suggèrent un effet toxique de l'ARN par séquestration de protéines de liaison à l'ARN double brin comme les protéines MBNL homologues des protéines Muscleblind de drosophile. En outre, l'activité de la protéine CUG-BP1 de liaison aux répétitions CUG est affectée. Mon travail de thèse a porté tout d'abord sur l'identification et la caractérisation du facteur de drosophile homologue de la CUG-BP1 (Delaunay et al. , NAR 2004). Les acteurs de la DM1 sont donc conservés entre la drosophile et l'homme. En raison de cette conservation, la deuxième partie de mes travaux de thèse a porté précisément sur la réalisation de modèles drosophile pour la DM1. Le but de ce travail est d'analyser les mécanismes moléculaires de la pathogénicité des expansions CTG et en particulier de vérifier l'hypothèse de la toxicité des ARN portant des expansions CUG. Des lignées de drosophiles transgéniques ont donc été réalisées en utilisant le système UAS/Gal4 qui permet de contrôler spacio-temporellement l'expression de l'ARN transgénique. Comme chez l'homme, dans tous les tissus observés où leur expression est induite, les expansions CUG240 et 480 forment des foyers nucléaires. Pourtant, parmi sept lignées différentes, la toxicité n'est observée que dans une seule lignée CTG240. Une analyse moléculaire a donc été menée afin d'identifier le mécanisme qui permet de rendre compte de ces différences. En conclusion de ces travaux, nous pouvons affirmer que les expansions CUG ne sont pas toxiques par elles-mêmes quelle que soit leur taille. En outre, les différences de niveau des ARN CUGn produits ne se traduisent pas par des différences de toxicité. Le facteur déterminant de la toxicité semble être lié au contexte dans lequel l'expansion est insérée.

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Subramania, Gangadhara Suryasree. "L'interaction de SAM68 avec U1 snRNP régule l'épissage alternatif." Doctoral thesis, Université Laval, 2019. http://hdl.handle.net/20.500.11794/35714.

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Abstract:

Le profilage transcriptomique global des gènes humains a permis d'estimer que 95% des gènes subissent un épissage alternatif. L'épissage alternatif élargit la diversité de notre génome et le module par des mécanismes de régulation croisée. Les principales petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP), à savoir U1, U2, U4, U6 et U5, catalysent l'excision des introns d'une manière concertée. Certains des modèles d'épissage prédominants par lesquels l'AS étend la diversité du génome incluent le saut d'exon, les exons mutuellement exclusifs, le site d'épissage alternatif 5' et la sélection du site d'épissage alternatif 3'. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle majeur dans la régulation de l´épissage alternatif en modulant le recrutement des snRNP aux niveaux des séquences cis-régulatrices; (« enhancer » et « silencer ») situées dans les exons ou les introns. L´objectif actuel dans le domaine de l´épissage est d´établir un « code d´épissage » pour chaque RBP afin de permettre la prédiction de son type d´activité en fonction de la région liée. Des applications récentes à l'échelle du génome, telles que les microréseaux et l'ARN-Seq, ont mis en lumière des modèles d'épissage souvent négligés, tels que la polyadénylation intronique et la rétention intron. La protéine de liaison à l'ARN, SAM68, module l'épissage alternatif de mTor - qui code mTOR, le régulateur principal de la croissance cellulaire et de l'homéostasie. SAM68 favorise l'épissage intron 5 normal de mTor. Des pré-adipocytes chez des souris déficientes en Sam68 ont montré des défauts de différenciation et une diminution de l'engagement dans la lignée adipocytaire. Ces souris étaient maigres et insensibles à l'obésité d'origine alimentaire. L'analyse à l'échelle d'une micropuce du tissu adipeux blanc de souris Sam68-null a permis d'identifier une régulation à la hausse d'une isoforme tronquée de mTor ; mTori5, qui se termine par transcription dans l'intron 5, en raison d'un manque d'épissage au site 5´ d´épissage. Cependant, le mécanisme par lequel SAM68 régule les événements d'épissage, en particulier dans le contexte de la reconnaissance du site d'épissage, n'a pas encore été caractérisé à ce jour. Dans cette thèse de doctorat, je décris une étude approfondie sur le rôle de SAM68 et des régions d'amplificateur intronique dans mTor intron 5 dans la reconnaissance de son site d'épissage 5' amont. Mes résultats mettent en évidence un nouveau rôle du SAM68 dans la modulation du recrutement du snRNP U1 snRNP sur des sites d'épissage de 5'. Je décris la caractérisation biochimique de l'interaction de SAM68 avec U1A, le composant central du snRNP U1 et le rôle de la phosphorylation de la tyrosine SAM68 dans la modulation de cette interaction. Je décris également comment SAM68 par son interaction avec U1 snRNP joue un rôle crucial dans le masquage des signaux de polyadénylation intronique cryptique dans un sous-ensemble de gènes. Collectivement, cette étude contribuera à une meilleure compréhension des éléments introniques et du rôle de SAM68 dans les décisions cruciales en matière d'épissage.
Global transcriptome profiling of human genes have led to the estimation that 95% of genes undergo alternative splicing. Alternative splicing expands the diversity of our genome and modulates it by cross-regulatory mechanisms. Major small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) namely U1, U2, U4, U6 and U5 catalyzes intron excision in a concerted manner. Some of the predominant splicing patterns by which alternative splicing expands genome diversity includes include exon skipping, mutually exclusive exons, alternative 5´splice site and alternative 3´splice site selection. RNA binding proteins play a major role in the regulation of alternative splicing by modulating snRNP recruitment and they do so by binding directly to pre-mRNA sequences called splicing enhancers or silencers that are located in exons and/or introns. A current goal in the splicing field is to establish a ‘splicing code’ for each RBP, whereby its activity, as in splicing activation or repression can be predicted based on its binding region relative to splice sites. Recent genome wide applications such as microarray and RNA-Seq have shed light on the often overlooked splicing patterns such as intronic polyadenylation and intron retention. The RNA binding protein, SAM68, modulates the alternative splicing of mTor – that encodes mTOR, the master regulator of cell growth and homeostasis. SAM68 promotes normal intron 5 splicing of mTor. Pre-adipocytes of Sam68 deficient mice showed differentiation defects and decreased commitment to adipocyte lineage. These mice were lean and unresponsive to dietary induced obesity. Exon-wide microarray analysis of white adipose tissue from Sam68-null mice identified upregulation of a truncated isoform of mTor; mTori5 , that transcriptionally terminates within intron 5 due to lack of splicing at the upstream 5´splice sites. However, the mechanism by which SAM68 regulates splicing events, particularly in the context of splice site recognition, has not been characterized till date. In this doctoral thesis, I describe an in-depth study on the role of SAM68 and the intronic enhancer regions in mTor intron 5 in the recognition of its upstream 5´splice site. My results uncover a novel role of SAM68 in modulating U1 snRNP recruitment at 5´splice sites. I describe the biochemical characterization of SAM68 interaction with U1A, the core component of U1 snRNP and the role of SAM68 tyrosine phosphorylation in modulating this interaction. I also describe how SAM68 by its interaction with U1 snRNP plays a crucial role in masking cryptic intronic polyadenylation signals in a subset of genes. Collectively, this study will contribute to advanced understanding of intronic elements and the role of SAM68 in affecting crucial splicing decisions.

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Clavel, Marion. "Les protéines de liaison à l'ARN double brin DRB d'Arabidopsis thaliana : petits ARN, épigénétique et contrôle transcriptionnel." Perpignan, 2013. http://www.theses.fr/2013PERP1255.

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Bruckert, Hélène. "Caractérisation d'Hrp48, une protéine de liaison aux ARNs, lors de la morphogenèse axonale chez la drosophile." Nice, 2012. http://www.theses.fr/2012NICE4063.

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Abstract:

Des études récentes ont montré que le contrôle post-transcriptionnel des ARNms joue un rôle essentiel sur la croissance et le guidage axonal, processus permettant la mise en place de circuits neuronaux. Afin d’étudier ce type de régulation in vivo, mon projet de thèse visait à caractériser Hrp48, une protéine de liaison aux ARNs appartenant à la famille conservée des hnRNPA/B. J’ai montré que l’inactivation d’hrp48 entraîne des défauts de croissance axonale comme des neurones projetant leurs axones dans une mauvaise direction ou au-delà de leur cible classique, défauts remarquablement plus forts chez les femelles que chez les mâles. Mes travaux ont révélé que la protéine femelle-spécifique Sex-léthal s’accumule ectopiquement dans le noyau des cellules mutantes hrp48, ce qui pourrait être à l’origine des défauts sexe-spécifiques de migration axonale observés. En parallèle, j’ai montré que l’inactivation de sema-1a, une cible ARNm putative d’Hrp48, provoque des défauts proches des mutants hrp48, et qu’hrp48 et sema-1a interagissent génétiquement. Par ailleurs, le niveau général d’ARNm sema-1a est plus faible chez les femelles que chez les mâles. Ces résultats suggèrent donc qu’une dérégulation de sema-1a pourrait induire les défauts sexe-spécifiques de croissance axonale observés en contexte mutant hrp48. Ce travail a permis de proposer un modèle préliminaire de régulation post-transcriptionnelle par une protéine de liaison aux ARNs de la famille hnRNPA/B in vivo et a mis en évidence des différences cryptiques entre les femelles et les mâles. Il s’inscrit dans le cadre d’études récentes révélant des différences sexe-spécifiques dans le contrôle de l’expression des gènes
Recent studies have shown that post-transcriptional regulatory mechanisms play essential roles in axon growth and guidance, processes involved in the establishment of neuronal circuits during development. To study these mechanisms in vivo, my project aimed at characterizing the role of the RNA-binding protein Hrp48, which belongs to the conserved hnRNP A/B family. I showed that inactivating hrp48 function leads to strong and specific axon migration defects, including axon misguidance and overextension. Notably, I have observed that the frequency of hrp48 mutant phenotypes is much higher in females than in males. Moreover, I showed that the female-specific Sex-lethal protein ectopically accumulates in the nucleus of mutant cells. This abnormal nuclear accumulation could explain the sex-specific defects observed in axonal migration. In parallel, I could show that inactivation of sema-1α, an Hrp48 putative mRNA target, causes defects similar to those observed in hrp48 mutants, and that hrp48 and sema-1 α genetically interact. Moreover, the overall levels of sema-1 α transcripts are much lower in females than in males. These results suggest that sema-1 α misregulation may induce the sex-specific defects in axonal growth observe upon hrp48 downregulation. Tis work has allowed us to propose a preliminary in vivo model for a post-transcriptional regulatory mechanism controlled by a member of the hnRNP A/B family. Furthermore, it has revealed cryptic differences between females and males in the context of recent studies revealing sex-specific differences in the control of gene expression

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Rondeau, Evelyne. "Identification d'interacteurs moléculaires et génétiques des argonautes impliqués dans la voie des microARN chez C. Elegans." Thesis, Université Laval, 2008. http://www.theses.ulaval.ca/2008/25600/25600.pdf.

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Abstract:

Chez les eucaryotes, les microARN sont de courts ARN non codants régulant les gènes essentiels pour le développement et la différenciation cellulaire. Parmi les facteurs cellulaires clés de cette voie métabolique, on retrouve les RNAses de type III Drosha et Dicer, ainsi que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 chez C. elegans. Dans le but de mieux caractériser l’implication des protéines Argonautes dans la voie des microARN, nous avons utilisé deux approches différentes. Premièrement, nous avons étudié la liaison de la protéine Argonaute ALG-1 aux microARN chez C. elegans en fonction du stade développemental, et ce par analyse par micropuce des microARN associés avec ALG-1. Cette étude nous a permis de remarquer que ALG-1 lie la majorité des microARN, mais non la totalité, et ce, de façon très importante aux stades développementaux tardifs. Deuxièmement, nous nous sommes intéressés à l’identification d’interacteurs génétiques d’alg-2. Nous avons donc réalisé un criblage génétique basé sur la létalité synthétique avec le gène alg-2. Ainsi, lorsque le gène synthétique létal est muté simultanément avec alg-2, tel qu’observé avec alg-1, la double lésion induit la mort de l’animal. De ce criblage, nous avons isolé 11 mutants, classés en 5 groupes de complémentation. Par l’utilisation de techniques de cartographie génétique, nous avons localisé la mutation chez le candidat sla-1 sur le chromosome V, entre les positions génétiques de -12.7 et -3.65.
In eukaryotes, microRNAs are small non-coding RNAs which have the role of regulating genes essential for development and cellular differentiation. Beside the RNAse III family members (Drosha and Dicer) and the Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in C. elegans, essential components of this gene regulation pathway are still not uncovered. In order to characterize the implication of Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in microRNA pathway, we used two approaches. First, we studied the interaction between microRNA and ALG-1 during worm development by microarray analysis of microRNA associated to ALG-1. From this analysis, we observed that the majority, but not the totality, of microRNA are associated to ALG-1, mostly at early developmental stages. Secondly, to identify new components of microRNA pathway, we conducted a genetic screen to identify new interactors of alg-2. Our screen is based on the synthetic lethality feature of alg-2 and alg-1 genes. In absence of both genes, the animal can not survive. With this synthetic lethal screen, we want to identify new genes that work in synergy with alg-2, like alg-1, interacting in the same genetic pathway. The worms have been mutagenized and 11 mutants, classified in 5 complementation groups, have been collected. By using various mapping techniques, we localized the mutation on mutant sla-1(qbc1) on chromosome V, between the genetic positions of -12.7 and -3.65.

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Le, Bras Morgane. "Rôle des protéines de liaison à l'ARN hnRNP H et hnRNP F dans les régulations traductionnelles dans les glioblastomes." Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30277.

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Abstract:

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale extrêmement agressive associée à un mauvais pronostic. C'est pourquoi, il apparaît nécessaire d'identifier les mécanismes moléculaires participant au développement des GBM ainsi qu'à leurs résistances aux traitements afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Récemment, il a été montré que les régulations traductionnelles jouent un rôle fondamental dans les propriétés agressives du GBM. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) sont des acteurs majeurs de ces régulations dont l'expression/activité est altérée dans les GBM. Les RBP hnRNP HF (HF) font partie des RBP les plus surexprimées dans les GBM et leur contribution dans la régulation traductionnelle des GBM n'a encore jamais été investiguée. Nous avons émis l'hypothèse que hnRNP H et hnRNP F soient au centre d'un réseau de régulations post-transcriptionnelles impactant la machinerie traductionnelle qui contrôle le développement tumoral et la résistance aux traitements des GBM. Nos résultats montrent qu'HF régulent la prolifération et la réponse aux traitements car leur perte d'expression (i) diminue la prolifération des GBM (modèle cellulaire, sphéroïde et xénogreffes in vivo), (ii) active les voies de réponse aux dommages à l'ADN et (iii) sensibilise les cellules de GBM aux irradiations. De plus, nous avons identifié un nouveau rôle pour HF en tant que régulateurs de la traduction. En effet, nos données montrent que les hnRNP HF contrôlent la traduction d'un ensemble d'ARNm en régulant l'expression et l'activité de facteurs d'initiation ainsi qu'en collaborant avec des ARN hélicases partenaires en ciblant des ARNm impliqués dans des processus reliés au développement tumoral et la résistance aux traitements possédant des structures secondaires G-quadruplexe dans leurs 5'UTR. Les données que nous avons générées suggèrent que hnRNP H et hnRNP F sont des régulateurs traductionnels essentiels au développement tumoral et à la résistance aux traitements des GBM
Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most aggressive brain tumors with poor prognosis. Understanding the molecular mechanisms involved in the development and resistance to treatments of gliomas could improve treatment efficiency. Recently, it has been demonstrated that translational regulations play a key role in the GBM aggressivity. RNA binding proteins (RBP) are major regulators of these processes and have altered expression / activity in GBM. The RBP hnRNP H and hnRNP F (HF) are among the most overexpressed RBP in GBM and their role in GBM translational regulation has never been investigated yet. We hypothesize that HF are at the core of a post-transcriptional regulation network which impacts the translational machinery that controls GBM tumor development and resistance to treatment. We have demonstrated that hnRNP H and hnRNP F regulate proliferation and response to treatment because their depletion (i) decreases the GBM proliferation (cell line model, spheroid and in vivo xenografts), (ii) activates the DNA damage response pathways and (iii) sensitizes the GBM cells to irradiation. We have identified HF as new regulators of GBM translation. Indeed, our data show that hnRNP H and hnRNP F control mRNA translation by regulating expression/activity of initiation factors and in collaboration with RNA helicases by targeting mRNA involved in oncogenic processes and containing secondary structures called G-quadruplex in their 5'UTR. The data that we have generated suggest that HF are essential translational regulators involved in tumor development and resistance to treatment in GBM

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Noiret, Maud. "Étude des protéines de liaison à l'ARN des familles PTB et ARE-BP au cours du développement chez le xénope." Phd thesis, Rennes 1, 2012. https://ecm.univ-rennes1.fr/nuxeo/site/esupversions/a420494c-0828-469e-bd2f-60a70118ef9f.

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Abstract:

Mes travaux ont porté sur l'étude de deux familles de protéines de liaison à l'ARN, la famille des ARE-BP (AU-rich elements binding protein) et la famille des PTB (Polypyrimidine tract binding protein) au cours du développement chez le xénope. L'étude de l'expression de cinq membres de la famille ARE-BP a mis en évidence une redondance d'expression tissulaire et temporelle entre quatre de ces ARE-BP (AUF1, KSRP, HuR et TIA1). A l'inverse, l'expression atypique de TTP a permis de suggérer son implication dans l'hématopoïèse. Mes travaux sur la famille PTB (PTBP1, PTBP2, PTBP3) ont montré que chacun des paralogues présente une expression spécifique ce qui suggère qu'elles aient des fonctions différentes lors du développement. Des résultats du laboratoire montraient que l'inactivation de PTBP1 ou de EXOSC9, un composant de l'exosome ARN, entraînait des défauts de morphogenèse de l'épiderme dorsal. Afin d'identifier l'origine moléculaire de ces défauts, j'ai réalisé l'analyse transcriptomique par séquençage à haut débit (RNA-Seq) des morphants PTBP1 et EXOSC9. J'ai produit des banques d'ADNc à partir des morphants ou d'embryons témoins et celles-ci ont été séquencées au Génoscope. L'analyse d'une cible connue de PTBP1 a montré que des modifications minoritaires de l'épissage étaient détectées à partir de ces données. De plus ces défauts d'épissage ne sont pas retrouvés dans les morphants EXOSC9, validant son utilisation comme crible additionnel permettant d'exclure les évènements d'épissage qui ne sont pas impliqués dans le défaut d'épiderme. Une approche gène candidat a été initiée afin de cibler l'analyse de transcrits impliqués dans la morphogenèse de l'épiderme dorsale
My work has focused on the function of RNA binding-proteins during early development in Xenopus. I first documented the expression pattern of members of the AU-rich element binding protein (ARE-BP) and of the polypyrimidin tract binding protein (PTB) families during development. Study of the expression patterns of five members of the ARE-BP family (AUF1, KSRP, HuR, TIA1 and TTP) has underlined the broad role and the redundancy of expression of four of these proteins. Conversely, the highly specific expression pattern of TTP in macrophages suggests a potential function for this ARE-BP in hematopoietic development. My study of the PTB family (PTBP1, PTBP2 and PTBP3), has showed that each paralog presents a unique pattern of expression emphasizing their diverse functions during development. From previous work in the lab we knew that morpholino mediated knockdown of both PTBP1 and EXOSC9, a component of the RNA exosome, generated similar defects in the dorsal fin morphology. To identify the molecular origin of these defects we realized the transcriptome analysis by high throughput sequencing (RNA-Seq) of both morphants embryos. I produced cDNA libraries of control and morphant embryos and the sequencing was performed at the Genoscope. Analysis of a known PTBP1 target showed that even modest modifications of alternative splicing could be detected in our data sets. In addition, because these defects are not found in the EXOSC9 morphants it validated its use as an additional screen to exclude splicing events not involved in the epidermal defects. Identification of RNA whose deregulation may be involved in the fin phenotype is currently under study for a set of candidate genes

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Noiret, Maud. "Étude des protéines de liaison à l'ARN des familles PTB et ARE-BP au cours du développement chez le xénope." Phd thesis, Université Rennes 1, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00786151.

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Abstract:

Mes travaux ont porté sur l'étude de deux familles de protéines de liaison à l'ARN, la famille des ARE-BP (AU-rich elements binding protein) et la famille des PTB (Polypyrimidine tract binding protein) au cours du développement chez le xénope. L'étude de l'expression de cinq membres de la famille ARE-BP a mis en évidence une redondance d'expression tissulaire et temporelle entre quatre de ces ARE-BP (AUF1, KSRP, HuR et TIA1). A l'inverse, l'expression atypique de TTP a permis de suggérer son implication dans l'hématopoïèse. Mes travaux sur la famille PTB (PTBP1, PTBP2, PTBP3) ont montré que chacun des paralogues présente une expression spécifique ce qui suggère qu'elles aient des fonctions différentes lors du développement. Des résultats du laboratoire montraient que l'inactivation de PTBP1 ou de EXOSC9, un composant de l'exosome ARN, entraînait des défauts de morphogenèse de l'épiderme dorsal. Afin d'identifier l'origine moléculaire de ces défauts, j'ai réalisé l'analyse transcriptomique par séquençage à haut débit (RNA-Seq) des morphants PTBP1 et EXOSC9. J'ai produit des banques d'ADNc à partir des morphants ou d'embryons témoins et celles-ci ont été séquencées au Génoscope. L'analyse d'une cible connue de PTBP1 a montré que des modifications minoritaires de l'épissage étaient détectées à partir de ces données. De plus ces défauts d'épissage ne sont pas retrouvés dans les morphants EXOSC9, validant son utilisation comme crible additionnel permettant d'exclure les évènements d'épissage qui ne sont pas impliqués dans le défaut d'épiderme. Une approche gène candidat a été initiée afin de cibler l'analyse de transcrits impliqués dans la morphogenèse de l'épiderme dorsale.

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Brottier, Philippe. "Étude fonctionnelle d'une protéine non structurale de rotavirus : la protéine NS53 fixe le zinc et l'ARN." Compiègne, 1991. http://www.theses.fr/1991COMPD402.

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Les rotavirus constituent un groupe de virus classe dans la famille des Reoviridae et sont reconnus comme l'agent étiologique majeur des gastro-entérites néonatales de nombreuses espèces animales. Notre connaissance du cycle viral est encore très incomplète et en particulier du rôle joué par les cinq protéines non structurales dans la réplication virale. La protéine non structurale NS53 codée par le segment 5 est synthétisée à faible niveau dans la cellule. Pour étudier ses propriétés fonctionnelles, l'ADNc du gène 5 de rotavirus bovin a été cloné dans un vecteur de transfert baculovirus sous le contrôle du promoteur fort de la polyédrine. Les baculovirus recombinants expriment, dans les cellules d'insecte, la protéine NS53 en quantité importante sous une forme stable mais insoluble. L'expression abondante de la protéine recombinante nous a permis d'obtenir un antisérum spécifique de la protéine NS53 naturelle présente dans les cellules MA104 infectées par le rotavirus. A l'aide de ce sérum, nous avons confirmé que la protéine NS53 n'est pas associée aux particules virales simple ou double capside, mettant ainsi fin aux controverses sur sa nature non structurale. L'analyse de la séquence de la protéine révèle la présence de deux arrangements de cystéines caractéristiques d'un motif « doigt à zinc » récemment identifié dans la séquence de nombreuses protéines régulatrices qui fixent les acides nucléiques. De plus, bien que le segment 5 montre une extrême variabilité de séquence, le motif « doigt à zinc » de l'extrémité NH2 terminale de la protéine NS53 reste hautement conservé au sein des souches de rotavirus des groupes A et C. Par l'utilisation de plusieurs méthodes, nous avons montré que la protéine recombinante fixe spécifiquement le zinc et que celui-ci est impliqué dans la conformation compacte de la protéine en solution. En outre, la purification de la protéine recombinante par FPLC nous a permis de mettre en évidence la fixation de l'ARN simple brin sur la protéine. L'ensemble de ces résultats nous conduit à formuler l'hypothèse que la protéine NS53 pourrait être impliquée dans la formation des particules précoces RI et le regroupement ou l'encapsidation de l'ARN (+) dans les particules virales immatures.

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Bossevain, Clémentine. "Formation des P-bodies et régulations post-transcriptionnelles associées à leurs facteurs d'assemblage dans les cellules humaines." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2020. http://www.theses.fr/2020SORUS019.

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Abstract:

Les P-bodies (PB) sont des granules ribonucléoprotéiques concentrant des milliers d’ARNm particulièrement riches en AU, et une centaine de protéines. Parmi celles-ci, 3 répresseurs de la traduction : DDX6, LSM14A et 4E-T sont indispensables à l’assemblage des PB. Dans une 1ère partie, nous nous sommes intéressés au mécanisme d’assemblage des PB. Nous avons identifié par une approche de TAP-tag et de spectrométrie de masse les partenaires de LSM14A, de son paralogue LSM14B et de 4E-T. Le croisement de leurs interactomes avec ceux, déjà connus, de DDX6 et des PB révèle 8 nouveaux candidats d’assemblage des PB. Nous montrons que l’un d’eux, ILF3, contribue au maintien des PB. Nous montrons par ailleurs qu’une fraction de LSM14A est associée au complexe d’initiation de la traduction. La 2nde partie porte sur l’influence du contenu en GC sur les régulations post-transcriptionnelles. Nous avons cherché : si DDX6, LSM14A et 4E-T ont des préférences de liaison à l’ARN expliquant l’accumulation préférentielle d’ARNm riches en AU dans les PB, quelles informations apporte la localisation des cibles des miARN dans/hors des PB sur le mécanisme de régulation des ARNm par les miARN, et quels autres paramètres que le contenu en GC influenceraient la localisation des ARNm aux PB. Nos analyses montrent : que 4E-T est la seule des 3 protéines d’assemblage des PB à manifester une préférence de liaison pour les ARNm riches en AU, que la localisation dans les PB des cibles des miARN est associée à une répression de leur traduction dépendante de DDX6, et que la rétention d’ARNm riches en AU sur les membranes et les ribosomes concurrence leur recrutement aux PB
P-bodies (PBs) are ribonucleoprotein granules where thousands of mRNAs especially AU-rich, and hundreds of proteins concentrate. Among these proteins, three repressors of translation: DDX6, LSM14A and 4E-T are required to assemble PBs. In a first part, we looked at PB assembly mechanism. We identified by a TAP-tag approach coupled to mass spectrometry analysis protein partners of LSM14A, its paralog LSM14B and 4E-T. Crossing their interactomes with already known DDX6 and PB interactomes revealed 8 new PB assembly candidates. We demonstrate that one of them, ILF3, contributes to PB maintenance. Concerning LSM14A, we show that a fraction of LSM14A associates to the initiation complex. In a second part, related to the influence of GC content on post-transcriptional regulations, we asked: if DDX6, LSM14A and 4E-T have a RNA-binding preference that could explain accumulation of AU-rich mRNAs in PBs, how global localization of miRNA targets in/out PB is informative in regards to mRNA regulation mechanism by miRNAs, and which other parameters apart from mRNA GC content could influence mRNA localization to PBs. Our analyses show: that out of the 3 PB assembly factors, only 4E-T has a preference for AU-rich mRNAs, that localization to PBs of miRNA targets is correlated to their translational repression by DDX6 and that retention of AU-rich mRNAs on membranes and ribosomes competes with their localization to PBs

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Bouasker, Samir. "Participation de l'activité endonucléasique des protéines argonautes ALG-1 et ALG-2 dans la maturation des miARN chez C. Elegans." Thesis, Université Laval, 2012. http://www.theses.ulaval.ca/2012/29019/29019.pdf.

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Romero, barrios Natali. "Non-codings RNAs, regulators of gene expression in Arabidopsis thaliana root developmental plasticity Noncoding Transcription by Alternative RNA Polymerases Dynamically Regulates an Auxin-Driven Chromatin Loop Battles and hijacks: noncoding transcription in plants Long noncoding RNA modulates alternative splicing regulators in Arabidopsis Detection of generic differential RNA processing events from RNA-seq data." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS128.

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Abstract:

Les techniques de séquençage à haut-débit développées ces dernières années ont permis d'identifier des milliers d’ARN non-codants et des événements tels que l’épissage ou l’édition. Cette approche est à l’origine d’une meilleure compréhension des mécanismes régulant l'expression des gènes. Les longs ARN non-codants (lncARN) ont ainsi émergé comme des acteurs clés de la régulation de divers processus développementaux. Ils agissent soit directement sous leur forme longue par des interactions lncARN-protéine(s) soit après une étape de maturation qui génère des siARN ou des miARN régulateurs, menant à l’extinction génique par clivage des ARNm, la répression de la traduction ou en entrainant des modifications épigénétiques (ADN/chromatine) de leurs cibles. L’objectif de cette thèse était d’élucider les mécanismes d'action de lncARNs dans le développement de la plante. J'ai contribué à l'analyse de l'action du lncARN APOLO dans la régulation de la topologie de la chromatine chez Arabidopsis thaliana. Ensuite, j’ai concentré mes efforts sur le lncARN ASCO (Alternative Splicing COmpetitor) qui interagit avec les protéines NSRs (Nuclear Speckles RNA-binding Proteins) et participent au patron d’épissage de certains gènes cibles. Lors d’un traitement par l’auxine, NSRb est induit alors qu’ASCO est réprimé dans les racines. Le même type de traitement, chez le double mutant nsra/b et les lignées surexprimant ASCO, entraine déficience partielle dans la formation des racines latérales. En utilisant un nouvel outil bio-informatique appelé "RNAprof", nous avons détecté 1885 ARN différentiellement maturés entre le mutant nsra/b et la lignée sauvage traités à l’auxine. Parmi ces gènes, nous avons identifié ARF19, un régulateur clé de la voie de signalisation de l’auxine au cours de l'initiation et le développement de la racine. J’ai démontré qu'ARF19 interagit directement avec les NSRs et qu’il est différentiellement polyadénylé dans le double mutant nsra/b, conduisant à une isoforme plus courte du transcrit ARF19. D’autre part, parmi les gènes dérégulés de manière transcriptionnelle chez le mutant des gènes impliqués dans la signalisation par l’éthylène ont été identifiés. J’ai ensuite montré que plusieurs de ces gènes sont aussi dérégulés dans les plantes mutantes arf19-1 et arf19-2 en réponse à l’auxine, soutenant un rôle d'ARF19 dans la réponse croisée entre l’auxine et l’éthylène. Le gène NSRb est induit par l'éthylène et l'inhibition de la synthèse d'éthylène par l'AVG complémente le phénotype de racine latérale du mutant nsra/b en réponse à l’auxine. De plus, l'AVG et la surexpression d’ASCO augmentent l'accumulation de l’isoforme courte d’ARF19. Cette étude met en avant la capacité du lncARN ASCO à moduler l’épissage par le détournement des NSRs et la capacité des ARN non-codants à moduler l’épissage
In the last years, high-throughput sequencing techniques have made possible to identify thousands of noncoding RNAs and a plethora of different mRNA processing events occurring in higher organisms. This led to a better understanding of different regulatory mechanisms controlling gene expression. Long noncoding RNAs (lncRNAs) are emerging as key players in the regulation of varied developmental processes. They can act directly in a long form by lncRNA-protein interactions or be processed into shorter small si/miRNAs, leading to mRNA cleavage, translational repression or epigenetic DNA/chromatin modification of their targets. In this study, we aim to understand the mechanism of action of lncRNAs in plant development. Initially, I contributed to the analysis of the action of the APOLO lncRNA in chromatin topology regulation. Then, I focused my work on the lncRNA ASCO (Alternative Splicing COmpetitor) that interacts with NSRs (Nuclear Speckles RNA-binding Proteins) to modulate the splicing pattern of NSR-regulated mRNA targets. Auxin treatment induces NSRb and represses ASCO expression in roots. The nsra/b double mutant and ASCO overexpressing lines treated with auxin are partially impaired in lateral root formation. Using a new bioinformatic tool called “RNAprof”, we detected 1885 differential RNA processing events genome-wide in auxin-treated nsra/b mutants compared to WT. Among them, we identified ARF19, a key regulator of auxin signaling in lateral root initiation and development. I demonstrated that ARF19 is directly bound by both NSRs and that in the nsra/b double mutant ARF19 is alternatively polyadenylated leading to a short transcript isoform. Furthermore, among the transcriptionally deregulated genes in the nsra/b mutant plants, I identified an important group related to ethylene response. I further showed that several of these genes are also deregulated in the arf19-1 and arf19-2 mutants plants in response to auxin, supporting a role of ARF19 in the auxin-ethylene crosstalk. NSRb is also induced by ethylene and the inhibition of ethylene synthesis by AVG rescues the nsra/b double mutant lateral root phenotype in response to auxin. Moreover, AVG and ASCO overexpression lead to increased accumulation of the ARF19 short isoform. Altogether, this study shed new light on the role of the lncRNA ASCO in the regulation of RNA processing by hijacking NSRs and the capacity of non-coding RNAs to modulate splicing

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De, Queiroz Bruna. "La localisation axonale des ARNms est essentielle à la formation de mémoire à long-terme chez la drosophile." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur, 2023. https://intranet-theses.unice.fr/2023COAZ6039.

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Abstract:

Les mémoires à long terme sont établies et maintenues dans le cerveau par des changements moléculaires et structurels durables qui se produisent au niveau des synapses en réponse à l'activation neuronale. Ces changements nécessitent une nouvelle expression génétique, impliquant non seulement la transcription et la traduction d'ARN à l'échelle du neurone, mais aussi la traduction locale d'ARNm quiescents transportés vers les axones ou les dendrites et stockés aux synapses sous forme de granules de ribonucléoprotéines (RNP). Il reste à démontrer si le transport et la traduction locale des ARNs sont nécessaires à la mémoire à long terme (MLT) dans le contexte des circuits de mémoire physiologiques, et comment ils sont régulés. Aborder cette question in vivo reste un défi en raison de la difficulté à perturber spécifiquement la régulation locale de l'ARN. Mon projet de thèse visait à (1) caractériser le pool d'ARNm localisé dans les terminaux pré-synaptiques des structures centrales de la mémoire chez la drosophile, (2) identifier les bases mécanistiques du transport d'ARNm vers les axones, et (3) étudier le rôle de la localisation des ARNm dépendant de la protéine Imp dans la formation de la mémoire à court et long terme.Par imagerie smFISH à haute résolution, j'ai identifié des ARNm localisés dans les axones des Corps Pédonculés (CPs), qui sont les principales structures impliquées dans l'apprentissage associatif et la formation de la mémoire. L'abondance axonale de ces ARNms varie suivant les transcrits, et certains sont recrutés spécifiquement dans certains sous-compartiments. Afin de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la localisation axonale des ARNms, j'ai étudié la distribution des cibles ARN de Imp, une protéine de liaison aux ARNs conservée transportée de façon sélective jusqu ‘aux axones des neurones g des CPs. L'analyse de constructions rapporteurs a démontré que le transport axonal dépendait de leur 3'UTR. De plus, ce travail a révélé que le ciblage axonal d'un sous-ensemble de ces ARNm est altéré lors de la suppression du domaine de type prion de l'Imp (PLD), un domaine requis pour le transport axonal de l'Imp. Afin d'évaluer fonctionnellement l'importance de la régulation locale des ARNs axonaux in vivo, j'ai développé et effectué des tests de conditionnement de courtship en utilisant des males Imp-ΔPLD, dans lesquels le transport de certains ARNs est spécifiquement altéré. Ces expériences ont révélé que les drosophiles Imp-ΔPLD, bien que capables d'établir des mémoires à court-terme, sont incapables de consolider des mémoires à long-terme, un phénotype induit par l'inactivation de Imp dans les neurones γ des CPs.En conclusion, l'ensemble de mes travaux a permis de mettre en évidence un mécanisme sélectif de ciblage des ARN vers des compartiments pré-synaptiques des circuits de mémoire in vivo et de démontrer son importance physiologique pour l'établissement de la mémoire associative à long terme
Long-term memories are established and maintained in the brain by long-term molecular and structural changes occurring at synapses in response to neuronal activation. Such changes require new gene expression, involving not only neuron-wide transcription and translation of RNAs, but also local translation of quiescent mRNAs transported to axons or dendrites and stored at synapses as ribonucleoprotein (RNP) granules. Whether RNA transport and local RNA translation are required for long-term memory (LTM) in the context of memory circuits, and how they are regulated remain to be demonstrated. Addressing this question in vivo has remained challenging due to the difficulty in specifically perturbing local RNA regulation. The objectives of my PhD project were: (1) to characterize the pool of mRNAs that localize to synapses in Drosophila memory circuits, (2) to identify the mechanistic basis of mRNA transport to axons, and (3) to investigate the role of mRNA localization dependent on the RNA-binding protein Imp in short-term memory and LTM formation.Focusing on Mushroom Bodies (MB), which are the main structures involved in associative learning and memory formation, I identified through high-resolution smFISH imaging mRNAs with varying axonal abundances, some exhibiting compartment-specific recruitment. To better understand the mechanisms underlying axonal mRNA localization, I investigated the localization of mRNA targets of Imp, a conserved component of transport complexes selectively recruited to MB γ axons. Analyzing the distribution of reporter constructs showed that their transport depends on 3'UTR sequences. Furthermore, this work revealed that axonal targeting of a subset of these mRNAs is altered upon deletion of the Imp prion-like domain (PLD), a domain required for Imp axonal transport. To functionally assess the importance of local RNA regulation in vivo, I then developed and performed courtship conditioning assays using Imp-ΔPLD flies, in which Imp RNA transport is selectively altered. Thus, I uncovered that Imp-ΔPLD flies fail to establish LTM, but exhibit normal short-term memory, a phenotype induced by the loss of functional Imp specifically in MB γ neurons.Together, this work uncovered a selective mechanism underlying the targeting of RNAs to presynaptic compartments of memory circuits in vivo and demonstrated its physiological importance for the establishment of long-term associative memory

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Mennour, Sabrina. "Activité de liaison à l’ARN des protéines de la voie de signalisation MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) dans le mélanome LncRNA-Mediated Protein-Protein Scaffolding in Intracellular Signal Transduction Pathways." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL062.

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Abstract:

Des études récentes ont souligné l'importance des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine. En permettant l'assemblage de complexes protéiques nucléaires, les ARN non codants agissent comme des échafaudages et favorisent ainsi les interactions protéine-protéine afin de réguler l'état de la chromatine. Les ARN sont également capables d’interagir avec des protéines pour en moduler leurs activités, leurs interactions ou encore leurs localisations. Cependant, le rôle potentiel des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine dans les principales voies de transduction du signal cytoplasmique reste largement inconnu. L’objectif de la thèse a consisté à rechercher et à mettre en évidence une activité de liaison directe à l’ARN de protéines impliquées dans les voies de transduction du signal cytoplasmique et d’évaluer le rôle des interactions ARN-protéines de transduction sur la signalisation intra-cellulaire. En utilisant des approches de CLIP (CrossLink et ImmunoPrécipitation) et de 2C (Complexe Capture : purification d’ARN basée sur leur affinité pour une matrice de silice), qui peuvent mettre en évidence des interactions directes entre les protéines et les ARN in vivo, nous avons démontré une interaction directe avec l’ARN de certaines protéines clés de la voie de signalisation MAPK. Des approches de microscopie telles que le PLA (Proximity Ligation Assay) nous ont permis de démontrer une modulation des interactions protéine-protéine dépendant de l'ARN dans la voie MAPK, suggérant qu'une composante ARN est impliquée dans la stabilisation de ces interactions protéine-protéine. Nous avons spécifiquement identifié un mutant de délétion BRAF, une protéine oncogène centrale et une cible thérapeutique dans le mélanome, qui montre une déficience dans son activité de liaison à l'ARN, ainsi qu’une activité de signalisation réduite. En mettant en évidence l'existence d'une modulation des interactions protéine-protéine médiée par l'ARN, cette étude démontre l'importance sans précédent de l'activité de liaison à l'ARN des principales protéines de transduction du signal qui devrait être prise en compte dans la compréhension et le ciblage des cellules tumorales
Recent studies have underscored the importance of RNAs in the regulation of protein-protein interactions. By allowing the assembly of protein complexes, non-coding RNAs act as scaffolds and thus promote protein-protein interactions in order to regulate the chromatin state. RNAs are also able to interact with proteins in order to modulate their activities, interactions or localisation. In the cytoplasm, signalling pathways are regulated through a cascade of protein-protein interactions. In the MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) signalling pathway, the binding of a ligand to a membrane receptor triggers a cascade of phosphorylation and protein-protein interactions that allow the transduction of the signal. Abnormal activity of this pathway through increased ligand binding or activating mutations lead to cellular dysfunction associated with tumor initiation and progression.The potential role of RNAs in the direct regulation of protein-protein interactions of key cytoplasmic signal transduction pathways remains largely unknown. The aim of the thesis was to investigate and demonstrate the direct RNA binding activity of proteins involved in the MAPK pathway and to evaluate the role of RNA-protein interactions on intracellular signalling.Using a combination of CLIP (crosslinking and immunoprecipitation) and silica matrix-based affinity capture (2C complex capture) approaches that can uncover direct interactions between proteins and RNAs in vivo, we demonstrated a direct interaction between key MAPK signalling proteins and RNA in melanoma cells. Subsequent microscopy studies using proximity ligation assay (PLA) led us to demonstrate an RNA-dependent modulation of protein-protein interactions in the MAPK pathway, suggesting that an RNA component is involved in the stabilization of these protein-protein interactions. We specifically identified a deletion mutant in BRAF, a central oncogenic protein and therapeutic target in melanoma, that lacks RNA binding activity and harbors decreased signalling activity.By highlighting the existence of an RNA-mediated modulation of protein-protein interactions, this study shows the unprecedented importance of the RNA binding activity of key signal transduction proteins that should be considered in the understanding and targeting of tumor cells

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Bourdon, Sebastien. "Régulation des ARN G-Quadruplexes par les protéines de liaison à l'ARN et leur interaction avec les N6-Méthyladénosines dans les cellules du cancer." Electronic Thesis or Diss., Université de Toulouse (2023-....), 2024. http://www.theses.fr/2024TLSES129.

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Abstract:

Le développement du cancer et la réponse aux traitements sont associés à des variations de la régulation post-transcriptionnelle qui entraîne une modification du protéome qualitativement et/ou quantitativement. La régulation post-transcriptionnelle implique des protéines de liaison à l’ARN (RBP), interagissant avec des éléments cis comme les séquences, les modifications ou les structures de l’ARN. Parmi ces éléments cis, les structures non-canoniques nommées ARN G-Quadruplexes (RG4), et les modifications N6-Méthyladénosines (m6A), jouent un rôle critique dans le modelage post-transcriptionnel guidant l’expression des gènes du cancer, et leur ciblage est actuellement envisagé par des essais pré-cliniques. L’un des défis majeurs de ce champ de recherches repose sur la compréhension des mécanismes contrôlants la sélectivité des sites modifiés en m6A, leur reconnaissance et leur suppression, ainsi que sur l’identification des régulateurs de la structuration des RG4. Pour répondre à ces défis, la colocalisation entre les RG4 et les m6A et leur régulation mutuelle doit encore être étudiée de manière claire. Un autre objectif clé consiste à relier les interactions entre les protéines liant les RG4 dans les transcrits et leurs fonctions biologiques liées au cancer en tirant parti des prédictions de la structuration des RG4 et des données expérimentales sur les RG4 et les RBP. Mon projet de thèse aborde ces deux défis centrés sur la régulation cis- et trans- des RG4, en utilisant des approches multidisciplinaires incluant la bioinformatique, la biologie moléculaire et cellulaire. Pour cartographier et caractériser globalement les régulateurs agissant en trans sur les RG4, nous avons développé QUADRatlas (https://rg4db.cibio.unitn.it), une base de données de RG4 identifiés expérimentalement et prédits par ordinateur dans le transcriptome humain, liés à leurs fonctions biologiques et à leurs associations aux pathologies (Bourdon et al, NAR, 2023). Ce travail offre un accès à un large catalogue construit manuellement de protéines de liaison aux RG4 connues, complété par un vaste ensemble de données de sites de liaison de RBP pour découvrir de nouvelles interactions potentielles RG4-RBP. Notre étude sur l'interaction entre les RG4 et les m6A a révélé leur colocalisation dans le transcriptome codant humain. Nous avons démontré in vitro que la stabilité des RG4 n'était pas inhibée par la présence de m6A. Cependant, nous avons montré que la stabilisation des RG4 diminuait le niveau global de m6A dans les lignées cellulaires cancéreuses. Pour expliquer cet effet, nous avons étudié la capacité des RBP à se lier aux RG4, m6A ou aux RG4 contenant des m6A (RG4(m6A)). Nous avons découvert que les RG4s pouvaient agir comme des plateformes pour les protéines de liaison aux m6A et ainsi réguler leur présence sur les transcrits. Ce travail fournit des informations essentielles sur la régulation mutuelle de deux éléments cis majeurs de l'ARNm par les RBP. De futures analyses seront nécessaires pour découvrir l’effet de la colocalisation RG4(m6A) sur l’expression des gènes du cancer
Cancer development and response to treatments are associated to post-transcriptional rewiring which in turn modifies the cancer proteome qualitatively and/or quantitatively. Post-transcriptional regulation involves RNA binding proteins (RBP) interacting with cis-acting elements like RNA sequences, modifications or structures. Among the cis-regulators, non-canonical structures, called RNA G-Quadruplexes (RG4), and N6-methyladenosines modifications (m6A), play a critical role in shaping post-transcriptional expression of cancer genes and their targeting is currently investigated in pre-clinical studies. One major challenge in the field lies in understanding the mechanisms controlling selectivity in m6A deposition, reading and removal, as well as deciphering RG4 folding and regulators. Whether m6A and RG4 colocalize and regulate each other remains to be fully investigated. Another key challenge is to link RG4-protein interactions in transcripts to cancer-relevant biological functions by leveraging predictions of RG4 structuration and experimental data on RG4 and RBP.My thesis project tackled these two challenges centered on the cis- and trans- regulation of RG4s, using multidisciplinary approaches including bioinformatics, molecular and cellular biology. To globally map and characterize RG4 trans-acting regulators, we developed QUADRatlas (https://rg4db.cibio.unitn.it), a database of experimentally-derived and computationally predicted RG4 in the human transcriptome, linked with their biological function and disease associations (Bourdon et al, NAR, 2023). This work provides a broad access to a manually curated catalogue of known RG4-binding proteins, complemented with an extensive RBP binding sites dataset to discover new potential RG4-RBP interactions. Our study on the interplay between RG4 and m6A revealed their colocalization in the human coding transcriptome. We demonstrated in vitro that RG4 stability was not inhibited by m6A presence. However, we showed that the stabilisation of RG4 decreased global m6A level in cancer cell lines. To explain this effect, we studied the ability of RBP to bind RG4, m6A or RG4 containing m6A (RG4(m6A)) and found that RG4 could act as a platform for m6A binding proteins and thus regulate their presence on transcripts. This work provides insights on the co-regulation of two major mRNA cis-acting elements by RBP. Future analyses will then be needed to unravel the effect of RG4(m6A) colocalization on cancer gene expression

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Formicola, Nadia. "Remodelage des granules ARN en réponse à l’activité neuronale." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2019. http://theses.univ-cotedazur.fr/2019AZUR6008.

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Abstract:

Une des questions les plus fascinantes – et les plus ouvertes – en neuroscience est de comprendre comment les cellules neuronales contribuent à la formation, le maintien puis le rappel des souvenirs. Des travaux antérieurs ont montré que la formation de la mémoire à long-terme (MLT) requiert la synthèse de novo de protéines, impliquant non seulement la traduction d’ARNs nouvellement transcrits, mais aussi la traduction locale, induite par l’expérience, d’ARNms latents transportés et stockés dans les synapses. En vue de leur transport et du contrôle de leur traduction, les ARNms sont empaquetés avec des protéines de liaison aux ARNs (RBP), qui sont majoritairement des répresseurs de traduction, dans des granules ribonucléoprotéiques (RNP). La manière dont les granules RNP neuronaux sont remodelés en réponse à l’activité neuronale pour lever la répression traductionelle des ARNms est pour l’instant peu claire. En outre, l’impact fonctionnel d’un tel remodelage sur l’établissement de la MLT reste à démontrer in vivo. L’objectif de mon doctorat était 1) d’étudier les mécanismes in vivo qui sous-tendent le remodelage des granules RNP neuronaux ; 2) de tester l’hypothèse que les granules RNP pourraient être impliqués dans les mécanismes de renforcement de la MLT en régulant l’expression génétique. Dans cette optique, j’ai utilisé comme modèle des granules RNP contenant la RBP conservée Imp chez la drosophile. Tout d’abord, j’ai étudié l’impact de l’activité neuronale sur les propriétés des granules RNP Imp, en traitant des explants de cerveau soit avec du KCl, soit avec le neuromodulateur Tyramine. Dans les deux cas, un désassemblage des granules RNP Imp - caractérisé par une dé-granulation à la fois de Imp et d’autres composants – est observé. Le désassemblage des granules RNP est réversible après retrait de la tyramine, et n’a pas été observé dans les neurones hyperpolarisés. Il ne dépend pas strictement du domaine de type prion qui se trouve à l’extrémité carboxy-terminale de Imp, un domaine connu pour être impliqué dans l’homéostasie des granules RNP. De plus, mes données suggèrent que ce désassemblage soit lié à une augmentation de la traduction des ARNms associés, ce qui est cohérent avec un modèle dans lequel le remodelage des granules RNP induit par l’activité des neurones induit une dé-répression de la traduction. Ensuite, j’ai recherché les mécanismes contrôlant le remodelage des granules RNP. Un candidat pour cette régulation était CamkII, une kinase conservée activée par le calcium, et identifiée comme partenaire de Imp dans une analyse d’immunoprécipitation-spectrométrie de masse. Au cours de mon doctorat, j’ai pu valider l’intéraction Imp-CamkII et montrer qu’elle n’est pas médiée par l’ARN, mais dépend de l’activité de CamkII. De plus, j’ai montré qu’inhiber l’activité de CamkII empêche le désassemblage des granules RNP Imp observé lors de l’activation neuronale, suggérant que CamkII pourrait être impliquée dans le remodelage des granules RNP Imp induit par l’activité neuronale. Ces résutats sont particulièrement intéressants dans le contexte de l’établissement de la MLT, car CamkII est depuis longtemps reconnue comme y étant essentielle. Plus encore, nous avons récemment démontré chez la drosophile qu’inactiver la fonction de Imp dans une population de neurones du cerveau central impliquée dans l’apprentissage et la mémoire – les neurones du Mushroom Body – altère radicalement la MLT. En conclusion, mes résultats sont cohérents avec un modèle où le remodelage des granules RNP Imp en réponse à l’activation neuronale dépend de CamkII, et pourrait contribuer à la formation de la MLT in vivo
One of the most fascinating – and still open – questions in neuroscience is how neuronal cells can form, store and then recall memories. Previous work has shown that Long-term memory (LTM) formation requires de novo protein synthesis, involving not only translation of newly transcribed RNAs, but also local, experience-induced translation of quiescent mRNAs carried and stored at synapses. For their transport and translational control, mRNAs are packaged with regulatory RNA binding proteins (RBPs), mainly translational repressors, into ribonucleoprotein (RNP) granules. To date, how neuronal RNP granules are remodelled in response to neuronal activity to relieve translation repression of mRNAs is unclear. Furthermore, the functional impact of such a remodelling in the establishment of long-term memories remains to be demonstrated in vivo. The objective of my PhD was to 1) investigate the in vivo mechanisms underlying activity-dependent remodelling of neuronal RNP granules; 2) test the hypothesis that RNPs could be involved in LTM-underlying mechanisms by regulating gene expression. To this end, I used as paradigm RNPs containing the conserved RBP Imp in Drosophila. First, I studied the impact of neuronal activity on Imp RNP properties by treating Drosophila brain explants with either KCl or the tyramine neuropeptide. In both cases, a disassembly of Imp RNPs was observed, characterized by a loss of both Imp and other RNP-component granular patterns, and a de-clustering of RNP-associated mRNA molecules. RNP disassembly could be reverted upon Tyramine withdrawal and was not observed in hyperpolarized neurons. Furthermore, my data suggest that RNP-disassembly is linked to increased translation of associated mRNAs, consistent with a model in which activity-induced RNP remodelling would lead to translational de-repression. Second, I investigated the mechanisms controlling RNP remodelling. A candidate regulator was CamkII, a conserved Ca2+ -activated kinase identified as a partner of Imp in an IP-Mass Spectrometry analysis. During my PhD, I could validate the Imp-CamkII interaction and showed that it is not mediated by RNA but depends on CamkII activity. Furthermore, I showed that inactivating CamkII function prevents the disassembly of Imp RNPs observed upon neuronal activation of brain explants, suggesting that CamkII may be involved in the activity-dependent remodelling of Imp RNP granules. These results are particularly interesting in the context of establishment of LTM, as CamkII has long been recognized as essential for LTM. Moreover, we recently showed in Drosophila that interfering with Imp function in a population of CNS neurons involved in learning and memory – the Mushroom Body γ neurons -, dramatically impairs LTM and that this effect relies on Imp C-terminal Prion-like domain, a domain known to be involved in RNP homeostasis. Altogether, my thesis work suggests a model where CamkII-dependent remodelling of Imp RNPs in response to neuronal activation might underlie LTM formation in vivo

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Bonnet-Magnaval, Florence. "Le rôle de la protéine de liaison à l'ARN Staufen 1 dans le développement et la progression tumorale." Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30383/document.

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Abstract:

Une des caractéristiques des cellules cancéreuses réside dans la modification de leur capacité à répondre à divers stress par rapport à des cellules saines. La modulation afférente de l'expression de gènes peut se produire à deux niveaux : transcriptionnel et post-transcriptionnel. La plupart des efforts de compréhension ont été axés sur l'étude la régulation transcriptionnelle. Néanmoins, une façon efficace et rapide de modifier l'expression des gènes est la capacité de réguler le " pool d'ARNm " pré-existant en intervenant au niveau post-transcriptionnel. Aussi, les modifications de la stabilité de l'ARNm et/ou de l'efficacité de traduction dans un contexte particulier tel que le stress tumoral et faisant intervenir des interactions ARN/protéines sont de plus en plus étudiés dans le cas des cancers. Une compréhension plus approfondie de ces mécanismes permettra de mieux comprendre 1/ l'implication des protéines liant l'ARN (RBP) dans le développement tumoral et 2/ considérer le développement de thérapies ciblées contre le cancer. Nous nous sommes concentrés sur l'étude d'une RBP pertinente vis à vis du cancer, mais très peu étudiée sur cette problématique : la protéine Staufen1 (Stau1). Stau1 est un membre de la famille des protéines qui lient l'ARN double-brin. Cette RBP contribue à la régulation post-transcriptionnelle de nombreux gènes par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir le transport, la dé-répression de la traduction et l'induction de la dégradation d'ARN messagers (ARNm) spécifiques. Stau1 apparait également comme un régulateur spécifique de l'expression génique intervenant dans un contexte particulier de stress cellulaire, contexte familier aux tumeurs en cours de développement. Les transcrits régulés par Stau1 se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles et il est intéressant de noter qu'une grande proportion d'entre eux code pour des protéines impliquées dans la régulation de processus biologiques cellulaires critique dans le développement de cancers. De part son rôle de régulateur de l'expression génique et son implication dans la réponse au stress cellulaire, nous avons émis l'hypothèse que la modification de l'expression de Stau1 puisse avoir un impact à différent niveaux sur le développement et la progression tumorale. Ce projet de thèse s'est orienté sur deux axes 1) l'étude de l'expression de Stau1 en condition de stress cellulaire et 2) l'effet de la répression de Stau1 sur le développement tumoral
One of the characteristics of cancer cells lies in the modification of their ability to adapt to various stresses compared to healthy cells. The afferent modulation of gene expression can occur at two levels: transcriptional and post-transcriptional. Most of the efforts for understanding the gene expression process are focused on transcriptional regulation study. However, a quick and effective way to modify gene expression is the ability to regulate the "mRNA pool" by intervening in post-transcriptional level. Besides, changes in mRNA stability and/or translation efficiency in a context such as cellular stress in tumors and interactions involving RNA / protein are increasingly studied in the case of cancers. A deeper knowledge of these mechanisms will allow a better understanding of 1 / the involvement of RNA binding proteins (RBP) in tumor development and the 2 / the consideration of the development of targeted cancer therapies. We focused on the study of a relevant RBP for cancer development process, but very few studies have been undertaken on this issue: the Staufen1 protein (Stau1). Stau1 is a family member of double-stranded RNA-binding proteins. This RBP contributes to the post-transcriptional regulation of many genes through its involvement in mechanisms that will promote the transport, the derepression of translation and the induction of degradation of specific RNA transcripts (mRNA). Stau1 also appears as a regulator of specific genes expressed in respond to cellular stress induced by an unfavorable tumor microenvironment. The transcripts regulated by Stau1 can be divided into a wide range of functional categories. Interestingly, a large proportion of Stau1 targets encode proteins which regulate many critical biological cell processes in cancer development. Regarding Stau1 regulatory role and its involvement in the response to cellular stress, we made assumptions that the modification of Stau1 expression could have an impact on various levels of development and tumor progression. This project will be considered from two aspects 1/ the study of Stau1 expression under cellular stress 2/ the impact of Stau1 repression on tumor development

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Rengifo, Gonzalez Juan. "Caractérisation structurale de TDP-43, une protéine de liaison à l’ARN, impliquée dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASE008.

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Abstract:

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ou Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative fatale et sans remède avec une prévalence de 2,5 à 3 cas par 100 000 habitants. Ce travail de thèse est consacré à TDP-43, une protéine de liaison à l'ARN, impliquée dans cette maladie et retrouvée dans des inclusions cytoplasmiques des neurones et motoneurones de malades SLA. Cette protéine cible principalement des longues séquences d'ARN riches en répétitions GU. En conditions normales, TDP-43 est localisée majoritairement dans le noyau. Elle est impliquée dans des processus d'épissage de l'ARN messager ainsi que dans la maturation et transport des ARNs. TDP-43 est impliquée dans la plasticité neuronale et dans la formation de compartiments appelés « phases liquides » par l'intermédiaire de granules de stress. Auparavant, il a été démontré que le domaine N-terminal (NTD) ainsi que le domaine C-terminal (CTD) intrinsèquement désordonné de TDP-43 sont impliqués dans des autoassemblages constitués de complexes de haut poids-moléculaire. Au cours de ce processus, le rôle des domaines RRMs responsables de la fixation de l'ARN reste à déterminer. Ainsi, le mécanisme déchiffrant le rôle de la fixation de cette protéine à l'ARN, dans son maintien à l'état normal ou pathologique, reste à élucider.Par une approche intégrative, nous avons entrepris une étude approfondie de la fixation de TDP-43 sur de longues séquences poly-GU, trouvées dans des régions introniques de certains pré-ARNm cibles de TDP-43. Nous avons montré que TDP-43 se fixe sur ces cibles poly-GU de manière coopérative en formant des multimères. Un modèle structural 3D a été obtenu lequel met en évidence une interface d'interaction entre deux unités monomériques de TDP-43 qui favorise la multimérisation. Cette interface intermoléculaire implique une poche centrée autour du résidu Val220, localisé dans le domaine RRM2 du premier monomère et la boucle 3 du domaine RRM1 de la seconde unité monomérique. Les résidus d'acides aminés et les interactions mises en jeu, pour la stabilité de cette interface, ont été identifiés. Par la suite, nous avons étudié in cellulo des formes mutées de TDP-43 dont la coopérativité est altérée. Ainsi, nous avons montré que la coopérativité de liaison de TDP-43 à l'ARNm est déterminante pour la solubilité de cette protéine aussi bien que pour la miscibilité de ses condensats dans les granules du stress au niveau du cytoplasme. Enfin, un modèle mécanistique a été proposé selon lequel des assemblages de TDP-43 mettant en jeu ses domaines RRM liés sur l'ARN, limitent des auto-interactions entre les domaines NTD et CTD des unités monomériques adjacentes. Ces assemblages favoriseraient ainsi la dynamique et la solubilité des complexes TDP-43/ARN. Une altération de la coopérativité d'interaction de ce complexe pourrait faciliter une fixation désordonnée de TDP-43 le long des ARNs ce qui favoriserait une abondance des interactions entre les domaines NTD et CTD et ainsi promouvoir l'agrégation de TDP-43. En conclusion, la multimérisation de TDP-43 opérée sur la plateforme ARN cible jouerait ainsi un rôle crucial dans le contrôle de son agrégation et dans certains processus d'épissage des ARN messagers
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease without any cure. The prevalence of ALS accounts for 2.5 to 3 cases per 100.000 inhabitants. This thesis work is devoted to TDP-43, an RNA-binding protein involved in ALS and found in cytoplasmic inclusions of neurons and motor neurons from ALS patients. The targets of TDP-43 are primarily GU-rich RNA sequences. In physiological conditions, TDP-43 localizes predominantly in the nucleus. The functions of this protein are associated to the splicing of messenger RNAs as well as the maturation and transport of RNAs. TDP-43 is also involved in the neuronal plasticity and in the formation of membrane-less compartments called “liquid-liquid phases” through the formation of stress granules (SGs). While the high-order TDP-43 self-assembly by its structured N-terminal (NTD) and the intrinsically disordered C-terminal domains (CTD) has been extensively studied, the role of the RRM domains responsible for the RNA binding remains unaddressed. Therefore, the mechanism dissecting the role of high-order TDP-43/RNA complexes in maintaining TDP-43 functional, in normal and pathological conditions, needs to be investigated.Through an integrative approach, we undertook an in-deep study regarding the TDP-43 binding on long poly-GU sequences which are found in the intronic regions of many TDP-43 target pre-mRNAs. We have shown that TDP-43 binds on poly-GU targets in a cooperative manner by self-assembling into multimers. A 3D structural model has been also obtained which highlights an interaction interface between deux monomeric TDP-43 units leading to the protein multimerization. This intermolecular interface involves a pocket centered around the V220 residue, located in the RRM2 domain of the first TDP-43 monomer and the loop 3 of RRM1 of the second monomer. The amino acid residues and the intermolecular interactions essential for the interface stability have been identified. Additionally, we have investigated, by in cellulo methods, several mutant forms of TDP-43 in which the cooperativity is impaired. Thus, we demonstrate that the cooperative binding of TDP-43 on mRNAs is critical to maintain the solubility of nuclear TDP-43 and the miscibility of TDP-43 condensates within cytoplasmic SGs. Based on the results presented here, we propose a mechanistic model in which the high-order TDP-43 assemblies promoted by the RRM domains bound to the RNA, constitutes a steric barrier limiting short range self-interactions between consecutive NTDs and CTDs of adjacent monomeric TDP-43 units. These assemblies may therefore favorize the dynamics and solubility of TDP-43/mRNA complexes. Impairments in the cooperative interaction of these complexes may lead to an anarchic attachment of TDP-43 along mRNAs leading to an increased occurrence of self-attraction between the NTDs and CTDs. Impaired multimers may then promote the TDP-43 aggregation. In conclusion, the TDP-43 multimerization on target RNA platforms would play a crucial role in processes linked to the control of its aggregation and mRNA splicing

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Leriche, Mélissa. "Mise en évidence d’une interaction entre la protéine 53BP1 et les fragments d’Okazaki." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASS065.

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Abstract:

Le maintien de l’intégrité du génome est un processus crucial à la vie cellulaire. Ce n’est que récemment que les protéines de liaison à l’ARN (« RNA-binding protein » ou RBP) ont été montré être impliquées dans ce processus. En présence d’ADN endommagé, les RBP régulent l’expression des gènes de réponse aux dommages de l’ADN et contrôlent le destin cellulaire. Elles jouent également un rôle plus direct dans la prévention et la réparation des dommages de l’ADN. De plus, des ARN sont présents aux sites de dommages de l’ADN et participent au maintien de l’intégrité du génome. Ainsi, le laboratoire recherche des acteurs protéiques capables de lier directement l’ARN au sein des protéines médiatrices de la réponse aux dommages de l’ADN. Un des candidats est la protéine 53BP1 (p53 binding protein 1) qui contient un domaine de liaison à l’ARN nommé domaine GAR (« Glycine-Arginine Rich »). 53BP1 est un acteur central de la signalisation des cassures double-brin de l’ADN et de la régulation de leur réparation par le processus de jonction d’extrémités non homologues pendant la phase G1 du cycle cellulaire. Le recrutement de 53BP1 aux sites de dommages de l'ADN dépend à la fois d'interactions directes entre 53BP1 et des marques d’histones, mais aussi d’une composante ARN.L’objectif était d’étudier l’interaction entre 53BP1 et l’ARN.Grâce aux méthodes de CLIP (« CrossLinking and ImmunoPrecipitation ») et de 2C (« Complex Capture »), nous avons montré que 53BP1 possède une activité de liaison directe à l'ARN, via son domaine GAR. Nous avons identifié l’acide nucléique interagissant avec 53BP1 comme étant une chimère ARN-ADN constituée d’une partie d’environ 10 ribonucléotides, suivie d’environ 100 désoxyribonucléotides. Ce type de molécule est très similaire à celle des fragments d’Okazaki qui sont impliqués dans l’initiation de la synthèse du brin retardé de la fourche de réplication. Par la méthode de SIRF (« In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks »), nous avons montré que 53BP1 est présent au niveau de l’ADN naissant, dans un contexte de réplication normal. De plus, la déplétion de la sous-unité catalytique de la primase (PRIM1) qui synthétise l’amorce ARN des fragments d’Okazaki, conduit à la diminution de la présence de 53BP1 à proximité d’ADN naissant. La déplétion de PRIM1 affecte également l’interaction de 53BP1 avec la chimère ARN-ADN in vivo. Ces résultats indiquent que 53BP1 est présent à la fourche de réplication via une interaction directe avec les fragments d’Okazaki. Enfin, sous stress réplicatif induit par l’hydroxyurée, la présence de 53BP1 au niveau de l’ADN naissant est fortement augmentée, indiquant que 53BP1 s’accumule aux fourches de réplication bloquées. L'ensemble de ces résultats montre que 53BP1 est une protéine de liaison aux ARN qui interagit directement avec les fragments d’Okazaki
Maintenance of genome integrity is essential for cell survival. It is only recently that RNA-binding proteins (RBPs) have been shown as fundamental actors in this process. In the presence of DNA damage, RBPs regulate the expression of DNA damage response (DDR) related genes and control cell fate. RBPs also have a more direct role in preventing and repairing DNA damage. Moreover, some RNAs are present at sites of DNA damage and, thus, participate in the maintenance of genome integrity. The laboratory is interested in proteins that are both able to directly bind RNA and involved in DDR. One candidate is the 53BP1 protein (p53 binding protein 1) that contains an RNA-binding domain called GAR domain (Glycin-Arginin Rich). 53BP1 is a key protein mediating the signalling of DNA double-strand breaks and channels DNA repair to the non-homologous end-joining pathway during the G1 phase of the cell cycle. The recruitment of 53BP1 to sites of DNA damage depends on both histones marks and an RNA component.The objective was to study the interaction between 53BP1 and RNA.By using CLIP (CrossLinking and Immunoprecipitation) and 2C (Complex Capture) technologies, we showed that 53BP1 presents a direct RNA-binding activity within its GAR domain. We identified the nucleic acid interacting with 53BP1 as being an RNA-DNA chimera composed of about 10 ribonucleotides, followed by about 100 dexoribonucleotides. This type of entity is highly similar to that of Okazaki fragments, that are involved in the initiation of lagging strand synthesis at replication forks. By using the SIRF method (In Situ Protein Interaction with Nascent DNA Replication Forks), we showed that 53BP1 is localized at sites of newly synthetized DNA, under normal conditions of replication. Furthermore, depletion of the catalytic sub-unit of the primase (PRIM1), that catalyzes the synthesis of the RNA primer of Okazaki fragments, results in a decrease in 53BP1 at sites of newly synthetized DNA. PRIM1 depletion also decreases the interaction between 53BP1 and RNA-DNA chimera in vivo. These results indicate that 53BP1 is localized at the replication fork through a direct interaction with Okazaki fragments. Likewise, under replicative stress induced by hydroxyurea, the presence of 53BP1 at the newly synthetized DNA is increased, indicating that 53BP1 accumulates at stalled replication forks. Altogether, these results show that 53BP1 is an RNA-binding protein that directly interacts with Okazaki fragments

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Huot, Marc-Étienne. "Études de l'expression des protéines fragile X related 1 (FXR1P) durant le développement des vertébrés." Thesis, Université Laval, 2005. http://www.theses.ulaval.ca/2005/22666/22666.pdf.

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Abstract:

La famille des protéines Fragile X Related (FXR) comprend la protéine FMRP ainsi que les homologues FXR1P et FXR2P. En plus d'une forte homologie de séquence, tous les membres de cette famille de protéines possèdent des domaines caractéristiques aux molécules liant l'ARN ainsi que des signaux d'importation et d'exportation nucléaire. FMRP est l’archétype de cette famille de protéine, puisque son absence cause le retard mental avec X Fragile. Par contre, aucune pathologie n’est associée avec la perte d’expression des homologues FXR1P et FXR2P et ce, même si ces deux protéines ont été mises en évidence dans des processus développementaux chez la souris. En effet, cette famille de protéines semble jouer un rôle primordial durant l’embryogenèse, puisque la délétion de FMR1 et FXR2 provoque des troubles cognitifs, alors que FXR1 semble plutôt jouer un rôle dans la myogenèse et la spermatogenèse chez les mammifères. Cette diversification fonctionnelle de FXR1 semble être attribuable à l’expression complexe de ses différentes isoformes. En effet, chez les mammifères, quatre des six isoformes de FXR1P (70, 74, 78 et 80 kDa) sont exprimées dans tous les tissus à l’exception des muscles striés et cardiaques où elles sont remplacées par deux isoformes dites « muscle spécifique » (82 et 84 kDa). Le nombre élevé d’isoformes de FXR1 rend cette protéine difficile à étudier chez les mammifères. Cette expression de FXR1 est hautement conservée chez tous les vertébrés et peut être décelée chez plusieurs organismes tels le poulet, le poisson zèbre ainsi que chez la grenouille Xenopus laevis. Le xénope s’avère être le modèle exemplaire, puisque l’expression de xFxr1 y est beaucoup plus simple et ce, tout en conservant l’expression tissu spécifique de ces isoformes. En effet, seule une isoforme de 84 kDa est exprimée dans tous les tissus à l’exception des muscles striés et cardiaques où il y a expression d’une isoforme de 88 kDa. Étant donné le rôle dans les cellules musculaires striées, il est impératif de comprendre les implications de l’inactivation de ce gène chez les vertébrés.
Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP) is part of a mRNA-binding proteins family that includes the Fragile X Related 1 and 2 proteins (FXR1P and FXR2P). These proteins share multiple functional domains typical of mRNA-binding domain (two KH domains and 1 RGG box) as well as a nuclear and a cytoplasmic localization domain. Whereas absence of FMRP is the cause of Fragile X Mental Retardation in human, it is not known whether FXR1P and FXR2P are associated to any pathology and whether these homologous proteins can compensate for the absence of FMRP in the case of the Fragile X syndrome. Knockout mice for FXR proteins are powerful tools that are commonly used in research to shed light on the functions of these proteins and point out their embryonic involvement. However, the Fxr1 knockout mouse didn’t proved to be a good model as the two mentioned above. In mammals, we have shown that FXR1 play a key role in muscle differentiation, since two of the six isoforms are muscle specific and are believed to be essential for the normal development of the cardiac and skeletal muscle. Although essential for embryonic development, it is nearly impossible to study the developmental implication of the differential expression of these tissues specific proteins in mammals due to the large number of FXR1P isoform. Simpler model such as drosophila melanogaster are being used, but this model have only one proteins (dFMRP) which is expressed ubiquitously in this organism and do not represent the tissue specific expression of some of the family member. We choose an intermediate model such as Xenopus laevis, which is an extensively used model for developmental studies, and proceeded with the inactivation of xFxr1. In Xenopus laevis, we found two different xFxr1 proteins isoform; one short isoform (84 KDa) is ubiquitously expressed in every tissues except in muscle, whereas the long isoform (88 KDa) is expressed only in cardiac and skeletal muscle. Specific inactivation of xFxr1 messengers during the early development gave us new insight on the specific functions of these proteins during the embryogenesis and primary myogenesis.

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Hobeika, Maria. "Propriétés stucturales et fonctionnelles du domaine UBA de Mex67 : le récepteur d'export nucléaire des ARNm." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077225.

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Abstract:

De manière concomitante à leur synthèse, les ARNm néotranscrits sont sujets à différentes étapes de maturation conduisant à la formation de complexes ribonucléoprotéiques (RNPm) compétents pour l'export. Ces RNPm matures sont reconnus par le récepteur d'export, Mex67 chez la levure, TAP chez les métazoaires, qui assure leur translocation à travers le pore nucléaire. De récentes études ont montré que l'ubiquitination joue un rôle régulateur majeur dans l'export des ARNm. De manière intéressante, Mex67/TAP présente dans sa région C-terminale un domaine UBA (Ubiquitin associated) jusqu'à présent caractérisé pour son interaction avec les nucléoporines. L'objectif de cette thèse a été d'approfondir les propriétés structurales et fonctionnelles du domaine UBA de Mex67 en vue de mieux comprendre le rôle de l'ubiquitination dans l'export nucléaire des ARNm. Nous avons tout d'abord montré que le domaine UBA de Mex67 est capable de lier l'ubiquitine ainsi que des partenaires spécifiques ubiquitinés par des mécanismes que nous avons identifiés, tels que Hpr1, facteur impliqué dans l'élongation de la transcription ou encore Swd2 participant à la méthylation de l'histone H3 et à la maturation des ARNm à leur extrémité 3'. D'un point de vue structural, nous avons mis en évidence la particularité de ce domaine qui, en plus des trois hélices caractéristiques des domaines UBA, présente une hélice supplémentaire (hélice H4). Nos résultats montrent que cette hélice H4 interfère avec le site de liaison à l'ubiquitine d'une part et est nécessaire à la reconnaissance des substrats spécifiques tel que d'Hprl d'autre part. Plus précisément, l'interaction entre le domaine UBA de Mex67 et Hpr1 via l'hélice H4 provoque un changement conformationnel qui permet de rétablir le site de liaison à l'ubiquitine coordonnant ainsi la reconnaissance simultanée de l'ubiquitine et de substrats spécifiques. In w'tfo, le domaine UBA de Mex67 est important pour le recrutement co-transcriptionnel du récepteur et joue un rôle crucial dans l'export des ARNm. Nous avons par ailleurs montré que l'interaction entre le domaine UBA de Mex67 et Hpr1 ubiquitiné facilite le recrutement du récepteur couplant ainsi export des ARNm et élongation de la transcription. De manière plus générale, nous proposons un modèle de travail selon lequel Mex67 pourrait participer à la coordination des machineries de biogenèse et d'export des ARNm grâce à la capacité de son domaine UBA à interagir spécifiquement et de façon dynamique avec des partenaires ubiquitinés impliqués dans différentes étapes de la biogenèse des ARNm
Concomitantly to their transcription, newly synthesised mRNAs undergo several processing steps leading to export competent ribonucleoprotein particles (mRNP). Fully mature mRNPs are recognised by the essential mRNA export receptor Mex67 in yeast, TAP in metazoans, which promotes their translocation through the nuclear pore complex. Recent studies have shown that the ubiquitin pathway is involved in the regulation of mRNA nuclear export. Interestingly, the essential mRNA export receptor Mex67/TAP harbours in its C-terminus a UBA (Ubiquitin associated) domain so far described to interact with nucleoporins. The aim of this thesis was to analyse the structural and functional properties of the UBA domain of Mex67 in order to better understand the role of ubiquitylation in mRNA export. Our studies first showed that the UBA of Mex67 is able to bind ubiquitin and led to the identification of distinct and ubiquitinylated spécifie UBA-Mex67 interacting proteins implicated in different steps of transcription, including Hpr1, a transcription elongation factor and Swd2 which participates in histone H3 methylation and 3' end processing of mRNAs. The determination by NMR of the structure of the UBA domain of Mex67 has revealed a classical UBA-fold consisting of three alpha helices. However, it differs from other studied UBA domains by the presence of an additional C-terminal helix (helix H4). We found that helix H4 interferes with the ability of the UBA domain to interact with ubiquitin. However, H4 is also essential for the interaction with specific substrates like Hpr1 and once engaged in such interaction, a conformational change occurs that unmasks the ubiquitin binding site and restores the ability of UBA-Mex67 to interact ubiquitin. Altogether, these results led us to propose that the additional fourth helix of the UBA domain of Mex67 acts as a molecular switch that restricts UBA-Mex67/ubiquitin interaction to specific targets. In vivo, we reported that the UBA domain of Mex67 is not only required for proper nuclear export but also contributes to early co-transcriptional recruitment of the receptor. We showed that the interaction between UBA of Mex67 and Hpr1 facilitates the recruitment of the receptor coupling by this way nuclear export to transcription elongation. More generally, we proposed a working hypothesis in which Mex67 could participate in the coordination of biogenesis and export machineries due to the dynamic interaction of its UBA domain with specific partners implicated in different steps of mRNAs biogenesis

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Vijayakumar, Jeshlee Cyril. "Rôle du domaine de type prion de Imp dans la régulation des granules RNP neuronaux." Electronic Thesis or Diss., Université Côte d'Azur (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018AZUR4099.

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Abstract:

Les ARNms des cellules eucaryotes sont liés à des protéines de liaison aux ARNs (RBPs) et empaquetés au sein d’assemblages macro-moléculaires appelés granules RNP. Dans les cellules neuronales, les granules RNP de transport sont impliqués dans le transport d’ARNms spécifiques jusqu’aux axones et dendrites, ainsi que dans leur traduction locale en réponse à des signaux externes. Bien que peu de choses soient connues sur l’assemblage et la régulation de ces granules in vivo, des résultats récents ont indiqué que la présence de domaines de type prion (PLDs) dans les RBPs facilite les interactions protéines-protéines et protéines-ARN, favorisant ainsi la condensation de complexes solubles en granules RNP. La RBP conservée Imp est un composant central de granules RNP qui sont transportés dans les axones lors du remodelage neuronal chez la drosophile. De plus, la fonction de Imp est nécessaire au remodelage des axones lors de la maturation du système nerveux de drosophile. Une analyse de la séquence de la protéine Imp a révélé qu’en plus de quatre domaines de liaison aux ARNs, Imp contient un domaine C-terminal désordonné enrichi en Glutamines et Serines, deux propriétés caractéristiques des domaines PLDs. Lors de ma thèse, j’ai étudié la fonction de ce PLD dans le contexte de l’assemblage et du transport des granules RNP. J’ai observé en culture de cellules que les granules Imp s’assemblent en absence de PLD, bien que leur nombre et leur taille soient augmentés. Des protéines présentant une séquence PLD mélangée, au contraire, s’accumulent dans des granules au nombre et à la taille normale, indiquant que l’état désordonné de ce domaine, et non sa séquence primaire, est essentiel à l’homéostasie des granules. De plus, des expériences de FRAP réalisées en culture de cellule et in vivo ont révélé que le domaine PLD de Imp favorise la dynamique des granules. In vivo, ce domaine est nécessaire et suffisant à l’accumulation axonale de Imp. Comme montré par une analyse en temps réel, l’absence de domaine PLD aboutit également à une diminution du nombre de granules axonaux motiles. Fonctionnellement, le domaine PLD de Imp est essentiel au remodelage neuronal car des protéines sans ce domaine ne sont pas capables de supprimer les défauts de repousse axonale observés après inactivation de imp. Enfin, la génération d’un variant de Imp dans lequel le domaine PLD a été déplacé en N-terminus a montré que les fonctions du PLD dans le transport des granules et dans leur assemblage sont découplées, et que la modulation des propriétés des granules Imp médiée par le domaine PLD n’est pas nécessaire au remodelage neuronal in vivo. En conclusion, mes résultats ont montré que le domaine PLD de Imp n’est pas nécessaire à l’assemblage des granules RNP Imp, mais régule leur nombre et leur dynamique. De plus, mon travail a mis en évidence une fonction inattendue pour un domaine PLD dans le transport axonal et le remodelage des neurones lors de la maturation du système nerveux
Eukaryotic mRNAs are bound by RNA Binding Proteins (RBP) and packaged into diverse range of macromolecular assemblies named RNP granules. In neurons, transport RNP granules are implicated in the transport of specific mRNAs to axons or dendrites, and in their local translation in response to external cues. Although little is known about the assembly and regulation of these granules in vivo, growing evidence indicates that the presence of Prion Like domains (PLD) within RBPs favours multivalent protein–protein and protein-RNA interactions, promoting the transition of soluble complexes into RNP granules. The conserved RBP Imp is as a core component of RNP granules that are actively transported to axons upon neuronal remodelling in Drosophila. Furthermore, Imp function was shown to be required for axonal remodelling during Drosophila nervous system maturation. Analyses of the domain architecture of the Imp protein revealed that, in addition to four RNA binding domains (RBD), Imp contains a Cterminal domain showing a striking enrichment in Glutamines and Serines, which is one of the characteristics of a PLD. During my PhD, I explored the function of the PLD in the context of granule assembly and transport. In cultured cells, I observed that Imp granules assembled in the absence of the PLD, however their number and size were increased. Proteins with scrambled PLD sequence accumulated in granules of normal size and number, implying that the degree of disorder of this domain, and not its sequence, is essential for granule homeostasis. Moreover, FRAP experiments, performed on cultured cells and in vivo, revealed that Imp PLD is important to maintain the turnover of these granules. In vivo, this domain is both necessary and sufficient for efficient transport of Imp granules to axons. These defects are associated with a reduction on the number of motile granules in axons. Furthermore, mutant forms lacking the PLD do not rescue the axon remodelling defects observed upon imp loss of function. Finally, a swapping experiment in which I moved Imp PLD from the C-terminus to the N-terminus of the protein revealed that the functions of Imp PLD in granule transport and homeostasis are uncoupled, and that PLD-dependent modulation of Imp granule properties is dispensable in vivo. Together, my results show that Imp PLD of is not required for the assembly of RNP granules, but rather regulates granule number and dynamics. Furthermore, my work uncovered an unexpected in vivo function for a PLD in axonal transport and remodelling during nervous system maturation

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Raji, Bahija. "Etude de l'expression des protéines Musashi1 et Partner of Inscuteable Pins dans l'oeil de souris au cours de développement et à l'âge adulte." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077145.

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Abstract:

Dans ce travail de thèse, nous avons étudié l'expression et le rôle des protéines Musashil et partner of inscuteable (Pins) dans le développement de l'œil. Nous avons montré une expression de Msi1 dans différents sites potentiels de cellules souches oculaires au cours du développement et à l'âge adulte. Ces zones incluent la rétine, le corps ciliaire, l'iris, l'épithélium pigmentaire, le cristallin, la cornée et le limbe. Msi1 est également présent dans les neurones adultes. Cette distribution dans différents compartiments oculaires et à diverses étapes du développement suggère que Msi1 pourrait jouer des rôles importants lors de multiples stades du développement de l'œil. Msi1 pourrait être impliqué aussi dans la physiologie et le fonctionnent des neurones adultes. Nous avons montré également que la protéine Pins est exprimée dans les cellules rétiniennes très tôt au cours du développement embryonnaires où elle pourrait jouer un rôle important dans les divisions des cellules souches/progénitrices. L'expression de la protéine Pins dans les cellules photoréceptrices, impliquées dans la transduction visuelle, suggère que cette protéine pourrait jouer un rôle important dans ce processus. D'autre part, l'expression prédominante de la protéine Pins dans les cellules épithéliales et les fibres du cristallin à l'âge adulte souligne les rôles importants vraisemblables de cette protéine dans la croissance et le maintien des propriétés physiologique du cristallin. Mots clé : Musashil, Pins, division cellulaire asymétrique, cellules souches, neurones adultes
In this work, we studied the expression and the role of the Musashi1 and partner of inscuteable (Pins) proteins in the development of the eye. We showed an expression of Msi1 in various potential sites of ocular stem cells during the development and at adulthood. These zones include the retina, ciliary body, iris, pigmentary epithelium, lens, cornea and the limbus. Msi1 is also present in the adult neurons. This distribution in various ocular compartiments and at various stages of the development suggests that Msi1 could play an important role at multiple stages of the eye development. Msi1 could be also implied in physiology and function of the adult neurons. We also showed that the Pins protein is expressed in the retinal cells very early during the embryonic development where it could play an important role in stem/progenitors cells division. The expression of Pins protein in the photoreceptors, implied in Visual transduction, suggests that this protein could play an important role in this process. In addition, the predominent expression of Pins protein in the lens epithelial cells and fibers lens at the adulthood pointed out the probable important roles of this protein in the growth and the maintenance of the physiological properties of the lens. Keywords: Musashi1, Pins, asymmetric cell division, stem cells, adult neurons

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Saliou, Jean-Michel. "Etude sur le complexe TAR/Tat/cycline T1 Et Etude des régulations de l'épissage de l'ARN pré-messager du virus HIV-1 : effet global des protéines virales et analyse fine du rôle des protéines SR ASF/SF2 et 9G8 au site accepteur A3." Thesis, Nancy 1, 2008. http://www.theses.fr/2008NAN10151/document.

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Abstract:

Ce travail de thèse a comporté deux parties distinctes : l'une porte sur l'étude du complexe TAR/Tat/cycline T1 impliqué dans la transactivation de la transcription de l'ARN du virus HIV-1, l'autre concerne différentes facettes de la régulation de l'épissage de l'ARN du virus HIV-1. L'interaction de la protéine virale Tat avec l'élément TAR présent à l'extrémité 5' des ARN du virus HIV-1 d'une part, et la cycline T1, composant du complexe p-TEFb responsable de l'hyperphosphorylation de l'ARN polymérase II d'autre part, est primordial pour obtenir des ARN viraux de pleine longueur. Dans l'objectif de réaliser une étude structurale du complexe TAR/Tat/cycline T1, l'ARN TAR et un fragment de la cycline T1 ont été produits en grandes quantités. De nombreuses tentatives de complexation des trois partenaires (TAR, Tat et cycline T1) ont été effectuées, mais la qualité des cristaux n'était pas suffisante pour une étude radiocristallographique du complexe. L'épissage est une étape majeure du cycle de multiplication du virus HIV-1. Son ARN comporte 5 sites donneurs et 8 sites accepteurs dont l'utilisation combinée permet la production des 9 ORF virales. Les variations de l'épissage alternatif de l'ARN du virus HIV-1 en fonction de l'expression de protéines virales Tat et Nef ont été étudiées. Nous avons par ailleurs étudié l'effet des protéines SR sur l'utilisation des sites accepteurs A2 et A3. L'étude fine de l'élément régulateur ESEt du site A3 a révélé l'implication de la protéine SR 9G8 dans le schéma complexe de régulation de ce site
This work of thesis contained two different parts : the one concerns the study of the TAR/Tat/cycline T1 complex involved in the transactivation of the transcription of the HIV-1 RNA, the other one concerns various facets of the regulation of the splicing of the HIV-1 RNA. The interaction of the viral protein Tat with the TAR element present in the 5 ' extremity of the HIV-1 RNA on one hand, and the cycline T1, composing of the complex p-TEFb responsible for the hyperphosphorylation of the RNA polymerase II on the other hand, is essential to obtain viral RNA of full length. In the objective to realize a structural study of the complex TAR/Tat/cycline T1, TAR RNA and a fragment of the cycline T1 were produced in appropriate quantities. Numerous attempts of complexation of three partners (TAR, Tat and cycline T1) were made, but the quality of crystals was not sufficient for a radiocristallographic study of the complex. Splicing is a major stage of the cycle of reproduction of the virus HIV-1. His RNA contains 5 donor splice sites and 8 acceptor splice sites whose combined use allows the production 9 viral ORF. The variations of the alternative épissage of HIV-1 RNA according to the expression of viral proteins Tat and Rev were studied. We besides studied the effect of proteins SR on the use of acceptor splice sites A2 and A3. The fine study of the regulating element ESEt of the site A3 revealed the involvement of the SR protein 9G8 in the complex regulation of this site

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Kobayashi, Lejars Asaki. "UHM-ULM interactions in spliceosomal complexes : structural characterization and targeting with small molecules." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASL042.

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Abstract:

Plusieurs étapes successives sont essentielles àl'expression génique, parmi lesquelles l'élimination de séquencesinternes des transcrits primaires des gènes par lemécanisme d'épissage. Le complexe macromoléculaire quiréalise cette modification des ARN, le spliceosome, est assemblépar étapes par le biais d'interactions protéine-protéine,ARN-ARN et protéine-ARN. D'abord, la ribonucleoprotéineU1snRNP reconnaît le site d'épissage 5', SF1 (SplicingFactor 1) se lie au site de branchement et U2AF(U2snRNP auxilliary factor) au tract de polypyrimidine et ausite 3' (complexe E). U2AF favorise alors l'ancrage deU2snRNP au point de branchement, à la place de SF1, pourformer le complexe A. Ensuite, le recrutement du tri-snRNPU4/U6-U5 conduit au complexe B, et finalement, des réarrangementsstructuraux libèrent U1 et U4 snRNP conduisantau complexe catalytique C. U2AF est un hétérodimère,avec une sous-unité de 35 kDa (U2AF35) liée par son domaineUHM (U2AF Homology Motif) au domaine ULM(UHM Ligand Motif) de la sous-unité de 65 kDa (U2AF65).En outre, U2AF65 présente deux motifs de reconnaissancede l'ARN, un UHM C-terminal et un domaine N-terminal defaible complexité (LCD) riche en arginine-sérine (RS). Dansce modèle, le domaine RS de U2AF65 facilite l'hybridationde U2snRNA au point de branchement et son domaineUHM interagit successivement avec les domaines ULM deSF1 et d'une sous-unité de U2snRNP, SF3b155. In vitro, l'affinitéde U2AF65 pour SF1 est relativement plus élevée quepour SF3b155. Les domaines defaible complexité sont souvent impliqués dans la formationde condensats par séparation de phase liquide-liquide(LLPS), ce qui contribue en particulier à la compartimentalisationde complexes moléculaires dans des organites sansmembrane. Nous avions déjà montré que le domaine RS deU2AF65 favorise la formation de condensats via LLPS. Ici,nous avons recherché les déterminants de ce mécanismeet en particulier la force saline, la température, la longueurdu domaine RS et la composition en acides aminés. Laformation de condensats via LLPS est connue pour êtremodulée par des modifications post-traductionnelles.Nous avons montré que la phosphorylation du domaineRS module la formation de condensats. En utilisant desexpériences de pull-down et des immunoprécipitations,nous démontrons que la délétion du domaine RS empêchel'interaction de U2AF65 à la fois avec SF1 etSF3b155, ce qui indique fortement le rôle du domaine RSdans ces interactions in vivo.En parallèle, nous avons comparé, à l'aide de la spectroscopiepar résonance magnétique nucléaire (RMN), les interactionsdu domaine UHM avec les domaines ULM deSF1 et SF3b155. Les perturbations des spectres HSQC de15N-U2AF65-UHM indiquent que l'interaction de SF3b155avec U2AF65 implique au moins trois ULM distincts, enaccord avec la littérature. Inversement, un dosage de15N-SF3b155-ULM par U2AF65-UHM révèle des perturbationsdes déplacements chimiques d'au moins trois résidustryptophane de SF3b155. Ces spectres HSQC deSF3b155-ULM montrent que ce domaine reste désordonnéen présence de U2AF65, ce qui pourrait faciliter lareconnaissance de plusieurs ULMs et la formation decondensats de U2AF65 en présence de SF3b155.Finalement, nous avons entrepris une collaboration avecla société Synsight afin d'identifier, par criblage in silico,des molécules capables de perturber les interactionsUHM-ULM. Nous avons identifié une petite molécule(C13) interagissant avec le domaine UHM de U2AF65comme le montrent des analyses RMN. La combinaisonde données de RMN et des simulations de dynamiquemoléculaire (MD) a permis d’apporter des informationssur le mode de liaison du C13 dans la poche hydrophobedu UHM. Nous avons également montré que C13 peutmoduler la liaison de U2AF65 à SF3b155. Ces résultatsprometteurs suggèrent que les interactions UHM-ULMpourraient être ciblées pour lutter contre des maladiesspécifiques telles que les cancers
Gene expression requires many layers ofregulation among which splicing consists in the removalof sequences from primary transcripts. For thisprocess, a macromolecular machinery, the spliceosome,undergoes a dynamic assembly through protein-protein, RNA-RNA and protein-RNA interactionsin a stepwise manner. The simplified view of assemblyof the spliceosome is that first, the ribonucleoproteinU1 snRNP recognizes the 5’ splice site, Splicing Factor1 (SF1) binds the branchpoint sequence andU2snRNP auxiliary factor (U2AF) binds the polypyrimidinetract and 3' splice site (complex E). U2AF assiststhe recruitment of U2 snRNP to the branch point sequenceto form the A complex. Later, the recruitmentof U4/U6-U5 tri-snRNP forges the B complex, uponwhich, structural rearrangements release U1 and U4snRNPs leading to the catalytic C complex. U2AF is aheterodimer, with its 35kDa subunit (U2AF35) boundthrough its U2AF Homology Motif (UHM) domain tothe ULM (UHM Ligand Motif) of the 65kDa subunit(U2AF65). In addition, U2AF65 presents two RNArecognition motifs, a C-terminal UHM and a N-terminalarginine-serine (RS) rich low complexity domain(LCD). In this model, the RS domain of U2AF65 stabilizesthe U2snRNA-branchpoint sequence duplex andthe U2AF65-UHM domain recognizes successively theULM motif of SF1 and several ULMs in the U2snRNPsubunit SF3b155. In vitro, the affinity of U2AF65 forSF1 is relatively better than for SF3b155. LCD are often involved in the formation of condensatesthrough liquid-liquid phase separation (LLPS),which contribute for example to the compartmentalizationof biological molecules in membrane-less organelles.We have previously reported that U2AF65promotes the formation of such condensates viaLLPS. In line with this work, we have characterized theU2AF65 interactions supported by condensates formationrelatively to physicochemical parameters, includingsalt concentration and temperature, as wellas the length of the RS domain and its amino acidcomposition. Furthermore, LLPS can be modulatedby post-translational modifications. We havedemonstrated that the phosphorylation state of theRS domain modulates the formation of U2AF65condensates in vitro. Using pulldown experimentsand immunoprecipitations, we demonstrate thatthe deletion of the RS domain prevents the interactionof U2AF65 with both SF1 and SF3b155, whichstrongly indicates the actual contribution of the RSdomain in UHM-ULM interaction.In parallel, we compared, using nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy, the interactions ofthe hydrophobic core of the U2AF65-UHM domainwith the ULM domains of SF1 and SF3b155. Perturbationsof the 15N-U2AF65-UHM HSQC spectrumindicates that SF3b155 interaction with U2AF65-UHM is supported by at least three ULMs, which isconsistent with previous reports. In agreement, increasingthe stoichiometry of U2AF65-UHM against15N-SF3b155-ULM reveals stepwise changes inchemical shift perturbations of at least three tryptophanresidues, in the SF3b155-ULM spectrum. Interestingly,these HSQC spectra of SF3b155-ULMdid not reveal any structuration upon U2AF65-UHMbinding, suggesting a role of this dynamics to favourthe binding to several ULMs and the formationof U2AF65 condensates in the presence ofSF3b155.Lastly, we initiated a collaboration with the Synsightcompany in order to identify molecules ableto perturbate UHM-ULM interactions. Through insilico analyses, we obtained a small molecule (C13)displaying affinity for U2AF65-UHM as evidenced byNMR analyses. Through NMR and molecular dynamics(MD) simulations, we obtained insights intothe C13 binding mode in the U2AF65-UHM hydrophobicpocket. Using an in vitro binding assay, weshowed that C13 can modulate the binding ofU2AF65 to SF3b155. These promising results suggestthat UHM-ULM interactions could be targetedto fight specific diseases such as cancers

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Yacoub, Taher. "Développement et implémentation d'une approche par fragments pour le design d'ARNs modifiés simple brin avec évaluation sur des protéines de liaison à l'ARN et un modèle d'étude la Bêta-Sécrétase 1." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL002.

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Abstract:

De nouvelles stratégies thérapeutiques ont émergé grâce aux aptamères qui sont des ligands à haute affinité générés par une méthode expérimentale appelée SELEX. Toutefois, leur utilisation demeure limitée en raison de leur manque de sélectivité et de leur liaison à d'autres cibles. Ces effets hors-cibles ("off-target") sont fréquemment observés dans toutes les stratégies thérapeutiques basées sur l'ARN. Pour accroître leur spécificité et sélectivité, des aptamères modifiés chimiquement in situ ont été générés par SELEX (SOMAmers). Néanmoins, des limitations techniques de SELEX persistent notamment dans le nombre et le type de modifications chimiques utilisables. Nous proposons donc une stratégie de conception in silico d'oligonucléotides modifiés pour s'affranchir de certaines de ces limitations. Pour ce faire, nous avons développé une nouvelle méthode de reconstruction d'ARN simple brin (ARNsb) basée sur l'approche par fragments, sur la connaissance 3D de la structure cible et sur la technique du Color-Coding développé par Alon, Yuster et Zwick. Celle-ci repose sur une modélisation de la connectivité des poses sous la forme d'un graphe permettant la mise en œuvre d'un algorithme combinatoire efficace par programmation dynamique. Cette approche est implémentée pour le « Docking » (recherche du mode de liaison natif) à partir d'une distribution donnée de fragments, pour le « Design » thérapeutique de-novo d'un ARNsb et pour l'analyse statistique de caractéristiques afin d'obtenir des informations entre les poses et la protéine (par exemple, l'analyse de profils de séquence ou la probabilité d'une pose d'appartenir à une chaine ARNsb). Cette nouvelle approche a fait l'objet d'une preuve de concept sur sept complexes ARNsb/protéines et a démontré des résultats pertinents, robustes et exploitables dans une perspective de design.Pour mettre à l'épreuve cette nouvelle méthodologie, une étude de cas a été faite sur l'enzyme Beta-Sécrétase 1 (BACE1, impliquée dans la maladie d'Alzheimer) et son homologue Beta-Sécrétase 2 (BACE2) afin de concevoir un ARNsb sélectif de BACE1. Pour ce faire, une étude a été réalisée afin de déterminer les caractéristiques clés de la spécificité et sélectionner des nucléotides modifiés pouvant se lier aux sites et sous-sites fonctionnels de BACE-1. Ces résultats pourront servir de base pour le design d'ARNsb sélectif et pour l'évaluation de la méthodologie basée sur le Color-Coding
New therapeutic strategies have emerged using aptamers that are high-affinity ligands generated using a procedure called SELEX. Nevertheless, their use are limited due to the lack of selectivity and off-target effects frequently observed as in all RNA-based therapeutic strategies. In order to increase their specificity and selectivity, a class of chemically modified aptamers has been designed in-situ by SELEX (“SOMAmers”). But, various limitations remain due to technical constraints in SELEX, in particular the number and the type of chemical modifications that can be used. We propose a new fragment-based strategy to design in-silico modified aptamers that will overcome some of these limitations, based on the knowledge of 3D structure and the color-coding technique introduced by Alon, Yuster and Zwick. This approach is based on the modeling of pose connectivity in the form of a graph, enabling the implementation of an efficient combinatorial algorithm using dynamic programming. It is used for the “Docking” from a given fragment distribution, the “Design” and the equilibrium statistics for learning features between fragments and the 3D protein, and has been the subject of a proof of concept on 7 ssRNA/protein complexes.To test this new approach on a real therapeutic case study, an analysis has been carried out on the Beta-Secretase 1 (BACE1), an enzyme involved in Alzheimer's disease, and the Beta-Secretase 2 (a homologous protein to BACE1) to determine the key features of specificity and to select the modified nucleotides that bind sites and subsites of BACE1. These results can provide a basis for the design of selective ssRNA and for the evaluation of the Color-Coding based methodology

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Leroux, Clémentine. "Etude de la protéine de liaison à l’ARN LIF2, partenaire de la protéine chromatinienne LHP1, chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112013.

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Abstract:

La dynamique chromatinienne joue un rôle central dans les contrôles développementaux, la différenciation cellulaire ou les réponses des organismes à l’environnement. Chez les animaux, les protéines du groupe Polycomb sont impliquées dans l’établissement d’états chromatiniens silencieux. Chez les plantes, des données récentes suggèrent que la protéine LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) participerait à un complexe de type Polycomb. Nous nous sommes intéressés aux complexes LHP1 en étudiant un de ses partenaires, LHP1 INTERACTING FACTOR 2 (LIF2). L’objectif de ce travail de thèse a été de poursuivre la caractérisation de LIF2. LIF2 se caractérise par la présence de domaines de liaison à l’ARN, suggérant la participation d’une composante ARN dans les complexes LHP1. Nous avons recherché des ARN ligands de LIF2 et étudié les interactions LIF2/ARN par différentes approches dont la technologie Biacore. En analysant le transcriptome du mutant lif2, nous avons remarqué un enrichissement pour des gènes impliqués dans la réponse aux stress biotiques et abiotiques. Nous avons étudié la fonction de LIF2 dans la réponse aux pathogènes et avons pu mettre en évidence que LIF2 joue un rôle dans l’immunité innée des plantes et est essentiel pour réguler négativement les réactions de défenses en l’absence de pathogènes
Chromatin dynamics play a central role in developmental control, cell differentiation or responses of the organisms to environment. In animals, Polycomb group proteins are involved in the establishment of silent chromatin states. In plants, recent data suggest that LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN 1 (LHP1) participates to a Polycomb-like complex. We focused on LHP1 complexes by studying one of its partners, LHP1 INTERACTING FACTOR 2 (LIF2). The aim of this thesis was to pursue the characterization of LIF2. LIF2 is composed of RNA-binding domains, suggesting the participation of an RNA component in LHP1 complexes. We have searched for LIF2 RNA-ligands and studied LIF2/RNA interactions with different approaches including Biacore technology. By analyzing the transcriptome profile of lif2, we have noticed an enrichment for genes involved in responses to abiotic and biotic stresses stimuli. We investigated the LIF2 functions in response to pathogens infection and we have been able to highlight that LIF2 plays a role in plant innate immunity and is essential to negatively regulate defense responses in the absence of pathogens

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Frison-Roche, Charles. "Perte des protéines MBNL dans les motoneurones : impact sur la fonction de l’unité motrice dans la Dystrophie myotonique." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2022. http://www.theses.fr/2022SORUS305.

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Abstract:

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie rare héréditaire avec des atteintes musculaires, cardiaques et cognitives. La DM1 est due à des expansions de répétitions CTG dans la partie 3’UTR du gène DMPK. Les ARN DMPK mutés s’agrègent et séquestrent les protéines de liaison à l’ARN Muscleblind-like (MBNL), menant à des anomalies du métabolisme des ARNs dans plusieurs tissus. La famille MBNL est composée de MBNL1, 2 et 3 mais seuls MBNL1 et 2 sont exprimés dans le système nerveux. Alors que le muscle est largement étudié dans la DM1, des études antérieures suggèrent également une altération de la communication entre les motoneurones (MNs) et le muscle squelettique via la jonction neuromusculaire (JNM). Pour déterminer le rôle des protéines MBNL dans les MNs, nous avons généré des souris MN-dKO invalidées pour Mbnl2 spécifiquement dans les MNs (MN-Mbnl2-KO) avec une déplétion constitutive de Mbnl1 (Mbnl1-KO). Les souris MN-Mbnl2-KO ne présentent pas de phénotype, cependant les souris MN-dKO développent progressivement des défauts de coordination par rapport aux souris Mbnl1-KO. Chez les souris âgées de 4 mois, les troubles moteurs des souris MN-dKO s’accompagnent d’anomalies structurales et ultrastructurales sévères et globales de la JNM. A contrario, les altérations de la JNM des souris Mbnl1-KO semblent cantonnées à la partie post-synaptique. Ainsi, la perte de Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs aggrave les altérations de la JNM causées par la perte de Mbnl1 seul. Une analyse plus précoce chez des souris âgées de 2 mois a permis de montrer que les JNM des souris MN-dKO présentent des défauts structuraux par rapport aux JNM des souris contrôles mais aussi Mbnl1-KO. En revanche, et malgré leur aspect anormal, les JNM des souris MN-dKO de 2 mois sont matures. Ces résultats suggèrent que les protéines MBNL1 et MBNL2 jouent un rôle dans le maintien des JNM et que les conséquences de la perte de Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs sont plus sévères, globales et se manifestent plus précocement que celles de la perte de Mbnl1 seul. Afin d’identifier les cibles dérégulées par la perte de Mbnl1 et/ou Mbnl2 dans les MNs, un séquençage ARN à haut-débit, associé à une analyse bio-informatique de l’épissage alternatif, a été réalisé à partir d’ARN extrait de moelles épinières lombaires des souris MN-dKO, MN-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO et contrôles âgées de 4 mois. Cette analyse a mis en évidence de nombreuses cibles spécifiques aux souris MN-dKO, et donc à la perte conjointe de Mbnl1 et Mbnl2. De manière intéressante, l’analyse GO-Term des ARN cibles communs aux souris MN-dKO et MN-Mbnl2-KO ou Mbnl1-KO a permis de montrer que la perte de MBNL2 affecte la maturation de gènes impliqués dans le transport de neurotransmetteurs ou l’amarrage des vésicules synaptiques alors que la perte de MBNL1 affecte la maturation de gènes impliqués dans les processus d’endocytose. Ainsi, MBNL1 et MBNL2 seraient impliqués dans des processus différents au sein des MN. Afin de compléter l’étude du rôle des protéines MBNL dans la maintenance de la JNM et de la communication neuromusculaire, des souris WT adultes ont été injectées avec des adeno-associated adenovirus exprimant un shmiR ciblant Mbnl1 et Mbnl2 spécifiquement dans le muscle squelettique. 2 mois post-injection (PI), les JNMs de ces souris récapitulent en partie les anomalies observées chez les souris Mbnl1-KO âgées de 4 mois, confirmant un rôle de Mbnl1 dans le muscle squelettique sur le maintien de la JNM. Ces anomalies post-synaptiques s’étendent progressivement au côté présynaptique de la jonction 4 mois PI. Cette aggravation confirme le rôle de MBNL1 dans le muscle squelettique sur le maintien de la JNM. L’ensemble de mes travaux de thèse soulignent l’importance des protéines MBNL dans les MNs pour la communication neuromusculaire et suggèrent, pour la première fois, que la perte de MBNL dans les MNs pourrait contribuer à la pathophysiologie musculaire de la DM1
Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a rare inherited disease with muscle, heart and cognitive impairments. DM1 is caused by CTG repeat expansions in the 3'UTR of the DMPK gene. DMPK mutated RNAs aggregate and sequester Muscleblind-like RNA (MBNL) binding proteins, leading to RNA metabolism abnormalities in several tissues. The MBNL family is composed of MBNL1, 2 and 3 but only MBNL1 and 2 are expressed in the nervous system. While skeletal muscle has been extensively studied in DM1, previous reports also suggest an impairment of communication between motor neurons (MNs) and skeletal muscle through the neuromuscular junction (NMJ) in DM1. To determine the role of MBNL proteins in MNs, we generated MN-dKO mice invalidated for Mbnl2 specifically in MNs (MN-Mbnl2-KO) in a Mbnl1 null background (Mbnl1-KO). MN-Mbnl2-KO mice don’t manifest a phenotype, however MN-dKO mice progressively develop coordination defects compared to Mbnl1-KO mice. In 4-month-old mice, MN-dKO mice motor disorders are accompanied by severe and global structural and ultrastructural abnormalities of the NMJ. In contrast, Mbnl1-KO mice NMJ alterations seem to be confined to the post-synaptic part. Thus, the loss of Mbnl1 and Mbnl2 in MNs exacerbates NMJ alterations caused by the loss of Mbnl1 alone. Interestingly, NMJs from younger MN-dKO mice exhibit early structural defects compared to NMJs from control and Mbnl1-KO mice, which are unaffected. However, and despite their abnormal appearance, NMJs of MN-dKO mice are mature at this age. These results suggest that MBNL1 and MBNL2 proteins play a role in the NMJ maintenance. Furthermore, defects caused by the Mbnl1 and Mbnl2 loss in MNs are more severe, global but also manifest earlier than those caused by the loss of Mbnl1 alone. In order to identify RNA targets deregulated by the loss of Mbnl1 and/or Mbnl2 in MNs, we conducted high-throughput RNA sequencing, using RNA extracts from lumbar spinal cords of 4 months old MN-dKO; MN-Mbnl2-KO; Mbnl1-KO and control mice. An alternative splicing analysis revealed numerous targets specific to MN-dKO mice, thus due to the simultaneous loss of Mbnl1 and Mbnl2. Interestingly, GO-Term analysis of RNA targets common to MN-dKO and MN-Mbnl2-KO or Mbnl1-KO mice showed that MBNL2 loss in MNs affects the maturation of genes involved in neurotransmitter transport or synaptic vesicle docking whereas MBNL1 loss affects the maturation of genes involved endocytosis processes. Thus, MBNL1 and MBNL2 may be involved in different processes in MNs. To complete the study of the role of MBNL proteins in NMJ and neuromuscular communication maintenance, adult WT mice were injected with adeno-associated adenovirus expressing a shmiR targeting Mbnl1 and Mbnl2 specifically in skeletal muscle. 2 months post-injection (PI), NMJs from these mice partly recapitulated NMJ defects observed in 4-month-old Mbnl1-KO mice, confirming a role for Mbnl1 in skeletal muscle on JNM maintenance. These postsynaptic abnormalities progressively extend to the presynaptic side of the junction 4 months PI. This aggravation confirms the role of MBNL1 in skeletal muscle on NMJ maintenance. The whole of my thesis work highlights the importance of MBNL proteins in MNs for neuromuscular communication. My work suggests, for the first time, that MBNL loss in MNs may contribute to DM1 muscle pathophysiology

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Haili, El Jaouhari Nawel. "Caractérisation fonctionnelle de protéines PPR mitochondriales essentielles à l’expression de gènes du complexe I chez Arabidopsis thaliana." Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112037/document.

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Abstract:

L’expression des gènes mitochondriaux est grande partie dirigée par des protéines codées dans le noyau et importées dans l’organite depuis le cytosol. Diverses études ont montré que les protéines de la famille PentatricoPeptide Repeat (PPR) jouent un rôle prépondérant et varié dans ce phénomène. Au cours de ma thèse, j’ai déterminé la fonction de deux nouvelles protéines PPR chez Arabidopsis thaliana, nommées MTSF1 (pour Mitochondrial Stability Factor 1) et PPR24. Chacune de ces protéines est impliquée dans l’expression d’un ARNm mitochondrial codant une sous-unité du complexe I de la chaine respiratoire. J’ai montré que la protéine MTSF1 était requise pour stabiliser l’ARN mitochondrial nad4. Le site de liaison de MTSF1 a été déterminé et il correspond aux vingt derniers nucléotides de l’ARN nad4. Nous pensons donc qu’en s’associant à l’extrémité 3’ terminale de cet ARN, la protéine MTSF1 bloque la progression d’exoribonucléases 3’-5’ et stabilise ainsi l’ARN nad4 in vivo. L’étude de la protéine PPR24 nous a conduit à observer qu’elle était essentielle à la traduction de l’ARNm mitochondrial nad7. J’ai pu démontrer que la protéine NAD7 n’était pas synthétisée chez les mutants ppr24 et que cela était associé à l’absence de ribosomes sur l’ARNm nad7. J’ai aussi montré que la protéine PPR24 pouvait se lier spécifiquement à une courte région située au milieu de la 5’ UTR de l’ARN nad7. La modélisation de la 5’ UTR de cet ARN indique que ce site de liaison se situerait à la base d’une structure en tige-boucle pouvant diminuer fortement l’accessibilité au codon initiateur de la traduction de l’ARN nad7. Il est donc possible que la fixation de la protéine PPR24 puisse déstabiliser cette structure en tige-boucle et permettre aux ribosomes mitochondriaux d’accéder plus facilement au codon AUG. L’ensemble de ces études a permis d’apporter des informations essentielles sur la fonction et le mode d’action des protéines PPR dans l’expression génétique mitochondriale chez les plantes
Gene expression in mitochondria is for the most controlled by nuclear encoded proteins that are from the cytosol into the organelle. Recent genetic and biochemical analysis have revealed that proteins of the PentatricoPeptide Repeat (PPR) family play preponderant and multifarious role in this process. During my thesis, I characterized the function of two novel Arabidopsis thaliana PPR protein called MTSF1 (for Mitochondrial Stability Factor 1) and PPR24. Each of these proteins is involved in the expression of a single mitochondrial gene encoding respiratory complex I subunit. I showed that the MTSF1 protein is essential for the stabilization of nad4 mRNA. The MTSF1 binding site was determined and was shown to correspond to the last twenty nucleotides of nad4 3’ UTR. We propose that, through an interaction with the extremity of nad4 transcript, the MTSF1 protein blocks the progression of 3’ to 5’ exoribonucleases and protects nad4 mRNA from degradation in vivo. PPR24 analysis indicated that this PPR protein is essential for nad7 mRNA translation. I observed that the NAD7 protein is not produced in ppr24 mutants and that this correlated with lack of ribosome loading of nad7 mature mRNA. I also showed that PPR24 binds to a short RNA fragment with high specificity located in the center of nad7 5’ leader. Structural predictions indicated that PPR24 binding site could correspond to the basis of a long stem-loop RNA structure just upstream of the AUG codon, which could prevent the accessibility to the nad7 translation codon. PPR24 binding could destabilize this stem-loop structure and permit a better access of the ribosome to the nad7 translation initiation codon. These findings shed light on the function and the mode of action of PPR proteins involved in mitochondrial gene expression in plants

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Lema, Ingrid. "Contrôle post-transcriptionnel de l'expression rénale du récepteur minéralocorticoide par les variations de tonicité extracellulaire : conséquences physiopathologiques." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS290.

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Abstract:

L’aldostérone et le Récepteur Minéralocorticoïde (MR) participent au contrôle de la balance hydrosodée et de la pression artérielle. Les altérations de l’expression du MR ou de la signalisation minéralocorticoïde sont associées à de nombreuses pathologies chez l’Homme. Dans ce travail, nous avons démontré, le rôle majeur de protéines de liaison à l’ARN, Tis11b et HuR, dans le contrôle post-transcriptionnel de l’expression du MR en réponse aux variations de tonicité extracellulaire dans un modèle de cellules principales rénales et chez la souris. L’hypertonicité (500 mOsmol/L) induit l’expression de la protéine Tis11b, qui lie la région 3’-non traduite du transcrit MR afin d’accélérer sa dégradation, diminuant ainsi l’expression rénale de la protéine MR et de la signalisation minéralocorticoïde. A l’opposé, l’hypotonicité (150 mOsmol/L) stimule la translocation nucléo-cytoplasmique de HuR, qui stabilise le transcrit MR, augmentant ainsi l’expression du MR et la sensibilité rénale à l’aldostérone. De plus, HuR est responsable de l’édition d’un nouveau variant d’épissage du MR, le variant MR Δ6, obtenu par l’exclusion de l’exon 6.Ce variant d’épissage exerce un effet dominant négatif sur la signalisation minéralocorticoïde. Enfin, l’identification de microARN modulés par l’hypertonicité suggère leur rôle potentiel dans le contrôle de la signalisation minéralocorticoïde rénale. La caractérisation de ces mécanismes inédits modulant l’action du MR améliore notre compréhension de la physiopathologie de la signalisation minéralocorticoïde, et pourrait aboutir, à terme, à de nouvelles stratégies thérapeutiques
Aldosterone and the Mineralocorticoid Receptor (MR) participate to the control of salt and water balance and the arterial pressure. Alteration of renal MR expression or mineralocorticoid signaling pathway contributes to the development of numerous human disorders. In this work, we have demonstrated the major role played by the RNA-Binding Proteins, Tis11b and HuR, in the control of MR expression in response to variations of extracellular tonicity in a model of principal tubular cells and in vivo. Hypertonicity (500 mOsmol/L) increases the expression ofTis11b, which binds the 3’-untranslated region of MR transcript and accelerates the degradation of MR transcript, leading to the reduction of the mineralocorticoid signaling. Conversely, hypotonicity (150 mOsmol/L) stimulates nuclear-cytoplasmic shuttling of HuR protein, which stabilizes MR transcript increasing its expression and renal sensitivity to aldosterone action. Furthermore, HuR participates to the editing of the novel MR Δ6 splice variant, which lacks exon 6, and exerts a dominant negative effect on mineralocorticoid signaling. Finally, we have provided evidence that hypertonicity modulates expression of microRNA, which may control mineralocorticoid signaling pathway. Characterization of these original mechanisms modulating MR action is pivotal for a better understanding of mineralocorticoid-related pathophysiology, and should ultimately lead to the development of new therapeutic strategies

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Maurel, Cindy. "Génétique de la Sclérose Latérale Amyotrophique et rôle de la voie de SUMOylation dans l'agrégation de la protéine TDP-43." Thesis, Tours, 2018. http://www.theses.fr/2018TOUR3315.

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Abstract:

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), caractérisée par la mort des motoneurones, est une maladie soumise à l'influence de facteurs génétiques et environnementaux. Ce travail de thèse a porté sur l'amélioration des connaissances de la composante génétique de la SLA et sur l'implication d'une modification post-traductionnelle, la SUMOylation, dans la formation des agrégats TDP-43 positifs intracytoplasmiques observés chez une majorité des patients SLA. Nous avons participé à une étude européenne d'association pangénomique (GWAS) qui a permis d'associer de nouveaux loci génétiques dont celui du gène C21ORF2, au risque de SLA. En parallèle, nous avons identifié une nouvelle mutation dans un gène causal de SLA, TARBBP codant la protéine TDP-43. Cette mutation, p.N259S, identifiée chez un patient SLA présentant une évolution rapide de la maladie, est la première décrite dans le domaine RRM2 de TDP-43. La surexpression de la protéine mutée in vitro était associée à la présence d'agrégats TDP-43/ubiquitine positifs cytoplasmiques. Nous avons suspecté la voie de la SUMOylation d'être impliquée dans la formation des agrégats via une modification post-traductionnelle de TDP-43. Nous avons tout d'abord montré que l'inhibition de la SUMOylation globale des protéines par l'ajout d'acide anacardique diminue la formation d'agrégats TDP-43 positifs, améliore la neuritogénèse et la viabilité cellulaire. Nous avons ensuite montré pour la première fois que la mutation de l'unique site potentiel de SUMOylation de TDP-43, modifie la localisation intracellulaire des agrégats TDP-43 positifs qui deviennent nucléaires, et est associée à une amélioration globale des fonctions cellulaires. Nos résultats permettent de considérer la voie de la SUMOylation comme un mécanisme régulant l'export de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme. Bloquer cet export pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique via une réduction de formation d'agrégats protéiques TDP-43 positifs dans le cytoplasme des motoneurones
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), characterized by motor neuron degeneration, is influenced by genetic and environmental factors. The objective of this work was to improve knowledge on the genetic of ALS and to study the implication of a post-translationnal modification (PTM), SUMOylation, in the formation of cytoplasmic TDP-43 positive aggregates observed in a majority of ALS patients. We participated in an European genome-wide association study (GWAS) which described an association between new genetic loci, including the locus of the gene C21ORF2, and ALS risk. We also identified a novel mutation in a causal gene of ALS, TARBBP encoding TDP-43 protein. This mutation, p.N259S, present in an ALS patient with rapid progression, is the first described in the RRM2 domain of TDP-43. The surexpression of this mutant protein in vitro was associated with cytoplasmic aggregates positive for TDP-43 and ubiquitin. We suspected the SUMOylation pathway to be implicated in aggregates formation via a PTM of TDP-43. First, we observed that a global inhibition of protein SUMOylation by anacardic acid reduces TDP-43 positive aggregates, improves neuritogenesis and cell viability. We next showed, for the first time, that the mutation of the unique potential SUMOylation site of TDP-43, modifies the intracellular localization of TDP-43 positives aggregates, which become nuclear, and is associated in improvement in global cellular functions. Based on our results, we propose that the SUMOylation pathway is a mechanism regulating TDP-43 export from the nucleus to the cytoplasm. Blocking this export might represent a new therapeutic target by reducing the formation of TDP-43 positive aggregates in the cytoplasm of motor neurons

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Jousselin, Clément. "Rôle fonctionnel de protéines cellulaires interagissant avec la polymérase du virus de la rage." Electronic Thesis or Diss., Sorbonne université, 2019. http://www.theses.fr/2019SORUS153.

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Abstract:

La transcription et la réplication du virus de la rage sont réalisées par sa polymérase (L), une ARN polymérase ARN dépendante, au sein d’inclusions cellulaires viro-induites : les corps de Negri (CN). Durant les premières étapes de l’infection, on observe un ou deux CNs par cellule (CN primaire) qui grossissent et donnent naissance à plusieurs autres CNs de taille inférieure (CN secondaire). Les CNs concentrent l’ensemble des protéines virales et cellulaires nécessaires à la réplication virale. Bien que certains mécanismes de régulation entre protéines virales impliquées soient décrits, la nature et le rôle des partenaires cellulaires demeurent largement inconnus. Un crible en double hybride en levure d’une banque d’ADNc humain a permis l’identification de partenaires cellulaires de la L rabique, notamment de la protéine hStaufen 1. La cartographie de l’interaction montre que les extrémités Cterminales des deux protéines sont requises. Lors d’une infection par le virus de la rage la protéine hStaufen 1, présente uniformément dans le cytoplasme, est réorganisée en structures granulaires à proximité des CNs autour desquels elle gravite avec des mouvements de rapprochement, d’éloignement et des contacts furtifs. Cette dynamique de la protéine hStaufen 1 pourrait être liée à son rôle intermédiaire entre les CNs et les granules de stress induits par l’infection rabique. La déplétion partielle de hStaufen 1 dans la cellule conduit à l’augmentation intracellulaire des protéines virales, à l’inhibition de la formation des CNs secondaires et à la diminution du bourgeonnement et de la libération des particules virales dans le milieu extracellulaire. Ceci indique que la protéine hStaufen 1 joue un rôle majeur dans le transport intracellulaire microtubule dépendant des ribonucléocapsides néo-synthétisées vers leur site de bourgeonnement. Trois autres partenaires de la protéine L issus du crible en double hybride ont aussi été étudiés : eEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1) ; hnRNPH2 (Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein) ; TGFβ1I1 (Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein). Des résultats préliminaires suggèrent leur implication dans le cycle réplicatif du virus de la rage depuis la régulation de la transcription et de la réplication rabiques au sein des CNs jusqu’au relargage des virions
The transcription and replication of the rabies virus are performed by the polymerase (L), an RNA dependant RNA polymerase, in cellular inclusions induced by the virus: the Negri Bodies (NB). During early infection, there is only one or two NB per cell (primary NB), growing with time up to their dispersion in several smaller NB (secondary NB). The NB concentrates all viral and cellular proteins necessary for the viral replication. Although several regulatory mechanisms between involved viral proteins are well described, the nature and role of cellular partners remain largely unknown. A yeast two-hybrid screening of a human cDNA library has identified cellular partners of the rabies L protein, in particular the hStaufen 1 protein. A mapping of the interaction showed that the Cterminal part of both proteins are required. During rabies infection, hStaufen 1, uniformly present in the cytoplasm, is reorganized in granular structures close to the NB, including back and forth movements with furtive contacts. This dynamics of hStaufen 1 is evocative of an intermediate role between NB and stress granules (SG) induced by rabies virus infection. Knock down of hStaufen 1 in the cell leads to increased amounts of intracellular viral proteins, to the inhibition of secondary NB formation and to a decrease of the budding and virion release from cell. This indicates that hStaufen 1 plays a major role in the microtubule-dependent intracellular transport of the newly synthesized ribonucleocapsids up to the site of budding. Three other L protein partners discovered during the two-hybrid screening have also been studied: eEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1); hnRNPH2 (Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein) ; TGFβ1I1 (Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein). Preliminary results suggest that they are somehow involved in the rabies virus replicative cycle, from transcription/replication inside NB to rabies virus release in the external environment

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Dissertations / Theses on the topic 'Protéines de liaison à l'ARN messager'

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