Academic literature on the topic 'Protéines de liaison à l'ARN messager'

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique.
Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

L'augmentation des taux cellulaires de p53 en réponse aux dommages à l'ADN a été largement attribuée à une augmentation de la demi-vie de la protéine. Il est maintenant bien établi que la régulation traductionnelle de l'ARNm de p53 est également critique à la fois pour la répression de l'accumulation de p53 dans des conditions normales, et l'induction de la protéine en réponse aux dommages de l'ADN. Nos travaux se sont accès sur l'étude du rôle de facteur de réparation de l'ADN Ku dans la régulation traductionnelle de l'ARNm P53. Nous avons montré que Ku réprime la synthèse de la protéine p53 et l'apoptose p53-dépendante via la liaison à une structure en tige-boucle dans la 5'UTR de l'ARNm. Cependant, la répression traductionnelle exercée par Ku est levée après un stress génotoxique. Le mécanisme sous-jacent implique l'acétylation de Ku qui perturbe les interactions Ku-ARNm p53. Ces résultats suggèrent que la répression traductionnelle de p53 par Ku constitue un nouveau mécanisme cytoprotectif liant la réparation de l'ADN et la traduction des ARNm
Increases in p53 protein levels after DNA damage have largely been attributed to an increase in the half-life of the p53 protein. It is now well accepted that translational regulation of p53 mRNA is also critical for both repression of p53 accumulation in unstressed conditions and induction of the p53 protein in response to DNA damage. Our work focused on studying the role of DNA repair factor Ku in the regulation of P53 mRNA translation. We showed that Ku represses p53 protein synthesis and p53-mediated apoptosis by binding to a stem-loop structure within the p53 5'UTR. However, Ku-mediated translational repression is relieved after genotoxic stress. The underlying mechanism involves Ku acetylation which disrupts Ku-p53 mRNA interactions. These results suggest that Ku-mediated repression of p53 mRNA translation constitutes a novel cytoprotective mechanism linking DNA repair and mRNA translation

Le contrôle traductionnel par la régulation de la taille des queues poly(A) est essentiel durant le développement précoce de nombreux organismes. Deux types de régulation de la taille des queues poly(A) peuvent exister : la polyadénylation cytoplasmique, qui consiste en l'ajout de résidus adénylés à l'extrémité 3' d'un ARNm et qui va activer sa traduction, et la déadénylation, qui consiste au raccourcissement de la queue poly(A) d'un ARNm cible et qui conduit à sa déstabilisation et/ou sa répression traductionnelle. Les poly(A) polymérases non canoniques de type GLD-2 ont été mises en évidence chez différents organismes. Elles sont impliquées dans la polyadénylation cytoplasmique. Chez les vertébrés, elles interagissent avec CPEB (Cytoplasmic polyadenylation element binding protein). Chez la drosophile, nous avons étudié un homologue de GLD-2, Wispy (Wisp). Des expériences in vivo et in vitro montrent que Wisp est une poly(A) polymérase cytoplasmique et mettent en évidence son interaction physique avec l'homologue de CPEB, Orb. Wisp et Orb agissent dans la polyadénylation cytoplasmique lors de l'ovogenèse tardive, notamment pour l'arrêt en métaphase I et la progression de la méiose après ce stade, et lors de l'embryogenèse précoce. La poly(A) polymérase canonique (PAP) est aussi impliquée dans la polyadénylation cytoplasmique avec Orb, lors des étapes plus précoces de l'ovogenèse. En conclusion, deux poly(A) polymérases, la PAP et Wisp, sont requises de façon séquentielle pour la polyadénylation cytoplasmique pendant l'ovogenèse de drosophile. Chez la drosophile, le mécanisme de déadénylation est étudié lors de l'embryogenèse précoce, pendant laquelle de nombreux ARNm maternels sont dégradés. Cette déadénylation est réalisée par le complexe de la déadénylase CCR4 qui est recruté de façon spécifique sur des ARNm cibles grâce à des protéines de liaison à l'ARN, telles que Smaug et Pumilio. Nos résultats mettent en évidence un rôle de la protéine de liaison à l'ARN, Bicaudal-C (Bic-C), dans la déadénylation, lors de l'ovogenèse précoce. Elle recrute le complexe de déadénylation de CCR4. Des cibles de Bic-C sont identifiées, dont l'ARNm Bic-C lui-même, qui est autorégulé par déadénylation. De plus, des résultats montrent que Bic-C pourrait avoir un double rôle à la fois dans la déadénylation et dans la polyadénylation cytoplasmique.

Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle majeur dans la régulation de la traduction de l'ARN messager et l'adaptation du métabolisme cellulaire à divers signaux environnementaux. La présence dans de nombreuses RBP d'une combinaison unique de domaines fonctionnels structurés et de régions intrinsèquement désordonnées, leur permet de générer des condensats riches en ARN par le processus de séparation de phase liquide-liquide. G3BP1 est une RBP centrale dans le processus de protection de l'ARNm lorsque les cellules sont exposées à des stress environnementaux via la formation des granules de stress - des condensats de ribonucléoprotéines qui s'assemblent en réponse au stress. Les granules de stress (SG) pourraient servir de point de contrôle dans la destinée des ARNm : stockage de l'ARNm pour éviter l'expression de protéines inutiles à la survie cellulaire, transfert des transcrits d'ARNm vers les p-bodies pour dégradation ou transfert dans des polysomes pour traduction de protéines essentielles à la survie cellulaire. G3BP1 est un élément central dans l'assemblage des SGs car elle possède des domaines de liaison à l'ARN et une activité hélicase, et interagit spécifiquement avec plusieurs protéines présentes dans les SG comme Caprin1.Le but de cette étude est d'analyser la coopération entre G3BP1 et Caprin1 dans la liaison à l'ARN et la formation de condensats. Des études antérieures mettent en évidence le caractère central de G3BP1 dans l'assemblage de SG, mais G3BP1 ne possède pas de domaine de type prion contrairement aux nombreuses protéines impliquées dans la nucléation des SG et son affinité pour l'ARNm est assez faible. On propose que Caprin1, en tant que partenaire de G3BP1 à travers le domaine NTF2L et également une protéine impliquée dans la formation de stress granules, favorise la liaison de G3BP1 à l'ARNm et son recrutement dans les granules de stress. De plus, on a décortiqué la fonction des différents domaines de G3BP1 dans cette interaction.Pour démontrer l'interaction G3BP1-Caprin1-ARNm, nous avons utilisé plusieurs méthodes de biologie structurale et cellulaire. Nous proposons que Caprin1, qui est à la fois un partenaire connu de G3BP1 via le domaine NTF2-L de G3BP1 et une protéine de liaison à l'ARNm via son domaine de faible complexité riche en RGG, puisse améliorer l'interaction entre ARNm et G3BP1 et favoriser le recrutement de l'ARNm dans les SGs. L'analyse de l'influence des différents domaines de G3BP1 dans cette interaction démontre que l'amélioration du recrutement de l'ARNm via l'interaction avec Caprin1 ne fonctionne que si G3BP1 conserve ses domaines de liaison à l'ARNm. La coopération entre Caprin1 et G3BP1 permet de mieux comprendre la centralité de G3BP1 dans l'assemblage des SGs et ouvre des perspectives sur le recrutement d'ARNm spécifiques lors d'épisodes de stress
RNA-binding proteins play major role in regulation of messenger RNA translation and the adaptation of cellular metabolism to various environmental signals. This is accomplished due to RBPs possessing unique combination of structured functional domains and non-structured intrinsically disordered regions, which allows them to undergo liquid-liquid phase separation and form separate condensates with mRNA. G3BP1 is a central protein in a network of RBPs that participate in protection of mRNA from environmental stress by forming stress granules - ribonucleoprotein condensates that assemble in response to stress. Stress granules (SGs) might function as checkpoint for mRNA fate: storage of translationally silent mRNA, transfer of mRNA transcripts to P-bodies for degradation or transfer back into polysomes for translation. G3BP1 possesses RNA-binding domains, helicase activity and recruits several proteins into SGs, with some of them considered central nucleators in SG assembly, Caprin1 among them. The aim of this study is to investigate the cooperation between G3BP1 and Caprin1 in RNA-binding and condensate formation. Previous studies evidence the centrality of G3BP1 in SG assembly but, unlike other SG-nucleating proteins, G3BP1 lacks a prion-like domain and its direct mRNA binding is not clear. We propose that Caprin1, which is a known G3BP1 partner through the NTF2L domain of G3BP1 and a SG protein, may promote the G3BP1 mRNA binding and improve the mRNA recruitment in SG. In addition, we analyzed the function of the different G3BP1 domains in this interaction To demonstrate G3BP1-Caprin1-mRNA interplay, we used several methods of structural and cellular biology. We confirmed that G3BP1 and Caprin1 can co-localize and recruit mRNA in vivo, moreover, NTF2L-domain of G3BP1 is needed for this interaction. The mRNA recruiting capabilities of G3BP1 are improved in presence of Caprin1, and the RNA-binding domains of G3BP1 are of fundamental importance. Similarly, the enhanced mRNA recruitment of G3BP1-Caprin1 complex to SGs is at play only when full length G3BP1 is present. The consequence of G3BP1-Caprin1 interaction explain the centrality of G3BP1 in SG assembly and complement the model in which the shift RNA concentration triggers the conformational switch of G3BP1 at the heart of SG assembly by liquid-liquid phase separation

Le gène unr (upstream of N-ras) code une protéine de liaison à l’ARN, Unr, qui régule la stabilité et la traduction d’ARN messagers cibles. L’invalidation du gène unr chez la souris conduit à une létalité embryonnaire à mi-gestation (10,5 jours post-coitum, jpc). Unr est donc essentielle pour le développement de la souris. Le phénotype le plus frappant des embryons unr-/- est leur petite taille qui est déjà visible à 8,5jpc. Ce phénotype pourrait refléter un problème précoce de prolifération/différenciation au cours du développement qu’il est possible d’étudier dans les cellules souches embryonnaires (ES). Les cellules ES sont dérivées des cellules pluripotentes des embryons au stade blastocyste (3,5jpc). Les cellules ES peuvent s’auto-renouveler c’est à dire proliférer indéfiniment sous forme non différenciée ce qui correspond à leur état pluripotent ou différencier en tous les types cellulaires (lignages) adultes dérivés des feuillets primordiaux (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) ce que défini la pluripotence. Ces deux propriétés des cellules ES conditionnent leur devenir et définissent leur identité. Nous avons remarqué que les cellules ES unr-/- ont tendance à différencier spontanément alors qu’elles sont cultivées dans des conditions qui les maintiennent dans un état non différencié et prolifératif (état pluripotent). En routine, les cultures de cellules ES unr-/- contiennent environ 25% de cellules morphologiquement différenciées. Nos travaux montrent en effet, qu’elles différencient en endoderme primitif. Nous avons reproduit ce phénotype dans une autre lignée des cellules ES de fond génétique différent par déplétion stable d’Unr. La restauration de l’expression d’Unr dans les cellules ES unr-/- limite fortement leur engagement en différenciation. Unr contribue donc au maintient de l’état pluripotent des cellules ES en prévenant leur différenciation spontanée vers le lignage endodermique primitif (Epr). Ce tissu au cours du développement va former l’épithélium de la poche embryonnaire ou sac vitellin. Nos données préliminaires montrent que les cellules ES en absence d’Unr maintiennent tout de même leur capacité de différenciation multi-lignages (endoderme définitif, mésoderme et ectoderme) quand celle-ci est induite. Ensuite, nous nous sommes intéressés au(x) mécanisme(s) d’action d’Unr. Nous avons fait l’hypothèse qu’Unr pourrait directement agir en régulant positivement des gènes qui inhibent la différenciation des cellules ES en Epr ou en régulant négativement des gènes qui l’induisent. Nous avons identifié le gène gata6 comme cible potentielle d’Unr. Une augmentation modérée de l’expression du facteur de transcription Gata6 dans les cellules ES conduit à une autorégulation positive du gène gata6 et induit la différenciation des cellules ES en Epr. Nos données suggèrent qu’Unr pourrait directement déstabiliser les ARNms Gata6 dans les cellules ES afin de prévenir leur différenciation spontanée en Endoderme primitif
Unr (upstream of N-ras) is a cytoplasmic RNA-binding protein with cold shock domains, involved in regulation of messenger RNA stability and translation. Unr is essential to mouse development since Embryos deficient for Unr die at mid-gestation. Here we report that unr knockout ES cells maintained under growth conditions that sustain self-renewal spontaneously differentiate toward the primitive endoderm (PrE) lineage. This phenotype was reproduced in another ES line (E14tg2a) after shRNA-induced Unr depletion. Moreover, Unr rescue in Unr-deficient ES cells limits their PrE differentiation engagement. However, Unr is dispensable for multilineage differentiation, as shown by knockout ES cells capacity to produce differentiated teratomas. We further investigated the molecular mechanisms underlying the differentiation of unr-/- ES to primitive endoderm, and found that Unr acts downstream of Nanog. Our data also show Gata6 mRNAs are more stable in Unr-deficient ES cells as compared to wild-type ES cells. We propose that the possible repression by Unr of this key inducer of PrE differentiation at a post-transcriptional level may contributes to the stabilization of ES cells pluripotent state

La régulation de l'ARNm dans les cellules humaines est l'un des mécanismes essentiels permettant aux cellules de s'adapter à un nouvel environnement et de répondre aux signaux entrants. En effet, il est bien plus efficace pour une cellule de réguler l'homéostasie protéique au niveau de la traduction des ARNm plutôt qu'en jouant sur la transcription ou les mécanismes de dégradation des protéines. Dans les mécanismes de régulation de la traduction de l'ARNm, les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle clé.Au cours de ce travail de recherche, nous avons démontré que Lin28, une RBP humaine avec un domaine de choc froid peut interagir avec l'ARNm en coopération avec YB1, une protéine très abondante contenant aussi un domaine de choc froid, essentielle dans la constitution des mRNPs. L'interaction entre ces deux protéines est basée sur leur haute similitude de structure, et permet potentiellement à Lin28a de réguler la traduction nombreux mRNPs en utilisant YB-1 comme «badge d'entrée» au mRNP.Pour étudier l'interaction entre Lin28 et YB-1, différentes méthodes de biologie structurale et cellulaire ont été utilisées. D'abord, l'oligomérisation des domaines de choc froid de Lin28 et YB-1 en présence d'ARNm a été démontrée in vitro, et les résidus d'acides aminés impliqués dans ce processus ont été mis en évidence par spectroscopie RMN. Ensuite, la colocalisation dans le cytoplasme de Lin28 et YB-1 a été démontrée dans un contexte cellulaire. Finalement, nous avons révélé les conséquences fonctionnelles de cette interaction, par exemple dans le cadre de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Ces résultats éclairent un nouveau rôle de Lin28 dans le développement et l'adaptation des cellules cancéreuses à leur environnement
The mRNA regulation in human cells is one of the key mechanisms allowing the cells to adapt to a new environment and to respond to incoming signals. In terms of protein synthesis, the regulation of mRNA translation is a preferable process for cells compared to a more rigid mechanism of transcription or degradation. The RNA-binding proteins (RBPs) play a key role in the mRNA translation regulation.In the present work, we made an effort to demonstrate that a human RBP containing a cold shock domain, Lin28a, can act in cooperation with another cold shock protein YB-1, a core protein of mRNPs. The interplay between two cold shock proteins is based on their high structure similarity, that potentially gives Lin28 an opportunity to regulate the mRNA target translation in a general way using YB 1 as an “entry badge” to the mRNP.To demonstrate the interplay between Lin28 and YB 1, several methods of structural and cellular biology were used in the present study. The oligomerization of Lin28-CSD and YB-1-CSD upon RNA binding was shown in vitro, and the amino acid residues responsible for that were highlighted by NMR spectroscopy. Then, the colocalization of Lin28 and YB-1 was demonstrated in cell cytoplasm. Also, the protein interplay was shown to have functional consequences, e.g. for cell proliferation and differentiation

La régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique est basée sur un réseau complexe et dynamique d’interactions ARN-protéines. Un défi important est de comprendre les mécanismes par lesquels ces protéines de liaison à l’ARN (RBPs) influencent chaque étape du métabolisme des ARNm. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont permis de caractériser de nouvelles fonctions de la RBP virale EB2 qui est indispensable à la production du virus d’Epstein-Barr (EBV). Des travaux antérieurs ont montré qu’EB2 favorise l’accumulation cytoplasmique de la majorité des ARNm viraux, dont la caractéristique est d’être transcrit à partir de gènes sans intron. Nous montrons que le rôle d’EB2 ne se limite pas à celui de facteur d’export des ARNm car cette RBP stabilise aussi ses ARNm cibles dans le noyau en les protégeant de la dégradation par l’exosome. Nos résultats indiquent qu’en absence d’EB2 : (i) certains ARNm viraux sont instables car ils contiennent des sites cryptiques d’épissage ; (ii) le facteur d’épissage SRSF3 déstabilise ces ARNm en interagissant à la fois avec l’exosome et le complexe NEXT, un des cofacteurs nucléaires de l’exosome. Par ailleurs, nous montrons également qu’EB2 est associée aux polysomes et stimule efficacement la traduction de ses ARNm cibles, en interagissant avec les facteurs d’initiation de la traduction eIF4G et PABP. Le développement d’un nouveau système de traduction in vitro nous a permis de montrer que l’effet d’EB2 sur la traduction nécessite le passage nucléaire de ses ARNm cibles. Ainsi, l’ensemble de nos travaux démontre le rôle clé d’une RBP virale dans le couplage entre les étapes nucléaires et cytoplasmiques de la biogenèse des ARNm
Post-transcriptional regulation of gene expression is based on a complex and dynamic network of RNA-proteins interactions. A major challenge is to understand the precise contribution of these RNA-binding proteins (RBPs) to each step of mRNA metabolism. During this thesis, we have characterized new functions of the EB2 viral RBP which is essential for the production of the Epstein-Barr virus (EBV). Previous works have shown that EB2 promotes cytoplasmic accumulation of most intronless viral mRNAs. Here, we show that EB2 is not just an mRNA export factor because this RBP also stabilizes its target mRNAs in the nucleus by protecting them from RNA exosome degradation. Our results indicate that in the absence of EB2 : (i) some viral mRNAs are unstable because they contain cryptic splice sites ; (ii) the splicing factor SRSF3 destabilizes these mRNAs by interacting with both the RNA exosome and the Nuclear EXosome Targeting (NEXT) complex. Moreover, we also show that EB2 is associated with polysomes and it strongly stimulates translation of its target mRNAs through interactions with the eIF4G and PABP initiation factors. Interestingly, the development of a new in vitro translational assay allowed us to show that EB2’s translation stimulation requires that EB2 binds its target mRNAs in the nucleus. Taken together, our works demonstrate the key function of a viral RBP in the coordination of the nuclear and cytoplasmic steps of mRNA biogenesis

Les protéines signal Hedgehog (HH) sont des acteurs majeurs du développement animal et de la carcinogenèse. Leur transduction requiert la protéine à 7 domaines transmembranaires Smoothened (SMO) dont l’activité est régulée par Patched (PTC), un récepteur et antagoniste d’HH. PTC et HH régulent le trafic, la phosphorylation et l’accumulation de SMO mais de nombreux aspects de sa régulation restent incompris. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur Smaug, un nouveau partenaire de SMO chez la drosophile identifié au laboratoire dans un crible double-hybride. Smaug est connue pour lier et réprimer de nombreux ARNm au cours de l’embryogenèse chez la mouche. Durant ma thèse j’ai étudié comment Smaug agit sur SMO et la voie HH et aussi comment elle est régulée par HH. J’ai montré que Smaug était un régulateur positif de la voie HH et ce très probablement via sa capacité à fixer des ARNm. J’ai également montré que SMO et Smaug colocalisaient dans des foci cytoplasmiques en absence de signal et que Smaug était relocalisée à la membrane plasmique avec SMO en réponse à HH. Enfin j’ai mis en évidence un effet de SMO et d’HH sur la phosphorylation de Smaug suggérant une potentielle régulation en retour sur l’activité de Smaug. Ce travail m’a permis de proposer à la fois un nouveau rôle de la protéine de liaison aux ARN Smaug dans un processus de signalisation cellulaire ainsi que l’implication jusqu’ici insoupçonnée, d’une possible régulation post-transcriptionnelle d’ARNm dans la voie HH
Hedgehog Proteins (HH) are major players of animal development and carcinogenesis. Their transduction requires the 7 transmembrane protein Smoothened (SMO) whose activity is regulated by Patched (PTC), the HH receptor and antagonist. PTC and HH regulates SMO trafficking, phosphorylation and accumulation but numerous aspects of these regulations remain poorly understood. During my thesis, I focused on Smaug, a new partner of SMO in drosophila which was identified in the laboratory in a yeast two-hybrid screen. Smaug is known to bind and repress numerous mRNA during embryonic development in fly. I analyzed how it acts on SMO and HH signaling and also how is it regulated by HH. I have shown that Smaug is a positive regulator of the HH pathway and that it probably acts via its capacity to bind mRNA. I have also demonstrated that SMO and Smaug colocalise in cytoplasmic foci in absence of signal and that SMO is sufficient to localized Smaug to the plasma membrane in response to HH. Finally, I highlighted an effect of SMO and HH on the phosphorylation of Smaug suggesting the existence of a regulatory loop

Les papillomavirus humains (HPV) sont des virus à ADN double brin qui infectent la peau et les muqueuses. Les infections par les HPV, bien que majoritairement asymptomatique, provoquent des défauts de prolifération cellulaire pouvant parfois générer des cancers. Selon leur pouvoir carcinogène, on distingue les HPV à bas risque oncogène (HPV-BR) provoquant des lésions bénignes, et les HPV à haut risque (HPV-HR) responsables de l’apparition de nombreux cancers ano-génitaux et de certains cancers des voies aéro-digestives supérieures. Parmi les HPV-HR, HPV16 est le plus prévalent. La carcinogenèse induite par les HPV-HR est corrélée à l’expression des protéines virales E6 et E7, qui dérégulent de nombreux processus cellulaires. L’expression des gènes viraux, réalisée par la machinerie de la cellule hôte, est finement régulée particulièrement au niveau posttranscriptionnel. En outre, l’épissage alternatif génère une vingtaine de transcrits viraux, permettant l’expression des protéines virales. L’épissage au sein de la région codante E6 permettant de former l’isoforme E6*I est présent uniquement chez les HPV-HR, mais pas chez les HPV-BR, ce qui suggère son implication dans la carcinogenèse induite par les HPV-HR. Toutefois, le rôle biologique de la protéine E6*I produite par les HPV-HR est encore controversé.Afin de mieux appréhender les mécanismes de la carcinogenèse induite par les HPV-HR, nous nous sommes intéressés à : (i) l’étude des fonctions biologiques de l’isoforme E6*I, et (ii) aux mécanismes impliqués dans la régulation de l’expression de E6 et E7.Pour appréhender le rôle biologique d’E6*I d’HPV16, nous avons utilisé le séquençage de l’ARN afin d’identifier des cibles dérégulées par son expression ectopique. L’expression des isoformes E6 et E6*I d’HPV16 dans des cellules HPV négatives dérégule des transcrits impliqués dans des processus biologiques relatifs à l’expression des gènes viraux, la carcinogenèse virale, la transduction du signal et la traduction. L’expression d’E6*I seule, dérégule des transcrits impliqués dans l’organisation de la matrice extracellulaire, des voies de signalisation et d’adhérence cellulaire. De façon intéressante, il a été montré que ces gènes dérégulés par l’expression d’E6*I sont communément affecté par le niveau intracellulaire de ROS (espèces réactives de l’oxygène). Cela corrobore le rôle d’E6*I dans l’augmentation de la production de ROS. Le stress oxydatif associé aux ROS pourrait favoriser l’intégration du génome viral à celui de la cellule hôte, caractéristique de carcinogenèse associée aux HPV-HR. En somme, E6*I pourrait avoir un rôle oncogénique indépendant de celui d’E6, et interviendrait dans la carcinogenèse associée aux HPV-HR.Nous avons aussi étudié le rôle du complexe de jonction des exons (EJC), dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression d’E6 et E7. L’EJC est un complexe multiprotéique déposé sur les ARNm via l’épissage influençant ainsi leur devenir. Nous avons montré qu’un facteur de l’EJC, eukaryotic initiation factor 4A3 (eIF4A3), se liait aux ARNm viraux. Par ailleurs, nous avons observé que les composants de l’EJC affectent, certes de différentes façons, l’expression d’E6 et E7. Enfin, nous avons aussi étudié l’effet du nonsense-mediated mRNA decay (NMD), un mécanisme lié à l’EJC, sur l’expression d’E6 et E7. Non seulement nos résultats suggèrent que le NMD inhibe l’expression d’E6 et E7, mais nous avons aussi observé que la protéine E6 d’HPV16 réduit l’activité du NMD. Cette inhibition permettrait à HPV16 d’avoir un contrôle sur ses transcrits mais d’affecter aussi des cibles cellulaires du NMD. Etant donné l’implication des gènes régulés par le NMD dans le maintien de l’homéostasie et l’adaptation cellulaires, il serait intéressant d’appréhender le rôle de cette nouvelle activité d’E6 dans la carcinogenèse associée aux HPV-HR
Human papillomaviruses (HPV) are double strand DNA viruses that infect skin and mucosa. HPV infections, although mostly asymptomatic, cause cell proliferation defects that can sometimes give rise to cancer. According to their carcinogenic potential, we distinguish low-risk HPVs (lr-HPV) causing benign lesions, and high-risk HPV (hr-HPV) responsible for the appearance of numerous anogenital and some head and neck squamous-cell cancers. Among the hr-HPV, HPV16 is the most prevalent. Hr-HPV-induced carcinogenesis is correlated with the expression of the viral oncoproteins, E6 and E7, which deregulate many cellular processes. Viral gene expression, performed by the host cell machine, is finely regulated particularly at the post-transcriptional level. Besides, alternative splicing generates about twenty viral transcripts, leading to the expression of viral proteins. The splicing within the E6 open reading frame that generates an E6*I mRNA only in hr-HPV, but not in the lr-HPV, suggests its involvement in hr-HPV-induced carcinogenesis. However, the biological role of E6*I protein produced by HPV-HR is still controversial.In order to better understand the mechanisms of hr-HPV-induced carcinogenesis, we have interested in: (i) the study of the biological functions of the E6*I isoform, and (ii) the mechanisms involved in the regulation of E6 and E7 expression.To get insight the biological role of HPV16 E6*I, we used RNA sequencing to identify targets deregulated by its ectopic expression. Expression of HPV16 E6 and E6*I isoforms in negative HPV cells deregulate several transcripts involved in biological processes related to viral gene expression, viral carcinogenesis, signal transduction and translation. The expression of E6*I alone, deregulates transcripts involved in the organization of the extracellular matrix, signaling pathways and cell adhesion. Interestingly, it was shown that the genes deregulated by E6*I expression are commonly affected by the intracellular level of ROS (reactive oxygen species). These results support the role of E6*I in increasing ROS production. The ROS-associated oxidative stress could favor viral genome integration with that of the host cell, a characteristic of hr-induced carcinogenesis. In sum, E6*I may have an oncogenic role independent of E6, and intervene in the carcinogenesis associated with hr-HPV.We also studied the role of the exon junction complex (EJC) in the posttranscriptional regulation of E6 and E7 expression. EJC is a multiprotein complex deposited on mRNAs via splicing, thus influencing their fate. We have shown that a factor of EJC, eukaryotic initiation factor 4A3 (eIF4A3), binds to viral mRNAs. Moreover, we have observed that the components of the EJC affected, in different ways, the expression of E6 and E7. Finally, we also studied the effect of nonsense-mediated mRNA decay (NMD), a mechanism linked to the EJC, on the expression of E6 and E7. Our results suggest that not only NMD inhibits the expression of E6 and E7, but we have also observed that HPV16 E6 protein reduces NMD activity. This inhibition would allow HPV16 to have control over its transcripts but also to affect NMD cellular targets. Given the involvement of NMD-regulated genes in the maintenance of cellular homeostasis and adaptation, it would be interesting to understand the role of this new E6 activity in carcinogenesis associated with HPV-HR

Au cours de la vie de l'ARNm dans la cellule, l'ARNm existe en complexe avec des protéines et n'est jamais libre. Dans le cytoplasme, l'ARNm actif est associé aux ribosomes pour former les polyribosomes tandis que les ARNm réprimés s’associent avec certaines protéines de liaison à l'ARN (RBP) pour former des mRNP. Les mRNP réprimés sont généralement isolés dans le cytoplasme mais ils peuvent également être trouvés dans des compartiments appelés granules d’ARN, notamment lors d'un stress cellulaire. Ces granules d’ARN sont des organelles non membranaires contenant principalement de l'ARNm inactif et coexistent avec des polysomes. Selon les conditions environnementales, il y a un changement dans le ratio des ARNms trouvés dans les granules d’ARN ou dans les polysomes. De plus, il existe des différences dans la teneur en ARNm des différents types de ces organelles en fonction de leur localisation et de leurs fonctions. Actuellement, les granules de stress présentent un grand intérêt pour les chercheurs en raison de leur relation avec certaines maladies neurologiques. Les mutations trouvées dans certaines protéines de liaison à l'ARN telles que TDP43 et FUS sont directement liées à certaines maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (FTLD) et la maladie d'Alzheimer (MA). Dans les neurones affectés, TDP-43 et FUS forment des agrégats cytoplasmiques alors que ces protéines se trouvent généralement dans le noyau dans des conditions physiologiques. Comme elles ont également été trouvées dans les granules de stress cytoplasmiques, les granules de stress peuvent servir d'intermédiaires pour la formation d'agrégats de FUS et TDP-43. En outre, FUS et TDP-43 contiennent des régions intrinsèquement désordonnées (IDR) qui contribuent à leur agrégation.La formation de granules de stress est stimulée par l'exposition à différents facteurs internes et / ou externes. Les granules de stress servent de lieu de stabilisation des ARNm et à les maintenir inactifs jusqu'à ce que les facteurs de stress disparaissent. On considère que les structures secondaires de l'ARNm jouent un rôle important dans l'assemblage des granules de stress. De telles structures servent aussi de sites de liaison pour les RBP, qui les stabilisent davantage (par exemple G3BP). La protéine de liaison Y-box 1 (YB-1) a également été identifiée comme un marqueur pour les granules de stress. YB-1 est une protéine de liaison à l'ARN qui accompagne l'ARNm dès sa synthèse dans le noyau jusqu’à sa dégradation dans le cytoplasme. YB-1 contient un domaine de choc froid (CSD) avec deux motifs de reconnaissance d'ARN (RNP-1 et RNP-2), ainsi qu'un domaine CTD non structuré similaire aux IDR. Pour la plupart des protéines impliquées dans la formation des granules de stress, leur activité stimulante de l'IDR dans ce processus a été démontrée. Dans le même temps, il existe quelques controverses concernant le rôle de YB-1 dans l'assemblage des granules de stress. Selon certains modèles, il y a lieu de le considérer comme un régulateur négatif dans la formation des granules de stress. Selon d'autres, YB-1 présente les propriétés d'un agent favorisant de l'assemblage de granules de stress. Par ailleurs, peu de travaux ont n'a été faits pour déchiffrer l'action de la protéine sur la traduction sous stress oxydatif. Ici, notre objectif était de démêler les mécanismes structuraux par lesquels YB-1 peut réguler négativement la formation de granules de stress et de clarifier son influence sur la traduction dans des conditions de stress
During mRNA life in cell mRNA exists in complex with proteins and is never free. In the cytoplasm, active mRNA is associated with ribosomes to form polyribosomes while repressed mRNAs in association with RNA-binding proteins forms mRNPs. Repressed mRNPs are generally isolated in the cytoplasm but they can also be found in compartments called mRNP granules, notably during cellular stress. Such mRNP granules are non-membrane organelles contains mostly translationally inactive mRNA and coexist with polysomes. Depending on the environmental conditions, there is a change in the ratio of mRNA found in these types of granules or in polysomes. In addition, there are differences in the mRNA content of the different types of such organelles depending on their localization and functions. Currently, stress granules are of great interest to researchers due to their relation to some neurological diseases. Mutations of some RNA-binding proteins such asTDP43 and FUS are directly linked to some neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), frontotemporal dementia (FTLD), and Alzheimer's disease (AD). In the affected neurons, TDP-43 and FUS form cytoplasmic aggregates while these proteins are generally found in the nucleus under physiological conditions. As they were also found in cytoplasmic stress granules, stress granules may serve as intermediates for the formation of FUS and TDP-43 aggregates. In addition, FUS and TDP-43 contain intrinsically disordered regions (IDRs) which contribute to their aggregation. The formation of stress granules is stimulated by exposure to different internal and/or external factors. Stress granules serve as a place for mRNA stabilization and keeping it inactive until stress factors disappear. It is considered that secondary structures of mRNA play a significant role in the assembly of stress granules. Such structures serve as binding sites for RBPs, which further stabilize them (e.g. G3BP). The Y-box binding protein 1 (YB-1) was also identified as a marker for stress granules. YB-1 is an RNA-binding protein that accompanies mRNA from its synthesis in the nucleus to degradation in the cytoplasm. YB-1 contains a cold shock domain (CSD) with two RNA-recognition motifs (RNP-1 and RNP-2), as well as an unstructured CTD domain similar to IDRs. For most of the proteins involved in the formation of stress granules, their stimulating activity of IDR in this process has been shown. At the same time, there are some controversies regarding the role of YB-1 in the assembly of granules. According to some sources, there is reason to consider it as a negative regulator. According to others, YB-1 exhibits the properties of an inducer during the assembly of stress granules. At the same time, no attempts were made to decipher the mechanism of action of the protein under oxidative stress.Here our aim was to unravel the structural mechanisms by which YB-1 can negatively regulate the formation of stress granules and to clarify its influence on translation in stress conditions