Academic literature on the topic 'Protéine prions'

A la suite de l’interdiction des farines animales en alimentation animale, il est nécessaire de mettre au point des procédés simples et économiques pour les valoriser et les décontaminer vis-à-vis de la présence possible de prion pathogène. L’usage des microorganismes est une solution possible. Aussi, des collections de microorganismes capables de croître sur la kératine ou sur des farines animales et sécrétant des protéases capables de dégrader la PrPsc contenue dans les farines animales ont été criblées. Ceci a permis de découvrir trois souches de bactéries thermophiles, isolées de différentes sources chaudes réparties sur la planète, qui sont capables de dégrader la protéine prion infectieuse PrPsc et de croître sur un milieu composé de farines animales. Leur activité protéolytique, de type chymotrypsique pour l’essentiel, est maximale à la température de 60 à 80°C et focalisée sur certaines liaisons peptidiques qui sont nombreuses sur la protéine prion. Leur action découpe ainsi la protéine prion en morceaux plus courts inoffensifs. Les perspectives sont de mettre en oeuvre ces microorganismes thermophiles dont le patrimoine protéolytique permettrait la dégradation des farines animales, actuellement incinérées, et les protéines prions qu’elles renferment.

Les Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST) sont des maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans le cerveau d’une forme anormale de la protéine prion, la PrP. La PrP cellulaire est une glycoprotéine membranaire qui a deux sites de glycosylation. La susceptibilité des moutons à la tremblante, la plus répandue des EST, est sous le contrôle d’un polymorphisme génétique en position 136, 154 et 171 de la protéine PrP. Différents travaux ont montré que l’efficacité de la conversion de la PrP normale (PrPc) en PrP anormale (PrPsc) pouvait être influencée à la fois par son degré de glycosylation et par sa séquence primaire en acides aminés. Au cours de notre travail de production d’anticorps monoclonaux dirigés contre la PrP ovine, nous avons obtenu de nouveaux anticorps discriminants les différentes formes glycosylées de la PrP. Parmi ces anticorps, nous avons montré que certains présentent une affinité différentielle vis-à-vis des allèles de la PrP, essentiellement en position 171. Cette position est connue pour jouer un rôle majeur dans le contrôle de la résistance (Arginine, R171) et de la sensibilité (Glutamine, Q171) des moutons à la tremblante. Ces anticorps représentent de nouveaux outils pour étudier la relation entre le niveau de glycosylation de la PrPc et sa capacité à être convertie en PrPsc. Ils nous permettront également une analyse plus fine du profil électrophorétique des différentes glycoformes de la PrP anormale dans le cadre du typage de souches de prions. Enfin, ces anticorps peuvent être utilisés pour le génotypage rapide des moutons en vue d’une sélection d’animaux résistants à la tremblante et pour la compréhension des bases moléculaires de la résistance à la tremblante conférée par la présence de l’Arginine en position 171 de la PrP.

Les agents des encéphalopathies spongiformes transmissibles (ESST) sont responsables de maladies neurodégénératives fatales chez l’homme (maladie de Creutzfeldt-Jakob, insomnie fatale familiale, syndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, Kuru) et chez les animaux (tremblante ovine et caprine, encéphalopathie spongiforme bovine, encéphalopathie spongiforme féline, encéphalopathie transmissible du vison, dépérissement chronique des cervidés. L’encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) est une maladie nouvelle apparue en 1985 au Royaume-Uni, puis s’est propagée ensuite dans les autres pays européens et en particulier en France (premier cas identifié en 1990). La tremblante des ovins est en revanche connue depuis plus de deux siècles en Europe. Elle se distingue de l’ESB par sa contagiosité et la distribution de la protéine prion pathologique PrPsc dans les tissus périphériques. L’agent de l’ESB est transmissible des bovins à l’homme chez lequel il provoque une forme particulière (variant) de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. En revanche, l’agent de la tremblante ovine semble sans danger pour l’homme. Jusqu’en 1992, date du premier rapport réalisé à la demande du ministre de la recherche, Hubert Curien, par une commission de 9 chercheurs présidée par Dominique Dormont, les recherches poursuivies en France sur les ESST étaient le fait d’un petit réseau informel qui a été à l’origine d’un premier programme de recherches piloté par l’INSERM. L’annonce faite le 20 mars 1996 par les autorités du Royaume-Uni que 10 britanniques venaient de succomber à une variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob liée à l’ESB, entraîne une crise de confiance sans précédent des consommateurs. Interpellée, la communauté scientifique incluant l’INRA est alors brutalement placée devant un ensemble de questions nouvelles qui l’oblige à recentrer sa stratégie en termes d’expertise collective. La mise en place à cette occasion, du comité interministériel d’experts sur les ESST animé par Dominique Dormont (et auquel 8 chercheurs INRA participaient) a été un facteur très important dans la mobilisation de la communauté scientifique française et en particulier de l’INRA (voir à ce sujet l’analyse critique du fonctionnement de ce comité interministériel faite par Jacqueline Estades et Elisabeth Rémy dans l’ouvrage « l’expertise en pratique : les risques liés à la vache folle et aux rayonnements ionisants », 249 pages, L’Harmattan éditeur, Novembre 2003). Depuis 1993, les chercheurs INRA du département de génétique animale réfléchissaient aux conditions de développement de projets de recherche nouveaux sur les maladies à prions et en particulier sur la tremblante ovine qui sévissait de façon spectaculaire dans un troupeau ovin expérimental (domaine INRA de Langlade). Les chercheurs concernés de ce département ont eu un rôle moteur dans la mobilisation ultérieure des autres départements. En effet, à partir de l’automne 1996, des chercheurs INRA appartenant à 6 départements de recherche différents (génétique animale, santé animale, physiologie animale, transformation des produits animaux, hydrobiologie et faune sauvage, économie et sociologie rurale) ont décidé de s’engager dans des projets de recherche centrés sur les maladies à prions. Cet intense effort de mobilisation s’est accompli essentiellement par mobilité thématique (et non pas à la faveur de recrutements nouveaux), ce qui a représenté pour chacun des chercheurs engagés un effort personnel de remise en cause l’obligeant à repartir de zéro dans un domaine totalement nouveau, en abandonnant des recherches où chacun avait acquis un positionnement national et international. Cette mobilisation collective importante a été favorisée par trois facteurs différents : - l’exceptionnelle demande sociétale résultant d’une crise de confiance sans précédent touchant à la fois le consommateur et le citoyen, - l’ensemble des nombreuses questions nouvelles posées par la problématique « prions » qui a profondément excité la curiosité et l’intérêt des chercheurs de disciplines différentes, - et, enfin, la mise en place rapide de nouveaux moyens financiers, à la faveur d’une série d’appels d’offres successifs (INRA en interne, interministériels, GIS Prions, Union Européenne) qui ont exercé un effet incitatif puissant. Dans ce contexte nouveau, les objectifs prioritaires de l‘INRA ont été les suivants : - tout d’abord, créer les conditions optimales pour la mise au point des différents outils indispensables au développement des recherches sur les ESST : . les souris transgéniques pour les infections expérimentales,. les lignées de cultures cellulaires pour la propagation in vitro du prion,. les anticorps monoclonaux anti protéine prion (PrP),. les techniques immunocytohistochimiques pour identifier la protéine prion pathogène PrPsc dans les tissus infectés,. les méthodes de génotypage à grande échelle du gène PrP chez les ovins,. les approches épidémiologiques adaptées,. et surtout toute la logistique appropriée pour la manipulation des prions en toute sécurité au laboratoire et dans les animaleries (souris et gros animaux). - parallèlement, organiser des instances nouvelles pour la coordination (comité d’action incitative programmée, bureau permanent des recherches ESST) et l’animation scientifique interdisciplinaire (séminaires réguliers) de façon à assurer les meilleures conditions pour favoriser les échanges entre les équipes et la cohérence des projets entre eux. - et, enfin, mettre en place des moyens nouveaux en termes de ressources humaines (redéploiements, recrutements). Plus d’une vingtaine d’équipes INRA se sont engagées depuis 1996. A partir des nouveaux outils mis à disposition des différentes équipes, les recherches se développent et les résultats obtenus ont été présentés et discutés lors des séminaires organisés en 1998, 2000 et 2003. Ces résultats ont été valorisés par un nombre important de publications et ont été concrétisés au niveau des applications par la mise au point de tests rapides de diagnostic des ESST (contribution au test Biorad pour l’ESB, convention avec l’Institut Pourquier pour la tremblante ovine) ainsi que par un plan ambitieux de contrôle génétique et d’éradication de la tremblante dans les troupeaux ovins français. Dans le domaine de la biosécurité du retraitement des farines animales, un brevet a été pris en mars 2004. A l’issue du dernier séminaire, la direction scientifique Animal et Produits Animaux a décidé de valoriser l’ensemble des résultats obtenus et des connaissances en découlant, par la réalisation de ce numéro hors-série. L’objectif était de présenter au plus grand nombre l’ensemble des avancées scientifiques et des axes de recherche actuels sur les prions, menés dans les différentes disciplines. Ce numéro hors-série de la revue « Productions Animales » comprend 7 chapitres structurés autour des questions nouvelles que les chercheurs se sont attachés à résoudre : les animaux modèles, la caractérisation des souches et la nature de l’agent, la protéine prion cellulaire, la pathogénie des ESST, la variabilité de la résistance aux ESST et enfin l’épidémiologie et la lutte contre les ESST. En outre à la fin du numéro, figurent des annexes présentant successivement : la liste des publications scientifiques réalisées à partir des résultats obtenus, la liste des séminaires scientifiques organisés en interne, et enfin la liste des 18 projets scientifiques européens dans le domaine des ESST, impliquant des équipes INRA comme coordinateur ou comme partenaire, illustrant ainsi leur positionnement international.

Les Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST) ou maladies à prion se caractérisent par l’accumulation dans le tissu nerveux d’une forme anormalement repliée d’une protéine cellulaire de l’hôte, la PrPc. Cette isoforme anormale, ou PrPsc, supposée responsable des désordres neurodégénératifs observés, est aussi assimilée par de nombreux auteurs à l’agent transmissible lui-même, lequel serait alors dépourvu de génome et se propagerait de manière épigénétique. Un phénomène au coeur des recherches sur les EST est l’existence de variants phénotypiques, ou souches. Les souches de prions peuvent être différenciées entre elles sur une base biologique, par la nature des manifestations anatomo-pathologiques engendrées lors de leur propagation chez un même hôte, en particulier une lignée pure de souris, et sur une base biochimique, par le profil moléculaire de la PrPsc présente dans le cerveau des individus atteints. Le déterminisme biologique et moléculaire de cette diversité et la dynamique évolutive qu’elle suggère demeurent largement incompris. De ce fait, la caractérisation des souches qui infectent les espèces naturellement atteintes par les EST constitue une tâche relativement ardue, au demeurant essentielle à la compréhension de l’épidémiologie de ces maladies, à leur contrôle sur le terrain et à la protection de la santé humaine. Les recherches menées à l’INRA visent à documenter la diversité des souches d’EST chez les petits ruminants par typage des isolats de tremblante naturelle, et à mieux comprendre le déterminisme de cette diversité. Elles ont également pour objectif l’amélioration des méthodes actuelles de typage en termes de rapidité et de fiabilité, notamment à travers le développement de souris transgéniques plus réceptives à la transmission que les souris conventionnelles.

Le passage de la forme non pathogène de la protéine prion normalement présente chez l’individu sain (PrPC) vers la forme pathogène (PrPSc) se traduit par une augmentation de la proportion de feuillet bêta dans la protéine, favorisant son agrégation, la formation de fibrilles et la résistance à la protéinase K. La structure tridimensionnelle de PrPC, déterminée pour quatre espèces, est extrêmement conservée. Elle comporte un segment désordonné et très flexible à l’extrémité N-terminale et une partie globulaire, constituée de deux brins bêta (S1, S2) et de trois hélices alpha (H1 à H3) associés par des boucles (L1 à L5). Le fragment de la protéine correspondant à l’hélice H1 se structure en hélice de façon autonome. En revanche, le peptide comportant la région H1-L3- S2 (PrPH1-L3-S2) montre, comme la protéine, une capacité à adopter différentes conformations. Ces résultats contribuent à proposer l’hélice H1 comme l’un des motifs structuraux de la protéine capables d’initier la transconformation, c’est-à-dire la transformation de la protéine prion normale en protéine prion pathogène. Le rôle clé de l’hélice H1 dans la transconformation a été étayé par une série d’études physicochimiques, détaillées dans l’article, réalisées à l’aide d’une série de peptides de tailles variées (9 à 33 résidus, séquence ovine) ciblés sur la région [133-165] qui comporte la succession des motifs structuraux L2-H1-L3-S2. Les principaux résultats de cette étude montrent la grande stabilité de l’hélice H1, en particulier en présence de la boucle L2 ou des deux boucles L2 et L3. L’absence de la boucle L2 et la présence du brin bêta S2 sont en revanche des facteurs de déstabilisation de l’hélice H1. La boucle L2 pourrait d’ailleurs jouer un rôle tout particulier comme le suggère l’observation d’une interaction entre cette boucle et la protéine PrPC. Une telle interaction pourrait être mise en jeu dans les mécanismes intervenant dans l’interaction protéine prion saine/protéine prion pathogène impliquée dans la propagation de la maladie. Ces résultats, qui devront être confirmés et développés, conduisent à proposer la boucle L2 et le feuillet S2 comme deux régions assurant la «régulation» de la stabilité de l’hélice H1, qui apparaît comme une région clef dans les processus de conversion pathogène.

Le terme prion a tendance à être utilisé pour désigner un nombre de plus en plus vaste de protéines souvent très divergentes. L’état actuel des connaissances permet de conclure à l’existence de ’prions’ potentiellement pathogènes chez les Mammifères uniquement. Des protéines de la même famille ont été trouvées chez les Oiseaux et les Tortues. Enfin, aucun homologue des ’prions’ n’a pu être mis en évidence chez les Poissons, en dépit de recherches approfondies. Une révision de la nomenclature de ces molécules semble donc s’imposer, à des fins de précision scientifique et d’information claire du public.

De nombreuses études sont menées pour élucider le mécanisme de la transformation de la protéine prion normale (PrPc) en protéine pathogène résistante aux protéases (PrPres) et pour comprendre comment l’accumulation de cette PrPres peut induire les dégénérescences nerveuses observées lors des Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST). Cependant, la protéine prion est une protéine ubiquitaire présente dans de nombreux tissus autres que le tissu nerveux et le rôle cellulaire «normal» joué par cette PrPc est très controversé et reste encore une énigme. Différentes équipes INRA utilisent leurs compétences en physiologie pour établir la présence et les voies de sécrétions de la protéine prion normale dans différents organes. Ces études se font en utilisant des modèles animaux et cellulaires classiques, mais aussi des souris où le gène codant pour la protéine prion est supprimé (PrP-/-) ou sa quantité sur-exprimée par introduction de multiples copies de ce gène. Ceci permettra d’une part d’étudier le ou les rôles possibles de cette protéine dans les différents tissus et fluides biologiques (protection contre le stress oxydatif, transport de métaux, signalisation cellulaire, etc.), d’autre part de rechercher si lors de l’infection, de la protéine prion pathogène est retrouvée dans certains de ces fluides biologiques tels que le lait et le sperme. En effet, si les études passées n’ont jamais montré de protéine prion pathogène dans ces fluides, des travaux utilisant des méthodes plus sensibles sont nécessaires pour confirmer ces résultats.

Les prions sont des agents infectieux constitués de Prp sc isoforme modifiée de la protéine prion (PrP c), codée par PRNP. La protéine Doppel (Dpl) est codée par le gène PRND adjacent à PNRP. Quatre polymorphismes de PRND sont observés chez l'homme ; aucun n'influence la suceptibilité aux maladies à prions. L'expression de prnd reste inchangée après infection. La surexpression de Dpl ne module pas l'accumulation de PrPsc et l'expression cérébrale de Dpl n'est pas modifiée chez des patients atteints de maladie de Creutzfeld-Jakob. Dpl est retrouvée dans les cellules de Sertoli, le liquide séminal et sur la flagelle des spermatozoides.
Prion are infectious agents accumulating in the central nervous system, constituted of PrPsc the modified isoform of the prion protein (PrPc), encoded by the PRNP gene. The Doppel protein (Dpl) is encoded by the PRND gene nearby PRNP. Four Polymorphisms of PRND are observed in human ; none of them modify the susceptibility to prion diseases. Prnd expression remains unchanged after infection in neuroblastoma cells. Dpl surexpression do not change the PrPsc accumulation in these cells and the cerebral accumulation of Dpl is not modified in patients with Cretzfeld-Jakob disease. Dpl in humans is so expressed both on germinal and somatic cells in the male genital tract, suggesting its implication in fertility. Sperm cells could make a good tool to investigate the interaction between Dpl and PrP wich are both. .

L'agent infectieux responsable des Encéphalopathies Spongiformes Transmissible (EST) serait essentiellement composé d'une protéine constitutive de l'hôte, la protéine prion (PrP), sous une forme pathogène infectieuse (PrPsc). L'identification de ligands de la PrP pourrait lever les doutes concernant ses rôles physiologiques et la nature controversée de l'agent infectieux. Puisque les acides nucléiques sont connus pour lier la PrP, nous avons identifié par la méthode SELEX des motifs d'ARN synthétiques de forte affinité pour la PrP ovine recombinante. Notre meilleur ARN présente un motif de 21 nucléotides partagé avec un ARN anti-PrP isolé par d'autres auteurs. Ces résultats renforcent les hypothèses que la PrP pourrait exercer un rôle sur des acides nucléiques dotés de motifs proches de ceux que nous avons identifiés et intervenant ou non dans la composition de l’agent infectieux. Par ailleurs, ces ARN constituent de potentiels outils d'étude ou de diagnostic des maladies à prions
One of the unsolved problems in prion diseases relates to the physiological function of cellular prion protein (PrP), of which a misfolded isoform is probably the only component of the transmissible spongiform encephalopathies (TSE) agent. Knowledge of the PrP-binding molecules may help in elucidating its role and understanding the pathological events underlying prion diseases. Because nucleic acids are known to bind PrP, we used the SELEX approach to identify the preferred RNA sequences that bind to the ovine recombinant PrP. Our best RNA presents 21 nucleotides shared with a previously described PrP aptamer. We believe that the prion protein may have a physiological function related to nucleic acids presenting some of the patterns we identified in our study. Theses nucleic acids could be involved in the composition of the infectious agent. These RNA can be useful for diagnostic or as new tools to study prion diseases

Des données récentes montrent qu'une rréponse immune, active ou passive, dirigée contre la protéine prion (PrP) retarde la progression de la tremblante chez des souris infectées. La vaccination active contre les maladies à prions se heurte cependant à une difficulté majeure, à savoir que la PrPqui est tenuepour l'élément pathogène essentiel de ces affectations, est perçue par le système immunitairecomme un composant du soi. L' objectif de ce travail de thèse se résume en trois points : évaluer précisément l'étndue de la tolérance du système immunitaire à l' égard de la PrP, chercher les moyens de la surmonter, notemment grâce à l'utilisation de peptides de synthèse, et commencer à valider la démarche vaccinale dans un modèle de tremblante expérimentale murine
TSE are lethal neurodégénérative disorders. Some works showed that we could generate a relative immunity response against prion protein (PrP), the major or unique cause of the disease. This work permit to highlight immun peptides from the PrP. First, three peptides were identified, in PrP KO mice, for their capacité to induce T p143-172, p158--187 and B p98-127 immun responses. Second, these peptides were tested with the same immun protocol in PrP+ mice, but none gave a delectable immun response. Yet, a response could be obtained with these peptides by immunization with oligo-CpG. Finally, peptide p158-187 was validated for its immunprotective capacity during the lymphoinvasion phase, in mouse experimental scrapie. But some evidences of brain infiltrats could let think of a possible autoimmun reaction

Le phénotype prion [URE3]chez la levure S. Cerevisiae est associé à la protéine Ure2p. Ure2p est agrégée dans les cellules [URE3] et forme des fibres amyloides in vitro. Il a donc été proposé qu'[URE3] soit le résultat d'un processus amyloide in vivo. Au cours de mon travail de thèse, j'ai en premier lieu étudié la stabilité du prion [URE3]. J'ai montré l'existence de deux voies d'élimination d'[URE3] : la première est l'inhibition de la réplication du prion (par certains composés chimiques) et la deuxième est la formation d'agrégats de haut poids moléculaire (avec certains allèles d'URE2). J'ai ensuite testé si les agrégats [URE3] étaient d'une nature comparable aux amyloides produites in vitro. La comparaison des propriétés de solubilisation et de protéolyse ménagée de ces deux types d'agrégats nous a permis de mettre en évidence qu'ils étaient différents. La nature biochimique des agrégats [URE3] reste énigmatique
[URE3] in yeast is the prion phenotype associated to Ure2p. Ure2p is aggregated in [URE3] cells and this protein form amyloids in vitro. Therefore, it has been proposed that [URE3] could be the result of an amyloid process. During my PhD, I first investigated the stability of [URE3]. I have demonstrated the existence of two ways of curing : the first isthe inhibition of prion replication (ie with guanidine-HC1) and the second is the large aggregation of Ure2p (ie with Ure2-gfp overproduction). These results emphasize the importance of intermediate species in the aggregation process for prion propagation. I then tested the possibility for [URE3] in vivo aggregates to be the result of an amyloid process. Comparison of solubilization properties and limited proteolysis patterns of these two types of aggregates demonstrated that they are different. The biochemical nature of in vivo aggregates is still enigmatic

Les maladies à prion sont un cas unique de pathologie où l’agent infectieux, le prion, est une protéine. La protéine prion possède plusieurs caractéristiques qui la rendent particulière vis-à-vis d’autres protéines cellulaires, telles que sa capacité à agréger et à transmettre sa conformation agrégée à la protéine soluble ainsi que la transmission des agrégats de la protéine d’une cellule à l’autre et d’un organisme à un autre. De plus en plus, on associe l’agrégation de protéines à différentes maladies humaines, comme les maladies d’Alzheimer, de Parkinson et le diabète de type 2. Certaines protéines impliquées dans ces pathologies font partie des prionoïdes, une catégorie réservée aux protéines aux propriétés agrégatives qui démontrent certaines des caractéristiques associées aux prions. Récemment, la protéine p53, un facteur de transcription fortement impliqué dans le cancer, a été montrée comme étant capable d’agréger in vitro. Une accumulation de la protéine a également été observée dans des cellules tumorales, laissant croire que l’agrégation de p53 se produit également in vivo, et pourrait avoir un rôle dans le développement du cancer. Ces observations portent à croire que la protéine p53 pourrait elle aussi faire partie des prionoïdes. L’objectif de cette étude est donc de montrer que la protéine p53 possède certaines des caractéristiques des prions. Pour ce faire, la protéine p53 recombinante a été produite pour former des agrégats de p53 et ces agrégats ont été utilisés pour déterminer si la protéine démontre des caractères prionoïdes. Les résultats obtenus montrent une agrégation in vitro de p53WT pleine longueur ainsi que de sa forme tronquée, p53C. De plus, des cellules en culture sont capables d’internaliser ces agrégats, qui co-agrègent ensuite avec la protéine p53 endogène de ces cellules. Enfin, nos résultats montrent clairement que l’internalisation des agrégats par les cellules se fait par la macropinocytose. Nous avons donc réussi à prouver que la protéine p53 agit comme un prion puisqu’elle s’agrège spontanément, ses agrégats sont internalisés par des cellules en culture et sont capables de co-agréger avec la protéine soluble.

Ce travail comporte deux projets indépendants. L'objet du premier était de produire et de caractériser les deux domaines de liaison aux nucléotides (NBD1 et NBD2) du transporteur ABC humain ABCC1/MRP1 d'un point de vue fonctionnel et/ou structural. Ceux-ci fournissent l'énergie nécessaire au transport de substrats à travers la membrane, en particulier pour l'export de molécules utilisées en chimiothérapie par des cellules cancéreuses. L'enjeu était de produire de grandes quantités du domaine NBD2 monomre pour des études structurales. Plusieurs approches ont été utilisées pour augmenter la solubilité de NBD2 sous forme de protéine recombinante dans E. Coli : différents construits, co-expression de chaperons et expression en corps d'inclusion suivie de renaturation. Mais la qualité des échantillons n'a jamais été suffisante pour envisager de poursuivre, par RMN en particulier. NBD1, dont la structure était déjà disponible, a été produit et purifié. La protéine sauvage ainsi qu'un mutant ne liant plus les nucléotides ont été testés pour une activité adénylate kinase, mise en évidence pour d'autres transporteurs ABC. Nous avons montré que dans le cas de MRP1 cette activité n'était pas liée à NBD1. Une deuxième partie a été consacrée à l'étude de la forme amyloïde du domaine H2H3 de la protèine du prion PrP, responsable d'encéphalopathies spongiformes transmissibles. L'objectif principal était l'amélioration de la qualité des échantillons pour des études par RMN du solide par sélection des voies d'oligomérisation. Au cours de ces études, nous avons pu montrer que le domaine H2H3 était suffisant pour transférer l'information structurale au cours du processus de fibrillisation
In the present work we dealt with two independent projects. The aim of the first part was to produce and functionally and/or structurally characterize the two nucleotide-binding domains (NBD1 and NBD2) of the human ABC transporter ABCC1/MRP1, which are needed to power the transport of substrates across the cell membrane, e. G. The export of chemotherapeutics from cancer cells. While a crystal structure together with functional reports are available for isolated NBD1, it has so far not been possible to produce large quantities of monomeric NBD2 to enable a more extensive structural/enzymatic characterization. Here, we tested a series of new approaches to increase the solubility of NBD2 expressed as a recombinant protein in E. Coli, including the use of different constructs, co-expression of chaperones, expression in inclusion bodies and refolding. Unfortunately this did not sufficiently improve the quality of NBD2 samples in terms of oligomeric state to envisage further investigation by NMR. In contrast, NBD1 could be produced and purified. The wildtype protein together with an a priori non ATP-binding mutant were tested for adenylate kinase activity, which had been reported for other ABC transporters, but which we showed not to be part of the activity spectrum of NBD1. In the second part we dealt with the H2H3 domain of the transmissible spongiform encephalopathy causing protein PrP in its amyloid conformation. The main objective was to improve sample quality for solid state NMR measurements by oligomerization pathway selection. Within the scope of this project we could show that the H2H3 domain is sufficient for structural information transference during fibrillation

La protéine prion PrPC est une sialoglycoprotéine ancrée à la membrane plasmique par une ancre GPI, qui peut être soumise à des changements de conformation générant la forme pathologique PrPSc, responsable des maladies à prion. Celles-ci se caractérisent par des encéphalopathies neurodégénératrices transmissibles, invariablement fatales, affectant l'homme et d'autres mammifères. Peu d'éléments concernant la fonction normale de PrPC sont actuellement connus. Nous avons étudié l'expression et les fonctions de la protéine prion normale PrPC dans les cellules endothéliales cérébrales de la barrière hémato-encéphalique, une barrière étanche protégeant le système nerveux centrale de l'extérieur et une voie possible d'entrée du prion. Nous avons montré que PrPC est exprimée dans les cellules endothéliales cérébrales de la BHE avec une localisation jonctionnelle au niveau de microdomaines de type cavéoles. Elle y est maintenue par des interactions homophiles entre molécules de cellules adjacentes. Nous avons aussi montré que, si PrPC n'est pas impliquée dans l'adhérence des cellules immunitaires à Pendothélium, elle a un rôle important dans la migration transendothéliale des monocytes. De plus, elle pourrait interagir avec la protéine des jonctions endothéliales PECAM-1 par l'intermédiaire de proteoglycans à héparane sulfate. La PrPC a aussi un rôle dans le contrôle de la concentration de cuivre au niveau de la membrane plasmique, et peut empêcher l'effet potentiateur du cuivre sur la mort cellulaire induite par l'homocysteine. La PrPC est donc une protéine jonctionnelle des cellules endothéliales cérébrales impliquée dans Ia migration transendothéliale et l'intégrité de la BHE
The prion protein PrPC is a GPI-anchored sialoglycoprotein, its conformational shift into the pathological form PrPSc being responsible for the prion diseases, transmissible fatal neurodegenerative encephalopathies that affect man (Creutzfeldt-Jakob disease, Fatal Familial Insomnia) and animals (scrapie, bovine spongiform encephalopathy). A number of progresses have been made regarding the implication of PrPSc in transmission and development of prion diseases. Nonetheless, the normal function of PrPC is still ill-defïned. We decided to study the expression and functions of PrPC in brain endothelial cells of the blood-brain barrier (BBB), a physiological barrier that protects the central nervous System and that constitutes a possible entry site for infectious prion. We have shown that PrPC is expressed at the intercellular junctions of brain endothelial cells of the BBB, at raft-like membrane microdomains. As for numerous adhesion molecules, its junctional localization is maintained by homophilic interactions between molecules in adjacent cells. We have also shown that PrPC, if not implicated in immune cell adhesion to the endothelium, is important for the transendothelial migration of monocytes. In addition, it should interact with the junctional proteins PECAM-1 through heparan sulfate proteoglycans. PrPC is also implicated in copper buffering at the cell membrane, and could completely abolish the copper- induced potentialization of cell death induced by homocystein. Taken together, these results show that PrPC is a junctional protein involved in transendotheliale migration and BBB integrity

Les prions sont des agents infectieux non conventionnels responsables des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). Les prions sont des protéines infectieuses capables d'exister sous deux conformations : une conformation normale et une conformation prion, capable de recruter l'isoforme normale et de la convertir sous forme prion. HET-s est la protéine prion du champignon filamenteux Podospora anserina. L'obtention de la structure 3 D de la forme prion de HET-s en fait un système idéal d'étude des caractéristiques de cette structure en regard de l'infectivité de la protéine. Au cours de ce travail nous avons optimisé puis utilisé des tests d'infectivité afin de faire le lien entre une structure caractérisable in vitro et son infectivité observable in vivo. En modifiant leurs conditions de formation, noous avons produit différents variants structuraux des fibres de HET-s. Parmi eux, nous avons montré que les plus infectieux des amyloides ne sont pas les plus canoniques. Nous avons ensuite caractérisé la structure adaptée in vivo par HET-s au sein de corps d'inclusion bactériens. Au vu de nos résultats nous avons émis l'hypothèse que corps d'inclusion et fibres amyloides présenteraient des structures et des mécanismes de formation apparentés. Enfin, nous avons montré la conservation des mécanismes prions et le passage de la barrière d'espèce par un orthologue d'HET-s : la protéine FgHET-s de Fusarium graminearum. Ces travaux nous conduisent à penser que quelle que soit la séquence primaire des prions en présence, leur interaction n'est possible que si ces séquences offrent un éventail de structures porteuses de déterminants structuraux au moins partiellement communs
Prions are non conventional infectious agents responsible for transmissible spongiform encephalopathies (TSE). Prions can adopt two conformations : a normal one and a prion one, which is able to recruit the normal conformation and to convert it into the prion one. HET-s is the prion protein of the filamentous fungus Podospora anserina. 3 D structure of the prion form of HET-s makes it an ideal system for studying the relationship between the caracteristics of this structure and the protein infectivity. We optimized and used infectivity tests to study in vivo the infectivity of one structure obtained in vitro. By modifying their agregation conditions, we produced some structural variants of HET-s fibers. We showed that, among them, the most infectious amyloids are not the most typical. Then we caracterized the HET-s structure adopted in vivo in bacterial inclusion bodies. In view of our results we make the hypothesis that inclusion bodies and amyloid fibers present related structure and formation mechanisms. Finally, we showed the conservation of the prion mecanisms and the species barrier crossing of an ortholog of HET-s : the FgHET-s protein of Fusarium graminearum. Our results lead us to think that whatever are the primary sequences of the prions in presence, their interaction is only possible if the sequences allow the protein to adopt structures with at least partially common structural determinants

La conversion de la protéine prion cellulaire (PrPC) en protéine prion scrapie (PrPSc) est à l’origine des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST). La toxicité de la PrPSc est restreinte aux neurones et implique la déviation de la (des) fonction(s) de la PrPC. Une action neurospécifique de la PrPC est le recrutement de la src kinase Fyn. Dans ce travail, nous montrons que la PrPC est capable de mobiliser une autre src kinase, Lyn, via la cavéoline (cav) dans les neurones. Une cible du couplage PrPC-cav-Lyn, restreint aux corps cellulaires, est la kinase GSK3ß. L’inactivation de GSK3ß par la PrPC intervient dans la régulation des fonctions neuronales, en limitant l’activité du récepteur sérotoninergique 1B. D’autre part, nous montrons que dans les cellules infectées par les prions, l’accumulation de PrPSc induit le recrutement constitutif de la plateforme PrPC-cav-Fyn, à l’origine d’un stress oxydant. Ce gain de fonction entraine notamment un défaut de clivage par la metalloprotéase MMP-9, dont une des conséquences est l’accumulation du peptide Aß. Un autre impact de l’infection est la suractivation de la kinase PDK1, qui génère une perte de fonction de la metalloprotéase TACE. Dans des neurones « Alzheimer », on observe également cette cascade délétère, qui dépend de la PrPC. L’inhibition de PDK1 dans des modèles d’infection par les prions ou de maladie d’Alzheimer permet de rétablir l’activité d’alpha-clivage de TACE vis-à-vis de ses substrats, la PrPC, APP et le récepteur au TNF-alpha. L’effet bénéfique observé in vivo permet de définir PDK1 comme une cible thérapeutique potentielle pour les EST et la maladie d’Alzheimer. En résumé, ce travail illustre comment une meilleure connaissance de la fonction de signalisation de la PrPC peut permettre de progresser dans la compréhension des mécanismes de neurodégénérescence associés non seulement aux maladies à prions, mais également à la maladie d’Alzheimer
Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are characterized by the conversion of the cellular prion protein (PrPC) into its scrapie isoform (PrPSc). PrPSc-mediated toxicity is restricted to neurons and results from the subversion of PrPC function(s). Some neuronal specificity of PrPC signaling relates to its coupling to the Fyn src kinase. In this work, we report that PrPC has the capacity to mobilize another src kinase, Lyn, via caveolin in neurons. A downstream effector of the PrPC-cav-Lyn signaling complex, which is spatially restricted to cell bodies, is the GSK3ß kinase. The inactivation of GSK3ß by PrPC takes part to the control of neuronal functions by negatively regulating the activity of the serotonin 1B receptor. Furthermore, we show that in prion-infected cells, PrPSc constitutively activates the PrPC-cav-Fyn platform, leading to oxidative-stress conditions. This toxic gain of PrPC function induces a defect in metalloproteinase MMP-9 activity, leading to increased Aß levels. Another impact of prion infection is the overactivation of the PDK1 kinase, which results in the loss of function of the TACE metalloproteinase. PDK1 overactivation is also observed in neurons from Alzheimer’s disease model mice, and is shown to be PrPC dependent. PDK1 inhibition in models of prion infection or Alzheimer’s disease restores TACE-mediated alpha-cleavage of PrPC, APP and TNF-alphareceptor. Since positive effects of PDK1 inhibition are observed in vivo, our data posit PDK1 as a putative therapeutic target to combat TSE disorders and Alzheimer’s disease. In summary, achieving a better knowledge of PrPC signaling function may help to improve our understanding of the mechanisms sustaining neurodegeneration in prion and Alzheimer’s diseases

Nous avons utilisé le système colibacille pour produire des protéines de fusion avec un polypeptide de six histidines, dans le cas du virus de l'immunodéficience bovine et des maladies à prion. L'impact de l'infection par le VIB (Virus de l'Immunodéficience Bovine) sur le statut sanitaire des troupeaux est peu connu en France. Une protéine recombinante correspondant à la protéine p26 de la capside du (VIB) a été produite pour développer un test de dépistage sérologique des animaux infectés par ce virus. Le fragment du gène gag codant pour la protéine p26 a été cloné dans le vecteur d'expression pMH79, en aval d'une séquence codant pour six histidines, et a permis d'obtenir la protéine de fusion (His)6p26, purifiée par chromatographie sur résine par affinité avec des ions métalliques bivalents. Nos travaux montrent que la protéine (His)6-p26 recombinante est reconnue spécifiquement par des sérums issus de lapins et de bovins infectés expérimentalement avec la souche originelle R29 du VIB, en western blot ainsi qu'en l'ELISA. Dans le cas des sérums de bovins, les anticorps dirigés contre la protéine recombinante apparaissent dès la troisième semaine après l'inoculation, et se maintiennent à un taux détectable au moins un an après l'infection. Les Encéphalopathies Spongiformes Subaigue͏̈s Transmissibles (ESST), ou maladies à prion, sont des maladies neuro-dégénératives, touchant aussi bien l'homme que l'animal. L'agent infectieux responsable de ces maladies serait composé de la protéine PrPsc elle-même, qui s'accumule dans le cerveau de l'hôte. Cette protéine correspond à une forme anormale, résultant d'une modification post-traductionnelle d'une protéine PrPc (PrP cellulaire) codée par l'hôte. Nous nous sommes proposés de produire en colibacille les protéines prion ovine et murine, de les caractériser au niveau immunologique, et d'essayer d'obtenir une réponse anticorps chez des souris PrP0/0, dépourvues du gène prion. Nous avons mis en évidence des différences de réactivité des sérums polyclonaux produit chez la souris PrP0/0, vis-à-vis de la PrPres (PrP résistante à la protéinase K) de différentes espèces (bovine, ovine et murine). Ces deux sérums reconnaissent les trois glycoformes de PrPres, selon un profil différent de celui obtenu avec un sérum dirigé contre la séquence peptidique bovine 106-121.

S’il est bien une discipline qui, par essence, se positionne au carrefour des savoirs, c’est l’archéologie. L’apport de la chimie dans ce domaine, notamment, est indispensable, tant du point de vue de l’apport intellectuel que des méthodes et des outils. De façon surprenante, cependant, le principe de réciprocité ne s’applique pas toujours ici de façon naturelle. Pourtant, il est indéniable que les connaissances acquises en archéologie pourraient parfaitement être pertinentes dans d’autres contextes qu’a priori tout sépare. Ainsi, quel lien peut-il exister entre les processus de diagénèse à la surface d’objets en ivoire anciennement décorés et l’ingénierie tissulaire des tissus osseux ? C’est sur cette question que nous avons choisi de focaliser ce chapitre. Tout d’abord en situant la problématique archéologique : l’observation de taches pourpres sur des objets en ivoire ayant été enfouies pendant plusieurs millénaires, l’identification de la nature de ces taches qui s’avèrent être formées de nanoparticules d’or (NpAu) et, enfin, la compréhension des mécanismes conduisant à la dégradation des polychromies et dorures anciennes en NpAu. L’analyse développée ici s’appuie sur l’idée que la matrice collagénique formant l’ivoire ou la colle protéique jouent un rôle essentiel dans la formation des NpAu. Dès lors, est-il possible de renverser l’approche ? Peut-on, dans des conditions chimiques inspirées de celles observées sur des temps archéologiques, proposer des nouvelles voies de synthèses de NpAu biocompatibles par greffage de collagène en surface ? C’est le propos développé dans une deuxième partie. Sans suspens, la réponse est affirmative et nous illustrons le potentiel d’application dans le domaine biomédical par une étude récente de régénération tissulaire osseuse utilisant de telles NpAu. Peut-être assiste-t-on aujourd’hui à la naissance d’une nouvelle discipline : l’archéomimétisme ?