Dissertations / Theses: 'Protéine de transport membranaire'

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Boulaflous, Aurélia. "Transport et rétention d’une protéine membranaire de type II dans le réticulum endoplasmique d’une cellule végétale." Rouen, 2007. http://www.theses.fr/2007ROUES019.

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Abstract:

Dans les cellules eucaryotes, les protéines secrétées subissent de nombreuses modifications co- et post-traductionnelles tout au long du système endomembranaire de sécrétion (SES). Ces modifications, dont la N-glycosylation, permettent aux protéines d’acquérir une conformation biologiquement active. La maturation des glycannes N-liés est initiée par l’-glucosidase I. Au cours de cette thèse, après avoir identifié et caractérisé biochimiquement l’-glucosidase I d’Arabidopsis thaliana (AtGCSI), nous avons étudié sa localisation dans la cellule végétale. AtGCSI est une glycoprotéine membranaire de type II clivant spécifiquement le glucose terminal lié en -1,2 du glycanne précurseur GlcNAc2-Man9-Glc3 et est exclusivement localisée dans le réticulum endoplasmique (RE). En parallèle, l’étude de la localisation d’autres enzymes impliquées dans la maturation des N-glycannes a permis de conclure que toutes ces protéines membranaires de type II sont réparties dans le SES selon leur ordre d’intervention. D’autre part, des études plus approfondies sur les signaux impliqués dans la localisation dans le RE d’AtGCSI a permit de mettre en évidence deux signaux : les motifs di-arginines, localisés dans le domaine cytosolique, et les 60 acides aminés dans le domaine luminal. . Ces signaux sont nécessaires et suffisants pour la rétention de protéines chimères membranaires dans le RE. Au cours de ce travail, des microdomaines à l’interface RE-Golgi ont également été mis en évidence. Aux vus de ces résultats, un modèle pour la rétention de l’-glucosidase I dans le RE de la cellule végétale a été proposer
In all eukaryotic cells, the secreted proteins undergo many co- and post-translational modifications along the secretory pathway. These modifications, among whom Nglycosylation, are required for biological activity of proteins. The maturation of the N-glycans is initiated by the Arabidopsis thaliana -glucosidase I (AtGCSI). During this thesis, after AtGCSI identification and biochemical characterisation, we studied its localisation in plantcell. AtGCSI is a type II membrane glycoprotein that cleaves the distal 1,2-glucose of the asparagines linked GlcNAc2-Man9-Glc3 precursor and it is exclusively located to the endoplasmic reticulum (ER). In parallel, localization studies of other N-glycan processing enzymes showed that all type II membrane proteins are located in the secretory pathway according to the order of their expected function. Then, in this study we demonstrated moreprecisely that two signals confer an ER localization of AtGCSI: the di-Arg signals, located to the cytosolic tail and the 60 amino acids of luminal domain. These signals are necessary and sufficient to retain truncated membrane proteins in the ER. At the same time, microdomains distinct but close to the ER and the Golgi are observed. Regarding these results, a theoretical model to explain ER residency of AtGCSI in plant cell was proposed

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Paik, Su-Jin. "Couplages entre un transporteur membranaire de type ABC, BmrA et son environnement membranaire." Electronic Thesis or Diss., Paris Sciences et Lettres (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018PSLET010.

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Abstract:

Les ABC (ATP binding cassettes) transporteurs constituent une grande famille de protéine transmembranaire présentent dans tous les organismes. Les ABC hydrolysent l'ATP pour transporter une quantité immense de substrats amphiphiles, comme les lipides, steroids, peptides... Certains ABCs confèrent un phénotype cellulaire de multiresistance aux drogues des bactéries contre les antibiotiques à l’homme contre les agents anticancéreux, antiviraux ...Une question fondamentale pour comprendre le transport de drogues est comment les propriétés de membranes modulent la fonction et l’organisation spatio temporelle des ABCs transporteurs. Nous avons étudié en détails ces couplage avec BmrA, un ABC bactérien de B. subtillis en utilisant différents systèmes membranaires in vitro et différentes approches de biochimie et de biophysique membranaire. Dans un premier temps, après expression et purification des protéines en détergent, nous avons caractérisé l’hydrolyse d’ATP en fonction de l’état de l’environnement membranaire, solubilisé en micelle de détergent et en micelles mixtes. Les proteoliposomes ont été caractérisés en fonction de l’orientation des protéines, leur taux d’incorporation, leur taille et la lamellarité. Cela nous a permis de moduler de façon contrôlée la composition lipidique, la densité et la conformation des protéines et la courbure membranaire pour déterminer de façon quantitative les contributions respectives de ces paramètres de membranes. Ainsi, nous montrons que l’hydrolyse d’ATP est sensible à la spécificité lipidique quand la protéine est dans une bicouche et que les lipides négatifs et les lipides de type phosphatidylethanolamine stimulent de façon synergique l’activité hydrolytique. L’hydrolyse d’ATP diminue pour les fortes courbure positives. Dans un second temps, nous avons déterminé les conditions de reconstitution de BmrA dans des vésicules géantes qui ont ensuite permis d’étudier les rôles respectifs de la courbure et de la tensions membranaire dans l’organisation spatiale de BmrA par des approches de nanotube pulling. Les expériences en collaboration montrent que BmrA a une préférence marquée pour les régions membranaires à forte courbure conduisant à la formation de cluster de protéines et que cette préférence varie en fonction de l’état catalytique de la protéine. Finalement, nous avons mis au point une méthode pour étudier la dynamique des NBDs par transfert d'énergie de résonance de Förster au niveau de la molécule unique dans un système reconstitué par spectroscopie de fluorescence et de corrélation croisée.L’ensemble des données suggère que organisations spatiales des ABC transporteurs dans les cellules bactériennes et eucaryotes sont différentes avec la possibilité de tris dans des zones de fortes courbures lors de remodelages membranaires mais sans modification importante de la fonction
ABCs (ATP binding cassettes) transporters constitute a large family of transmembrane proteins present in all organisms. ABC transporters hydrolyze ATP to translocate an immense quantity of amphiphilic substrates, such as lipids, steroids, peptides... Some ABCs confer a multiresistance cellular phenotype to drugs from bacteria against antibiotics to humans against anticancer agents, antivirals...A fundamental question for understanding drug transport at the molecular level is how the properties of membranes modulate the function and spatial temporal organization of ABCs. We studied in detail these coupling with BmrA, a bacterial ABC of B. subtillis using different in vitro membrane systems and different biochemical and membrane biophysical approaches. Firstly, after expression and purification of proteins in detergent, we characterized the hydrolysis of ATP of BmrA according to its membrane environment, solubilized in detergent micelles and in mixed lipid/detergent micelles. Proteoliposomes were characterized according to protein orientation, incorporation rate, size and lamellarity. This allowed us to modulate in a controlled manner lipid composition, protein density and conformation and membrane curvature to quantitatively determine the respective contributions of these membrane parameters. Thus, we show that ATP hydrolysis is sensitive to lipid specificity when the protein is embedded in a bilayer. This lipid specificity is provided by negative lipids and phosphatidylethanolamine type lipids that synergistically stimulate hydrolytic activity. However, ATP hydrolysis was decreased in high positive membrane curvature. Secondly, we determined the conditions of reconstitution of BmrA in Giant Unilamellar Vesicles, which then allowed our collaborator to study the respective roles of membrane curvature and tension in the spatial organization of BmrA. Nanotube pulling experiments performed in collaboration show that BmrA has a strong preference for highly curved membrane regions leading to protein cluster formation and that this preference varies according to the catalytic state of the protein. Finally, we developed a method to study the dynamics of NBDs by Förster resonance energy transfer at the single molecule level in reconstituted system via fluorescence cross-correlation spectroscopy.The data set suggest that spatial organizations of ABC transporters in bacterial and eukaryotic cells are different with the possibility of sorting during membrane remodeling of eukaryotic membranes in areas of strong membrane curvatures but without significant change in function

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Marchetti, Gino. "Modélisation moléculaire du phénomène du transport du calcium dans la protéine ATPase-Ca2+ (SERCA1a) : une première étude." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066382.

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Abstract:

Cette thèse propose l’étude par Dynamique Moléculaire (DM) de la structure de l’ATPase-Ca2+ (SERCA1a) pendant le processus de transport des ions à travers la membrane. On a considéré trois structures, représentant trois étapes conformationnelles successives du processus de pompage. Les simulations sur les structures ont été faites en utilisant deux types de recouvrement de la région transmembranaire: en monocouche de surfactant (LDAO) et en bicouche lipidique (POPC). L’étude structurale s’est intéressée à la mobilité relative des domaines cytoplasmiques ainsi qu’à celle des hélices transmembranaires. Une étude sur l’hydratation des différentes régions transmembranaires a révélé la formation de canaux de solvant à l’intérieur de la protéine. Le surfactant LDAO a été séparément étudié par DM dans sa forme micellaire. L’étude de l’hydratation de la micelle a été présentée dans un article publié dans J. Phys. Chem. B 110: 11504 (2006) comparant la micelle de LDAO avec une micelle de C12E6.

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Woźnicka-Misăilă, Aleksandra. "An investigation and characterization of different ADP/ATP Carrier homologs." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016GREAV011/document.

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Abstract:

L'objectif principal de ce projet de thèse était d'obtenir de nouvelles données structurales sur les transporteurs ADP/ATP mitochondriaux et de développer des outils pour les approches de micro- et nano-cristallographie appliquées à la biologie structurale des protéines membranaires.Le rôle principal du transporteur ADP/ATP (AAC) est d'importer et d'exporter respectivement de l’ADP3- et l’ATP4- à travers la membrane mitochondriale interne, entre l'espace intermembranaire et la matrice. AAC est le transporteur mitochondrial le mieux caractérisé de toute cette famille de protéines. De nombreuses études ont été menées pour caractériser sa fonction et sa structure. Toutefois, les données structurales n’étant disponibles que pour une conformation de la protéine, de nombreuses questions fondamentales notamment sur les différents états conformationnels adoptés par la protéine au cours du processus de transport restent encore posées. Dans cette thèse, nous avons étudié les 4 isoformes humaines d’AAC. Elles sont impliquées dans diverses maladies génétiques, mais jouent également un rôle dans la cancérogenèse. Cette thèse décrit ainsi en détail la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces protéines et leur comparaison. C’est est une étape essentielle pour définir leurs propriétés, et constitue un point de départ précieux dans le développement de nouvelles thérapies.Le domaine de la biologie structurale ne cesse de connaître de nouveaux développements, comme c’est le cas par exemple avec l’avènement de la cristallographie sérielle. Il y a donc un besoin constant de nouvelles approches notamment pour la préparation des échantillons, leur montage sur les lignes de lumière et les collectes de données afin de continuer à améliorer la qualité des données collectées au synchrotron. Ainsi, notre objectif était d'utiliser différents échantillons de protéines membranaires pour développer de nouvelles techniques de cristallisation et de montage d’échantillons sur les lignes de lumière afin de préserver au mieux la qualité des échantillons tout en permettant des collectes de données plus rapides, plus efficaces et plus simples
The main objective of this PhD project was to gain new structural data on the mitochondrial ADP/ATP carriers and develop tools for micro- and nano-crystallography approaches applied to membrane protein structural biology.The main role of the ADP/ATP carrier (AAC) is to import and export ADP3- and ATP4- respectively between the intermembrane space and the matrix through the inner mitochondrial membrane. AAC is the best characterized among all mitochondrial carriers. Much has been done to investigate its function and structure. However, since structural data are only available for one conformation of the protein some fundamental questions about the different conformational states adopted during the transport process still need to be answered.In this thesis we considered 4 human AAC homologs as a main target. They are involved in different genetic diseases but play also a role in cancerogenesis. This thesis describes and compares in detail the functional and structural characterization of the human AAC isoforms. It was an essential step to give insight into their native properties and is a precious starting point for the drug development field.Since the structural biology field is rapidly developing especially in serial crystallography techniques, there are more and more new applications for samples preparation, mounting and measurements in order to improve the quality of the data collected at the synchrotrons. Hence, our second objective was to use different membrane protein samples to develop new crystal-friendly crystallization set up combined with different sample environment on the beamline toward faster, more efficient and simpler data collection

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Samson, Michel. "Le transport membranaire des hormones thyroïdiennes : caractérisation, identification et purification partielle des protéines de transport de l'érythracyte." Paris 11, 1993. http://www.theses.fr/1993PA11T035.

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Panwar, Pankaj. "Relations structure-fonction des transporteurs nucléotides." Phd thesis, Université de Grenoble, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00684264.

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Abstract:

Le transporteur NTT1 est responsable pour l'import d'ATP dans les chloroplastes afin de maintenir le métabolisme en période d'activité réduite ou nulle de la photosynthèse. Cependant, le mécanisme moléculaire de ce transporteur est encore méconnu, essentiellement du à la difficulté de manipulation des protéines membranaires. Nous avons réussi à développer un protocole pour la production de ce transporteur, permettant une bon rendement de solubilisation et obtention de protéines purifiées pour des études structurales. Combinant des caractérisations biochimiques et biophysiques, nous avons pu identifier des conditions de préparation d'échantillons qui ont mené aux premiers cristaux. Afin d'étendre notre connaissance sur les transporteurs de nucléotides, nous avons également entrepris des études structurales et fonctionnelles sur AAC, le transporteur ADP/ATP des mitochondries. AAC et NTT1 appartiennent à des familles de protéines différentes mais ont des fonctions voisines. À partir de la première structure d'AAC déjà connue, nous avons recherché par des criblages in silico de nouvelles molécules se liant au transporteur de façon compétitive avec le nucléotide et pouvant ainsi inhiber le transport. Les outils de docking ont été mis en place et ont permis à partir d'une librairie de 75000 composés d'identifier 17 molécules. Ensuite, nous avons testés ces molécules expérimentalement et montré qu'une d'entre elles inhibent le transport. De plus, trois nouveaux analogues d'ADP ont également été identifiés comme inhibiteurs.

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Bodon, Gilles. "Impact de la protéine CHMP2B et de ses variants pathogènes sur le modelage des membranes biologiques." Phd thesis, Grenoble, 2010. http://www.theses.fr/2010GRENV062.

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Abstract:

Ce travail de thèse s'est concentré sur l'étude de la protéine CHMP2B. Cette protéine fait partie du complexe ESCRT-III, impliqué dans divers processus de fissions membranaires à topologies inversées (genèse ces corps multivésiculés, cytokinèse, bourgeonnement des virus enveloppés, autophagie). Des mutations dans le gène codant pour CHMP2B ont été très fortement corrélées à la survenue de maladies neuro-dégénératives (démences fronto-temporales et amyotrophie latérale spineuse). Ce travail a consisté à préciser les mécanismes moléculaires d'action de cette protéine afin de mieux cerner les causes potentielles des ces dysfonctionnements. Il se divise en trois sous parties: - L'étude du l'import potentiel de CHMP2B dans les mitochondries, et de son rôle dans la dynamique mitochondriale. - Le rôle de CHMP2B et l'impact de mutants pathogènes dans la morphogénèse des épines dendritiques. - L'étude de la formation de d'hyper-complexes tubulaires de CHMP2B déformants la membrane plasmique. Nous avons ainsi pu montrer les propriétés suivantes: L'extinction de CHMP2B semble inhiber la fission des mitochondries par un mécanisme qui reste à préciser. L'expression des mutants de CHMP2 liés aux démences fronto-temporales perturbe la morphogénèse des épines dendritiques. Cette altération pourrait participer à l'émergence progressive des symptômes de la FTD. La littérature suggère que les fonctions que CHMP2B concernent des organelles cytoplasmiques (endosomes tardifs, autophagosomes,centrosome). Nous avons montrés que cette protéine est principalement recrutée à la membrane plasmique, où elle se polymérise en une structure tubulaire rigide capable de déformer cette bicouche lipidique
This work focused on CHMP2B, an ESCRT-III complex subunit. This protein complex is involved in several membrane fission processes with an inversed topology (virus budding, multivesicular body genesis, cytokisesis, autophagy). Mutations in the gene coding for CHMP2B have been linked to neurodegenerative diseases such as fronto temporal demencia (FTD) and Spinal Lateral Amyotrophy (SLA). This work consisted in understanding molecular mechanisms of CHMP2B's action in order to better understand it' s links with these pathologies. The project was organized around three research axis: - The potential involvement of CHMP2B in the mitochondrial dynamics. - The role of CHMP2B and the impact of the FTD linked mutations on the morphology and the physiology of dendritic spines. - The study of helical CHMP2B containing complexes that deform the plasma membrane into tubular structures. Our experiments led us to the following observations: Extinction of CHMP2B inhibits mitochondrial fission by an unknown mechanism. The FTD linked CHMP2B mutants disrupt the normal pattern of spine development. This alteration could participate to the progressive appearance of FTD. CHMP2B is thought to be involved in the remodeling of cytoplasmic organelles such as late endosomes, autophagosomes, centrosome. . . Our work demonstrate that the protein is manly recruited at the plasma membrane where it assembles in rigid tubular structure that can deform the lipid bilayer

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Azouaoui, Hassina. "Étude structurale et fonctionnelle d’un transporteur de lipides « une flippase » de la levure S. cerevisiae : l’ATPase P4 Drs2p et sa sous unité-associée Cdc50p." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS224/document.

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Abstract:

Les ATPases-P4 sont des transporteurs membranaires couplant l'hydrolyse de l'ATP au transport de lipides dans les membranes cellulaires eucaryotes. Avec leurs partenaires, les protéines CDC50, les ATPases-P4 transportent les phospholipides, en particulier la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidyléthanolamine (PE), du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes, assurant ainsi le maintien de l'asymétrie membranaire.Drs2p est l'une des cinq ATPases-P4 de la levure Saccharomyces cerevisiae. Elle est localisée dans les membranes du trans-Golgi (TGN), et elle a comme partenaire la protéine Cdc50p, qui est nécessaire à l'adressage correct et probablement au transport catalysé par Drs2p. Drs2p est principalement responsable du transport de la phosphatidylsérine (PS) dans les membranes du TGN et son activité est essentielle pour le maintien de la PS dans le feuillet cytosolique de ces membranes. En raison du rôle crucial de la PS dans de nombreuses voies de signalisation, aussi bien à l’extérieur (au cours de l’apoptose par exemple) qu’à l’intérieur de la cellule (par le recrutement de protéines impliquées dans des processus cellulaires essentiels), il est important de comprendre le mécanisme par lequel l’asymétrie de la PS est établie.Afin de progresser dans la compréhension du mécanisme moléculaire du transport de lipides, nous avons mis au point une procédure qui nous a permis de co-exprimer Drs2p et Cdc50p dans Saccharomyces cerevisiae. La purification de Drs2p par chromatographie d'affinité sur résine streptavidine a permis d'obtenir une fraction purifiée contenant très majoritairement Drs2p et Cdc50p, à raison de 1-2 mg/L de culture. Les deux protéines sont sous forme de complexe avec une stœchiométrie d'association de 1:1. Le complexe purifié est fonctionnel, et présente une activité d’hydrolyse de l’ATP stimulée par son substrat, la PS. Cette stimulation n’est cependant possible qu’en présence de PI4P, un phosphoinositide impliqué dans la régulation du trafic membranaire.De par leur rôle crucial dans le maintien de l'asymétrie membranaire, les ATPases-P4 ne peuvent qu'être régulées. Comme de nombreuses ATPases de type P sont soumises à une auto-régulation de leur activité, nous avons examiné la possibilité d’une telle auto-régulation dans le cas des ATPases P4. Pour ce faire, une approche par mutagenèse dirigée et protéolyse ménagée associée à l’identification par spectrométrie de masse des peptides ont été effectuées. La protéolyse ménagée du complexe purifié Drs2p/Cdc50p montre une activité ATPasique dépendante au PI4P de 30-50 fois plus importante. La protéolyse par la thrombine engendre un Drs2p dépourvu d'une partie N-terminale (R104) et d'une partie C-terminale (R1290) qui reste toujours associé à Cdc50p. Ce résultat montre qu'une coupure appropriée au niveau des extrémités terminales de Drs2p peut augmenter de façon significative, en présence du PI4P, l'activité ATPasique du complexe, nous amenant ainsi à identifier un rôle auto-inhibiteur des extrémités N- et/ou C-terminales de Drs2p.Ce travail ouvre des perspectives quant à la caractérisation structurale et fonctionnelle du mécanisme de transport de lipides par le complexe. Par ailleurs, il laisse entrevoir la possibilité d’étudier les bases moléculaires des pathologies associées aux mutations de certaines ATPases P4 humaines
Maintenance of phospholipid asymmetry in eukaryotic cell membranes is essential for cellular integrity and function. P4-ATPases, from the P-type ATPases family, are energy-dependent transporters, together with their CDC50 accessory subunits couple ATP hydrolysis to lipid transport from the exoplasmic to cytoplasmic leaflet to maintain membrane asymmetry.Drs2p is one of these P4-ATPases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Drs2p is localised in trans-Golgi (TGN) membranes in association with its binding partner Cdc50p, which contributes to the correct addressing of Drs2p and probably in the catalyzed transport by Drs2p. Drs2p transport principally phosphatidylserine (PS) in TGN membranes. The PS is important for a several signalling pathways, for example, in apoptosis and recruitment of the proteins implied in various essential cellular process, so, it's very important to understand the mechanism that establishes this asymmetry.To gain in comprehension of molecular mechanism of lipid transport, robust protocols for expression and purification are required. In this work, we present a procedure for high-yield co-expression of Drs2p and Cdc50p. The purification of Drs2p and Cdc50p is achieved in a single step by affinity chromatography on streptavidin beads, yielding, 1-2 mg purified Drs2p/Cdc50p per liter of culture. This procedure allows purification of the complex Drs2p/Cdc50p with stoichiometry to 1:1. Our complex is functional, overal ATP hydrolysis by the complex is dependent of PS, favourite substrate of Drs2p. This hydrolyze is critically dependent on the presence of PI4P, a phosphoinositide involved in regulation of membrane trafficking.Like many P-type ATPases auto-regulate their activity, we examined the possibility that P4-ATPases are auto-regulated. In this work, we use directed mutagenesis and limited proteolysis associated with mass spectrometry for identify peptides. We show that limited proteolysis of a purified complex Drs2p/Cdc50p resulted in up to a 30-50 fold increase of it ATPase activity, which however remained dependent on PI4P. Using thrombin as the protease, Cdc50p remained intact and in complex with Drs2p, which was cleaved at two positions, namely after R104 and after R1290. Our results therefore reveal that trimming off appropriate regions of the terminal extensions of Drs2p can increase its ATPase activity in the presence of PI4P by an enormous factor, thereby identifying a role of N and/or C-terminal extensions in auto-inhibition of Drs2p.Our results open perspectives on the structural and the functional characterization of the lipid transport mechanism by the complex Drs2p/Cdc50p. Furthermore, our procedures open up the possibility of studying the molecular bases of the pathologies associated with the mutations of human P4-ATPases

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Richer-Potier, Carole. "Identification de signaux impliqués dans la rétention d'une protéine membranaire de type I : la calnexine, dans le réticulum endoplasmique (RE) de la cellule végétale." Rouen, 2000. http://www.theses.fr/2000ROUES054.

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Abstract:

Dans les systèmes d'expression eucaryotes, les protéines destinées à être sécrétées sont introduites dans le système endomembranaire de sécrétion via le réticulum endoplasmique (RE). Ces protéines sont ensuite transportées par des vésicules jusqu'à leur compartiment de stockage : vacuole et compartiment extracellulaire en passant par l'appareil de Golgi. Dès leur insertion dans la lumière du RE, ces protéines vont subir des maturations post-traductionnelles qui leur confèreront stabilité et activité biologique. Les protéines responsables de ces maturations doivent posséder des signaux peptidiques spécifiques de rétention pour échapper au flux de sécrétion. Les mécanismes de localisation des protéines solubles et membranaires dans le RE ont été très étudiés dans les cellules animales et de levure mais peu d'informations sont disponibles chez les plantes. Au cours de cette étude, la calnexine d'A. Thaliana a été choisie comme protéine modèle pour identifier les signaux impliqués dans la rétention d'une protéine membranaire de type I dans le RE de cellules végétales. Des protéines chimères contenant les domaines transmembranaire et/ou cytosolique de la calnexine d'A. Thaliana fusionnés à une protéine marqueur extracellulaire, la prosporamine, ont été réalisées. Ces protéines chimères ont été exprimées dans des cellules de tabac BY2 via Agrobacterium tumefaciens et leur localisation a été étudiée. Nous avons mis en évidence que le segment transmembranaire de la calnexine d'A. Thaliana permet la rétention d'une protéine marqueur dans le RE de cellules de tabac. Toutefois, nous avons observé que, quand ce segment transmembranaire est remplacé par celui d'une protéine vacuolaire, l'extrémité cytosolique de la calnexine est également impliquée dans la rétention de la protéine marqueur dans le RE.

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Morello, Vincent. "Hélices amphipathiques et transport vésiculaire." Phd thesis, Université de Nice Sophia-Antipolis, 2009. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00496960.

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Abstract:

Les membranes cellulaires sont constamment remodelées par le bourgeonnement et la fusion de vésicules assurant le transport entre les différentes organelles. De nombreuses protéines périmembranaires orchestrent ce trafic vésiculaire. Les hélices amphipathiques jouent un rôle important dans le mécanisme d'interaction de certaines de ces protéines avec les membranes. A la différence de domaines protéiques reconnaissant spécifiquement un lipide, les hélices amphipathiques reconnaissent plus globalement la physicochimie d'une membrane (forme, charge...). GMAP-210 est une très longue protéine golgienne qui agit comme corde moléculaire grâce à sa structure en coiled-coil. Le laboratoire avait montré que l'extrémité N-terminale de GMAP-210 possède un motif ALPS, une hélice amphipathique singulière sensible à la courbure membranaire. Les motifs ALPS sont caractérisés par l'absence de résidus basiques, l‘interaction avec les membranes ne repose donc que sur l'hydrophobicité. Pour compenser ce déficit, la liaison des motifs ALPS n'a lieu qu'au contact de membranes fortement courbées. Dans le cas de GMAP-210, le motif ALPS permettrait de capturer des vésicules de transport. J'ai démontré que l'autre extrémité de la corde interagit avec Arf1GTP sur des membranes. Cette interaction est conditionnée par le contact avec la surface membranaire d'une petite hélice amphipathique située en aval du domaine d'interaction avec Arf1. De façon remarquable, l'interaction entre Arf1GTP et le domaine C-terminal de GMAP-210 est régulée indirectement par la courbure membranaire. En effet, ArfGAP1, identifiée comme la première protéine possédant un motif ALPS, est capable de dissocier rapidement le complexe de membranes courbées. Par conséquent, GMAP-210 connecte des membranes courbées, par exemple des vésicules, à des membranes planes recouvertes d'Arf1, par exemple des citernes golgiennes. Le mécanisme vectoriel d'attachement de membranes par GMAP-210 repose donc sur de nombreuses hélices amphipathiques (deux dans GMAP-210, une dans Arf1 et une dans ArfGAP1) et permettrait d'expliquer le confinement des vésicules de transport autour de l'appareil de Golgi. Des mesures de vitesse spontanée de désorption membranaire des extrémités de GMAP-210 suggèrent que l'attachement des membranes est très dynamique et a lieu sur des échelles de temps de la seconde à la minute. Le motif ALPS n'est pas le seul motif amphipathique sensible à la courbure. L'alpha-synucléine, une protéine synaptique célèbre pour son implication dans la maladie de Parkinson, contient également une hélice amphipathique senseur de courbure. Curieusement, la physicochimie du motif ALPS et de l'alpha-synucléine est opposée tant pour la face polaire que pour la face hydrophobe. L'alpha-synucléine a une périodicité atypique (3/11), une face polaire zwittérionique et une face hydrophobe présentant de petits résidus et des thréonines. En utilisant des liposomes de composition et de rayon définis, j'ai montré que la charge négative des membranes est un paramètre discriminant dans la liaison aux membranes des deux protéines. En effet, à la différence de GMAP-210, l'alpha-synucléine est strictement dépendante d'un taux élevé de phospholipides anioniques. Par contre, ces protéines sont toutes les deux très sensibles à la nature des chaînes insaturées des phospholipides. Les premiers résultats montrent néanmoins des subtilités intéressantes : l'alpha-synucléine semble mieux adaptée que GMAP-210 à une membrane polyinsaturée comme l'est celle des vésicules synaptiques. En conclusion, de nombreuses hélices amphipathiques sont impliquées dans le trafic vésiculaire. Elles présentent de nettes différences dans leur physicochimie suggérant une adaptation à des membranes cellulaires (de composition lipidique et de rayon définis) par des mécanismes qui restent largement à explorer.

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Bodon, Gilles. "Impact de la protéine CHMP2B et de ses variants pathogènes sur le modelage des membranes biologiques." Phd thesis, Université de Grenoble, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00594742.

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Abstract:

Ce travail de thèse s'est concentré sur l'étude de la protéine CHMP2B. Cette protéine fait partie du complexe ESCRT-III, impliqué dans divers processus de fissions membranaires à topologies inversées (genèse ces corps multivésiculés, cytokinèse, bourgeonnement des virus enveloppés, autophagie). Des mutations dans le gène codant pour CHMP2B ont été très fortement corrélées à la survenue de maladies neuro-dégénératives (démences fronto-temporales et amyotrophie latérale spineuse). Ce travail a consisté à préciser les mécanismes moléculaires d'action de cette protéine afin de mieux cerner les causes potentielles des ces dysfonctionnements. Il se divise en trois sous parties: - L'étude du l'import potentiel de CHMP2B dans les mitochondries, et de son rôle dans la dynamique mitochondriale. - Le rôle de CHMP2B et l'impact de mutants pathogènes dans la morphogénèse des épines dendritiques. - L'étude de la formation de d'hyper-complexes tubulaires de CHMP2B déformants la membrane plasmique. Nous avons ainsi pu montrer les propriétés suivantes: L'extinction de CHMP2B semble inhiber la fission des mitochondries par un mécanisme qui reste à préciser. L'expression des mutants de CHMP2 liés aux démences fronto-temporales perturbe la morphogénèse des épines dendritiques. Cette altération pourrait participer à l'émergence progressive des symptômes de la FTD. La littérature suggère que les fonctions que CHMP2B concernent des organelles cytoplasmiques (endosomes tardifs, autophagosomes,centrosome). Nous avons montrés que cette protéine est principalement recrutée à la membrane plasmique, où elle se polymérise en une structure tubulaire rigide capable de déformer cette bicouche lipidique.

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Eladari, Dominique. "Etude de trois protéines de transport membranaire impliquées dans la régulation de l'état acide basé par le rein." Paris 6, 2003. http://www.theses.fr/2003PA066429.

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Montamat, Florence. "Isolement et caractérisation d'ADNc codant des protéines impliquées dans le transport membranaire des acides aminés chez Arabidopsis thaliana et Vicia faba." Poitiers, 1998. http://www.theses.fr/1998POIT2276.

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Abstract:

La distribution de l'azote reduit, qui est essentielle pour le developpement et la productivite des plantes, s'effectue surtout sous forme d'acides amines. L'influx des acides amines dans les cellules est assure par cotransport avec des protons. Un certain nombre de transporteurs d'acides amines, notamment les ataaps, ont deja ete clones chez arabidopsis thaliana par complementation fonctionnelle de levures mutantes. Par une approche similaire, nous avons isole pour la premiere fois un adnc de plante (a. Thaliana) codant un homologue aux hmgs (hydroxy-methylglutaryl-coenzyme a synthase) animales. L'activite hmgs de la proteine vegetale a ete confirme par expression heterologue chez la levure. Cette enzyme semble stimuler, de facon faible mais reproductible, l'absorption des acides amines. Nous suggerons que l'hmgs, qui intervient dans la voie de biosynthese des sterols, modifie la composition de la membrane plasmique, avec une incidence sur sa permeabilite. Une seconde approche nous a amenee a preparer une banque d'adnc de feuilles adultes de feve (vicia faba l. ) et a la cribler avec une sonde obtenue par reaction d'amplification sur la banque en utilisant des amorces oligonucleotidiques degenerees. Un adnc pleine longueur (vfaap2) codant un homologue aux ataaps a ete isole. Le profil d'hydrophobicite revele que la proteine deduite de 56 kd est intrinseque ; sa structure presente 12 helices potentiellement transmembranaires. L'expression de cet adnc dans la levure montre qu'il code un transporteur reconnaissant les acides amines neutres et acides avec une forte affinite pour les acides amines hydrophobes aromatiques et aliphatiques. Le transport est stereospecifique et couple avec des protons. L'expression elevee du transporteur dans les tiges et les gousses de feve, visualisee par northern blot, suggere qu'il intervient dans les echanges xyleme/phloeme. Par pcr sur des arns totaux reversement transcrits et prepares a partir des differents organes de la plante, 3 autres adnc d'environ 800 pb et presentant des sequences peptidiques partielles homologues aux aaps ont ete isoles. Leur expression dans les differents organes de la plante a ete precisee. Ces derniers resultats representent les premieres avancees moleculaires concernant le transport de l'azote dans une famille vegetale ou ce phenomene joue un role important sur le plan economique (legumineuses).

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Saint-Jean, Bruno. "Etude de la voie de transport assurée par le récepteur d’adressage vacuolaire BP80." Rouen, 2006. http://www.theses.fr/2006ROUES037.

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Abstract:

Le récepteur d’adressage vacuolaire BP80 assure le transport des préprotéases solubles à destination de la vacuole lytique. BP80 reconnaît son ligand au niveau du TGN. Le complexe formé est empaqueté dans des vésicules de transport puis transporté jusqu’au compartiment prévacuolaire (PVC). Le ligand transite jusqu’à la vacuole lytique alors que le récepteur recycle jusqu’au TGN. Nous avons initié une approche de microscopie confocale pour étudier BP80. Nous avons créé une chimère correspondant à la fusion entre la GFP et les domaines transmembranaire et cytosolique de BP80 nommée GFP-PS1. Cette chimère GFP-PS1 reproduit parfaitement le trafic de BP80. Nous avons réalisé différentes protéines chimériques dérivant toutes du reporter GFP-PS1 et portant une ou deux mutation(s ) sur des signaux de tri potentiels présents sur la portion cytosolique de BP80. Par cette approche, nous avons identifié deux signaux importants qui participent à des événements de recyclage et d’endocytose de BP80
BP80 is a vacuolar receptor responsible for sorting proaleurain from the trans-Golgi network. The complex receptor-ligand is packed into shuttle vesicles that are directed and fused to a prevacuolar compartment where the lower pH induces the dissociation between the receptor and the proaleurain. This latter matured and released in the lytic vacuole. Beside the fact that BP80 uses clathrin coated vesicles for its traffic, we have no other indication on the signals in the cytoplasmic tail used by BP80 traffic. In an attempt to identify trafficking signals, we fused the GFP to the transmembrane and the cytosolic domains of BP80 and called the resulting fusion protein GFP-PS1. Like the native vacuolar receptor, GFP-PS1 accumulates and cycles in the same cell compartment. We then introduced single or two mutation(s) in the cytosolic portion of GFP-PS1. Using this approach, we identify two important sorting signals, which participates to recycling and endocytic events of BP80

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Mesmin, Bruno. "La reconnaissance de la courbure membranaire par ArfGAP1." Phd thesis, Nice, 2007. https://theses.hal.science/tel-00320072.

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Abstract:

La formation d’un bourgeon vésiculaire repose sur une machinerie complexe qui déforme, par une action mécanique, une membrane plane en une membrane courbée. Le manteau COPI, responsable de ce phénomène dans le Golgi, se polymérise latéralement à la surface de la membrane, sous le contrôle de la petite protéine G Arf1 activée. Suite à la formation de la vésicule, Arf1 revient à l’état inactif par hydrolyse de son GTP et se dissocie de la membrane, provoquant alors le désassemblage du manteau. Cette réaction d’hydrolyse doit être finement régulée, pour ne pas intervenir trop tôt et compromettre l’assemblage du manteau. Notre laboratoire a révélé que l’activité de la protéine ArfGAP1, responsable de la désactivation d’Arf1, est hypersensible à la courbure membranaire. Ceci permettrait à ArfGAP1 de réguler de manière spatio-temporelle l’état du manteau COPI en couplant son désassemblage à la courbure membranaire qu’il a lui-même induite. Au cours de ma thèse, j’ai montré que la dépendance d’ArfGAP1 à la courbure s’explique par la présence dans cette protéine de deux motifs « ALPS », qui se replient en hélices alpha lors de leur adsorption membranaire. Ce sont des hélices amphipathiques atypiques car, si elles possèdent une face hydrophobe classique, elles ont une face polaire riche en sérine et thréonine et pauvre en résidus chargés. Puisque ces résidus hydroxylés ne peuvent interagir avec les têtes polaires des lipides, la liaison d’un motif ALPS ne repose que sur l’insertion de ses résidus hydrophobes entre les lipides, ce qui est favorisé par l’écartement lipidique induit par la courbure membranaire, mais plus difficile sur membrane plane où les lipides sont plus compactés
The COPI coat drives the budding of small vesicle from Golgi apparatus. After being recruited by membrane-bound Arf1-GTP, the COPI coat subunits (Coatomer) polymerise, and shape mechanically the lipid membrane into a spherical structure. Then, GTP hydrolysis in Arf1 is required for the disassembly of the COPI coat, but this reaction must be finely tuned to permit coat disassembly only after vesicle formation. ArfGAP1 is a cytosolic protein that associates in dynamic manner with the Golgi apparatus, and controls the cycling of COPI coat on membranes by catalyzing GTP hydrolysis on Arf1. Results from our lab indicated that the activity of ArfGAP1 is highly sensitive to membrane curvature. Thus a negative feed-back loop was suggested, where COPI assembly drives membrane curvature, which in turn prepares the coat for disassembly by recruiting ArfGAP1, thereby promoting GTP hydrolysis in Arf1. During my thesis, I found that two motifs in the central region of ArfGAP1 act as lipid-packing sensors and help anchor ArfGAP1 at the surface of highly curved membrane. These “ALPS” motifs, which are not structured in solution, adopt an amphipathic helical structure on curved membranes. These helices contrast from classical membrane-adsorbing helices in the abundance of serine and threonine residues and the paucity of charged residues in their polar faces. Because these residues cannot make electrostatic interaction with lipid polar heads, the adsorption of ALPS motifs is driven solely by the insertion of hydrophobic residues between lipids and is thus strongly favored by the creation of lipid packing defects such as those introduced by high membrane curvature

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Mesmin, Bruno. "La reconnaissance de la courbure membranaire par ArfGAP1." Phd thesis, Université de Nice Sophia-Antipolis, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00320072.

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Abstract:

La formation d'un bourgeon vésiculaire repose sur une machinerie complexe qui déforme, par une action mécanique, une membrane plane en une membrane courbée. Le manteau COPI, responsable de ce phénomène dans le Golgi, se polymérise latéralement à la surface de la membrane, sous le contrôle de la petite protéine G Arf1 activée. Suite à la formation de la vésicule, Arf1 revient à l'état inactif par hydrolyse de son GTP et se dissocie de la membrane, provoquant alors le désassemblage du manteau. Cette réaction d'hydrolyse doit être finement régulée, pour ne pas intervenir trop tôt et compromettre l'assemblage du manteau. Notre laboratoire a révélé que l'activité de la protéine ArfGAP1, responsable de la désactivation d'Arf1, est hypersensible à la courbure membranaire. Ceci permettrait à ArfGAP1 de réguler de manière spatio-temporelle l'état du manteau COPI en couplant son désassemblage à la courbure membranaire qu'il a lui-même induite.
Au cours de ma thèse, j'ai montré que la dépendance d'ArfGAP1 à la courbure s'explique par la présence dans cette protéine de deux motifs « ALPS », qui se replient en hélices alpha lors de leur adsorption membranaire. Ce sont des hélices amphipathiques atypiques car, si elles possèdent une face hydrophobe classique, elles ont une face polaire riche en sérine et thréonine et pauvre en résidus chargés. Puisque ces résidus hydroxylés ne peuvent interagir avec les têtes polaires des lipides, la liaison d'un motif ALPS ne repose que sur l'insertion de ses résidus hydrophobes entre les lipides, ce qui est favorisé par l'écartement lipidique induit par la courbure membranaire, mais plus difficile sur membrane plane où les lipides sont plus compactés.

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Dalbon, Pascal. "La protéine mitochondriale de transport des adénine-nucléotides : localisation des sites nucléotidiques par photomarquage, étude de la topographie membranaire de la chaîne polypeptidique à l'aide d'anticorps anti-peptides synthétiques." Grenoble 1, 1987. http://www.theses.fr/1987GRE10121.

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Jamal, Layal. "Structural and functional characterization of the lysosomal amino acid transporter PQLC2." Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL129.

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Abstract:

PQLC2, qui signifie protéine conte- nant des répétitions de boucle proline-gluta- mine 2, appartient à une famille de protéines de transport membranaires caractérisées par une topologie membranaire à sept hélices et deux motifs proline-glutamine. PQLC2 est localisé dans la membrane lysosomale des cellules mammifères, et des études utilisant du PQLC2 recombinant exprimé dans des ovocytes de Xe- nopus ont démontré que PQLC2 est un unipor- teur qui transporte spécifiquement des acides aminés cationiques. Cependant, sa structure atomique en 3D n’a pas encore été déterminée. En plus de son rôle de transporteur, PQLC2 est également un récepteur membranaire. Lorsque la cellule est privée d’acides aminés cationiques, PQLC2 recrute à la surface du lysosome un com- plexe de trois protéines (appelé CSW) : les pro- téines GTPas-activatrices C9ORF72 et SMCR8, et WDR41, l'ancrage entre CSW et PQLC2. Le com- plexe CSW est important pour le bon fonction- nement des lysosomes. De plus, des mutations congénitales dans le gène codant pour C9ORF72 sont directement associées à deux maladies neurodégénératives. Des essais de pull-down dans des extraits cellu- laires indiquent que l’interaction d’un court mo- tif peptidique de 10 acides aminés provenant d’une boucle saillante de WDR41 (boucle WDR41-7CD) avec PQLC2 est suffisante pour le recrutement lysosomique de CSW. Afin de ca- ractériser cette interaction ainsi que le rôle fonc- tionnel de PQLC2, nous avons exprimé PQLC2 de mammifère dans la levure Saccharomyces cerevisiae et établi un protocole de purification de PQLC2 basé sur la reconnaissance entre des nanocorps anti-GFP et GFP fusionné à PQLC2. Pour améliorer la stabilité de PQLC2 purifié par détergent, nous avons introduit des mutations spécifiques le long de la séquence de la pro- téine en utilisant une approche de mutagenèse basée sur un consensus. La microscopie électro- nique à contraste négatif de PQLC2 purifié par détergent suggère que ce transporteur s’as- semble sous forme d’homotrimère, comme les autres membres de la même famille de trans- porteurs à boucle PQ. Enfin, par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE), nous avons évalué l’interaction directe entre PQLC2 et un peptide codant la boucle WDR41. Ces expériences ont révélé le rôle de certains résidus de la boucle WDR41 dans l’in- teraction PQLC2/boucle WDR41-7CD, ainsi que l’effet d’un substrat de PQLC2
PQLC2, which stands for proline-glu- tamine loop repeat-containing protein 2, be- longs to a family of membrane transport pro- teins characterized by a seven-helix membrane topology and two proline-glutamine motifs. PQLC2 is localized in the lysosomal membrane of mammalian cells, and studies using recombi- nant PQLC2 expressed in Xenopus oocytes have demonstrated that PQLC2 is an uniporter that specifically transports cationic amino acids. However, its 3D atomic structure has not yet been determined. In addition to being a trans- porter, PQLC2 is also a membrane receptor. When the cell is deprived of cationic amino acids, PQLC2 recruits at the lysosome surface a complex of three proteins (called CSW): the GTPase-activating proteins C9ORF72 and SMCR8, and WDR41, the anchor between CSW and PQLC2. The CSW complex is important for normal lysosome function. In addition, congeni- tal mutations in the gene encoding C9ORF72 are directly associated with two neurodegene- rative diseases. Pull-down assays in cell extracts indicate that the interaction of a short 10 amino acid peptide motif from a protruding loop of WDR41 (WDR41-7CD loop) with PQLC2 is sufficient for lysosomal recruitment of CSW. To characterize this interaction as well as the functional role of PQLC2, we expressed mammalian PQLC2 in the yeast Saccharomyces cerevisiae, and established a purification protocol of PQLC2 based on the recognition between anti-GFP nanobodies and GFP fused to PQLC2. To improve the stability of detergent-purified PQLC2, we introduced speci- fic mutations along the protein sequence using a consensus-based mutagenesis approach. Ne- gative-staining electron microscopy of deter- gent-purified PQLC2 suggests that this trans- porter assembles as a homotrimer, like other members of the same PQ-loop family of trans- porters. Finally, by electron paramagnetic re- sonance (EPR) spectroscopy, we assessed the direct interaction between PQLC2 and a peptide encoding the WDR41 loop. These experiments revealed the role of certain WDR41 loop resi- dues in the PQLC2/WDR41-7CD loop interac- tion, as well as the effect of a PQLC2 substrate

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Chentouf, Myriam. "Compréhension des mécanismes d'action de l'anticorps recombinant 13B8. 2 par l'analyse de la dynamique membranaire." Montpellier 1, 2008. http://www.theses.fr/2008MON13509.

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Abstract:

L’anticorps recombinant anti-CD4 13B8. 2, breveté par l’équipe Modulation Moléculaire, utilisé dans le cadre du traitement de tumeurs hématopoïétiques CD4+ rares, a démontré des capacités de lyse dépendante du complément (CDC) et d’inhibition de la prolifération cellulaire. Cependant les modalités qui amènent à ces effets biologiques restent inexpliquées. C’est pourquoi, basés sur les études menées sur le Rituximab anti-CD20 et dans le but de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’anticorps 13B8. 2, nous nous sommes intéressés à la réorganisation membranaire au niveau des rafts lipidiques suite au traitement par l’anticorps. Les rafts lipidiques étant le siège des premiers événements qui amènent à la mise en place de voie de signalisation, la visualisation de la réorganisation de ces fractions a été l’élément clef de notre étude. Nous avons donc tenté (1) d’appréhender la réorganisation des rafts après traitement par l’anticorps, (2) d’identifier le flux moléculaire associé en relation avec les effets biologiques induits par l’anticorps. Cette étude nous a permis de démontrer que les effets biologiques de l’anticorps recombinant 13B8. 2 passent par une réorganisation protéique et lipidique au niveau des rafts lipidiques. RIgG1 13B8. 2 permet l’accumulation de la molécule CD4 dans les rafts lipidiques alors que la protéine ZAP-70 et ses cibles sous-jacentes SLP-76, Vav-1 et PLCγ1 en sont exclues. Par des jeux de phosphorylations/déphosphorylations ceci amène à l’inhibition des voies activatrices dans la prolifération cellulaire. De plus, rIgG1 13B8. 2 induit une augmentation de l’activité de la sphingomyélinase acide, conduisant à l’accumulation de céramides dans la cellule qui ont eux aussi des effets anti-prolifératifs. Cette meilleure connaissance de la réorganisation de la membrane, permettra de dégager de nouvelles cibles pertinentes et d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à moduler le flux membranaire.

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Louvel, Hélène. "Les systèmes d'acquisition du fer chez les leptospires." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077065.

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Abstract:

Les leptospires sont des bacteries du phylum des spirochetes et regroupent des especes saprophytes comme l. Biflexa et pathogenes responsables de la leptospirose comme l. Interrogans. Leur manipulation genetique est possible depuis quelques annees nous permettant alors, avec l'analyse des donnees des genomes, d'ameliorer nos connaissances de leur physiologie. Le fer est un element essentiel pour les leptospires comme pour la plupart des organismes vivants. Nous avons montre que les leptospires sont capables d'utiliser de multiples sources de fer comme l'hemine et plusieurs siderophores. Nous avons developpe un nouvel outil genetique de mutagenese aleatoire base sur la transposition qui nous a permis de montrer que les leptospires possedent de nombreux transporteurs specifiques pour permettre la translocation du fer a travers les membranes biologiques. L. Biflexa possede des recepteurs de la membrane externe de type tonb-dependant dont un est implique dans le transport du citrate de fer et de l'aerobactine et un autre transporte la desferrioxamine. Il existe, au niveau de la membrane cytoplasmique, un systeme specifique des ions ferreux de type feoab et un abc transporteur specifique des ions ferriques. Ces mecanismes de transport pourraient etre regules par une proteine de type fur et nos resultats indiquent que l'un des fur potentiels de l. Interrogans presente une activite de liaison a l'adn. Notre approche contribue a etablir les bases concernant les mecanismes d'acquisition du fer des leptospires. Le systeme de mutagenese aleatoire qui s'est egalement revele fonctionnel chez les especes pathogenes devrait permettre d'aborder le role du fer dans leur virulence
Leptospires are bacteria of the phylum of spirochetes that are composed of saprophytic species like l. Biflexa and pathogenic species responsible for leptospirosis like l. Interrogans. Genetic manipulation of leptospires is available since several years and, in combination with genomic analyses, it would allow us to improve our knowledge of their physiology. Iron is an essential element for leptospires as for most of the living organisms. We showed that leptospires are aele to use multiple iron sources as hemin and several siderophores. We developed a random mutagenesis system based on transposition that allowed us to show that leptospires possess numerous specific transporters for the iron translocation through biological membranes. L. Biflexa possesses outer membrane tonb-dependent receptors including one for the transport of iron citrate and aerobactin and another transporting desferrioxamine. We identified a ferrous iron specific feoab-type system and a ferric iron specific abc transporter. A fur-like protein may regulate these mechanisms and our results indicate that one of the putative fur of l. Interrogans displays a dna-binding activity. Our work contributes to set the basis of iron acquisition mechanisms in leptospires. The random transposon mutagenesis system, which was found functional in pathogenic species, will allqw the evaluation of the role of iron for virulence

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Quentin, Fabienne. "Caractérisation et régulation de protéines de transport membranaire du néphron distal impliquées dans la régulation de l'état acide-base et du bilan du chlorure de sodium par le rein." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066069.

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Adrait, Annie. "Etudes spectroscopiques et magnétiques de la protéine Fur (Ferric Uptake Regulation) d'Escherichia coli." Université Joseph Fourier (Grenoble), 1998. http://www.theses.fr/1998GRE10212.

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Abstract:

La proteine fur (ferric uptake regulation), homodimere de 2 fois 17 kda, est impliquee dans le controle de la concentration intracellulaire du fer chez les bacteries gram negative telle que escherichia coli. Ce controle est essentiel car, bien que necessaire a la croissance de pratiquement toutes les cellules, le fer est aussi un element potentiellement toxique puisqu'il peut catalyser la formation de radicaux libres. Un mecanisme est propose selon lequel fur lie l'ion fe(ii) et, ainsi activee, peut se fixer sur la region promotrice de genes impliques dans le transport du fer, inhibant de ce fait la transcription. La presence du metal est essentielle a l'activite. In vitro, plusieurs cations divalents comme mn(ii) ou co(ii) peuvent remplacer fe(ii) pour conduire a la fixation specifique de fur sur l'adn. Toutefois, la stoechiometrie metal/monomere et l'environnement du metal n'ont pas ete jusque la clairement identifies. Notre objectif est de caracteriser les sites metalliques de la proteine et d'identifier les ligands du metal. Pour cela les proteines fur substituees au manganese et au cobalt ont ete preparees et etudiees par plusieurs techniques spectroscopiques et magnetiques, chaque metal representant une sonde structurale interessante grace a ses proprietes spectroscopiques. L'incorporation du metal, suivie par spectroscopie d'absorption electronique pour le co(ii) et rpe a temperature ambiante pour le mn(ii), a permis de montrer la presence d'un site metallique principal par monomere. La rpe et les mesures d'aimantation montrent que l'ion metallique est present a l'etat haut spin dans un environnement hexacoordonne deforme pour l'ion co(ii) (s = 3/2) et peu ou pas deforme dans le cas de l'ion mn(ii) (s = 5/2). Un site secondaire a zinc de type structural a egalement ete caracterise par ailleurs. Les experiences rmn de la forme co(ii)-fur ont permis d'identifier les protons n-h echangeables d'histidines et egalement des signaux correspondant a des protons ch#2 de ligands carboxylates. Au moins deux histidines (peut-etre trois) et au moins un aspartate ou glutamate sont ligands, la sphere de coordination est complete par des atomes n/o mais il n'y a pas de cysteine ligand du cobalt.

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Moussa, Myriam. "Les transporteurs de caroténoïdes et de la vitamine E : identification et effet de leurs polymorphismes génétiques sur l'absorption/le statut en ces micronutriments." Aix-Marseille 2, 2009. http://www.theses.fr/2009AIX20667.

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Abstract:

Les caroténoïdes et la vitamine E sont des microconstituants lipidiques d’origine végétale. Leur consommation est associée à une diminution du risque de certaines maladies chroniques telles que les maladies cardiovasculaires, certains types de cancers ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Ces dernières années, plusieurs études se sont intéressées aux mécanismes moléculaires de l’absorption de ces molécules. Ces études ont mis en évidence le rôle d’un transporteur intestinal du cholestérol, le Scavenger Receptor Class B Type I (SR-BI) dans l’absorption de la vitamine E, du β-carotène et de la lutéine. Dans la première partie de cette thèse, nous avons montré l’implication de SR-BI dans le captage apical de deux autres caroténoïdes, le lycopène et l’α-carotène. Au niveau basolatéral, nous avons montré l’implication de l’ATP Binding Cassette A1 (ABCA1) dans l’efflux de la vitamine E. Nous nous sommes intéressés par la suite à deux autres transporteurs, le Niemman Pick Like 1 C1 (NPC1L1) transporteur intestinal du cholestérol, et le Cluster Determinant 36 (CD36) transporteur adipocytaire des acides gras à longue chaîne. Dans nos conditions d’étude, nous avons montré que le premier n’était pas impliqué dans l’absorption entérocytaire du lycopène, alors que le second semble jouer un rôle dans le captage de caroténoïdes par les adipocytes. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons montré l’effet de variations au niveau de gènes impliqués dans le métabolisme lipidique sur les concentrations sanguines de caroténoïdes et de la vitamine E. Ces résultats apportent de nouveaux éléments expliquant la grande variabilité interindividuelle d’absorption des caroténoïdes et de la vitamine E, et pourraient notamment être pris en compte à terme, pour affiner les recommandations nutritionnelles.

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Martinez, Denis. "Rôles des phosphoinositides dans l'intéraction membranaire de la protéine Rgd1 et la croissance polarisée des levures : étude structurale et interaction par RMN et cristallographie." Thesis, Bordeaux, 2014. http://www.theses.fr/2014BORD0369/document.

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Abstract:

Les phosphoinositides sont des molécules régulatrices présentes à l'interface membrane-cytosol, impliquées dans la transduction du signal, le trafic membranaire ainsi que l'organisation du cytosquelette. Ces lipides recrutent non seulement diverses protéines vers des compartiments spécifiques, mais régulent aussi leur activité enzymatique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ils interagissent directement avec le domaine RhoGAP de la protéine Rgd1, identifiée comme un activateur commun aux GTPases Rho3 et Rho4. Ces 2 protéines, respectivement impliquées dans la croissance polarisée et la cytocinèse, voient leur activité GTPasique exacerbée en présence de Rgd1pet des PIPs. L'objectif de cette thèse était comprendre à l'échelle moléculaire le processus unique d'activation de RhoGAP par les PIPs. Pour ce faire, nous avons réalisé l'étude structurale de RhoGAP par cristallographie couplée à la RMN en solution. Nos résultats montrent que le domaine possède les éléments essentiels à l'activation des protéines Rho. L'interaction avec les PIPs a été suivie par RMN en présence de PI(4)P et de PI(4,5)P2, respectivement localisés dans les vésicules de sécrétion et à la membrane plasmique. Nos résultats révèlent un site de liaison commun aux PIPs dans une région non conservée chez les domaines RhoGAP. L'affinité des complexes, de l'ordre de la centaine de micromolaires suggèrent qu'in vivo l'interaction soit transitoire et réversible avec les PIPs. La sélectivité de l'interaction se ferait donc de façon spatio-temporelle, au niveau des vésicules de sécrétion pour la croissance polarisée et de la membrane plasmique pour la cytocinèse
Phosphoinositides act as regulatory and signalling molecules at the membrane-cytosol interface in signal transduction, membrane traffic and cytoskeleton organization. These lipids recruit several proteins to specific compartments, but also regulate their activity. In the yeast Saccharomycescerevisiae, they directly bind the Rgd1-RhoGAP domain, that stimulates the GTPase activity of bothRho3p and Rho4p. The GTPase activity of these two Rho proteins, respectively involved in the polarized growth and cytokinesis of the yeast, is enhanced with the presence of Rgd1p and PIPs. The main objective of this thesis is to understand the PIP-RhoGAP interaction at the molecular level. In order to do that, we coupled X-ray structure determination to solution NMR spectroscopy on the isolated RhoGAP domain. Our results show that the domain contains the conserved elements that would usually confer the catalytic GTPase activation. We us e liquid-state NMR spectroscopy to follow the interaction with PI(4)P and PI(4,5)P2, respectively found in secretion vesicles and the plasma membrane. Our study reveals a common binding site for both PIPs in a non-conserved region in the RhoGAP domain family. We measured sub-millimolar binding affinity for PIPs. Such moderate binding affinities are consistent with the biological requirement for reversible complex formation. The selectivity of the interaction could be made in a spatio temporal way, on the secretion vesicles during polarized growth and at the plasma membrane during cytokinesis

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Mozo, Julien. "Etude du transport des UCPs : utilisation du modèle cellulaire CHO et de la reconstitution en protéoliposomes." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066228.

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Wilhelm, Léa. "Etude du rôle de STARD3 dans le transport du cholestérol." Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ048/document.

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STARD3 est une protéine endosomale de la famille START (Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) Related lipid Transfer), qui lie le cholestérol. STARD3 module l’organisation de la cellule en formant des sites de contact membranaire entre les endosomes et le réticulum endoplasmique (RE). Le lien entre les sites de contact membranaire et le transport du cholestérol n’était pas compris. Dans ce travail, nous montrons que STARD3 en interagissant avec les protéines VAPs (VAMP–Associated Proteins) bâtit une machine moléculaire autonome qui transporte le cholestérol au niveau des contacts RE–endosomes. Ce transport permet la formation de membranes internes dans les endosomes et est potentiellement impliqué dans le fonctionnement de ces organites. De plus, nous avons étudié la fonction de STARD3 dans la maladie Niemann Pick type C, qui est caractérisée par une anomalie du transport de cholestérol dans les endosomes
STARD3 is an endosomal sterol-binding protein which belongs to the START protein family. Remarkably, STARD3 modulates the cellular organization by creating membrane contact sites between the endoplasmic reticulum (ER) and endosomes. The link between ER-endosome contact sites and cholesterol transport was not understood. In this work, we showed that STARD3 and its ER–resident partner, VAMP–associated protein (VAP), assemble into a machine that allows a highly efficient transport of cholesterol within ER–endosome contacts. This cholesterol transport provides building blocks for endosome inner membranes formation, and is probably involved in endosome dynamics. Furthermore, we studied STARD3 function in Niemann Pick type C disease, a condition characterized by an impairment of endosomal cholesterol export

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Verchère, Alice. "Functional investigation of the efflux pump MexA–MexB-OprM of Pseudomonas aeruginosa." Thesis, Paris 5, 2014. http://www.theses.fr/2014PA05P622/document.

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Abstract:

L’efflux actif, qui permet aux bactéries d’exporter les antibiotiques vers le milieu extérieur est l’un des mécanismes majeurs de résistance aux antibiotiques. L’une des pompes d’efflux de Pseudomonas aeruginosa, MexA-MexB-OprM, est constituée de trois protéines : i) MexA, une protéine membranaire de fusion qui se trouve dans le périplasme ; ii) MexB qui se trouve dans la membrane interne et qui reconnaît l’antibiotique et initie son transport grâce à la force protomotrice et iii) OprM un canal qui se trouve dans la membrane externe. Durant ma thèse, j’ai mis au point un test fonctionnel pour MexA et MexB. Ce test est basé sur la coreconstitution de ces protéines avec la bactériorhodopsine, une protéine membranaire qui génère un gradient de proton après activation par la lumière. L’activité de MexB est suivie de manière indirecte via la mesure du pH. En mesurant le pH à l’intérieur des liposomes, on peut connaître l’activité de MexB puisque ce dernier utilise la force protomotrice pour transporter ses substrats. Une mesure fiable du pH peut être obtenue grâce à la pyranine dont la fluorescence varie avec le pH. Grâce à ce test, j’ai prouvé que MexB possède une activité basale qui ne dépend pas de la présence de substrat et que l’activité de MexB devient optimale quand cette dernière est reconstituée en présence de MexA. Dans un deuxième temps, j’ai mis au point un test fonctionnel pour la pompe d’efflux entière. Pour cela, je prépare deux types distincts de protéoliposomes. Dans le premier type de liposome, j’encapsule de la pyranine, (pour suivre l’activité de MexB) et un substrat de MexB qui est un agent intercalant de l’ARN. Ce substrat est faiblement fluorescent dans un environnement aqueux et fortement fluorescent lorsqu’il est intercalé dans l'ARN. MexB et MexA sont reconstitués dans ces liposomes. Dans le deuxième type de liposomes, je reconstitue OprM et j’encapsule de l’ARN. Ces deux types de liposomes sont alors mélangés. Lorsque la pompe s’assemble et qu’il y a un transport actif à travers cette dernière, deux phénomènes sont observés: la diminution de la fluorescence de la pyranine (car MexB fait entrer des protons dans le premier type de liposome pour transporter le substrat) et l’augmentation de la fluorescence du substrat car ce dernier s’intercale dans l’ARN se trouvant dans le deuxième type de liposome. En mélangeant les deux types de liposomes, j’obtiens une preuve de la reconstitution in vitro de la pompe entière et j’ai mis en évidence qu’OprM s’ouvre en présence de MexA et MexB et que sa présence augmente l’activité de MexB
Among the various mechanisms developed by the bacteria to counter to the effect of antibiotics, active efflux is on the front line. In Pseudomonas aeruginosa, a Gram negative bacteria, efflux transporters are organized as multicomponent systems where MexB, the pump located in the inner membrane, works in conjunction with MexA, a periplasmic protein, and OprM, an outer membrane protein. MexB is a proton motive force-dependent pump with broad substrate specificity. During my PhD, I have designed an original activity assay for MexB and MexA. The pump is coreconstituted into proteoliposomes together with bacteriorhodopsin (BR), a light-activated proton pump. In this system, upon illumination with visible light, the photo-induced proton gradient created by the BR is shown to be coupled to the active transport of substrates through the pump. The activity of MexB is monitored indirectly. Since MexB uses the protomotive force to transport antibiotics, one can determine substrate transport though MexB by monitoring the pH inside the liposomes. For that purpose, pyranine, a fluorescent probe whose fluorescence yield increases with increasing pH, is encapsulated inside the liposomes. This test makes the investigation of the pump possible. In the absence of MexA, MexB has a basal activity which is not substrate-dependent. Once MexB is reconstituted together with MexA, its activity is specific and substrate-dependent. Then I worked on the reconstitution of the whole efflux pump. For this, I prepare two different kinds of liposomes: i) Liposomes with reconstituted MexA and MexB in which pyranine and a nucleic acid intercalating agent are encapsulated, ii) Liposomes with reconstituted OprM and encapsulated RNA. The activity of MexB is monitored thanks to the addition of EthB, a substrate of MexB, that is poorly fluorescent in aqueous medium and highly fluorescent when intercalated into RNA. Upon generation of a pH gradient, I observe two concomitant phenomena: the decrease of pyranine fluorescence, as MexB is using protons to transport the substrate, and the increase of the fluorescence of the RNA intercalating agent as a result of its interaction with RNA. I have successfully assembled the efflux pump and monitored transport through it from one liposome to the other. I have demonstrated that OprM needs to interact with MexA and MexB in order to open and that MexB activity is accelerated when the pump is assembled

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Boutant, Emmanuel. "Caractérisation des interactions entre la protéine de mouvement (MP) du Tobacco mosaic virus et le cytosquelette microtubulaire et étude du mécanisme de transport de la MP aux plasmodesmes." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2007. https://publication-theses.unistra.fr/restreint/theses_doctorat/2007/BOUTANT_Emmanuel_2007.pdf.

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Abstract:

Le virus de la mosaïque du tabac possède un génome d’ARN codant pour quatre protéines dont la MP. Lors de la virose, la MP:GFP s’accumule au niveau des plasmodesmes (pd), du réticulum endoplasmique et des microtubules (MT). L’essentiel des résultats décrits dans ce mémoire concernent la caractérisation de l’association de la MP avec les MT notamment le mécanisme d’association de la MP, l’influence sur la dynamique des MT, l’incidence sur la division cellulaire, l’oligomérisation de la MP, la caractérisation d’interactions in vivo et in vitro de la MP avec des facteurs cellulaires comme la protéine End Binding 1, les protéines du complexe de nucléation ou encore la MAP65. 5. Nous nous sommes également intéressés à l’implication de la voie de sécrétion dans le mécanisme d’adressage de la MP aux pd. Il apparaît que l’adressage de la MP aux pd est indépendant du système de sécrétion qui serait plutôt impliqué dans la formation des corps d’inclusion servant à la réplication virale
The RNA genome of Tobacco mosaic virus encodes four proteins of which one is the movement protein (MP). MP accumulates with plasmodesmata (pd), with the endoplasmic reticulum (ER) and microtubules (MT). In this manuscript we therefore focused on the following aspects: 1. Characterisation of the association of MP with MTs. We demonstrate that MP is recruited to MTs by a lateral anchoring mechanism in a multimeric state. We show that MT-associated MP protects MTs in vivo against destabilizing agents but, binding of MP to mitotic MTs does not affect mitosis. Our analysis of the in vitro and in vivo interactions between MP and the MT-EndBinding protein1 show that MP alters EB1 localisation and dynamics. We also demonstrate that MP interacts with proteins from the MTs nucleation complex. 2. Analysis of MP transport to pd. We investigated whether Pd-targeting of MP involves the secretory pathway and demonstrate, that the targeting of MP to pd is independent of a functional secretory pathway

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Ahmed, Ouameur Amin. "Caractérisation de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) chez le parasite protozoaire Leishmania." Thesis, Université Laval, 2011. http://www.theses.ulaval.ca/2011/28244/28244.pdf.

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Palakas, Somchit. "Etudes fonctionnelles dans son environnement membranaire natif d'un transporteur multispécifique, la "Multidrug Resistance-associated Protein 1" (MRP1, ABCC1) : application à la recherche de radiopharmaceutiques potentiels." Tours, 2004. http://www.theses.fr/2004TOUR3309.

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Abstract:

La MRP1 (ABCC1) est un transporteur membranaire qui contribue à la détoxication cellulaire, aux processus d'absorption/distribution/élimination de médicaments et confère, dans certaines cellules tumorales, le phénotype de résistance multiple aux anticancéreux (MDR). Dans le cadre d'une recherche de radiopharmaceutiques pour imager in vivo, par exploration scintigraphique, le phénotype MDR, nous avons analysé les perturbations des fonctions ATPasique et de transport de MRP1 dans des microsomes préparés à partir de cellules pulmonaires tumorales humaines (GLC4/Adr). Nous avons caractérisé le transport de [3H]LTC4, de [3H]E217G et de [3H]GSH par MRP1 ainsi que son activité ATPasique qui est stimulée par ces substrats de transport. Ces deux sondes fonctionnelles sont inhibées en présence de QCRL-3, un anticorps monoclonal spécifique de MRP1. Nous avons démontré que l'apigénine et ses cinq dérivés halogénés nouvellement synthétisés interagissent avec MRP1 uniquement en présence de GSH
MRP1 (ABCC1) is a multispecific membrane transporter who plays an important role in cellular detoxification and absorption/distribution/elimination processes of drugs, and confers to certain cancer cells, the multidrug resistance phenotype (MDR) to anticancer agents. In search of radiopharmaceuticals for in vivo imaging of MDR phenotype by scintigraphic exploration, perturbation of MRP1 ATPase and transport functions have been investigated using microsomes issued from human small cell lung cancer cells (GLC4/Adr). Transport of [3H]LTC4, [ 3H]E217βG and [3H]GSH by MRP1 as well as its ATPase activity stimulated by its transported substrates have been characterized. Both functional probes are inhibited in the presence of QCRL-3, a specific monoclonal antibody of MRP1. Furthermore, we have demonstrated that apigenine and its five newly synthesized halogenated derivatives interact with MRP1 only in the presence of GSH

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Tanguy, Emeline. "Implication de l’acide phosphatidique dans le trafic membranaire : rôle et régulation de la phospholipase D au cours de la phagocytose et de l’exocytose régulée." Thesis, Strasbourg, 2019. http://www.theses.fr/2019STRAJ112.

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Abstract:

La mise en évidence du rôle des lipides dans le trafic membranaire fait partie des avancées majeures de ces dernières années. Mes travaux de thèse se sont focalisés sur le plus simple des phospholipides, l’acide phosphatidique (PA). La production de PA par la phospholipase D (PLD) joue un rôle crucial au cours de la phagocytose et l’exocytose régulée, mais la dynamique de sa formation, tout comme les mécanismes d’action des différentes formes de PA, restent à ce jour totalement inconnus. Durant mon doctorat, j’ai contribué à la caractérisation de trois domaines de liaison peptidique au PA, qui nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d’interaction des protéines avec le PA et de générer des sondes moléculaires pour repérer ce lipide au sein des cellules. Ainsi, j’ai pu visualiser la production de PA au cours de la phagocytose et mis en évidence l’implication de la GTPase Arf6 dans la régulation de la synthèse de PA par la PLD. J’ai également pu montrer que la PLD est impliquée dans plusieurs étapes de l’exocytose dans des cellules neuroendocrines. Des expériences de lipidomique et de restauration ont révélé notamment que des formes mono- et polyinsaturées du PA contrôlent des étapes distinctes de l’exocytose que j’ai pu définir
The discovery of the involvement of lipids in membrane trafficking is one of the major recent progress in cell biology. My thesis work focused on phosphatidic acid (PA), the simplest phospholipid. PA synthesis by phospholipase D (PLD) plays a crucial role during phagocytosis and regulated exocytosis, but its precise dynamics, as well as the mode of action of the different PA species, remain unknown. I characterized three PA binding domains allowing a better understanding of the interaction between proteins and PA and leading to the generation of genetic sensors for PA in cells. Thus I could visualize PA synthesis during phagocytosis and identified that the small GTPase Arf6 regulates PLD activity and consequently PA synthesis. My work also reveals that PLD modulates several steps during exocytosis in neuroendocrine cells. Further lipidomics and rescue experiments allowed me to show that mono- and polyunsaturated forms of PA are involved in distinct steps of exocytosis

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Bergé, Matthieu. "Étude du recrutement de la nucléase EndA au sein du complexe de transport de l'ADN transformant chez Streptococcus pneumoniae." Toulouse 3, 2012. http://thesesups.ups-tlse.fr/1901/.

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Abstract:

La transformation est un mécanisme largement répandu dans le monde bactérien permettant des échanges génétiques via la capture d'ADN exogène. Elle requiert généralement le développement d'un état physiologique transitoire, la compétence, au cours de laquelle sont néo-synthétisées les protéines essentielles à la capture de l'ADN du milieu extérieur, à sa traversée de la paroi cellulaire, à son internalisation dans le cytoplasme sous forme simple brin et à son intégration dans le génome par recombinaison homologue. Collectivement, ces protéines définissent l'appareil de transformation génétique, l'ADN Transformasome, dont la caractérisation est la plus avancée pour les bactéries modèles Streptococcus pneumoniae et Bacillus subtilis. Mon projet de thèse visait à caractériser la dynamique de mise en place de la partie du transformasome en charge du transport de l'ADN exogène au travers de la membrane cytoplasmique chez S. Pneumoniae. Pour cela, j'ai principalement utilisé (et adapté au pneumocoque) des techniques de biologie cellulaire permettant de suivre par épifluorescence l'assemblage de ce pore d'entrée de l'ADN transformant dans des cellules vivantes. Ainsi, j'ai pu mettre en évidence un retard du processus de septation cellulaire lors du premier événement de division qui suit l'induction de la compétence. Pour localiser le pore d'entrée du transformasome, j'ai étudié la localisation de l'endonucléase membranaire EndA, en charge de la dégradation à l'extérieur de la cellule du brin complémentaire de l'ADN transformant internalisé. Contrairement à toutes les autres protéines du Transformasome, EndA est exprimée de manière constitutive. Mes résultats montrent que, d'une part, EndA localise de manière homogène dans la membrane des cellules non compétentes et, d'autre part, forme des foci dans les cellules compétentes. La formation des foci d'EndA est dépendante de la protéine membranaire ComEA du Transformasome, dont le rôle est de recevoir l'ADN double-brin exogène au niveau du pore pore d'entrée. Lorsque la capacité de transformation est maximale, EndA et ComEA sont préférentiellement localisées au niveau de la zone équatoriale des cellules. Par ailleurs, j'ai pu montrer que l'ADN transformant marqué par des fluorophores se concentre aussi principalement à la zone équatoriale des cellules compétentes. Dans l'ensemble, ce travail suggère que l'assemblage du pore d'entrée de l'ADN transformant chez S. Pneumoniae se ferait à la zone équatoriale des cellules compétentes. Chez B. Subtilis il a été montré que la fixation de l'ADN a lieu aux pôles des cellules compétentes. Ainsi, bien que les composantes des transformasomes de B. Subtilis et de S. Pneumoniae soient très conservées, il semble qu'une (ou des) caractéristique(s) propre(s) à ces deux espèces bactériennes déterminent le site d'assemblage du pore d'entrée de l'ADN transformasome dans la membrane
Natural genetic transformation is widely distributed in bacteria, allowing genetics exchange. Transformation requires a specialized membrane-associated complex which forms a DNA entry pore allowing internalization of exogenous single-stranded DNA (ssDNA). It also requires dedicated cytosolic proteins to integrate internalised ssDNA into the chromosome by homologous recombination. This complex, named DNA Transformasome, has been intensively studied in the human pathogen S. Pneumoniae and the soil bacteria B. Subtilis. The aim of my project was to characterize the membrane-associated complex in S. Pneumoniae. I adapted two complementary cellular biology methods. To identify physical links between Transformasome components, I developed a method to purify membrane complexes in S. Pneumoniae. Moreover, I performed fluorescence microscopy, which allows us to track and record individual bacterial cells of S. Pneumoniae upon competence induction. Using GFP (Green Fluorescent Protein) fused to a key division protein FtsZ, I demonstrated a delayed septation process in competent cells. To visualize the integration of components of the DNA entry pore, I focused on EndA. EndA is a sequence non-specific endonuclease bound to the membrane which is responsible for processing double-stranded DNA into single-stranded fragments that in turn enter the microbial cell. This nuclease has been identified only in the streptococcal system. Remarkably, EndA is the only known component of the DNA entry pore that is constitutively expressed in non-competent cells and is not induced in competence. I showed that EndA concentrates into localized foci upon competence induction. This specific localization depends on the presence of the DNA-receptor, ComEA. Moreover, EndA and ComEA appear preferentially located at midcell in cultures exhibiting optimal transformation efficiency. Similarly, binding of extracellular DNA was localized to the cell centre. Together, our results are consistent with a model in which the active entry pore for DNA transformation is located at the septum in pneumococcal cells. In contrast, it appears that the entire process of DNA transformation localizes at the cell poles in B. Subtilis. Although components of Transformasome are conserved between species, it appears that bacteria have adapted the transformation process according to their own physiology

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Marie, Solène. "Imagerie translationnelle pour la mise en évidence des répercussions pharmacocinétiques des transporteurs de médicaments Imaging Probes and Modalities for the Study of Solute Carrier O (SLCO)-Transport Function In Vivo Validation of Pharmacological Protocols for Targeted Inhibition of Canalicular MRP2 Activity in Hepatocytes Using [99mTc]mebrofenin Imaging in Rats." Thesis, université Paris-Saclay, 2020. http://www.theses.fr/2020UPASQ004.

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Abstract:

La distribution des médicaments du sang vers les tissus, où ils exercent leurs effets pharmacologiques et/ou toxiques, implique souvent des transporteurs qui régulent leur passage membranaire. Les transporteurs Organic Anion-Transporting Polypeptide (OATP), avec d’autres systèmes de transporteurs hépatocytaires, participent à l’élimination hépatique de nombreux médicaments. Certains OATPs ont été retrouvés dans d’autres organes où leurs répercussions pharmacocinétiques restent mal connues.L’objectif de ce travail a été de développer des approches d’imagerie originales permettant de mesurer sélectivement l’importance du transport OATP à l’interface sang-tissu. Tout d’abord, nous avons utilisé la [99mTc]mébrofénine, un radiopharmaceutique classiquement utilisé pour la scintigraphie hépatobiliaire. Chez le rat, nous avons validé un protocole d’inhibition pharmacologique ciblé, réalisable chez l’Homme, permettant de distinguer l’activité OATP sinusoïdale de l’activité d’excrétion biliaire, de manière non-invasive.Nous avons ensuite optimisé les méthodes d’analyse des images dynamiques TEP (tomographie par émission de positons) issues d’une nouvelle sonde substrat OATP, le [11C]glyburide, utilisée pour la première fois chez l’Homme. Une approche d’acquisition corps-entier dynamique nous a permis de quantifier l’activité OATP dans les tissus hépatiques et extra-hépatiques chez le primate puis chez l’Homme.L’imagerie translationnelle ouvre des perspectives d’études pharmacocinétiques originales, jusqu’alors inenvisageables chez l’Homme. Le développement de radiopharmaceutiques dédiés à la mesure de l’activité des transporteurs et l’optimisation de l’analyse des données d’imagerie qui en sont issues permettent d’en apprécier les répercussions fonctionnelles sur les étapes de distribution et d’élimination
Drug distribution from blood to tissues, where pharmacological and/or toxic effects occur, often involves transporters that control their passage across biological membranes. Organic-Anion Transporting Polypeptides (OATP), among other hepatocyte transporters, mediate the hepatic elimination of many drugs. Some OATPs are expressed in other organs where their impact for pharmacokinetics is unclear.The aim of this work was to develop original imaging methods to selectively measure the OATP-mediated transport at the blood-tissue interface. First, we used [99mTc]mebrofenin, a radiopharmaceutical routinely used for hepatobiliary scintigraphy. In rats, we validated a targeted pharmacological inhibition protocol, feasible in Humans, allowing to study the sinusoidal OATP activity apart from biliary excretion,in a non-invasive way.Then we optimized the analysis methods of PET (positron emission tomography) kinetics obtained using the new OATP-substrate probe [11C]glyburide, used for the first time in Humans. A whole-body dynamic acquisition method enabled quantitative determination of OATP function in the liver and other tissues in primate and in Humans.Translational imaging offers novel perspectives for original pharmacokinetic studies, that could not be envisioned in humans so far. Thanks to the development of radiopharmaceuticals to measure drug transporters activity and to the optimization of imaging data analysis, it is possible to study their functional impact on drug distribution and elimination at the tissue level in humans

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Paulet, Damien. "Variation d'hydrophobicité et structure secondaire des protéines transmembranaires." Thesis, Montpellier 1, 2010. http://www.theses.fr/2010MON13518/document.

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Abstract:

Contexte. Les protéines transmembranaires ont une importance considérable tant au niveau de la survie d'une cellule qu'au niveau de ces interactions avec les autres cellules. En raison de contraintes techniques, la cristallisation de ce type de protéine demeure très complexe, ce qui limite grandement l’exploration de leur structure. Pour contourner ces difficultés, différents outils de prédiction ont été développés,en se fondant originellement sur l'hydrophobicité des régions enfouies dans la membrane. Méthode. L'outil développé repose sur une dérivation de la moyenne d'hydrophobicité calculée sur deux ensembles de taille de fenêtres. Le premier ensemble (G1) contient des petites tailles de fenêtres ce qui correspond à des événements locaux, tandis que le second (G2) correspond à des tailles de fenêtres plus larges, adaptées à la taille des hélices formant certaines protéines transmembranaires. La variation d'hydrophobicité est obtenue en dérivant les moyennes d'hydrophobicité. Un consensus est établi pour chaque groupe, et les résultats sont comparés à un ensemble de protéines transmembranaires cristallisées. Résultats. Les variations d'hydrophobicité G2 sont liées aux extrémités des hélices transmembranaires,tandis que les variations G1 sont en relation avec la limites des structures et certaines irrégularités structurelles.Ces résultats nous ont amené à introduire une nouvelle notion : les unités transmembranaires(TMU). Les TMU consistent en un ensemble de sous-structures qui composent les structures transmembranaires
Background. Few high-resolution structures of integral membranes proteins are available, as crystallization of such proteins needs yet to overcome too many technical limitations. Nevertheless, prediction oftheir transmembrane (TM) structure by bioinformatics tools provides interesting insights on the topology of these proteins.Method. We describe here how to extract new information from the analysis of hydrophobicity variations or hydrophobic pulses (HPulses) in the sequence of integral membrane proteins using the Hydrophobic Pulse Predictor, a new tool we developed for this purpose. To analyze the primary sequence of 70 integralmembrane proteins we defined two levels of analysis : G1-HPulses for sliding windows of n=2 to 6 andG2-HPulses for sliding windows of n=12 to 16.Results. The G2-HPulse analysis of 541 transmembrane helices allowed the definition of the new conceptof transmembrane unit (TMU) that groups together transmembrane helices and segments with potentialadjacent structures. In addition, the G1-HPulse analysis identified helix irregularities that correspondedto kinks, partial helices or unannotated structural events. These irregularities could represent key dynamicelements that are alternatively activated depending on the channel status as illustrated by the crystalstructures of the lactose permease in different conformations. Our results open a new way in the understanding of transmembrane secondary structures : hydrophobicity through hydrophobic pulses stronglyimpacts on such embedded structures and is not confined to define the transmembrane status of aminoacids

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Buffet-Bataillon, Sylvie. "Relation épidémiologique et génétique entre la résistance aux antibiotiques et des concentrations minimales inhibitrices élevées d'Escherichia coli isolés de bactériémies vis-à-vis d'ammoniums quaternaires." Rennes 1, 2011. http://www.theses.fr/2011REN1B085.

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Abstract:

Les ammoniums quaternaires (AQs) sont utilisés comme conservateur, rentrant dans la composition des produits cosmétiques et pharmaceutiques. Ils sont également largement utilisés comme détergents-désinfectants. L’utilisation croissante des AQs pourrait être un des facteurs responsable de l’émergence de la multirésistance de souches bactériennes cliniques. Une étude prospective a été ainsi menée chez 153 patients atteints de bactériémies à Escherichia coli au CHU de Rennes. Cette étude a montré un lien épidémiologique entre des valeurs elevés de concentrations minimales inhibitrices (CMI) d’E. Coli aux AQs et la résistance aux antibiotiques (ATB). Secondairement, les mécanismes de co-résistance ont été étudié montrant l’implication cumulée des intégrons de classe 1, de la pompe d’efflux AcrAB-TolC et du régulon mar chez des souches d’E. Coli à la fois résistantes aux ATB et présentant des CMI élevées aux AQs. Une revue a enfin rapporté le rôle des AQs dans l’acquisition de la résistance aux antibiotiques. Il apparait important que ce mécanisme puisse être mis en évidence par les laboratoires de microbiologie
Quaternary ammonium compounds (QACs) are used as a preservative in the composition of cosmetics and pharmaceuticals products. They are also widely used as detergents, disinfectants. The increasing use of AQs may be one factor responsible for the emergence of multidrug resistance in clinical bacterial strains. A prospective study was conducted in 153 patients with Escherichia coli bacteremia at the University Hospital of Rennes. This study showed an epidemiological link between high values of minimum inhibitory concentrations (MIC) of QACs in E. Coli and resistance to antibiotics (ATB). Secondarily, the mechanisms of co-resistance has been studied showing the involvement of the Class 1 integrons, the AcrAB multi-drug efflux pump and mar regulon in E. Coli strains resistant to ATB and with high MICs of QACs. A review finally reported the role of QACs in the acquisition of antibiotic resistance. It appears important that this mechanism can be identified by microbiology laboratories

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Gubar, Olga. "Rôle de l'intersectin-1 au cours du trafic membranaire : identification de nouveaux partenaires moléculaires." Thesis, Strasbourg, 2013. http://www.theses.fr/2013STRAJ010/document.

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Abstract:

L’homéostasie cellulaire est intimement liée au trafic membranaire, processus dynamique qui permet les échanges de lipides et de protéines entre les compartiments cellulaires mais aussi entre la cellule et le milieu extracellulaire. L’intersectin-1 (ITSN1) est une protéine d’échafaudage multifonctionnelle, impliquée dans les processus d’endocytose, d’exocytose, diverses voies de signalisation ainsi que dans la survie cellulaire. L’ensemble de mes travaux de doctorat a permis d’identifier deux nouveaux partenaires de l’ITSN1, RhoU et l’OPHN1, et de montrer leur implication dans le trafic membranaire. De plus je démontre que les variants d’épissage de l’ITSN1 pourraient avoir une spécificité d’interactiondifférente vis-à-vis de ses partenaires. Nous montrons aussi que l’ITSN1 est capable de former des complexes entre ses différentes isoformes. Ainsi, l'ensemble de ces données apportent de nouvelles connaissances sur l’interactôme d’ITSN1
The cellular homeostasis is tightly linked to the membrane trafficking, a dynamic process which allows lipid and protein exchange between the cellular compartments as well as the cell and the environment. Intersectin1 (ITSN1) is a multifunctional scaffold protein implicated in the processes of endocytosis and exocytosis, different signaling pathways and cell survival. In present study I have identified two new partners of ITSN1, RhoU and OPHN1, and demonstrated their implication in membrane trafficking. Surprisingly, I have also found that the alternative splicing of ITSN1-L can lead to the change of the specificity of its interaction with binding partners. In addition, I have shown that different ITSN1 isoforms are capable to form complexes with each other. All together these data add new knowledge to ITSN1 interactome

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Seigneurin-Berny, Daphné. "Recherche de nouveaux systèmes de transport à travers l'enveloppe du chloroplaste : caractérisation de nouvelles protéines hydrophobes." Phd thesis, Université Joseph Fourier (Grenoble), 2000. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00181078.

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Abstract:

Le chloroplaste est un organite totalement intégré dans le métabolisme de la cellule végétale. Il possède des voies métaboliques qui lui sont propres comme la photosynthèse, la synthèse d'acides gras, la synthèse d'acides aminés. Le chloroplaste est limité par l'enveloppe, constituée de deux membranes distinctes et d'un espace intermembranaire. Par sa localisation, l'enveloppe du chloroplaste constitue un site privilégié de transport de métabolites, d'ions, de protéines et d'informations entre le stroma du chloroplaste et le cytosol de la cellule végétale. Ainsi, l'enveloppe doit renfermer de nombreux systèmes de transport permettant ces échanges. Malgré l'importance de ces transporteurs, très peu d'entre eux ont été totalement caractérisés. La limitation principale provient de la très faible représentation de ces protéines et de leur hydrophobicité. Afin de caractériser de nouveaux systèmes de transport, nous avons développé une nouvelle approche qui nous a permis d'identifier de nouvelles protéines. Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation fonctionnelle de ces protéines.
L'approche que nous avons développée repose sur le caractère hydrophobe des transporteurs qui permet de les solubiliser dans des mélanges de solvants organiques, comme le chloroforme/méthanol. Cette approche permet l'extraction de protéines hydrophobes et mineures de l'enveloppe, elle est spécifique de la localisation subcellulaire. D'autre part, suivant leur hydrophobicité, les protéines peuvent être extraites de façon différentielle en fonction des rapports de solvants organiques. Les protéines extraites sont séparées par électrophorèse en conditions dénaturantes, et analysées par microséquençage. Plusieurs protéines ont été identifiées dont les protéines IE16 et IE18.
Nous avons poursuivi la caractérisation fonctionnelle de IE16 et IE18 en analysant d'une part les homologies de séquences avec des protéines de fonction connue. D'autre part, nous avons obtenu des mutants de cyanobactéries et d'Arabidopsis thaliana dont les gènes correspondant aux protéines IE16 et IE18 ont été interrompus. L'analyse des phénotypes peut fournir des informations sur la fonction des protéines mutées. Notamment, la protéine IE18 pourrait être impliquée dans le transport des ions K+ et/ou H+. Afin d'effectuer des analyses biochimiques sur ces protéines, elles ont été exprimées dans des systèmes hétérologues. Ces protéines sont produites dans le système d'expression cellules d'insecte/baculovirus alors qu'aucune expression n'est détectée dans le système E. coli. Ces protéines forment des homodimères. Les analyses fonctionnelles par électrophysiologie sont en cours actuellement.
Lors des premiers séquençages des protéines extraites dans les solvants organiques, une séquence correspondant à une annexine a été obtenue. Nous avons poursuivi l'étude de cette protéine. Le sulfolipide, lipide spécifique du plaste, est un site à haute affinité permettant l'interaction de l'annexine avec l'enveloppe. L'annexine copurifie avec les chloroplastes et des vésicules d'enveloppe en présence de calcium. Cette protéine ne forme pas de canal ionique lorsqu'elle est insérée dans des bicouches lipidiques planes. Elle ne présente pas non plus d'activité péroxydase. La signification de son interaction avec l'enveloppe du chloroplaste reste à être déterminée.
L'approche que nous avons développée peut être utilisée de façon systématique pour l'étude des transports dans différents systèmes membranaires.

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Benba, Jamila. "Contribution à l'étude du système de transport des dicarboxylates des mitochondries; purification, caractérisation." Rouen, 1993. http://www.theses.fr/1993ROUES053.

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Abstract:

Le travail presenté dans ce mémoire a été entrepris dans le but de purifier et de caractériser le transporteur des dicarboxylates des mitochondries, qui catalyse l'échange un contre un des dicarboxylates entre eux (malate, malonate, succinate) ou contre le phosphate. Cette étude a été effectuée simultanément sur les mitochondries de foie de rat et sur les mitochondries d'une souche de levure: Saccharomyces cerevisiae. Les mitochondries de levure ont été solubilisées par le Triton X-100 et l'extrait a été chromatographié sur hydroxyapatite. Le filtrat, traité par électrophorèse en milieu dénaturant, a révélé par coloration à l'argent la présence d'environ 5 protéines de Mr compris entre 28000 et 35000. Après reconstitution de l'activité de transport dans des liposomes, un accroissement de 10 fois, de l'activité spécifique d'échange a été observé. Le passage des protéines du filtrat d'hydroxyapatite sur une colonne de malate deshydrogénase mitochondriale (EC 1. 1. 1. 37) immobilisée sur Sépharose, a conduit à la purification complète du transporteur. Cette protéine, purifiée à partir des deux types de mitochondries, possède toutes les propriétés caractéristiques du transporteur in situ et présente, en milieu dénaturant, un poids moléculaire de 28000. L'activité du transporteur purifié à partir des mitochondries de levure, reconstituée dans des liposomes, montre un Km pour le succinate de 2 mM et un Vmax de 1,5 lmol. Min-1. Mg-1 protéines tandis que l'activité spécifique augmente de 300 fois par rapport à l'extrait de départ. L'activité d'échange du transporteur reconstituée des deux types de mitochondries est inhibée par un réactif des groupements SH, le p-chloromercuriphénylsulfonate et par un réactif des acides aminés, le phosphate de pyridoxal, suggérant l'implication d'un ou plusieurs groupements SH et d'un ou plusieurs résidus lysine dans le mécanisme catalytique du transporteur. L'analyse de la composition en acides aminés de la protéine de transport des mitochondries de foie de rat indique qu'il s'agit d'une protéine hydrophobe, légèrement acide, avec la partie N-terminale bloquée

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Hovsepian, Junie. "L'arrestine Csr2/Art8 régule l'endocytose des transporteurs d'hexoses lors d'une carence en glucose chez Saccharomyces cerevisiae." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCC151/document.

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Abstract:

L’abondance des transporteurs présents au niveau de la membrane plasmique des cellules est régulée par leur endocytose, qui peut être déclenchée par des signaux nutritionnels. Chez la levure S. cerevisiae, l’endocytose des transporteurs requiert leur ubiquitylation par l’E3 ligase à domaine HECT nommée Rsp5, appartenant à la famille des protéines Nedd4. L’ubiquitine, conjuguée aux transporteurs, agit comme un signal déclenchant leur internalisation puis leur dégradation dans la vacuole (lysosome). L’activité de Rsp5 nécessite la présence de protéines adaptatrices de type arrestine, appelées ARTs (Arrestin-Related Trafficking adaptors). Ces ARTs participent à la spécificité du mécanisme d’endocytose en régulant l’activité de Rsp5 envers certains cargos dans des conditions physiologiques spécifiques. Au cours de ma thèse, j’ai étudié l’endocytose des transporteurs de glucose lors d’une carence en glucose chez S. cerevisiae. Cette levure possède de très nombreux transporteurs de glucose avec différentes affinités pour ce substrat. Cela lui permet de s’adapter à des variations importantes de la concentration de glucose dans son environnement. J’ai montré que les transporteurs à haute affinité pour le glucose sont dégradés par endocytose au cours de l’adaptation des cellules à un milieu dépourvu de glucose. Cette endocytose requiert la protéine ART nommée Csr2/Art8. J’ai mis en évidence la régulation transcriptionnelle et post-traductionnelle de Csr2 par le glucose. Mon travail a permis de montrer le rôle central de la kinase Snf1/AMPK dans la régulation de l’endocytose des transporteurs de source de carbone, en fonction de la disponibilité en glucose dans le milieu
Cells respond to environmental nutritional signals by regulating transporter availability at their plasma membrane. This adaptation first occurs trough the regulation of transporter gene expression. Nutritional signals also regulate the stability of transporters and their subcellular localization, which is controlled by trafficking events such as endocytosis. In S. cerevisiae, transporter endocytosis is a consequence of their ubiquitylation by the E3 ubiquitin ligase Rsp5, which belongs to the Nedd4 protein familly. Ubiquitin conjugates act as a molecular signal that triggers transporter internalization and degradation in the yeast lysosome. Rsp5 activity requires adaptor proteins called ART (Arrestin-related trafficking adaptors). ART proteins are involved in the specificity of the endocytosis process because they regulate Rsp5 activity towards specific cargoes in response to specific environmental cues. During my PhD, I studied glucose transporter endocytosis in response to glucose starvation in yeast. S. cerevisiae genome encodes many glucose transporters with different substrate affinities. This allows cells to adapt to a wide range of extracellular glucose concentrations. I showed that high affinity glucose transporters are internalized and degraded during cell adaptation to glucose-free medium. These endocytosis events require the ART protein Csr2/Art8. I highlighted the glucose-mediated transcriptional and post-translational regulation of Csr2. My work showed the central role of the Snf1/AMPK kinase in the regulation of carbon source transporter endocytosis according to glucose availability in the medium

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Ammar, Mohamed Raafet. "Rôle de la phospholipase D1 dans le trafic membranaire : implication dans le développement neuronal et l'exocytose régulée." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2013. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00998047.

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Abstract:

La croissance neuritique est un mécanisme complexe qui fait toujours l'objet d'intenses investigations. Les donnés actuelles ont permis de mettre en évidence l'implication de trois mécanismes principaux dans la croissance neuritique : i) la dynamique du cytosquelette, ii) le trafic intracellulaire et l'apport membranaire au niveau du cône de croissance et iii) la signalisation cellulaire, principalement via la voie MAPK-ERK1/2, qui abouti à la régulation de la transcription.La PLD1 et son produit l'acide phosphatidique semblent être au centre de voies majeures impliquées dans le développement neuronal. Mes travaux ont permis d'approfondir nos connaissances sur le rôle cellulaire de la PLD1 au cours de la croissance neuritique. J'ai montré que la PLD1 en collaboration avec la kinase RSK2 régule la fusion des vésicules positives pour Ti-VAMP/VAMP7 au cours de la croissance neuritique. D'autre part, j'ai établi que la PLD1 joue un rôle important dans le maintien de la signalisation endosomale de la voie MAPK-ERK1/2-RSK2-CREB induite par les neurotrophines. J'ai également montré que la PLD1 régule l'activation de mTOR/p70S6K en réponse au BDNF. La dérégulation des voies MAPK-ERK1/2 et mTOR/p70-S6K pourraient être à la base de la réduction de l'arborisation dendritique et de la maturation des épines dendritique observée dans les neurones corticaux Pld1-/- en culture. En plus de l'implication de RSK2 dans la régulation de la PLD1, j'ai également montré que la PLD1 régule l'activation de RSK2 en réponse aux neurotrophines, probablement via une boucle de rétrocontrôle. Ainsi les donnés obtenus suggèrent un lien fort entre les deux protéines au cours du développement neuronal. A la lumière de ces donnés, un dysfonctionnement de ce mécanisme pourrait expliquer le retard mental observé chez les patients atteints du syndrome de Coffin-Lowry causé par la perte de l'activité kinase de RSK2. D'autre part, les résultats obtenus suggerent un rôle de la PLD1 dans l'exocytose des vésicules.

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Chirivino, Dafne. "Rôle de l’ezrine dans l’endocytose et la stabilité des récepteurs de type tyrosine kinase." Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA112281.

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Abstract:

L’ezrine appartient à la famille des protéines ERM. Ces protéines assurent la liaison entre la membrane plasmique et le cytosquelette d’actine. L’ezrine est impliquée dans le trafic de protéines membranaires, cependant sa fonction dans ce processus n’est pas connue à ce jour. Des cribles doubles hybrides utilisant l’ezrine comme appât ont permis l’identification de protéines impliquées dans le transport de protéines membranaires. Nous avons étudié la fonction de l’interaction de l’ezrine avec la sous unité Vps11 du complex HOPS et WWP1, une ubiquitine ligase de type E3. Le complexe HOPS orchestre la fusion de compartiments intracellulaires car il coordonne les activités des protéines Rab et SNARE. Nous avons étudié comment l’interaction de l’ezrine avec Vps11 régule le transport du récepteur de l’EGF vers la voie de dégradation par les lysosomes. Nous avons montré que cette interaction promeut la maturation des endosomes et qu’elle est nécessaire au transport du récepteur à l’EGF des endosomes précoces aux tardifs ainsi participant à la régulation de la dégradation du récepteur à l’EGF. WWP1 a été impliquée dans la régulation et la dégradation des récepteurs aux facteurs de croissance ainsi que des facteurs de transcription. Nous avons montré que l’interaction entre l’ezrine et WWP1 induit l’ubiquitylation de l’ezrine sans toutefois entraîner sa dégradation. Nous avons montré que l’interaction de l’ezrine avec WWP1 stabilise le récepteur c-Met. Nos résultats indiquent que l’ezrine participe au contrôle de la dégradation des récepteurs de type tyrosine kinase en régulant l’assemblage de complexes multiprotéiques impliqués dans le transport et l’ubiquitylation des protéines
Ezrin is a member of the ERM protein family, which provides a regulated linkage between the plasma membrane and the actin cytoskeleton. Ezrin has been involved in the trafficking of membrane proteins however its function in this process is as of yet unknown. Two-hybrid screens performed with ezrin as baits led to the identification of proteins involved in membrane protein transport. We analyzed the function of ezrin association with two new interactors: the HOPS complex subunit Vps11 and the E3 ubiquitin ligase WWP1. Vps11 is a member of the tethering HOPS complex that coordinates Rab and SNARE functions during vesicular fusion along the endocytic pathway. We have investigated the role of ezrin/Vps11 interaction in the endocytosis of the EGF receptor. We have shown that the interaction between ezrin and the HOPS complex promotes endosome maturation and is necessary for EGF receptor transport from early to late endosomes, therefore participating in the regulation of EGFR endocytosis and degradation. WWP1 is an E3 ubiquitin ligase of the Nedd4 family. A role for WWP1 was identified in the regulation and degradation of growth factors receptors and transcription factors. We have shown that Ezrin/WWP1 interaction results in ezrin ubiquitylation, but is not involved in regulating ezrin degradation. Rather, we were able to show that this ubiquitylation likely mediates protein interaction and that the binding between ezrin and WWP1 promotes c-Met receptor stabilization. Altogether our results indicate that ezrin participates in the control of tyrosine kinase receptor degradation by regulating the assembly of multimeric complexes involved in protein trafficking and ubiquitylation

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Wang, Guan. "Roles of substrate rigidity and composition in membrane trafficking." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC195.

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Abstract:

Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer
From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

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Ferrand, Michel. "Etude des mouvements internes de la bactériorhodopsine par diffusion inélastique de neutrons et simulation de dynamique moléculaire." Grenoble 1, 1991. http://www.theses.fr/1991GRE10160.

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Abstract:

La bacteriorhodopsine (br), seule proteine de la membrane pourpre (pm) d'halobacterium halobium fonctionne comme une pompe a protons activee par la lumiere. Consecutivement a l'absorption de photons se produit l'isomerisation d'un pigment (retinal) lie de maniere covalente a celle-ci. Des transitions conformationnelles de la proteine accompagnent cette isomerisation, lesquelles sont absolument necessaires pour son activite. Dans la membrane pourpre, br et lipides sont organises dans un reseau bi-dimensionnel hautement ordonne. La fonction est gravement alteree lors du piegeage a froid de la pm ou lors de l'assechement de celle-ci. Dans les deux cas une contraction de la maille du reseau cristallin de la pm survient. L'etude experimentale in situ du comportement dynamique de la br, par diffusion inelastique de neutrons, en fonction des deux parametres influencant l'activite, a savoir hydratation et temperature, a etabli la correlation existant entre la fonction de la br et les mouvements internes qui l'animent. Les observations ont ete realisees dans une fenetre en frequences s'etendant de 0 a 200 cm##1, correspondant aux mouvements thermiquement excites a temperature ambiante. La proteine est uniquement fonctionnelle pour des conditions d'environnement permettant des mouvements a caractere anharmonique de grande amplitude. En effet, et ce pour les seuls echantillons pleinement hydrates, une transition dynamique apparait aux alentours de 240 k, temoignant du passage d'un regime harmonique a anharmonique du systeme membranaire. Des mesures du deplacement carre moyen des atomes d'hydrogene, des densites d'etats vibrationnels et de la composante quasi-elastique a la diffusion sont toutes coherentes avec cette observation. Plus haut en temperature (260 k), et toujours pour les seules membranes hydratees, nous avons egalement detecte un deplacement vers les basses frequences (20 cm##1>14 cm##1) de la caracteristique spectrale principale, pouvant etre attribue a un amortissement de ces modes en raison d'un frottement visqueux, ou encore a des modifications de la dynamique intrinseque du systeme en raison de changements dans sa surface d'energie potentielle. Une simulation de dynamique moleculaire (t=300 k) a ete engagee pour rendre compte de ces effets. A cette temperature, l'anharmonicite semblerait provenir de mouvements diffusifs resultant de la potentialite de certaines helices- de la proteine a echantillonner un espace conformationnel assez large autour de leur position d'equilibre. Les elements de structure secondaire concernes encadrent le chromophore (retinal) et coincident avec ceux pour lesquels des etudes prealables par d'autres auteurs ont etabli des changements structuraux au cours de l'accomplissement de la fonction

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HAJEM, SAID. "Etude epidemiologique du transport ionique membranaire." Paris 11, 1990. http://www.theses.fr/1990PA11T012.

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Cescau, Sandra. "Sécrétion de l'hémophore HasA de Serratia marcescens via un transporteur ABC." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077213.

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Abstract:

Chez les bactéries à Gram négatif, la voie de sécrétion ABC (T1SS) permet l'export de protéines présentant un signal de sécrétion C-terminal non clivable. Les transporteurs sont constitués de 3 protéines membranaires : une ATPase de la famille largement répandue des protéines ABC, une deuxième protéine de membrane interne et une protéine de membrane externe de la famille de TolC. TolC participe également aux pompes d'efflux de détergents et d'antibiotiques, les T1SS et les pompes d'efflux co-exprimés se partageant TolC sans perte de fonctionnalité. Le complexe de sécrétion n'est pas associé de façon permanente. Sa formation est induite par l'interaction entre le signal de sécrétion et la protéine ABC. L'oligomérisation du transporteur a été étudié par des approches biochimiques : chromatographie d'affinité et pontage chimique. Les mécanismes moléculaires permettant l'association et la dissociation du transporteur sont inconnus. Lors de ces travaux, le T1SS modèle utilisé est celui de l'hémophore HasA de S. Marcescens. Nous avons montré que HasA dépourvu de son signal C-terminal induit une oligomérisation stable du transporteur, séquestrant la protéine TolC. La pénurie de molécules TolC disponibles pour l'association aux pompes d'efflux entraîne une sensibilité accrue au SDS. L'hyperproduction de la protéine TolC réverse le phénotype de sensibilité. L'expression du signal de sécrétion sous forme de polypeptide distinct restaure aussi la résistance montrant que le signal C-terminal est actif de façon intermoléculaire. Ainsi, l'hémophore a deux domaines d'interaction avec la protéine ABC : le signal C- terminal et un 2eme domaine dit domaine d'ancrage
The Type I secretion System makes it possible the Gram negative bacteria to export proteins presenting an uncleaved C-terminal secretion signal. The transporter are constituted of 3 proteins: a membrane ATPase of the large family of ABC proteins, a second cytoplasmic membrane protein and an outer membrane protein belonging to TolC family. TolC is multifunctional. It participates also to efflux pump which expulse detergents and antibiotics. When they are co-expressed, T1SS and efflux pump share TolC without lost of functionality. The secretion complex is not permanently associated. Its formation is induced by the interaction between the secretion signal and the ABC protein. The oligomerisation of the transporter has been studied by several biochemical approaches: affinity chromatography and cross-linking. Th molecular mechanisms of the association-dissociation of the transporter are unknown. During this work, the model studied was the T1SS of the HasA hemophore of S. Marcescens. We have shown that Has deleted for its C-terminal secretion signal induced a stable oligomerisation of the transporter, trapping TolC proteins. The unavailability of TolC molecules for the efflux pump involved a increased SDS sensitivity. The hyperproduction of the TolC protein reversed this phenotype. The expression of the secretion signal as a single molecule also restored the resistance This suggests that the secretion signal is active in an intermolecular manner. Thus, the hemophore presents 2 interaction domains with the ABC protein: the secretion signal and a second site name the anchoring domain

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Kurauskas, Vilius. "Fonction d'une protéine membranaire : étude structurale et dynamique par RMN." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017GREAV005/document.

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Abstract:

L’utilisation de détergents est inévitable pour les études structurales des protéines membranaires. Dodecylphosphocholine (DPC) est un des détergents les plus utilisés pour ce type d’études employant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. L’effet des détergents sur la structure et la dynamique des macromolécules est une problématique importante, mais peu étudiée à ce jour. Dans cette étude nous avons caractérisé la dynamique à l’échelle de la milliseconde, la liaison des substrats ainsi que des propriétés structurales de trois protéines membranaires différentes solubilisées dans des micelles de DPC. Ces protéines font partie de la famille des transporteurs mitochondriaux et nous avons choisi les séquences de la levure (ORC1, GGC1, AAC3). Nous avons détecté de la dynamique à l’échelle de la milliseconde qui est distribuée d’une manière asymétrique à travers la structure. En contradiction avec des propos de la littérature, nous montrons que cette dynamique n’est pas corrélée à la fonction, puisqu’elle n’est pas modifiée par des mutations qui inhibent le transport effectué par ces protéines quand elles sont reconstituées dans des liposomes. En plus, nous avons pu montrer que leur spécificité par rapport aux substrats, n’est pas conservée quand ces transporteurs sont reconstitués dans du DPC, mettant en question leur fonctionnalité dans ce détergent. La RMN a aussi permis de démontrer que les structures tertiaire et secondaire sont perturbées dans les micelles avec quelques hélices transmembranaires apparaissant exposées au solvant. Nous avons donc conclu que la présence du détergent a un effet fort sur les trois transporteurs mitochondriaux de notre étude et probablement d’autres protéines similaires, en les rendant très flexible. Nos résultats indiquent un probable effet général de ce détergent sur les protéines membranaires, comme nous le discutons dans une analyse détaillée de quelques études de protéines membranaires décrites dans la littérature. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons adressé une question fondamentale de la dynamique des protéines: comment se comportent les protéines dans des cristaux ? Nous avons étudié la dynamique de l’ubiquitine cristalline à l’échelle de la milliseconde afin de comprendre l’influence de la maille cristalline sur ce type de mouvement. Pour ce faire, nous avons employé la RMN à l’état solide et des simulations de dynamique moléculaire de la protéine dans différents réseaux cristallins distincts. Il est intéressant à noter que dans ces cristaux on détecte toujours des processus locaux d’échange dynamique sur une échelle de temps de la milliseconde. Cependant, en comparant les résultats obtenus avec différentes formes cristallines, nous constatons que les paramètres thermodynamiques des différents états en échange et les vitesses d’interconversion entre ces dernières sont significativement modifiés par les contacts cristallins. De plus, nous avons détecté des mouvements globaux de type «rocking» des ces molécules à l’état cristallin qui surviennent également à l’échelle de la milliseconde. Ceci suggère que les mouvements globaux et locaux sont corrélés. Cette observation ouvre la discussion de l’importance de ce type de mouvements pour la qualité et l’interprétation des données des expériences de diffraction des rayons-X
The use of detergents is often unavoidable in the structural studies of membrane proteins. Dodecylphosphocholine (DPC) is one of the most commonly used detergents for such studies in solution state NMR spectroscopy. The effect of detergent on structure and dynamics remains an important and poorly understood question. In this study we have investigated millisecond dynamics, substrate binding and structural features of three different yeast proteins from mitochondrial carrier family (GGC1, ORC1 and AAC3) in DPC micelles. We have detected millisecond dynamics, which are asymmetrically distributed across the structure. Contrary to previous claims, we show that these dynamics are unrelated to function, as they are not affected by the substitutions which abolish mitochondrial carrier transport in proteoliposomes. Furthermore, we could show that the very well-defined substrate specificity of these proteins in membranes is abolished when they are reconstituted in DPC, questioning their functionality. Structural investigations have revealed that both tertiary and secondary structures of these carriers are perturbed in DPC micelles, with some TM helices showing substantial solvent exposure. We have concluded from these observations that DPC detergent strongly perturbs these, and likely other mitochondrial carriers by rendering them very flexible. Our findings point to a possibly general effect of this detergent on membrane proteins, as we discuss with examples of previously studied membrane proteins. In the second part we have addressed a fundamental question of protein dynamics: how do proteins move inside crystals? We have investigated ms dynamics in a crystalline ubiquitin to gain the insight on the impact of the crystalline lattice on such motions, using solid-state NMR and ms long MD simulations of explicit crystal arrangements. Interestingly a local dynamic exchange process on a ms time scale is still present in crystals. However, by comparing different crystal forms we establish that the thermodynamics of the exchanging states and their interconversion rate constants are significantly altered by the crystal contacts. Furthermore, we detect overall "rocking" motion of molecules in the crystal, occurring on a tens-of-ms time scale, and provide evidence that overall and local motion are coupled. We discuss the implications of ms dynamics on the data quality in X-ray diffraction experiments

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Adrien, Vladimir. "Diffusion des lipides et interaction protéine-protéine dans des membranes modèles." Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCB033.

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Les membranes biologiques, qui compartimentent les différents éléments du vivant, jouent un rôle essentiel dans les processus biologiques comme la signalisation, le transport, la transmission du message nerveux, etc. Envisagées comme des fluides à deux dimensions, l’étude de leurs propriétés physiques peut nous aider à comprendre certains mécanismes biologiques. Ce travail de thèse s’est intéressé à la mobilité des molécules au sein des membranes, et notamment à deux paramètres essentiels, la viscosité membranaire, et la diffusion latérale. Après avoir optimisé la technique de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) au microscope confocal, nous avons étudié la mobilité des molécules au sein de deux types de membranes modèles in vitro : la phase éponge d’un surfactant non-ionique (C12E5) et les vésicules géantes unilamellaires (GUVs) lipidiques. 1) La phase éponge (ou L3) : après avoir déterminé son diagramme de phase et montré que les protéines membranaires restent actives dans cette phase, nous avons mesuré la mobilité de protéines par recouvrement de fluorescence après photoblanchiment sur un motif à franges (FRAPP). Cela nous a permis d’obtenir les constantes d’association de protéines de la pompe d’efflux OprM-MexAB, impliquée dans la résistance aux antibiotiques de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ces interactions dépendent très fortement du degré de confinement de chacune des protéines. 2) Les GUVs : après avoir développé une méthode simple de formation des GUVs, au sein desquelles les protéines membranaires restent actives, nous avons mesuré la diffusion des lipides par FRAP, et montré que dans certaines conditions, ils se déplacent en groupe, ce qui permet d’expliquer la diversité des résultats de la littérature. En mesurant la viscosité membranaire par imagerie microscopique du temps de vie de fluorescence (FLIM), nous avons également montré qu’elle ne se déduit pas nécessairement des modèles hydrodynamiques de diffusion
Biological membranes, which divide the elements of life, are a key factor in biological processes such as signaling, transport, transmission of an nerve impulse, etc. Seen as two-dimensional fluids, the study of their physical properties could help us understand some unsolved biological mechanisms. This work focused on molecule mobility within membranes, and specifically on two essential parameters: membrane viscosity and lateral diffusion. After optimizing the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) technique on confocal microscopes, we studied the mobility of molecules within two types of in vitro model membranes: the sponge phase made of a non-ionic surfactant (C12E5) and the giant unilamellar lipidic vesicles (GUVs). 1) Sponge phase (or L3) : after having established its phase diagram and shown that membrane proteins stay active in this phase, we measured protein mobility by Fluorescence Recovery After fringe Pattern Photobleaching (FRAPP). This allowed us to obtain the association constants of the proteins of the efflux pump OprM-MexAB involved in the resistance to antibiotics of the bacteria Pseudomonas aeruginosa. These interactions heavily depend on the degree of confinement of each protein. 2) GUVs : after having developed a simple method for the formation of GUVs, in which membrane proteins stay active, we measured the lipid diffusion by FRAP. We showed that, under certain conditions, they can move together, which explains the diversity of results in the literature. By measuring membrane viscosity by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), we also showed that viscosity should not be necessarily deduced from hydrodynamic diffusion models

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Miroux, Bruno. "Analyse de la structure secondaire d'une protéine membranaire mitochondriale la protéine découplante du tissu adipeux brun." Paris 11, 1993. http://www.theses.fr/1993PA11T018.

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Cointry, Virginia. "Biochemical characterization of the IRT1 transporter and of its regulatory mechanism." Thesis, université Paris-Saclay, 2021. http://www.theses.fr/2021UPASB019.

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Le fer est un nutriment clé pour tous les organismes vivants et il est impliqué dans de nombreux processus cellulaires. Bien qu'il soit l'un des éléments les plus abondants sur terre, le fer est souvent indisponible car il précipite dans le sol, formant des complexes insolubles. Les plantes absorbent le fer du sol à travers les cellules épidermiques de la racine en utilisant le transporteur de fer IRT1 qui appartient à la famille de transporteurs ZIP largement répandue. Outre le fer, l'IRT1 peut également transporter des métaux non ferreux (Zn, Mn, Co et Cd), que nous appelons également les substrats secondaires. Notre équipe a récemment montré que l'IRT1 agit comme un transcepteur, détectant directement les métaux non ferreux à l'aide d'un motif riche en histidine dans une boucle intracellulaire non structurée (Dubeaux et al., 2018). Brièvement, sous un excès de métal non ferreux, les métaux se lient aux histidines recrutant la kinase CIPK23. La phosphorylation, à son tour, permet le recrutement de la ligase IDF1 E3 qui ubiquitine IRT1 et la cible pour la dégradation par la voie endocytique. À ce jour, nous en savons encore très peu sur les caractéristiques structurelles de l'IRT1, ses mécanismes de transport, la base de la sélectivité de transport de l'IRT1 et les mécanismes moléculaires à l'origine des événements de régulation tels que le recrutement de la kinase CIPK23. Un tel écart existe pour toutes les ZIP eucaryotes. Au cours de ce travail, nous avons initié des étapes cruciales pour réaliser la caractérisation biochimique de cette protéine. Ici, nous sommes les premiers à rapporter avoir établi un protocole optimisé pour l'expression hétérologue, la solubilisation et la purification d'une protéine variante IRT1 dans les cellules de levure. En outre, nous avons déterminé une procédure technique pour l'étude du transporteur IRT1 dans les protéoliposomes. Les deux approches techniques rapportées ici ont jeté les bases de l'avenir de la caractérisation structurelle et mécanique de l'IRT1 et des ZIP eucaryotes en général. L'échantillon généré par notre protocole a abouti à une qualité suffisante pour la caractérisation préliminaire de la structure par microscopie électronique cryogénique en collaboration avec nos collaborateurs. De plus, nous avons pu étudier les propriétés oligomères de l'IRT1 in vitro, en soumettant l'échantillon pur à une chromatographie d'exclusion de taille couplée par fluorescence et à une ultracentrifugation analytique, et par des techniques in vivo telles que la co-immunoprécipitation et la complémentation de fluorescence bimoléculaire. En outre, nous avons étudié la nature du mécanisme moléculaire induit par la liaison du métal sur la boucle de l'IRT1. Nous avons déterminé par dichroïsme circulaire et RMN l'absence de structure tridimensionnelle sur ladite partie de la protéine, même en présence des substrats secondaires qui déclenchent la voie régulatrice de l'IRT1. Nous fournissons ici, des preuves supplémentaires de la liaison des métaux sur la boucle de l'histidine, ainsi qu'une quantification de cette interaction in vitro. De plus, nous avons déduit le rôle d'un résidu d'acide aspartique, également présent dans la boucle de régulation, qui semble avoir un rôle majeur dans la stabilité structurelle de l'IRT1, mais aucun sur la liaison directe du métal
Iron is a key nutrient for all living organisms and it is involved in many cellular processes. Despite being one of the most abundant elements on earth, iron often is unavailable because it precipitates in soil, forming insoluble complexes. Plants take up iron from the soil through the epidermic cells of the root using the IRT1 iron transporter that belongs to the widely distributed ZIP family of transporters. Aside from iron, IRT1 can also transport non-iron metals (Zn, Mn, Co and Cd), which we also refer to as the secondary substrates. It was recently shown by our team that IRT1 acts as a transceptor, directly sensing non-iron metals using a histidine-rich stretch in an unstructured intracellular loop (Dubeaux et al., 2018). Shortly, under non-iron metal excess, metals bind to the histidines recruiting the CIPK23 kinase. Phosphorylation, in turn, allows the recruitment of the IDF1 E3 ligase that ubiquitinates IRT1 and targets it for degradation through the endocytic pathway. To date, we still know very little about the structural characteristics of IRT1, its transport mechanisms, the basis of IRT1 transport selectivity and the molecular mechanisms driving regulation events such as the recruitment of the CIPK23 kinase. Such a gap exist for all the eukaryotic ZIPs. During the course of this work, we initiated crucial steps for achieving the biochemical characterization of this protein. Here, we are the first to report having established an optimized protocol for the heterologous expression, solubilization and purification of an IRT1 variant protein in yeast cells. Also, we determined a technical procedure for the study of the IRT1 transporter in proteoliposomes. Both technical approaches reported here set ground in the future of the structural and mechanical characterization of IRT1, and eukaryotic ZIPs in general. The sample generated by our protocol resulted in a quality enough for preliminary characterization of the structure by cryogenic electron microscopy together with our collaborators. Additionally, we were able to investigate the oligomeric properties of IRT1 in vitro, by subjecting the pure sample to fluorescent coupled size exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation, and by in vivo techniques such as co-immunoprecipitation and bimolecular fluorescence complementation. Furthermore, we investigated the nature of the molecular mechanism driven by metal binding on the loop of IRT1. We determined by circular dichroism and NMR the absence of tridimensional structure on said portion of the protein, even in presence of the secondary substrates that trigger the regulatory path of IRT1. We provide here, further evidence of metal binding on the histidine loop, as well as a quantification of this interaction in vitro. Additionally, we inferred on the role of an aspartic acid residue, present in the regulatory loop as well, which appears to have a major role in the structural stability of IRT1, but none on the direct metal binding

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Noureddine, Hiba. "Etude de l'association entre l'acétylcholinestérase et sa protéine d'ancrage membranaire "PRiMA"." Paris 5, 2008. http://www.theses.fr/2008PA05T009.

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Abstract:

Le système nerveux et les muscles des mammifères expriment le variant T de l'acétylcholinestérase (AChET), associé à des protéines d'ancrage ColQ et PRiMA produisant respectivement des formes avec des queues collagéniques et des tétramères membranaires. Les formes collagéniques sont ancrés dans la lame basale de la jonction neuro-musculaire, tandis que les tétramères membranaires sont ancrés à la surface cellulaire par le domaine transmembranaire de PRiMA. Les tétramères membranaires constituent la forme majoritaire de l'enzyme dans le cerveau. L'association de l'AChET avec ColQ a été bien étudiée : elle est basée sur l'interaction de 4 peptides t avec un motif riche en pralines, appelé PRAD ("Proline-Rich Attachment Domain"), localisé dans la région N-terminale de ColQ. L'association de l'AChET avec PRiMA paraît similaire puisque cette protéine transmembranaire contient aussi un PRAD, mais qui est significativement différent par le nombre de pralines (8 dans ColQ, 14 dans PRiMA) et par le nombre et positions des cystéines qui peuvent former des ponts disulfures avec les cystéines C-terminales des peptides t. Donc, nous avons analysé l'association de l'AChET avec PRiMA. En effectuant des délétions et des mutations dans PRiMA, nous avons défini un motif peptidique, suffisant pour l'interaction avec les sous-unités AChET
The nervous tissue and muscles of mammals express the T splice variant of acetylcholinesterase (ACHET), associatied with anchoring proteins, ColQ and PRiMA, producing respectively collagen-tailed forms and membrane-bound tetramers. These interactions are important since they condition the functional anchoring of AChE in cholinergic tissues. The collagen-tailed forms are inserted in the basal lamina at neuromuscular junction, while the membrane-bound tetramers are anchored at the cell surface through the transmembrane domain of PRiMA. The membrane-bound tetramers represent the major enzyme species in the brain. The association of AChEr subunits with ColQ has been extensively studied : it is based on an tight interaction between four t peptides and a praline-rich motif, called PRAD ("Proline-Rich Attachment Domain"), located in the N-terminal region of ColQ. The association of AChEj subunits with PRiMA appears similar because this transmembrane protein also contains a proline-rich motif, but there are significant differences in the number of pralines (8 in ColQ, 14 in PRiMA) and in the number and positions of cysteines that might form intercatenary disulfide bonds with the cysteine located near the C-terminus of the t peptides. Therefore, we have undertaken an analysis of the association of AChET with PRiMA. Using deletions and point mutations in PRiMA, we defined a minimal motif in PRiMA, which could associate with AChEr subunits

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Dissertations / Theses on the topic 'Protéine de transport membranaire'

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