Academic literature on the topic 'Piastrinopenia'

La malattia MYH9-correlata è una rara sindrome genetica caratterizzata da piastrinopenia congenita associata al rischio di sviluppare, durante l’infanzia o l’età adulta, ipoacusia neurosensoriale, nefropatia e cataratta presenile ad andamento evolutivo. Furono inclusi in uno studio retrospettivo tutti i casi con sordità da severa a profonda arruolati consecutivamente nel Registro Italiano dei pazienti affetti da malattia MYH9-correlata. La popolazione esaminata coinvolse 147 pazienti Italiani con malattia MYH9-correlata: l’ipoacusia fu identificata nel 52% dei casi e solo 4 pazienti (6%) presentarono un quadro di sordità da severa a profonda all’età media di 33 anni. In tutti i 4 pazienti, la sordità fu associata ad un lieve sanguinamento spontaneo e in 3 pazienti fu accompagnata da un coinvolgimento renale. L’impianto cocleare fu eseguito in 3 casi, con beneficio, in assenza di complicanze maggiori. La diagnosi di malattia MYH9-correlata fu eseguita circa 28 anni dopo la prima manifestazione clinica della malattia che non fu mai sospettata da un otorinolaringoiatra. Saranno discussi gli aspetti clinici e diagnostici di 4 pazienti con sordità da severa a profonda affetti da malattia MYH)-correlata, focalizzando anche le implicazioni terapeutiche.

Summary Treatment of patients affected by metastatic gastric cancer with low performance status (PS) is a very hard choice. It is mandatory to define a very well-tolerated schedule to be employed in these subgroup of patients. Patients and Methods From June 1999 to December 2001, 21 patients (pts) affected by metastatic gastric cancer with low performance status (≥2 ECOG) were treated with bimonthly “de Gramont” schedule. Treatment was planned to perform 6 courses of chemotherapy for each patient plus other 2-4 if a response had been documented. Results A total of 161 courses of de Gramont schedule was administered to the 21 pts enrolled. We observed 8 PD (38%), 8 SD (38%), 5 objective responses (24% – 2 MR, 3 PR). Duration of objective responses (OR) was 5 months, 3 months for 3 PRs and 2 and 1 months for two MRs respectively. At time of observation (June 2002) median overall survival (OS) was 14 months, median survival from the starting de Gramont schedule was 8 months. Toxicity was very mild: grade 3 leukopenia in 1 pt, grade 1-2 anemia and piastrinopenia in 3 pts, grade 1-2 nausea vomiting in 5 pts, grade 1 diarrhea in 4 pts, grade 3 mucositis in 2 pts. No other side effect was renowned. PS ameliorated in 12 (57%) pts, even if a major response was not noted. Conclusions de Gramont schedule can be safely and effectively employed in metastatic gastric cancer pts with very low performance status.

15179 Background: To date, gemcitabine (GEM) remains the cornerstone of chemotherapy (CHT) for APC. According to GERCOR and GISCAD phase III trials the combination of GEM and oxaliplatin (GEMOX) has proven superior to GEM alone in terms of response rate (RR), time to progression (TTP) and clinical benefit rate (CBR). Methods: We conducted a retrospective analysis on 19 patients (pts) affected with histologically-confirmed APC, in order to determine the impact of GEMOX as first-line chemotherapy in terms of objective responses (OR) and TTP, using the Kaplan-Meier method. Among the 19 pts considered there were 15 males and 4 females (median age at diagnosis of 60.84 yrs; ECOG 0–2). The staging, according to AJCC criteria, was: IIB in 1 case, III in 5 cases and IV in the 13 remaning cases. The only metastatic site was the liver (in 13/19 pts). Ten of the 19 pts underwent surgical treatment prior to CHT: 2 radically resected (R0) subsequently treated with GEMOX after recurrence, 4 with positive margins (R1) and 4 surgically palliated. All pts received GEM 1000 mg/m2/d1 + oxaliplatin 100 mg/m2/d2 every 2 weeks. The median number of cycles was 5.89. Results: Among the 19 pts, 3 had a partial response (PR, 15.69%), 6 had stable disease (SD, 31.57%); no complete response was observed and 10 pts had progressive disease (PD, 52.63%). The overall disease control rate (DCR: PR + SD) was 47.37% while the OR were 15.69%. The median survival observed was 9.03 months (95% C.I. 5.15–12.91) and the median TTP was 6.13 months (95% C.I. 2.81–9.46). The main toxicities were: leucopenia, piastrinopenia, diarrhoea, nausea, fever and peripheral neuropathy; 3 pts discontinued the treatment due to grade 3–4 neurotoxicity. Conclusions: In our experience GEMOX gives an improved control of APC in terms of OR and TTP, with acceptable toxicity. The OS is in accordance to literature as well as the other data. No significant financial relationships to disclose.

Abstract Indolent Non-follicular non-Hodgkin Lymphoma (NFo-NHL) is a group of relatively frequent lymphoproliferative diseases, nevertheless extended clinical and prognostic studies are still lacking. In 2002 the Gruppo Italiano Studio Linfomi (GISL) initiated a LL02 prospective multicenter phase II trial, with the aim to evaluate the efficacy and safety of FC combination in the first-line therapy of NFo-NHL patients younger than 70 years. Between July 2002 and September 2006, 58 adult patients (35 males and 23 females, median age 64 yrs, range 40–75) affected by NFo-NHL in active disease phase, were consecutively enrolled in 12 GISL Hematological Centres. Patients were treated with a dose of 25 mg/mq Fludarabine plus 250 mg/mq Cyclophosphamide administred intravenously daily for 3 days; each cycle was repeated every 28 days for 6 courses. During the treatment patients received oral thrimethoprim-sulphametoxazole prophylaxis. After the intermediate evaluation, 48/58 patients (82.8%) had an objective response (ORR) with a 20.7% of complete remission (CR) plus 62.1% of partial remission (PR); at the final evaluation the ORR percentage was 84.5% with a 41.4% of CR (24 pts) and 43.1% of PR (25 pts); three patients were in progressive disease (5.2%) and one in stable disease (1.7%). The median overall survival (OS) was not reached with an 88% and 84% at 12 and 24 months; the progression free survival (PFS) was 89% and 77% and the event free survival (EFS) was 81% and 66% at 12 and 24 months respectively.About the toxicity profile, the major toxicity was hematological with a 18% cases of WHO grade III or IV anemia, 40% leucopenia, 33% neutropenia and 10% piastrinopenia. The 12% of patients had an infective episode wich a 7.7% of WHO grade III–IV.In conclusion the FC chemotherapy is a useful chance for advanced untreated non follicular low-grade NHL, with an optimal ORR, CR and PFS. The crucial point of FC remains OS, that not seems to be significantly improved in comparison with fludarabine alone or with standard therapy, even though the better quality of responses; Rituximab plus FC association is growing in literature as the probably key to find a real improvement also in this aspect.

2012 Background: Bevacizumab (BV) has shown a promising activity in recurrent malignant gliomas (MG) in combination with irinotecan. Few data are available on the combination of bevacizumab and nitrosoureas, that represent the standard cytotoxic option at recurrence. Methods: In this ongoing phase II study patients with MG recurrent after surgery, radiation therapy, and temozolomide are eligible. The treatment consists of an induction phase with BV at 10 mg/kg intravenously on day 1 and 15 and fotemustine (FTM) (a nitrosourea with elevated lipophilic properties) at 75 mg/m2 intravenously on day 1 and 8, followed after a 3-week interval by a maintenance phase with BV at 10 mg/kg i.v. and FTM 75 mg/m2 i.v. every 3 weeks until tumor progression or unacceptable toxicity. Patients undergo clinical and MRI assessment 1 month after the start of treatment and thereafter every 2 months. Monitoring of CBV with perfusion MRI is performed in selected centers. The co-primary endpoints are objective response rate (ORR), based on Mc Donald's criteria (CR + PR) and progression-free survival at 6 months (PFS6), with secondary endpoints of safety time to tumor progression (TTP) and overall survival. Results: From April 2008 to December 2008, 34 patients were enrolled and 31 (22 glioblastomas and 9 anaplastic gliomas) are evaluable for response. Overall response rate (2 CR and 9 PR) was 35% (glioblastomas 33%, anaplastic gliomas 41.5%). Median time to maximal response was 1 month. Steroids were reduced in 50% of patients. Sixteen of 31 patients progressed with a TTP of 2.6 months (1–8.5). Patterns of progression were local in 10/16, local + leptomeningeal spread in 3/16 and gliomatosis in 3/16. Fifteen patients are free of tumor progression (from 2 to 8 months). Toxicities included grade III-IV neutropenia in three patients, grade III-IV piastrinopenia in five, and grade III thrombosis in two. Seventeen patients developed mild to moderate fatigue, six arterial hypertension, and three grade I intratumoral haemorrhage. Conclusions: Combination of bevacizumab and fotemustine in recurrent malignant gliomas is safe and promising. Updated results, monitoring of CBV with perfusion MRI, and correlations between MGMT promoter methylation and response/outcome will be presented. No significant financial relationships to disclose.

Abstract Abstract 1645 Background: Indolent non follicular B-Cell Lymphomas (INFL) are an eterogenous group of lymphomas and include small lymphocityic lymphoma (SLL), lymphoplasmacytic lymphoma (LPL), and marginal zone lymphoma (MZL). Relapsed INFLs in advanced stage have a relatively poor prognosis, with low complete response to conventional chemotherapy and short survival. Lenalidomide (R®) is an immunomodulatory drug with effects on the innate immune system that may enhance antibody-dependent cell mediated cytotoxicity as well as the development of specific anti-tumor immune responses. These immunologic effects may synergize with the action of rituximab (R). To test the efficacy of R® combined with R (R2), we have conducted a multi center, open label phase II clinical trial in patients (pts) with relapsed INFL. Methods: Eligible pts must have indolent non follicular B-cell lymphoma relapsed after at least 2 but less than 4 prior lines of R-containing immuno-chemotherapy with measurable disease. Patients received oral R® 20 mg once daily on days 1–21. R is administered at a dose of 375 mg/m2 at day 14 of every course. Treatment is repeated every 28 days for up to 6 courses. The primary objectives of the study were to evaluate the antitumor activity of oral R® when given in combination with R and to assess the safety of R2 evaluated by standard criteria (CTC-NCI 3.0). The secondary objectives were progression free survival (PFS), event free survival (EFS) and duration of remission (DR). Results: From July 2010 and June 2012, 39 patients were enrolled: 19 had SLL, 11 had LPL, 4 splenic MZL, 3 extranodal MZL and a 2 nodal MZL. Median age was 68 years (51–76) and 58% were male. LDH value was increased in 17% of pts and β-2-microglobulin in 87%; 41% of pts had Hb<12 g/dL and 62% were bone marrow positive. At time of current analysis treatment and response data were available in 27 pts. Overall treatment was completed in 18 pts (67%); in 9 cases treatment was interrupted prematurely primarily due to hematological toxicity (n=5) and due to disease progression (n=4). Of the 27 pts, 5 achieved a complete remission and 9 a partial remission with an ORR of 52%. In general, the regimen R2 was relatively well-tolerated. Grade 3–4 hematological events included neutropenia occurring in 50% of pts, infection in 7% and piastrinopenia in 3%. Growth factors were administered in 60% of pts. The median dose intensity was 0.94 for R and 0.92 for R®. With a median follow-up of 13 months (range 1–36), overall 9 pts had a lymphoma progression and 2 of them died. The 1-year overall survival and the 1-year PFS were 92% (IC95% 57–99%) and 78 months (IC95% 54–91%) respectively. Conclusions: In our trial follicular histology was an exclusion criteria and all pts were relapsed/refractory to immuno-chemotherapy rituximab-containing regimens. Thus the results observed with the chemo-free R2 scheme compare favorably with other previously reported results observed in relapsed indolent lymphoma treated with standard immuno-chenotherapy. Further the R2 combination was relatively well tolerated. In conclusion our results, although obtained in a small series of patient are encouraging and support further evaluation of R2 scheme in a larger cohort of patients. Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.

Hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) is a rare and life-threatening condition characterized by uncontrolled activation of the immune system. HLH is a reactive mononuclear phagocytic response that occurs in association with a constellation of conditions such as malignancies and infections. The clinical diagnosis of HLH remains challenging because HLH can present with symptoms that significantly overlap with other causes of cytopenia, such as sepsis, autoimmune diseases, hematological cancers, and multiorgan failure. A 50-year-old man went to the emergency room (ER) for hyperchromic urine, melena, gingivorrhagia, and spontaneous abdominal wall hematomas. The first blood tests showed severe thrombocytopenia, alteration of the INR, and consumption of fibrinogen, and therefore, a diagnosis of disseminated intravascular coagulation (DIC) was made. A bone marrow aspirate showed numerous images of hemophagocytosis. With the suspicion of immune-mediated cytopenia, oral etoposide, intravenous immunoglobulin, and intravenous methylprednisolone were administered. Then, a diagnosis of gastric carcinoma was performed with a lymph node biopsy and gastroscopy. On the 30th day, the patient was transferred to the oncology ward of another hospital. On admission, he had serious piastrinopenia, anemia, hypertriglyceridemia, and hyperferritinemia. He was supported with a platelet transfusion and underwent a bone biopsy that showed a picture compatible with myelophthisis from diffuse medullary localization of a carcinoma of gastric origin. A diagnosis of HLH secondary to solid neoplasm was formulated. The patient started chemotherapy with oxaliplatin, calcium levofolinate, 5-fluorouracil bolus, 5-fluorouracil for 48 h (mFOLFOX6), and methylprednisolone. Six days after the third cycle of mFOLFOX6, the patient was discharged with the stabilization of his piastrinopenia condition. The patient continued chemotherapy with an improvement in his clinical conditions and normalization of hematological values. After 12 cycles of mFOLFOX, it was decided to start maintenance chemotherapy with capecitabine but, unfortunately, after only one cycle, HLH reappeared. The oncologist has to keep in mind the existence of HLH when there is an unusual clinical presentation of cancer, such as cytopenia affecting ≥2 lineages and alterations of ferritin and triglycerides other than fibrinogen and coagulation. Increased attention and additional research as well as a close collaboration with hematologists are needed to benefit patients with solid tumors complicated by HLH.

Abstract Background Several therapeutic strategies are available for cancer patients, leading to a longer life expectancy; however, each drug might have different side effects, which increase morbidity and mortality. Cardiovascular diseases are one of the most frequent and dramatic of these side effects, leading to interruption of a potentially lifesaving treatment or hesitating into heart failure. Clinical Case A 50 year-old female with recent diagnosis of breast cancer presented to our Emergency Department (ED) for asthenia, vomiting and dyspnea. A first dose of epirubicin and cyclophosphamide as neoadjuvant chemotherapy (CT) was administered three days before the onset of symptoms. Screening echocardiogram performed before starting the CT showed normal systolic ejection fraction, normal diastolic function and no valvular disease. At ED admission, the patient presented hypotension, tachycardia, sweating and mental confusion. The ECG showed sinus tachycardia with diffuse ST segment elevation and diffuse low QRS voltages. Echocardiogram proved severe left dysfunction (LVEF 15%) with low cardiac output (LVOT VTI 6 mm) and elevated ventricular filling pressure (E/e’ 26). EAB showed severe hyperlactacidemia. The diagnosis of cardiogenic shock was done and high doses of dobutamine and noradrenaline were started. Laboratory values confirmed multiorgan involvement, in absence of any signs of inflammation and infection. The coronary angiography performed revealed normal coronary arteries and elevated left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP 29 mmHg). Despite pharmacological therapy, the patient's condition worsened so we proceeded to IMPELLA CP implantation and started methylprednisolone 10 mg/kg for three days with subsequent tapering doses. After 24 hours, we obtained hemodynamic stability and hyperlactacidemia clearance. Unfortunately, myelotoxicity and marked piastrinopenia (until 16 000*10 9/L) complicated the clinical course; for this reason, we stopped unfractionated Heparin (UHF) and no anticoagulant therapy, other the one in purge solution, was performed. CMR revealed diffuse signal enhancement during the T2w sequences associated with a global enhancement of T2 Mapping values due to general edema, a global intramyocardial strengthening, a significant enhancement of the T1 mapping values and extracellular volume were described at the delayed enhancement sequences. The hemodynamic conditions progressively improved during the hospitalization and the IMPELLA pump was removed. Serial echocardiograms documented an improvement of the ejection fraction and further mild reduction of ventricular filling pressure (E/e’ 8) normal right ejection fraction and initial inferior vena cava collapsibility. All the inotropic supports were suspended; we introduced beta-blocker, ACE-inhibitors, subsequently replaced with sacubitril/valsartan, well tolerated. Conclusion Acute cardiotoxicity with possible life-threatening conditions regardless of the basal cardiovascular risk class is a rare clinical condition, but needs further investigation. Future researches are warranted to determine the molecular mechanisms underlying cardiotoxicity to contain the side effects, maximize the benefit of the oncological therapy and, when necessary, select the best therapeutic option.

IntroduzioneM. Scudeletti La trombocitopenia immuneM. Cavalleri, P. Pitto, S. Timitilli, M. Scudeletti Approccio dell’internista alla leucemia acutaG.L. Michelis Sindrome emolitico-uremica atipica e porpora trombotica trombocitopenicaM. Brignone I linfomi aggressivi a rapida crescitaM. Cavaliere L’emofilia A acquisitaG.A. Berisso La gestione delle complicanze acute del paziente con mieloma multiploR. Goretti Le complicanze trombo-emboliche nel paziente ematologicoS. Panarello, C. Fioravanti, F. Raggi, G. Antonucci Come affrontare il paziente con leucocitosi e linfocitosiC. Venturino, R. Tassara Come affrontare il paziente con adenomegaliaP. Gnerre, N. Artom, E. Schiavetta, L. Parodi Come affrontare il paziente con splenomegaliaP. Gnerre, N. Artom, E. Schiavetta, L. Parodi Come affrontare il paziente con leucopeniaG. Pastori, R. Tassara Come affrontare il paziente con trombocitosiL. Rebella, R. Tassara Policitemia vera o morbo di VaquezE. Arboscello Approccio all’adulto con piastrinopeniaR. Tassara, L. Paris La gestione delle infezioni nel paziente oncoematologicoA.L. Garlaschelli, F. Artom La gammopatia di origine indeterminataS. Timitilli, M. Cavalleri, M. Scudeletti La malattia di GaucherM. Cavaliere Come affrontare i pazienti con...

La Piastinopenia Immune (PTI) è una patologia autoimmune ad eziologia ignota caratterizzata da piastrinopenia. I linfociti T regolatori (Tregs) sono coinvolti nei meccanismi di tolleranza immunologica e agiscono regolando l’attività delle cellule T autoreattive e delle cellule dendritiche (DCs). Viceversa, le DCs, che esprimono Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), partecipano al mantenimento della tolleranza agli auto-antigeni attraverso l’espansione dei Tregs. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che i linfociti T helper 17 (Th17) sono coinvolti nell’autoimmunità e che l’espressione di Interleuchina (IL)-17 è associata a numerose patologie autoimmuni. Il ruolo dell’interazione fra DCs e Tregs ed il ruolo dei Th17 nella patogenesi della PTI non sono mai stati studiati in maniera approfondita. Gli obiettivi principali di questa tesi sono stati: a) caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente i linfociti Tregs e DCs; b) valutare il ruolo patogenetico dell’interazione tra Tregs e DCs; c) quantificare i Th17 circolanti. I risultati dimostrano che: 1) il numero dei Tregs circolanti dei pazienti, identificati tramite i marcatori Foxp3 e CD127, è significativamente ridotto rispetto alla controparte normale; 2) la conversione in vitro delle cellule CD4+CD25- in linfociti Tregs (CD4+CD25+Foxp3+) dopo stimolazione con DCs mature è significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli; 3) sia l’espressione dell’enzima IDO nelle DCs mature (mRNA) che i livelli di chinurenine prodotte (indice di attività enzimatica) sono risultati significativamente ridotti nei pazienti rispetto alla controparte normale. Questi risultati suggeriscono quindi che il ridotto numero dei Tregs circolanti nei pazienti con PTI può essere, almeno in parte, attribuito alla scarsa capacità di conversione delle DCs, in quanto tali cellule esprimono meno IDO. I risultati dimostrano inoltre che: 1) i Tregs dei pazienti con PTI hanno una capacità soppressoria che è significativamente inferiore rispetto ai soggetti normali; tale dato è stato confermato dal dosaggio di IFN- nel surnatante della coltura; 2) i Tregs di pazienti con PTI non sono in grado di inibire la maturazione delle DCs, a differenza di quanto avviene nei soggetti sani: infatti, l’espressione delle molecole costimolatorie CD80 e CD86 sulle DCs è risultata invariata in seguito a cocoltura con DCs immature; 3) il dosaggio delle citochine nel surnatante delle cocolture dimostra che la concentrazione di IL-10 e IL-6 è significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli. La scarsa abilità dei Tregs di inibire la maturazione delle DCs e l’alterato pattern di secrezione di citochine potrebbero quindi contribuire all’ insorgenza del fenotipo più maturo delle DCs nei pazienti con PTI. I linfociti Th17 circolanti di pazienti e controlli sono stati identificati in citofluorimetria come cellule CD4+CD161+CD196+. Da tale analisi è emerso che la frequenza dei Th17 circolanti non è significativamente diversa nei due gruppi. Questi dati dimostrano quindi che nella PTI l’interazione bidirezionale tra Tregs e DCs risulta alterata e svolge un ruolo patogenetico, in quanto, da un lato, ci sono Tregs con un deficit numerico e funzionale e, dall’altro, DCs con maggiore capacità immunogenica. Il numero dei Th17 non risulta invece alterato.

La Piastinopenia Immune (PTI) è una patologia autoimmune ad eziologia ignota caratterizzata da piastrinopenia. I linfociti T regolatori (Tregs) sono coinvolti nei meccanismi di tolleranza immunologica e agiscono regolando l’attività delle cellule T autoreattive e delle cellule dendritiche (DCs). Viceversa, le DCs, che esprimono Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), partecipano al mantenimento della tolleranza agli auto-antigeni attraverso l’espansione dei Tregs. Inoltre, recenti studi hanno dimostrato che i linfociti T helper 17 (Th17) sono coinvolti nell’autoimmunità e che l’espressione di Interleuchina (IL)-17 è associata a numerose patologie autoimmuni. Il ruolo dell’interazione fra DCs e Tregs ed il ruolo dei Th17 nella patogenesi della PTI non sono mai stati studiati in maniera approfondita. Gli obiettivi principali di questa tesi sono stati: a) caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente i linfociti Tregs e DCs; b) valutare il ruolo patogenetico dell’interazione tra Tregs e DCs; c) quantificare i Th17 circolanti. I risultati dimostrano che: 1) il numero dei Tregs circolanti dei pazienti, identificati tramite i marcatori Foxp3 e CD127, è significativamente ridotto rispetto alla controparte normale; 2) la conversione in vitro delle cellule CD4+CD25- in linfociti Tregs (CD4+CD25+Foxp3+) dopo stimolazione con DCs mature è significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli; 3) sia l’espressione dell’enzima IDO nelle DCs mature (mRNA) che i livelli di chinurenine prodotte (indice di attività enzimatica) sono risultati significativamente ridotti nei pazienti rispetto alla controparte normale. Questi risultati suggeriscono quindi che il ridotto numero dei Tregs circolanti nei pazienti con PTI può essere, almeno in parte, attribuito alla scarsa capacità di conversione delle DCs, in quanto tali cellule esprimono meno IDO. I risultati dimostrano inoltre che: 1) i Tregs dei pazienti con PTI hanno una capacità soppressoria che è significativamente inferiore rispetto ai soggetti normali; tale dato è stato confermato dal dosaggio di IFN- nel surnatante della coltura; 2) i Tregs di pazienti con PTI non sono in grado di inibire la maturazione delle DCs, a differenza di quanto avviene nei soggetti sani: infatti, l’espressione delle molecole costimolatorie CD80 e CD86 sulle DCs è risultata invariata in seguito a cocoltura con DCs immature; 3) il dosaggio delle citochine nel surnatante delle cocolture dimostra che la concentrazione di IL-10 e IL-6 è significativamente ridotta nei pazienti rispetto ai controlli. La scarsa abilità dei Tregs di inibire la maturazione delle DCs e l’alterato pattern di secrezione di citochine potrebbero quindi contribuire all’ insorgenza del fenotipo più maturo delle DCs nei pazienti con PTI. I linfociti Th17 circolanti di pazienti e controlli sono stati identificati in citofluorimetria come cellule CD4+CD161+CD196+. Da tale analisi è emerso che la frequenza dei Th17 circolanti non è significativamente diversa nei due gruppi. Questi dati dimostrano quindi che nella PTI l’interazione bidirezionale tra Tregs e DCs risulta alterata e svolge un ruolo patogenetico, in quanto, da un lato, ci sono Tregs con un deficit numerico e funzionale e, dall’altro, DCs con maggiore capacità immunogenica. Il numero dei Th17 non risulta invece alterato.

The congenital thrombocytopenias are a heterogeneous group of disorders characterized by reduced number of platelets and variable clinical manifestations from severe to milder forms of incidental finding. They are divided into: 1) thrombocytopenia defect of megakaryocytic differentiation and maturation 2) MK migration defect from the bone marrow to the vascular niche 3) elongation of the pro-platelets. Then there are the hereditary thrombocytopenias from reduced platelet survival and thrombocytopenias with a still unknown pathogenesis. Currently, there are now at least 20 genes whose genetic defects determine a phenotype characterized by hereditary thrombocytopenia, but approximately 50% of patients have forms that do not coincide with any known defect. In recent years, there were several forms of hereditary thrombocytopenia associated with the development of hematologic and non-haematological malignancies that have aroused a great interest in researchers; especially the forms associated with mutations of ANKRD26, RUNX1 and ETV6. Purpose The purpose of this work is: 1. Build a comprehensive database of patients with inherited thrombocytopenia studied in our laboratory, defining the genetic mutations found. 2.Conduct a preliminary study on the presence of mutations in the 5'UTR of ANKRD26 in patients with sporadic and inherited thrombocytopenia, who did not fit into known forms of inherited thrombocytopenia and who had normal platelet volume (4μm˂MPV˂8μm), establishing the clinical and molecular features of this new form of thrombocytopenia and studying families with inherited mutations in this gene. 3. Enlarge the investigation to two other genes involved in inherited forms of thrombocytopenia with susceptibility to hematological malignancies: RUNX1 and ETV6. 4. Collect and analyze data related to the course of pregnancy in a large cohort of patients with IT forms (inherited thrombocytopenia). Materials and methods At the Medical Clinic 1 of the City Hospital-University of Padua complex there exist a series of about 70 family pedigrees of patients with inherited thrombocytopenia from hidden defect. The assessment includes the clinical history and the study of the expression of surface platelet antigens by flow cytometry method using monoclonal antibodies. To evaluate the platelets morphology, the method of staining with May-Grunwald / Giemsa (MGG) on peripheral blood (macro, micro and normo thrombocytopenia) has been adopted. The DNA was extracted from whole blood and amplified for the study of the following genes: GpIbα, GpIbβ, GPIX, MYH9, ACTN1. The products of the amplification reactions were visualized by agarose gel electrophoresis and sequenced with the Sanger method. We carried out a preliminary study on the presence of mutations in the 5'UTR of ANKRD26 in patients with sporadic and inherited thrombocytopenia, which did not fit into known forms of inherited thrombocytopenia and who had normal platelet volume (4μm˂MPV˂8μm) in order to be able to define the clinical and molecular features. We then expanded the investigation to RUNX1 and ETV6, two genes involved in hereditary forms of thrombocytopenia with predisposition to blood cancer in thrombocytopenic patients and not (MDS + thrombocytopenia; MDS thrombocytopenia -) belonging to different classes of myelodysplastic syndrome sec. WHO 2008. Finally, as part of thrombocytopenia family confirmed through genetic investigation, we participated in Pregnancy In Inherited Platelet Abnormalities (PIPA), multicenter retrospective evaluation of 339 pregnancies in 181 women with 13 different forms of thrombocytopenia. Results 8 families (12%) have mutations in the MYH9, MYH9-related disease, 12 families (19%) have mutations GP1Bα, 4 families (6%) have gene mutations that cause GP1Bβ Bernard-Soulier Syndrome (BSS) mono or biallelic. The remaining families (60%) do not have the genetic mutations in the studied glycoproteins, and no mutation in the ACTN1 gene. In light of recent studies on the forms of inherited thrombocytopenia characterized in our laboratory, we conducted a preliminary study on the presence of mutations in the 5'UTR of ANKRD26 in patients with sporadic and inherited thrombocytopenia, which did not fit into known forms of inherited thrombocytopenia and showed normal platelet volume (4μm˂MPV˂8μm). We identified two different heterozygous mutations, located in the 5'UTR untranslated region of the gene. Given the interest in the study of hereditary thrombocytopenia associated with the development of hematologic and non-hematological malignancies, in particular of RUNX1 and ETV6 genes, responsible for non-syndromic autosomal dominant thrombocytopenia, we collected preliminarily a small series of myelodysplastic thrombocytopenic subjects (9 subjects), myelodysplastic subjects with platelet counts within the normal range (12 subjects) and 27 control subjects with hereditary undetermined thrombocytopenia; this in order to strengthen the evidence about a possible association between mutations in the mentioned genes, thrombocytopenia and risk myelodysplastic / leukemia evolution. Of these subjects, we collected data on age, sex, karyotype, number of blast cells, hemoglobin and platelets. Preliminary data (Table 1) show that mutations of RUNX1 ETV6 gene are present only in the group of myelodysplastic thrombocytopenic. GENE POSITION MUTATION RUNX-1 EXON 4 c.76C>G RUNX-1 EXON 8 c.934del A RUNX-1 EXON 9 c.1214_1215insTG ETV6 INTRON 1 c.28+192delC Table 1. Mutations found in RUNX1 and ETV6 genes Although the involvement of these genes in thrombopoiesis is known, the exact mechanism responsible for thrombocytopenia is not yet clear. The rarity of these diseases makes it difficult to collect relevant data for analysis of genotype-phenotype relation. In the multicenter study (PIPA) we have classified 23 pregnancies (13 women): 5 women have BBSs, mBSS 3, 4 MYH9-RD, 1 ANKRD26. The average age at diagnosis of thrombocytopenia is 30 years, the average platelet count before giving birth is about 60 x 109 platelets / L, even if in some cases there was a drastic reduction in platelet aggregation. The bleeding tendency is low before birth and only in two pregnancies platelet transfusion is needed. All births took place between the 34th and 40th week; 13 are born by caesarean section and 10 vaginally. Only 9 infants carry the same disease of the mother, although in 6 cases the data is not available because they were not made inquiries about it. We found only one case of neonatal death due to brain hemorrhage, but no cases of bleeding in newborns. Conclusions The thrombocytopenia is the most common disorder of hemostasis and is a heterogeneous group of clinical entities. The peculiarity of family forms is the difficulty of clinical identification since they are often classified as immune thrombocytopenia and patients undergoing inappropriate therapy. As reported in the results of recent studies involving a higher number of families, in our work the most common forms of thrombocytopenias family is the BSS, the MYH9-RD followed by ANKRD26. Thanks to a careful analysis of clinical and genetic investigations associated with recent molecular studies, it is now possible to identify and correctly classify patients with new genetic mutations even though more than 50% of families remain with no diagnosis. To evaluate the possible mechanisms involved in the development of thrombocytopenia being myelodysplastic syndromes will be essential to study extensively the three categories of patients: thrombocytopenia hereditary with defect of ANKRD26, RUNX-1 and ETV6, myelodysplasia or leukemia with prevailing thrombocytopenia. A larger number of cases of these subjects will allow us to deepen the study of functional mutations defining the clinical and molecular features, in order to evaluate a possible link between myelodysplasia and thrombocytopenia and understand at what level of megakaryopoiesis and hematopoiesis they intervene
Le piastrinopenie congenite sono un eterogeneo gruppo di patologie caratterizzato da ridotto numero di piastrine e si presentano con manifestazioni cliniche variabili da forme gravi a forme più lievi di riscontro casuale. Si suddividono in piastrinopenie da difetto della differenziazione e maturazione megacariocitaria, difetto di migrazione dei MK dalla nicchia ossea del midollo a quella vascolare e della elongazione delle pro-piastrine. Vi sono poi le piastrinopenie ereditarie da ridotta sopravvivenza piastrinica e le piastrinopenie a patogenesi ancora sconosciuta. Attualmente si conoscono almeno 20 geni i cui difetti genetici determinano un fenotipo caratterizzato da trombocitopenia ereditaria, ma circa il 50% dei pazienti hanno forme che non coincidono con nessun difetto noto. Negli ultimi anni sono emerse alcune forme di piastrinopenia ereditaria associate allo sviluppo di neoplasie di tipo ematologico e non ematologico che hanno destato un estremo interesse nei ricercatori; in particolare le forme associate a mutazioni di ANKRD26, RUNX1 e ETV6. Scopo Lo scopo di questo lavoro è quello di: 1. Costruire un database completo dei pazienti con piastrinopenia familiare finora pervenuti nel nostro laboratorio, definendo le mutazioni genetiche rinvenute. 2. Condurre uno studio preliminare sulla presenza di mutazioni in 5’UTR di ANKRD26 in pazienti con piastrinopenia sporadica e familiare, che non rientravano in forme note di piastrinopenia ereditaria e che presentavano volume piastrinico nella norma (4μm˂MPV˂8μm), definendone le caratteristiche cliniche e molecolari di questa nuova forma di piastrinopenia ereditaria e studiando le famiglie con mutazioni in questo gene. 3. Ampliare l’indagine ad altri due geni coinvolti in forme di piastrinopenia ereditaria con predisposizione a neoplasie ematologiche: RUNX1 ed ETV6. 4. Raccogliere e analizzare i dati relativi al corso della gravidanza in una ampia coorte di pazienti con forme di IT (inherited thrombocytopenia). Materiali e metodi Presso l’Unità di Clinica Medica 1 dell’Azienda Ospedale-Università di Padova è presente una casistica di circa 70 pedigree familiari di soggetti con piastrinopenia familiare da difetto ignoto. La valutazione comprende storia clinica e lo studio dell’espressione degli antigeni piastrinici di superficie mediante metodica citofluorimetrica utilizzando anticorpi monoclonali. Per valutare la morfologia piastrina è stato adottato il metodo della colorazione con May-Grunwald/Giemsa (MGG) su strisci di sangue periferico (macro, micro e normo trombocitopenia). Il DNA è stato estratto da sangue intero e amplificato per lo studio dei seguenti geni: GpIbα, GpIbβ, GpIX, MYH9, ACTN1. I prodotti delle reazioni di amplificazione sono stati visualizzati con elettroforesi su gel di agarosio marcato e quindi sequenziati con metodo di Sanger. Abbiamo condotto uno studio preliminare sulla presenza di mutazioni in 5’UTR di ANKRD26 in pazienti con piastrinopenia sporadica e familiare, che non rientravano in forme note di piastrinopenia ereditaria e che presentavano volume piastrinico nella norma (4μm˂MPV˂8μm) per poterne definire le caratteristiche cliniche e molecolari. Abbiamo quindi ampliato l’indagine a RUNX1 ed ETV6, due geni coinvolti in forme di piastrinopenia ereditaria con predisposizione a neoplasie ematologiche in pazienti piastrinopenici e non (MDS piastrinopenia +; MDS piastrinopenia -) appartenenti alle diverse classi di sindrome mielodisplastica sec. WHO 2008. Infine, nell’ambito delle piastrinopenie familiari confermate mediante indagine genetica, abbiamo partecipato al Pregnancy In Inherited Platelet Abnormalities (PIPA), studio multicentrico retrospettivo di valutazione di 339 gravidanze in 181 donne con 13 diverse forme di trombocitopenia. Risultati 8 famiglie (12%) presentano mutazioni nella MYH9, MYH9-related disease, 12 famiglie (19%) presentano mutazioni del gene GP1Bα, 4 famiglie (6%) presentano mutazioni del gene GP1Bβ che causano Bernard-Soulier Syndrome (BSS) mono o biallelico. Le rimanenti famiglie (60%) non presentano mutazioni genetiche sulle glicoproteine studiate, e nessuna mutazione sul gene ACTN1. Alla luce dei recenti studi relativi alle forme di piastrinopenie ereditarie caratterizzate, nel nostro laboratorio abbiamo condotto uno studio preliminare sulla presenza di mutazioni in 5’UTR di ANKRD26 in pazienti con piastrinopenia sporadica e familiare, che non rientravano in forme note di piastrinopenia ereditaria e che presentavano volume piastrinico nella norma (4μm˂MPV˂8μm), identificando due diverse mutazioni in eterozigosi, localizzate nella regione del 5’UTR non tradotta del gene. Dato l’interesse nello studio delle piastrinopenie ereditarie associate allo sviluppo di neoplasie di tipo ematologico e non ematologico, in particolare dei geni RUNX1 ed ETV6, responsabili di trombocitopenia non sindromica a trasmissione autosomica dominante, abbiamo preliminarmente raccolto una piccola casistica di soggetti mielodisplastici piastrinopenici (9 soggetti), di soggetti mielodisplastici con conta piastrinica nei limiti di norma (12 soggetti) e di 27 soggetti di controllo con trombocitopenia ereditaria indeterminata; questo per rinforzare le evidenze circa una possibile associazione tra mutazioni dei geni citati, piastrinopenia e rischio di evoluzione mielodisplastica/leucemica. Di questi soggetti abbiamo raccolto i dati relativi all’età, sesso, cariotipo, numero di blasti, emoglobina e piastrine. I dati preliminari (Tabella 1) dimostrano che le mutazioni dei geni RUNX1 e ETV6 sono presenti solo nel gruppo dei mielodisplastici piastrinopenici. GENE POSIZIONE MUTAZIONE RUNX-1 ESONE 4 c.76C>G RUNX-1 ESONE 8 c.934del A RUNX-1 ESONE 9 c.1214_1215insTG ETV6 INTRONE 1 c.28+192delC Tabella 1. Mutazioni rinvenute nei geni RUNX1 ed ETV6 Anche se il coinvolgimento di questi geni nella piastrinopoiesi è noto, l’esatto meccanismo responsabile di trombocitopenia non è ancora chiaro. La rarità di queste patologie rende difficile raccogliere dati utili ad una analisi genotipo-fenotipo. Nello studio multicentrico (PIPA) abbiamo classificato 23 gravidanze (13 donne): 5 donne presentano bBSS, 3 mBSS, 4 MYH9-RD, 1 ANKRD26. L’età media alla diagnosi di trombocitopenia è di 30 anni, la conta media piastrinica prima del parto è di circa 60 x 109 piastrine/L, anche se in alcuni casi è stata osservata una drastica riduzione piastrinica. La tendenza al sanguinamento è bassa prima del parto e solo in due gravidanze è stata necessaria la trasfusione di piastrine. Tutte le nascite sono avvenute tra la 34a e 40 a settimana; 13 sono i nati con parto cesareo e 10 con parto naturale. Solo 9 neonati riportano la stessa patologia della mamma, anche se in 6 casi il dato non è disponibile poiché non sono state fatte indagini a riguardo. Abbiamo riscontrato un unico caso di decesso neonatale a causa di emorragia cerebrale, ma nessun caso di sanguinamento nei nuovi nati. Conclusioni Le piastrinopenie rappresentano il più frequente disordine dell’emostasi e costituiscono un gruppo eterogeneo di entità cliniche. La peculiarità delle forme familiari risiede nella difficoltà della loro identificazione clinica poiché spesso le piastrinopenie vengono classificate come immuni ed i pazienti sottoposti a terapie inappropriate. Come riportato nei risultati di studi recenti che coinvolgono un numero di famiglie più elevato, anche nel nostro lavoro le forme più comuni di piastrinopenia familiare risultano essere la BSS, la MYH9-RD seguite dalla ANKRD26. Grazie ad una attenta analisi clinica ed alle indagini genetiche associate a recenti studi molecolari, ad oggi è possibile individuare e classificare correttamente i pazienti con nuove mutazioni genetiche considerando che ancora più del 50% delle famiglie non ha diagnosi. Per valutare possibili meccanismi implicati nello sviluppo di piastrinopenia in corso di sindromi mielodisplastiche sarà indispensabile studiare in modo estensivo queste tre categorie di pazienti: piastrinopenie ereditarie con difetto noto di ANKRD26, RUNX-1 e ETV6, mielodisplasie o leucemie con prevalente piastrinopenia. Aumentare la casistica di tali soggetti ci permetterà di approfondire lo studio funzionale delle mutazioni definendone le caratteristiche cliniche e molecolari, al fine di valutare un possibile link tra mielodiplasia e piastrinopenia e comprendere a che livello della megacariopoiesi e dell’ematopoiesi esse agiscano

ABSTRACT INTRODUCTION: Megakaryopoiesis is regulated by a complex network of cytokines and chemokines controlling all different stages of the process. Thrombopoietin (TPO), produced constitutively by, the liver, is the main regulator of platelet count and critically influences megakaryocyte proliferation and differentiation through a complex signal transduction TPO levels inversely correlated to platelet count and MK bone marrow mass. cMPL is TPO receptor and it is made up of an intra- and an extracellular domain. Three isoforms, P, K and Tr, were identified and subsequent findings suggested Pisoform being the dominant form Upon ligand-induced Mpl homodimerization, the major signaling events for proliferation are mediated through the JAK-STAT pathway we want to evaluate TPO levels and cMPL expression in different platelet disease, in splectomized subjects and in patients treated with TPO-mimetic. MATERIALS and METHODS: we assessed patients affected by primary immune thrombocytopenia, familial thrombocytopenia, hypoplasia forms and myelodysplastic syndromes. We compared these groups with not affected as well as thrombocythemia patients. The method for measurement for TPO was an ELISA; cMPL was evaluated through cytofluorimetry and Western Blot. RESULTS: cytofluorimetry was not applied to cMPL because of high interassay volatility. The highest TPO levels were found in patients affected by bone marrow hypoplasia; ITP shows TPO levels higher than not affected, essential thrombocythemia and familial thrombocytopenia patients. ITP patients display a higher cMPL than controls and ET, but comparable levels to that of bone marrow hypoplasia. 8 In splenectomized ITP patients TPO and cMPL decreased after splenectomy whereas in TPO-mimetic treated ones they stayed stable. DISCUSSION: according to literature, our ITP patients show a little increase in TPO. Bone marrow hypoplastic as well as myelodisplastic patients display higher cMPL and TPO levels. In ITP there seems to be a linear correlation between TPO and cMPL, whereas in MDS the correlation seems to be indirect. It could be suggested a modulatory role for different receptor isoforms. No clear conclusion can stem from these data due to the reduced dimension of splenectomized and TPO-mimetic treated groups of patients.
RIASSUNTO INTRODUZIONE: la trombopoiesi è un processo multifattoriale dipendente da vari fattori tra cui microambiente midollare, cellule di superficie e fattori di crescita ematopoietici. Il principale fattore che regola la produzione piastrinica è la trombopoietina (TPO), una proteina di 332 aminoacidi, con peso molecolare pari a 95 kDa, contenente due domini: quello amino-terminale con omologia strutturale con l’eritropoietina e quello carbossi-terminale coinvolto nel mantenimento della stabilità della TPO. La TPO è sintetizzata prevalentemente a livello epatico e presenta livelli inversamente correlati al numero di piastrine e alla massa megacariocitaria anche se vi sono delle eccezioni quali i casi di massiva distruzione piastrinica o di trombocitosi reattiva. La TPO aumenta dimensioni e numero dei megacariociti, favorisce l’espressione dei marcatori di superficie per le piastrine (CD41 e CD61) e stimola poliploidia dei megacariociti. Il recettore per la TPO è il cMPL, costituito da un dominio extracellulare e da uno intracellulare, espresso soprattutto a livello di cellule CD34, megacariociti e piastrine. Esistono diverse isoforme del cMPL, K, P e Tr, di cui quella fondamentale per la trasduzione del segnale è la P. Il legame della TPO al suo recettore determina l’omodimerizzazione del recettore con conseguente fosforilazione di JAK2 e attivazione della via di trasduzione del segnale. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare i livelli di TPO e l’espressione di cMPL in diversi disordini piastrinici, in soggetti splenectomizzati e in quelli in terapia con agonista del TPO-R 6 MATERIALI e METODI: le patologie da noi considerate sono state piastrinopenia immune primaria, piastrinopenia costituzionale, forme di ipoplasia midollare e sindromi mielodisplastiche; come gruppo di controllo sono stati considerati soggetti sani e soggetti con trombocitemia essenziale. La TPO è stata dosata con metodica ELISA, il cMPL è stato valutato sia in citofluorimetria sia con Western Blot. La valutazione statistica è stata effettuata con il software GraphPad Prism. RISULTATI: lo studio del cMPL in citofluorimetria non è stato possibile per l’impossibilità a confrontare i risultati ottenuti data l’ampia variabilità interassay. I soggetti con ipoplasia midollare presentano i più alti livelli di TPO dell’intera casistica; nei soggetti con ITP si hanno livelli di TPO superiori ai soggetti sani, alle ET e alle forme familiari e inferiori ai soggetti con ipoplasia midollare. I soggetti con ITP hanno un’espressione di cMPL superiore ai controlli e alle ET, ma del tutto sovrapponibile alle ipoplasie midollari. Nei soggetti splenectomizzati i livelli di TPO e l’espressione del cMPL si è ridotta mentre non vi sono state modifiche nei soggetti trattati con agonista del TPO-R. DISCUSSIONE: analogamente a quanto descritto in letteratura anche nei nostri soggetti con ITP, la TPO è solo modestamente aumentata. I soggetti con ipoplasia midollare, così come quelli con mielodisplasia hanno un’aumentata espressione di cMPL e un aumento dei livelli di TPO. La correlazione tra TPO e cMPL nelle ITP è risultata lineare mentre nelle MDS vi è una correlazione inversa a sottolineare un possibile ruolo modulatorio da parte delle diverse isoforme del recettore. I dati relativi ai soggetti trattati, chirurgicamente o no, sono sovrapponibili a quelli descritti in letteratura ma sono relativi a un gruppo estremamente piccolo di pazienti

2013/2014
Next Generation Sequencing (NGS) technologies, such the Ion Torrent platform, could allow to simplify the diagnostic process of diseases characterized by an high genetic and phenotypic heterogeneity, because of the possibility to sequence simultaneously more genes and more patients in a single sequencing run. In order to develop a new diagnostic algorithm for rapid molecular diagnosis of these disorders, we have applied the Ion Torrent technology on two different genetically heterogeneous diseases, Fanconi anemia (FA) and inherited thrombocytopenias (IT). Since FA is a disorder better characterized than ITs, we first validated the Ion torrent technology on 30 samples (2 wild type and 28 FA), 25 of which were already analyzed with Sanger sequencing. Because of their low sequencing quality, we have excluded from this type of analysis 2 of the 28 FA samples. Then, comparing Ion Torrent and Sanger sequencing data, we have evaluated the sensitivity (95%) and the specificity (100%) of Ion Torrent technology. Moreover, in order to detect copy number variations (CNVs) in FA genes, we have improved a statistical analysis based on coverage sequencing data, confirming the presence of large intragenic deletions on FANCA in 5 patients. In summary we have characterized 25 of the 26 FA patients analyzed, identifying also 4 mutant alleles in the rare complementation group FANCL and FANCF and 10 mutations in loci different from genes causing the disease. Since we cannot exclude that new genes are involved in FA, the only patient without any mutation identified is suitable for whole exome analysis. Taking advantage from these good sequencing data, we have developed a diagnostic algorithm that combines the identification of both point mutations and CNVs. In order to verify if this new diagnostic process could be applied also to other genetically heterogeneous diseases, we have analyzed 21 IT patients, already characterized by Sanger sequencing. Among the 2225 variants identified by Ion torrent technology, using this new approach, we have select those (N=75, 56 different) potentially pathogenetic because of their frequency (MAF<0.01), or of their presence in IT mutation database o because of bioinformatics analysis. Thirty of these variants were confirmed by Sanger sequencing, 14 (12 different) of which localized in loci different from the gene causing the disease. It would be interesting to carry out functional studies on these additional variants to unravel the molecular basis of ITs. In summary we were able to characterized 17 of the 21 IT patients, including 2 patients with deletions in RBM8A (Thrombocytopenia and Absent Radii syndrome, TAR). The remaining 4 mutant alleles were not detected because of a low sequencing coverage. In conclusion, according to our data, we can consider the Ion Torrent technology and in particular the diagnostic algorithm proposed in our study, as a feasible approaches for the study of diseases characterized by high genetic and phenotypic heterogeneity. RIASSUNTO Le tecnologie di Next Generation Sequencing (NGS) consentono di analizzare più geni e più campioni contemporaneamente. In questo modo potrebbe essere possibile ridurre i tempi e i costi di analisi di tutte quelle patologie caratterizzate da elevata eterogeneità genetica e fenotipica, la cui caratterizzazione risulta essere spesso complessa e dispendiosa. Al fine di elaborare un nuovo algoritmo diagnostico che consenta la rapida elaborazione di una diagnosi molecolare di tali patologie, abbiamo deciso di validare una tra le più innovative tecnologie NGS attualmente in commercio, la metodica Ion Torrent, su due differenti malattie, entrambe caratterizzate da eterogeneità genetica. l’anemia di Fanconi (FA) e le piastrinopenie ereditarie (IT). Siccome la FA è una patologia meglio caratterizzata rispetto alle IT, durante la prima fase di questo lavoro di tesi abbiamo analizzato 30 campioni (25 dei quali già precedentemente analizzati con sequenziamento Sanger), di cui 2 wild type e 28 affetti. In seguito all’esclusione dalla nostra analisi di 2 campioni FA a causa di una bassa qualità di sequenziamento, abbiamo determinato la sensibilità (95%) e la specificità (100%) della nuova metodica confronto i dati di sequenziamento Ion Torrent e quelli Sanger a nostra disposizione. Inoltre, utilizzando i dati di copertura della sequenza, abbiamo messo a punto un’analisi statistica volta all’identificazione delle Copy Number Variation (CNV), confermando le delezioni a carico del gene FANCA presenti in 5 pazienti. Abbiamo quindi caratterizzato 25 dei 26 pazienti analizzati, identificando inoltre 2 casi con mutazioni nei rari gruppi di complementazione FANCF e FANCL e 10 mutazioni in loci differenti dai geni causativi. Poiché non escludiamo la possibilità che un nuovo gene possa essere coinvolto nella patologia, riteniamo che l’unico paziente ancora privo di diagnosi molecolare possa essere un buon candidato per lo studio dell’esoma. Infine, avvalendoci dei buoni risultati ottenuti, abbiamo elaborato un nuovo processo diagnostico con il quale identificare in modo semplice e rapido sia le mutazioni sia le CNV a carico dei 16 geni coinvolti nella FA. Nella seconda parte del nostro studio, abbiamo verificato se l’applicazione di tale algoritmo possa essere estesa anche ad altre patologie ad elevata eterogeneità genetica. Per questo motivo abbiamo analizzato 21 campioni affetti da piastrinopenie ereditarie, già precedentemente analizzati mediante sequenziamento Sanger. Grazie all’algoritmo proposto abbiamo potuto selezionare tra le 2225 varianti identificate le 75 (56 differenti) che sono risultate essere potenzialmente patogenetiche in base alla loro frequenza nella popolazione (MAF<0.01), alla loro presenza nei database di mutazione e all’analisi bioinformatica di patogenicità. Trenta (27 differenti) di queste varianti sono state confermate mediante sequenziamento Sanger, di cui in particolare 14 (12 differenti) presenti in geni diversi da quelli causativi. Alla luce di questo dato si rendono necessari studi funzionali su tali varianti al fine di comprendere i meccanismi molecolari alla base delle piastrinopenie ereditarie. Infine, utilizzando l’algoritmo proposto, è stato possibile confermare la diagnosi molecolare in 17 dei 21 pazienti IT, compresi i 2 affetti da trombocitopenia con assenza del radio (TAR) e portatori di una delezione sul cromosoma 1q21.1. I restanti 4 alleli mutati non sono stati identificati a causa di una bassa copertura di sequenziamento. In conclusione, in base ai dati raccolti sui campioni affetti da FA e IT, possiamo affermare che la tecnologia di sequenziamento Ion Torrent e l’algoritmo diagnostico da noi proposto sono degli strumenti utili per ottenere una diagnosi molecolare completa, veloce ed economica.
XXVII Ciclo
1984