Academic literature on the topic 'Phagedisplay'

AbstractWe developed a strategy to improve the properties of ligands selected from phagedisplayed random peptide libraries. A sitedirected mutagenesis protocol that introduces mutations and extends the size of a target sequence has been set up to generate diversity in a single or in a population of clones. The pool of mutants thus created is screened to identify variants with the desired properties. We refer to this strategy as in vitro evolution of ligands. Here we report the application of this in vitro evolution protocol to the identification of improved ligands for HCVspecific serum antibodies. A single clone or population of clones were processed to generate a secondary library. Screening of these libraries with sera from HCVinfected patients identified peptides with an enhanced and broadened ability to detect HCVspecific serum antibodies.

SummaryFollowing replacement therapy with coagulation factor VIII (FVIII), up to 30 % of haemophilia A patients develop FVIII-specific inhibitory antibodies (FVIII inhibitors). Immune tolerance induction (ITI) is not always successful, resulting in a need for alternative treatments for FVIII inhibitor-positive patients. As tolerance induction in the course of ITI appears to involve the formation of anti-idiotypes specific for anti-FVIII antibodies, such anti-idiotypes might be used to restore haemostasis in haemophilia A patients with FVIII inhibitors. We isolated antiidiotypic antibody fragments (scFvs) binding to murine FVIII inhibitors 2-76 and 2-77 from phage-displayed libraries. FVIII inhibitor/anti-idiotype interactions were very specific as no cross-reactivity with other FVIII inhibitors or isotype controls was observed. ScFvs blocked binding of FVIII inhibitors to FVIII and neutralised their cognate inhibitors in vitro and a monoclonal mouse model. In addition, scFv JkH5 specific for FVIII inhibitor 2-76 stained 2-76-producing hybridoma cells. JkH5 residues R52 and Y226, located in complementary determining regions, were identified as crucial for the JkH5/2-76 interaction using JkH5 alanine mutants. SPR spectroscopy revealed that JkH5 interacts with FVIII inhibitor 2-76 with nanomolar affinity. Thus, FVIII inhibitorspecific, high-affinity anti-idiotypes can be isolated from phagedisplayed libraries and neutralise their respective inhibitors. Furthermore, we show that anti-idiotypic scFvs might be utilised to specifically target inhibitor-specific B cells. Hence, a pool of anti-idiotypes could enable the reestablishment of haemostasis in the presence of FVIII inhibitors in patients or even allow the depletion of inhibitors by targeting inhibitor-specific B cell populations.

2013/2014
Le cellule di mollusco immunocompetenti, in primis gli emociti circolanti, provvedono ad una rapida e robusta risposta difensiva nel confronti dei potenziali patogeni. Una volta che gli emociti vengono attivati dall'interazione tra pattern molecolari (PAMPs) presenti sulla superficie dei patogeni e specifici PRRs (pattern recognition receptors) in grado di riconoscerli, queste cellule innescano reazioni difensive. Nonostante un numero sempre più elevato di molecole in grado di interagire con i PAMPs sia stato caratterizzato in M. galloprovincialis, ad oggi non è mai stato effettuato uno studio di interattomica per l’identificazione su larga scala dei PRRs di mitilo coinvolti nel riconoscimento di specifici patogeni. Lo scopo di questo studio è, dunque, quello di identificare i PRRs delle cellule di mollusco immunocompetenti coinvolti nel riconoscimento dei batteri Vibrio splendidus e V. aestuarianus, Gram-negativi presenti in acque costiere e associati ai casi di mortalità che hanno colpito gli allevamenti di ostriche in tutto il mondo e verso i quali i mitili mostrano, invece, notevole resistenza . Per eseguire questo tipo di analisi è stata utilizzata, in modo innovativo, la tecnica phage-display, che si basa sulla possibilità di far esprimere ad un batteriofago un peptide esogeno in fusione con una delle proteine del capside, in modo che la particella fagica esponga sulla sua stessa superficie il peptide di interesse. Il nuovo approccio utilizzato in questo studio ha permesso lo studio diretto dell’interazione tra i fagi recanti un pool di peptiti espressi da emociti di mitilo e i PAMPs presenti sulla superficie delle cellule batteriche. Mediante successive fasi di selezione e amplificazione delle particelle fagiche in grado di legarsi alla superficie dei batteri, è stato possibile arricchire la frazione di cDNA di mitilo codificante PRRs. Con tecniche di sequenziamento massivo e strumenti bioinformatici è stato poi possibile risalire a tutte le sequenze codificanti i peptidi selezionati. I risultati ottenuti indicano che vi è una notevole differenza tra il numero di PRRs di emociti di mitilo che ha interagito con V. splendidus ripetto a V. aestuarianus. Lo studio si è, quindi, incentrato sui 42 peptidi selezionati contro V. splendidus, presunti PRRs, identificandone alcuni con funzione immunitaria già nota (C-type lectin, FREPs, C1qDC proteina, apextrin-related proteina), alcuni presumibilmente falsi positivi ed altri completamente nuovi che non mostrano similarità con sequenze omologhe annotate e il cui ruolo e funzione andrebbero indagati con futuri studi sperimentali.
XXVII Ciclo
1985